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CAPITOLO 2 NATURA MOLECOLARE DEI GENI NATURA DEL MATERIALE GENETICO Il DNA costituito da basi azotate puriniche ( A/G)

G) e pirimidiniche (C/T),acido fosforico e dallo zucchero deossiribosio;nellRNA si trova lo zucchero ribosio e lU al posto della timina. Un nucleoside composto da una base e uno zucchero( in RNA e DNA) e un nucleotide rappresenta lunione di pi nucleotidi tramite legami fosfodiesteri tra acido fosforico e posizioni 3 e 5 degli zuccheri,mentre la base si lega in posizione 1 dello zucchero. Una catena di DNA polare poich presenta nella parte alta un gruppo fosfato 5 e nella parte bassa un gruppo ossidrilico 3. STRUTTURA DEL DNA Chargaff decret che la quantit di adenine e timine fosse identica cosi come quello di G e C,e che il numero di pirimidine fosse quasi lo stesso delle purine. Nella determinazione della struttura fu rilevante la diffrazione ai raggi X: da una soluzione concentrata di DNA si traeva,con un ago,una fibra costituita da un insieme di molecole di DNA affiancate longitudinalmente a causa della trazione a cui erano sottoposte. Tale fibra si comporta come un cristallo diffrangendo i raggi X ad una determinata umidit. Una molecola complessa ( proteina) genera un profilo di diffrazione costituito da molte macchie;una struttura semplice invece ha un profilo costituito da puntini disposti a forma di X,evidenziabili nellanalisi del DNA solo se costituiti da una struttura semplice,ripetuta e allungata,quale pu essere lalfa-elica. Il DNA una doppia elica con gruppi zucchero-fosfato allesterno e basi allinterno,con appaiamento pur-pir;la distanza fra le coppie di basi adiacenti di 3.32 A,e la distanza per compiere un giro dellelica di 33,2 A(passo dellelica),ossia per ogni giro ci sono 10 coppie. I due filamenti sono antiparalleli,una con polarit 53 e laltro 35,e in soluzione il DNA ha una struttura simile a quello della diffrazione se non per la presenza di 10.5 coppie di basi ogni giro delica. I filamenti complementari possono essere separati ed ognuno pu servire da stampo per la sintesi di un nuovo filamento durante la replicazione semiconservativa che assicura che i 2 Duplex siano uguali alle molecole di partenza. GENI COSTITUITI DA RNA Alcuni virus contengono geni costituiti da RNA a singolo e doppio filamento invece che di DNA,come ilfago,un virus batterico privo di vita propria ed attivit metabolica finch non infetta una cellula ospite che comincer a produrre proteine virali. I geni virali producono,con le proteine del capside,nuove particelle virali. CHIMICA FISICA DEGLI ACIDI NUCLEICI Nella cellula il DNA pu presentarsi in varie forme:la forma B,destrorsa con basi orizzontali proposta da Watson e Crick,come una struttura di sale di sodio del DNA in una conformazione fibrosa ottenuta a valori elevati di umidit relativa (92%);forma A destrorsa ottenuta ad un livello di umidit del 75%,con il piano su cui giacciono le basi inclinato di 20 rispetto al piano orizzontale,con 11 coppie ogni giro e con un valore del passo dellelica di 24.6 A (tale struttura assunta da ibridi DNA-RNA e da un doppio filamento di RNA);forma Z estesa,elicoidale e sinistrorsa con un andamento a zig zag. Separazione dei filamenti di DNAIl contenuto di G+C varia in una molecola di DNA dal 22 al 73% e ci pu avere effetto sulle caratteristiche fisiche del DNA,quali la temperatura di denaturazione e la densit che aumentano allaumentare della % G+C . Se una soluzione di DNA scaldata i legami covalenti si rompono dando vita al processo di denaturazione/fusione del DNA e la temperatura alla quale i filamenti sono denaturati o dissociati per met detta