L'epigenetica 

è una branca della genetica che si occupa dei cambiamenti fenotipici ereditabili da una cellula

o un organismo, in cui non si osserva una variazione del genotipo.
Un marcatore genetico è una sequenza di DNA conosciuta che può essere identificata mediante un
semplice saggio. Un marcatore genetico può essere costituito da una breve sequenza di DNA, come la
sequenza che circonda un polimorfismo a singolo nucleotide (single nucleotide polymorphism), o da una
sequenza lunga, come i microsatelliti. 
I vari marcatori epigenetici che possono essere utilizzati sono il DNA metilato, i miRNA e i lncRNA; questi
sono presenti nei fluidi biologici come plasma, urine o per esempio nelle feci.
lncRNA è acronimo di long non coding RNA. 
I lncRNA, così come i microRNA, i siRNA, gli aRNA, i piwiRNA ed altri tipi di RNA, fanno parte del
gruppo degli RNA non codificanti (ncRNA).
Il ruolo cruciale di questi RNA non codificanti in vari processi biologici è ormai dato per scontato, sebbene i
loro meccanismi d’azione rimangano ancora oggi poco conosciuti.
I miRNA sono regolatori dell’espressione genica a livello post-trascrizionale; coinvolti nel controllo
epigenetico di numerosi processi fisiologici.
Pertanto, viaggiando all’interno dei fluidi biologici, possono raggiungere cellule anche molto lontane dalla
genitrice, trasmettendo la regolazione da essi operata, anche a distanza.
Questa branca della biologia molecolare nasce dalla consapevolezza che l’uomo non è soltanto espressione
del proprio genoma, cioè non è solo il DNA che controlla quello che noi siamo.
Quindi possiamo dire che il genotipo non caratterizza totalmente il nostro fenotipo.
Come già sappiamo nell’uomo sono stati riconosciuti circa 23.000 geni e da questi geni che sono la parte
codificante del DNA si ottengono attraverso la trascrizione per produrre mRNA e di traduzione per produrre
le proteine, delle informazioni che in parte vanno a caratterizzare il fenotipo della cellula o dell’organismo.
I 23.000 geni rappresentano una piccola parte del nostro DNA poiché la restante parte di questo è
rappresentata da DNA non codificante, la quale è stata definita in passato “DNA spazzatura”.
Solamente successivamente ci si è resi conto che in realtà questa è la parte fondamentale per il giusto
funzionamento della parte codificante.
Noi come specie umana, ma in generale le specie che si riproduzione mediante l’unione di due gameti
tramite una riproduzione sessuata, origina lo zigote che si evolverà in organismi complessi come, per
l’appunto, noi umani. Lo zigote va incontro ad una serie di divisioni cellulari che conducono alla produzione
di cellule identiche tra loro, quindi cloni, che hanno lo stesso materiale genetico, ma, alla fine, si arriva ad un
punto in cui da cellule uguale vi è un differenziamento.
Le cellule per gruppi uguali andranno a formare un tessuto, i tessuti differenziandosi andranno a formare
organi e gli organi con le stesse funzioni andranno a formare gli apparati.
In questo processo di differenziamento cellulare è determinante per la formazione di due o più cellule
diverse è l’attivazione della trascrizione di geni specifici che sono coinvolti in questo differenziamento.
Questi fattori di trascrizione guidano l’espressione dei 23.000 geni codificanti del nostro DNA.
Ciò vuol dire che non tutti i geni codificanti vengono attivati allo stesso modo.
Per esempio, se una cellula deve differenziarsi per formare un neurone, la neurogenina, uno dei più
importanti fattori di trascrizione, condurrà all’espressione di quei geni che possono formare il sistema
nervoso centrale e periferico; al contrario per quelle cellule che dovranno formare, per esempio il tessuto
muscolare, avranno un fattore di trascrizione differente che è la miogenina.
Quindi per l’attivazione di diversi fattori di trascrizione che si legano a promotori di geni specifici che sono
coinvolti nel processo di genesi di un dato tessuto, si ottengono dallo stesso genotipo due fenotipi diversi.
Questo ha messo in luce che le condizioni fisiologiche o patologiche di un individuo solamente in parte
possono essere definite ereditarie.
Le malattie genetiche sono legate al genotipo familiare dell’individuo poiché le mutazioni vengono
tramandate alla prole dai genitori.
Ci sono invece delle patologie che non dipendono dal genotipo e che quindi non sono ereditabili, ma hanno
una familiarità, ossia dipendono da una serie di fattori che insieme al genotipo concorrono alla
manifestazione di questi caratteri che verranno espressi nel fenotipo.
Tutti questi fattori hanno poco in comune con i geni ma molto spesso derivano da stimoli esterni che non
solo derivano dall’esterno del nostro organismo ma anche da determinate situazioni che si istaurano
all’interno del nostro organismo al di fuori di un dato gruppo di cellule, per esempio.
Ci sono ovviamente i fattori ambientali, l’alimentazione, a stimoli infiammatori, all’esposizione di agenti
tossici e così via.
Questa influenza viene spiegata con il termine Epigenetica che viene definita come l’insieme delle
informazioni, in aggiunta a quelle del codice genetico, necessarie alla regolazione della trascrizione.
Quando parliamo di malattie su base genetica parliamo di malattie che sono legate alla mutazione che
avviene nella sequenza nucleotidica di un gene.
Quindi si può avere una mutazione di una base azotata e a seconda di dov’è posizionata la mutazione
possiamo avere la perdita o alterazione della funzionalità proteica o la perdita o alterazione dell'espressione
di quella proteina; questi due processi sono irreversibili perché sono delle mutazioni dentro la molecola del
DNA che se non è molto grave e quindi conduce alla morte della cellula, è una mutazione che verrà
trasmessa a tutte le cellule che derivano da questa e a tutti gli organismi che discendono da tale cellula.
Nella modificazione epigenetica si può andare incontro all’alterazione dell’espressione.
La mutazione avviene al di sopra della sequenza del DNA e ne influenza l’espressione.
Queste sono delle modificazioni reversibili che possono essere ereditate, ma non è detto perché dipende
dalla differenziazione cellulare.
Inoltre, la memoria della cellula nel differenziarsi derivava dalle modifiche epigenetiche che subisce la
cellula progenitrice e che trasferisce alle cellule figlie.
Il termine epigenetica fu coniato nel 1942 da Conrad Hal Waddington per definire “lo studio delle
modificazioni ereditabili dell’espressione genica o del fenotipo cellulare, non legate a cambiamenti della
struttura del DNA”.
Nonostante questo, già Aristotele parlava di epigenesi.
Possiamo definire i tre principi su cui si fonda l’epigenetica come:
 L’espressione genica non dipende solo da cambiamenti, mutazioni, nella struttura del DNA.
 Il fenotipo cellulare, ossia l’aspetto e le caratteristiche di una cellula non è dovuto solo ai
cambiamenti della struttura del DNA
 Un fenotipo cellulare può essere ereditato indipendentemente da cambiamenti o mutazioni nella
struttura del DNA.
I meccanismi che controllano l'espressione genica attraverso modificazioni del materiale genetico senza
alterare la sequenza dei nucleotidi sono rappresentati dalla metilazione del DNA, dalla modificazione delle
proteine istoniche, quindi della modificazione della struttura della cromatina e dai microRNA.
Tali meccanismi sono modulati ed influenzati dallo stile di vita, dai farmaci, dall’esposizione ad agenti
tossici…
La base di tutto questo base le radici sulle osservazioni dei gemelli omozigoti che derivando dallo stesso
zigote, si notava che nonostante avessero lo stesso materiale genetico, vi erano delle differenze tra i due,
anche a livello fisiologico o patologico.
Da lì capirono che non era solo la genetica a determinare chi noi fossimo, ma subentra l’epigenetica.
Per quanto riguarda le modificazioni delle proteine istoniche possiamo parlare di:
 Acetilazione istonica L'acetilazione dell'istone riduce il legame dell'istone alla struttura del DNA,
rendendo questa sezione di DNA disponibile per il legame dei fattori di trascrizione e RNA
polimerasi alla regione promotrice dei geni per iniziare la trascrizione.
 Metilazione istonica  La metilazione del DNA è essenziale per il normale sviluppo e questa è
associata con alcuni processi chiave, tra cui l'imprinting genomico, l'inattivazione del cromosoma X,
 la soppressione di elementi ripetitivi e la carcinogenesi. Tale metilazione è una modificazione
biochimica e coinvolge l'aggiunta di un gruppo metile al livello del carbonio-5 della citosina, quasi
esclusivamente nel contesto del dinucleotide CpG.
 Fosforilazione istonica  Avviene nelle regioni N-terminali di H2A, H2B, H3 e H4 ed è stata
associata tradizionalmente alla formazione dei cromosomi metafasici.
Il fenomeno è stato visto verificarsi dopo l'azione del glutammato sul recettore NMDA a livello
dell'ippocampo, regione cerebrale associata alla memoria e ad altri processi cognitivi.
Anche stress esogeni vari possono indurre la fosforilazione dell'H3, come l'esposizione in coltura di
cellule epatocitarie ad etanolo ed in ratti trattati in acuto.
La fosforilazione dell'istone H3 sembra essere coinvolta nei fenomeni di oncogenesi.