temperatura di fusione Tm. Lentit della denaturazione misurata in base allassorbanza a 260 nm della soluzione di DNA( il DNA assorbe la luce a questa lunghezza donda a causa della natura elettrica delle basi). Quando i 2 filamenti sono uniti,lassorbanza ridotta dalla vicinanza delle basi e quando si separano,aumenta del 30-40% e il fenomeno detto effetto ipercromico. Siccome le basi G e C sono tenute insieme da 3 legami H,la loro energia di legame superiore rispetto al legame A-T,e allaumentare del contenuto di G/C aumenta anche la Tm. La denaturazione consentita anche da solventi organici (dimetil solfossido,formammide) da un elevato valore di pH e da una bassa [ ] ionica/salinica ottenuta rimuovendo gli ioni che schermano le cariche (-) sui filamenti. Un aumento del contenuto di G/C influenza anche la densit del DNA,poich il volume molare < rispetto ad A/T e ci dipende dal metodo di misurazione tramite centrifugazione in CsCl che si lega maggiormente alle coppie G/C la cui densit risulta aumentata. Rinaturazione/Annealing I filamenti separati possono riassociarsi se influenzati dalla:temperatura,25 al di sotto della Tm,e per tale motivo una procedura comune per mantenere il DNA nella forma denaturata di mettere la soluzione calda in ghiaccio (quenching),cossich il raffreddamento rapido impedisca lappaiamento;concentrazione,> la [ ] e > a probabilit che i filamenti complementari si incontrino e quindi la velocit di appaiamento; tempo,maggiore ,e maggiore sar lannealing.

Ibridazione Se isoliamo un filamento di DNA costituente un gene e lo poniamo in presenza di un filamento di RNA complementare,si crea un ibrido;lo stesso accade se si pongono insieme 2 filamenti di origine diversa con lievi differenze,ad esempio se uno dei 2 radioattivo. CAPITOLO 4 TECNICHE DI CLONAGGIO MOLECOLARE ( LABORATORIO) CLONAGGIO DEI GENI Un clone un gruppo di cellule o organismi identici tra loro e la procedura tipica consiste nellintroduzione di un gene estraneo in cellule batteriche e la separazione delle singole cellule da cui si ottengono colonie. Le cellule di una stessa colonia possiedono lo stesso gene introdotto e finch questo in grado di replicarsi pu essere clonato,clonato la cellula batterica ospite. Endonucleasi di restrizione Impediscono linvasione da parte di DNA esogeno (virale) tagliandolo in frammenti restringendo i possibili ospiti del virus; i tagli avvengono in siti allinterno del DNA esogeno e non alle estremit. Soltanto lenzima Hind II del ceppo Rd di Haemophilus influenzae in grado di tagliare il DNA in siti specifici e riconosce la sequenza GTPyPuAC/CAPuPyTG,operando il taglio a livello della sequenza Py-Pu. Gli enzimi a taglio sporadico (Not I) riconoscono siti di taglio di 8 coppie di basi e tagliano meno frequentemente;gli enzimi isoschizomeri ( Sma I Xma I) riconoscono la medesima sequenza ma con sito di taglio diverso. Gli enzimi di restrizione sono importanti perch capaci di tagliare i 2 filamenti negli stesi punti e perch possono effettuare tagli sfalsati lasciando porzioni di DNA a singolo filamento alle estremit,dette estremit coesive,in grado di appaiarsi temporaneamente ( possibilit di legare 2 diverse molecole di DNA). Tali tagli sono possibili perch le sequenze di riconoscimento hanno una simmetria bilaterale (identiche se capovolte di 180): 5GAATTC-3 / 3CTTAAG-5e sono dette palindromi;la lettura deve essere sempre 53. Le endonucleasi sono quasi sempre accoppiate a metilasi che metilano gli stessi siti sul DNA e collettivamente sono noti come siti di restrizionemodificazione/R-M. La metilazione consente al DNA la protezione dalle endonucleasi e il suo permanere nella cellula ospite. Quando