miRNA
come già sappiamo abbiamo tre dipi di RNA: mRNA, tRNA e rRNA.
Ognuno di questi ha una funzione particolare e rappresentano gli RNA più conosciuti e, di questi, solo il 4%
è l’RNA codificante e ha a che fare con il processo di trasferimento e di informazione genica dal DNA
all’mRNA alle proteine.
La funzione dell’RNA che non è codificante (che deriva dal DNA non codificante), e che quindi non andrà a
formare le proteine ma viene ugualmente trascritto, è quella di avere una funzione regolatoria.
 i microRNA o miRNA sono un piccolo gruppo di RNA non codificanti a singolo filamento che sono stati
identificati in molti organismi.
Sono formati dai 18 ai 22 nucleotidi e sono
originati da un precursore a Stem-loop cioè a
bastoncello con anello circolare.

NOMENCLATURA DEI miRNA

 La parte iniziale del miRNA è per tutti uguale: miR-
 I miRNA sono identificati con un numero: miR-15
 Avendo due miRNA che non hanno alcuna somiglianza tra di loro vengono identificati con numeri in
successione: miR-15, miR-16
 I miRNA che sono omologhi in organismi differenti vengono indicati con lo stesso nome
 Forme mature identiche ma che vengono prodotte da loci diversi vengono indicate con lo stesso nome, ma
con un suffisso numerico per distinguerli: miR-16-1 e miR-16-2
 Quando vi è una differenza in 1 o 2 basi vengono indicati con un suffisso letterale: miR-181a e miR-181b
 Se un precursore a stem-loop dà origine a due miRNA, uno per ogni braccio, vengono chiamati con il
seguente suffisso: miR-142-5p SUL BRCCIO IN 5’ MIr-142-3p SUL BRACCIO IN 3’

 La forma meno espressa può essere indicata con un asterisco: miR-191*

Abbiamo detto che questi

miRNA sono degli RNA di
tipo regolatorio.
L’espressione genica può
essere regolata in più punti del
percorso che conduce dal
DNA all’RNA e quindi alle
proteine.
Se consideriamo le fasi di
avanzamento dell’espressione
genica nel nucleo possiamo
individuare due punti di controllo: il controllo trascrizionale che porta alla formazione del trascritto di RNA
ed il controllo delle modificazioni dell’RNA che portano alla trascrizione dell’mRNA.
Nel citosol possiamo individuare un terzo punto di controllo correlato al trasporto e alla localizzazione
dell’RNA. Qui l’mRNA può o Subire un controllo della degradazione e formare l’mRNA inattivo, oppure
può andare incontro a traduzione quindi subire il controllo della traduzione per formare la proteina.
a sua volta la proteina subisce un controllo dell'attività e può formare o la proteina inattiva o una proteina
attiva.