il DNA replicato,un filamento del duplex formatosi non sar metilato a differenza dellaltro metilato,ma questaemimetilazione/a met assicurer protezione alla doppia elica,consentendo alla metilasi di trovare i siti per ottenere una doppia elica completamente metilata. Cohen e Boyer tagliarono 2 molecole di DNA diversi (plasmidi = piccole molecole di DNA circolare indipendenti dal cromosoma della cellula ospite)con lo stesso enzima EcoRI. Il 1 plasmide pSC101 conteneva il gene che conferiva resistenza allantibiotico tetraciclina mentre il 2 RSF1010 conferiva resistenza alla streptomicina e alla sulfonammide. Entrambi contenevano un sito di restrizione EcoRI e in seguito al taglio si ottennero 2 molecole di DNA lineari con le stesse estremit coesive che si appaiarono. La DNA ligasi un covalentemente le 2 molecole ottenendo unDNA ricombinante in vitro,costituito da 2 pezzi di DNA precedentemente separati; se introdotto in cellule batteriche conferisce resistenza alla tetraciclina ( si possono ottenere anche comunemente in natura). Vettori Entrambi i plasmidi sono utilizzati come trasportatori per permettere la replicazione di DNA ricombinanti;generalmente si utilizzano 1 vettore e 1 frammento di DNA esogeno che dipende dal vettore per essere replicato;siccome il DNA esogeno sprovvisto di unorigine di replicazione pu essere replicato solo se si trova in un vettore contenente tale sito. 1)Plasmidi come vettori : Uno dei pi famosi ma non pi utilizzati il pBR322 contenente i geni che conferiscono la resistenza agli antibiotici ampicillina e tetraciclina e tra questi 2 geni si trova lorigine della replicazione. Attraverso manipolazioni il plasmide ottenne un solo ed unico sito di taglio per enzimi di restrizione,utile per evitare la perdita di parte del plasmide. Nella clonazione del frammento di DNA esogeno nel sito per lenzima Pst I del pBR322 si taglia il vettore con Pst I per creare le estremit coesive e ci deve avvenire anche nel DNA. In seguito sono combinati il vettore e il DNA esogeno,ed incubati con la DNA ligasi che lega covalentemente i 2 DNA dopo che si sono unite le estremit coesive del vettore e del DNA. In seguito si deve trasformare lE.coli con la miscela di DNA,incubando le cellule in soluzione concentrata di sale di calcio per rendere le membrane permeabili;poi le cellule permeabili sono mescolate con il DNA permettendogli di entrare allinterno. Il DNA pu entrare anche attraverso elettroporazione,utilizzando campi elettrici ad alto voltaggio. Siccome il DNA che otteniamo non tutto ricombinato ma si hanno anche plasmidi ricomposti,per separarli utile la resistenza agli antibiotici caratteristica dei plasmidi. Le cellule crescono in presenza della tetraciclina,selezionando le cellule che hanno acquisito il vettore autonomamente con il DNA inserito. Le cellule senza DNA acquisito,con DNA esogeno,non saranno resistenti e non cresceranno. Linserzione di DNA nel sito di Pst I inattiva il gene rendendola cellula ospite resistente,e per determinare quali cloni hanno ricevuto il DNA ricombinante si effettua unanalisi per identificare quelli contemporaneamente resistenti alla tetraciclina e allampicillina. Un metodo utilizzato il piastramento in replica/replica plating che trasferisce i cloni dalla piastra originale con tetraciclina su una con ampicillina,grazie ad un panno sterile di velluto: in questo modo si riconoscono le cellule che non crescono sulla piastra con tetraciclina nello screening individuale. Con uno stuzzicadenti sterile si prelevano le cellule del clone in cui avvenuta la trasformazione,e sono inoculate su 1 terreno di coltura fresco per essere utilizzate o conservate. I Vettori pUC hanno siti di clonaggio riuniti in unarea detta MCS/sito di clonaggio multiplo:tali vettori hanno i geni per la resistenza allampicillina del pBr322 per

consentire la selezione dei batteri che hanno ricevuto una copia del vettore. Questi vettori compensano la perdita del gene per le resistenza alla tetraciclina con la presenza di siti multipli di clonaggio,come quello che codifica la regione N-terminale (peptide alfa)della beta-galattosidasi in pUC 18 e 19. I batteri ospiti trasformati col vettore pUC hanno un frammento di gene che codifica per la regione C-terminale della beta-galattosidasi. I due frammenti di beta-galattosidasi sono inattivi se da soli,e attivi se si combinano mediante alfacomplementazione. Quindi nel momento in cui pUC18 trasforma una cellula batterica trasportando il gene parziale della beta-galattosidasi,se ne produce uno attivo;se i cloni sono piastrati su un terreno con un indicatore per la beta-galattosidasi,le colonie con il plasmide pUC cambieranno colore. Lindicatore X-gal un galattoside sintetico incolore che,se digerito dalla beta-galattosidasi,diventa galattosio pi un colorante indaco che colora la colonia di blu. Se invece interrompiamo il gene parziale per la beta-galattosidasi sul plasmide,inserendo una molecola di DNA nel sito di clonaggio multiplo,il gene si inattiva e diventa incapace a sintetizzare il prodotto complementare al frammento della beta-galattosidasi della cellula ospite,e X-gal resta incolore. I cloni con gli inserti saranno quelli bianchi,e quelli resistenti allampicillina blu. I siti multipli di clonaggio permettono inoltre di effettuare tagli con diversi enzimi di restrizione in 2 diversi siti,e di inserire un frammento di DNA con unestremit EcoRI e una BamHI,tramite la tecnica del clonaggio unidirezionale. 2) Fagi come vettori : I batteriofagi sono vettori naturali che trasducono DNA batterico da una cellula allaltra e,tramite modifiche,possono operare su tutti i tipi di DNA. Tali fagi sono pi vantaggiosi dei plasmidi perch hanno una resa di colonie pi alta,che sono chiamate placche,formatesi quando un fago crea un buco su una distesa di batteri. Ogni placca deriva da 1 solo fago che infetta una cellula,producendo una progenie che lisa la cellula infettata ,avendo lo stesso effetto sulle cellule circostanti fino alla comparsa di una placca di cellule morte. I fagi di una placca,derivati da un singolo fago,sono tutti geneticamente identici e costituiscono un clone. 3) Fago lambda come vettore : Estraendo la regione centrale del DNA del fago,rimasero i geni utili alla sua replicazione e i geni mancanti furono sostituiti dl DNA esogeno trasportato dal vettore Caronte nelle cellule batteriche. I vettori lambda sono anche noti come vettori di sostituzione siccome il DNA di lambda rimosso e sostituito da quello esogeno. I vettori lambda possono contenere pi DNA esogeno dei plasmidi e sono utili nella costruzione di collezioni geniche(genoteche). Identificazione di un clone con una sonda specifica Il gene desiderato pu essere sondato con un gene omologo di un altro organismo,se clonato,e occorre che i 2 geni siano simili in sequenza,affinch ci sia libridazione. Spesso per si deve ridurre la stringenza delle condizioni di ibridazione cosicch libridazione tolleri un certo numero di coppie di basi non appaiate tra la sequenza di basi della sonda e il gene clonato. Ci possibile a temperature alte,a [ ] elevata di solventi organici e a basse [sale],condizioni che separano i filamenti del DNA e che possono variare finch i 2 filamenti complementari non formano un duplex. Rendendo queste condizioni meno rigide,si riduce la stringenza finch non si