BIOGENESI DEI miRNA

Gli studi hanno dimostrato il significato della biosintesi del miRNA e della funzione regolatore nel
mantenimento dell'omeostasi cellulare.
I miRNA sono trascritti dall'RNA polimerasi II e in parte dall’RNA polimerasi III, dalla lavorazione iniziale
alla maturazione finale.
La maturazione dell’RNA avviene in tre fasi:
1. Cropping (taglio operato da Drosha) I miRNA vengono trascritti quindi in pre-miRNA la quale
attraverso un complesso multi-enzimatico verrà tagliata in pre-mi-RNA.
2. Export: il pre-miRNA viene trasportato nel citoplasma da Exportin5/RanGTP; si forma un
eterotrimero che passa attraverso i pori nucleari, quindi passa attraverso una serie di proteine nel
citoplasma.
3. Dicing: taglio di Dicer: una RNAse III citoplasmatica chiamata Dicer che (nell’uomo) insieme al suo
partner TR, nel citoplasma, processa il pre-miRNA eliminando il loop, ossia la parte ad anello.
Produce quindi una molecola di 22 nucleotidi in forma duplex (due filamenti).
Per passare nella forma attiva il microRNA duplex viene a sua volta processato da un altro complesso
che prende il nome di RISC che trasforma il miRNA duplex in miRNA maturo a singolo filamento
costituito dai 18 ai 22 nucleotidi.
Il microRNA maturo rimane ancorato al RISC e come tale è in grado di andarsi a legare per
complementarietà ad una sequenza di mRNA che diventa il suo taget, ossia il bersaglio.
Quindi il compito dei miRNA è quella di riconoscere ed appaiarsi a specifiche sequenze di mRNA
messaggero controllandone la traduzione poiché rende inaccessibile l’mRNA al legame con il complesso
che poi lo indurrà alla traduzione per la formazione delle proteine.
Dunque, il ruolo dei microRNA è quello di regolare negativamente l’espressione genica a livello post-
trascrizionale.
Un singolo mRNA può essere preso di mira da più miRNA diversi con efficienze variabili.
Al contrario, un singolo miRNA può colpire più di un mRNA.
Attraverso il loro legame con le sequenze di mRNA bersaglio, i miRNA hanno varie funzioni biologiche.
Hanno la capacità di inibire o promuovere l'espressione di molti geni correlati, che possono influenzare
diverse vie di segnalazione cellulare essenziali per lo sviluppo e la progressione del tumore, come la
proliferazione cellulare, la differenziazione, la mobilità e l'apoptosi.
Una riduzione globale o un aumento dei miRNA maturi si osserva nel cancro e coinvolti nei comportamenti
biologici del cancro, il che ha reso i miRNA candidati attraenti per la terapia del cancro.
La complementarietà può essere di due tipi:
1. Se il microRNA nella forma matura si allinea e si lega in maniera perfetta con l’RNA target si ottiene
la degradazione dell’mRNA prima della sua normale emivita e talvolta la proteina non vien
nemmeno prodotta.
2. Se si ha una complementarietà imperfetta si ottiene un’inibizione della traduzione, quindi l’mRNA
non viene degradato ma non andrà a tradurre la proteina.
Dunque, i miRNA agiscono mediante il riconoscimento di specifici mRNA targets al fine di determinarne la
degradazione o la repressione della traduzione.
la funzione di molti mi RNA non è nota ma per alcuni è stata provata la partecipazione a processi fisiologici
e patologici: hanno ruolo in proliferazione cellulare, apoptosi e differenziazione cellulare; possono essere
deregolati in malattie umane e possono essere coinvolti nella tumorigenesi.

In una patologia si parla di alterazione o disregolazione di uno o più miRNA.

Se in una data patologia io ho un abbassamento del valore normale di miRNA posso capire che l’mRNA
target che il miRNA silenziava, verrà up-regolato perché non ci sarà la giusta concentrazione di miRNA per
evitare che questi vadano incontro a traduzione.
Al contrario un aumento dei valori di miRNA silenziano gli mRNA non mandandoli in traduzione.
Quindi nel caso di inattivazione di un miRNA si avrà la sovra espressione dell’mRNA bersaglio mentre
l'attivazione di un miRNA porterà la down regolazione dell’mRNA target che potrebbe essere coinvolto in
processi come l’apoptosi, ciclo cellulare, invasione, angiogenesi.
Quindi la disregolazione nell’espressione dei miRNA intracellulari è stata associata molte condizioni
patologiche.
I miRNA sono regolatori dell’espressione genica a livello post-trascrizionale; coinvolti nel controllo
epigenetico di numerosi processi fisiologici.
Sono presenti in tutti i fluidi biologici come il sangue e le urine, in forma libera o all’interno di vescicole
dette esosomi. Pertanto, viaggiando all’interno dei fluidi biologici, possono raggiungere cellule anche molto
lontane dalla genitrice, trasmettendo la regolazione da essi operata, anche a distanza.
La loro disregolazione è stata associata all'insorgenza di diverse patologie: cardiovascolari,
neurodegenerative, diabete e cancro. Vengono considerati marcatori di patologia, utili sia nella diagnosi sia
nella risposta al trattamento. Nel cancro, i pattern di espressione dei miRNA sono utilizzati anche per la
prognosi.
miRNA in terapia: l’induzione o la repressione mirata di oncosopressori o oncogeni utilizzando vari miRNA
vector system, delivery basato su nanoparticelle, spugne, antimiRs.
Ricordiamo che un gene oncosoppressore è un gene che codifica per prodotti che agiscono negativamente
sulla progressione del ciclo cellulare proteggendo in tal modo la cellula dall'accumulo di mutazioni
potenzialmente tumorali.
Un oncogene è un gene, o una serie di nucleotidi che codificano una proteina, che potenzialmente
indirizzano la cellula verso lo sviluppo di un fenotipo neoplastico. Solitamente gli oncogeni intervengono
nello sviluppo tumorale e aumentano le possibilità che lo sviluppo (proliferazione e differenziamento) di una
cellula si diriga in senso tumorale. I miRNA possono controllare tali geni attraverso la down regolazione.
miRNA nella diagnosi: mirNAoma di un individuo (Next Generation Sequencing si individuano tutti i
miRNA presenti in quelle cellule, tessuto etc. con un’analisi di tipo qualitativo); ma anche effettuare analisi
quantitativa, miRNA come biomarcatori (Realtime PCR, microarrays) nella diagnostica e per
l’individuazione precoce di patologie; questa è un’analisi quantitativa.
A livello diagnostico analizzando il profilo di espressione nel serio di pazienti e paragonandolo con controlli
sono stati trovati miRNA up o down regolati specificatamente in determinati patologie.
C’è anche la possibilità di utilizzarli come marcatori precoci non invasivi di patologie oppure come
marcatori di risposta a determinate terapie farmacologiche.
I primi miRNA associati al cancro erano miR-15a e miR-16-1 I quali si trovano in regione del cromosoma
umano 13q14, tra esoni 5 e 6del gene LEU2, regione frequentemente cancellata nella leucemia linfocitica
cronica che progredisce a uno stato aggressivo.
I tumori sono presenti pattern specifici di espressione dei miRNA che permettono di discriminare i diversi
tipi di cancro e di identificare il tessuto di origine delle metastasi.
Pertanto, i pattern di espressione dei miRNA sono utilizzati come marcatori per la diagnosi, la prognosi e
per il responso terapeutico.
Se consideriamo alcune patologie come il diabete di tipo 1 vediamo che il miRNA associato come
biomarcatore è solamente uno, in altri tipi di patologie come l’obesità o nel neuroblastoma ci sono diversi
miRNA associati e non solo.
Per ogni miRNA possiamo individuare se questo viene up regolato o down regolato.
Per quanto riguarda la terapia vi è la possibilità di inserire in particolari vettori e veicolare in cellule
bersaglio i miRNA sintetici per quei miRNA che vengono down-regolati, quindi all’interno della cellula il
miRNA manca o è presente in piccole concentrazioni o l’antagomir nel caso di miRNA up-regolati poiché
ci sarà un’inibizione dei miRNA.
Poiché le molecole di RNA hanno una bassa stabilità e si cerca di aumentarne l’emivita e con dei vettori si
possono indirizzare verso la cellula bersaglio modificando la superficie del vettore.
Le Strategie per terapie anticancro basate su miRNA sono
1. Bloccare miRNA oncogeni usando oligonucleotidi antisenso
2. Costrutti Locked nucleic acid (LNA)
3. miRNA sponges  sono degli inibitori competitivi che posseggono delle sequenze complementari a
quelli dei miRNA che si vanno a legare al miRNA e lo inibiscono.
4. miR-mask  mascherano le sequenze a cui il miRNA si dovrebbe andare a legare con l’mRNA target e
non hanno il miRNA come bersaglio diretto ma l’mRNA a cui questo si dovrebbe legare.
5. Small molecule inhibitors
6. Ripristinare l’espressione di miRNA oncosoppressori
7. Riprogrammare le cellule cancerogene
L’analisi dei miRNA nei nostri fluidi biologici evidenziano anche i miRNA delle piante o in genarle di
quello che noi ingeriamo con l’alimentazione, quindi chi va a fare l’analisi dei miRNA poiché abbiamo detto
che ci sono dei miRNA identici di organismi e specie diverse, deve essere in grado di distinguere i miRNA
di origine umane dagli altri.
I miRNA possono essere trasportati al di fuori delle cellule e forse possono essere usati come indici
diagnostici extracellulari per la diagnosi e la terapia di alcune patologie.
I miRNA circolanti nei fluidi biologici, miRNA extracellulari, rappresentano una nuova forma di
comunicazione intercellulare attraverso il trasferimento di informazioni genetiche
I miRNA che sono biomarcatori di diagnosi e di prognosi
vengono rilasciati :
▪ negli esosomi
▪nelle microvescicole
▪ con i corpi apoptotici
▪con complessi proteici (NPM1: nucleofosmina, famiglia delle Argonaute_Ago2, 1, 3, 4 )
▪con le HDL
Mentre vengono analizzati.
✓ microarray
✓qRT-PCR
✓tecniche di sequenziamento di nuova generazione