ibridano i 2 filamenti che presentano differenze nella sequenza di basi. Senza un DNA analogo si pu procedere conoscendo in parte la sequenza del prodotto proteico del gene. Il clonaggio della ricina,tossina vegetale, stato possibile perch si conosceva la sequenza amminoacidica dei 2 polipeptidi di cui costituita;si risaliti alle sequenze di nucleotidi che codificano per quegli Aa,riuscendo a sintetizzarli chimicamente usando questa sonda di sintesi per trovare il gene per la ricina tramite ibridazione. Le sonde usate sono costituite da oligonucleotidi e si usano in gran numero perch il codice genetico degenerato e molti Aa sono codificati da pi di una tripletta. Uno dei polipeptidi della ricina,per,conteneva la sequenza di AaTrp-Met-Phe-Lys-Asn-Glu: i primi 2 Aa sono codificati ognuno da un codone e i 3 successivi da 2 codoni,mentre il 6 Aa richiede 2 basi extra poich la degenerazione coinvolge solo la 3 base. Clonaggio di cDNA un DNA copia di un RNA (solitamente mRNA):richiesto nella produzione di una genoteca di cDNA,un insieme di cloni che rappresentano il > numero possibile di mRNA di un tipo cellulare in un dato momento e che possono contenere anche decine di migliaia di cloni diversi. In ogni processo di clonaggio la fase centrale la sintesi di cDNA da uno stampo di mRNA,ad opera della trascrittasi inversa(DNA polimerasi RNA dipendente)che ha bisogno di un innesco per cominciare la sintesi. Approfitto perci della presenza della coda POLI-A al 3 della > parte degli mRNA eucaristici e uso come un innesco un oligo(dT) complementare alla coda e che si lega al 3favorendo la sintesi di DNA a singolo filamento. In seguito lmRNA parzialmente degradato da una Ribonucleasi(RNasiH) che degrada il filamento di RNA di un ibrido RNA-DNA permettendo la digestione dellRNA appaiato al 1 filamento di cDNA e i frammenti di RNA rimanenti fungono da innesco per la sintesi del 2 filamento di DNA (uso il 1 come stampo). Tale fase nota come NickTranslation/spostamento dellincisione e ha come risultato un cDNA a doppio filamento con un piccolo frammento di RNA al 5 del 2 filamento;lo spostamento consiste nella rimozione del DNA a valle di unincisione e la simultanea sintesi di DNA a monte dello stesso taglio;lo spostamento avviene in direzione 53. Lenzima adoperato una DNA pol I di E.coli con attivit di esonucleasi in direzione 53 che gli permette di degradare il DNA a valle dellincisione,mentre si muove. In seguito il cDNA legato ad un vettore e le estremit coesive(che nellRNA genomico si ottengono con enzimi di restrizione) sono ottenute grazie alla TdT/deossinucleotidil trasferasi terminale e a un deossiribonucleotide trifosfato. Se viene usato il dCTP,lenzima aggiunge,una alla volta,i dCMP al 3 del cDNA cosi come i terminali costituiti da oligo(dG) sono aggiunti ad un vettore. Lappaiamento tra le estremit oligo(dC) del

cDNA e quelle oligo(dG) del vettore ne permette lunione con una ligasi e produce un DNA ricombinante da riutilizzare.(La DNA pol I rimuove residui di RNA,sostituendoli con DNA). Di solito i vettori usati per il cDNA sono plasmi dici o fagmidici e i cloni(+) sono identificati con libridazione della colonia con una sonda di DNA marcato. Se usato come vettore il fago lambda,questo pone il cDNA clonato sotto il controllo di un promotore lac per consentire trascrizione e traduzione del gene clonato,il cui prodotto proteico ricercato con un anticorpo. Amplificazione rapida delle estremit di cDNA (RACE) Pu accadere che la trascrittasi non giunga al termine dellmRNA,lasciando frammenti mancanti riempiti con la RACE sullestremit 5 e 3: la5RACE inizia con una soluzione di contenente lmRNA in questione e il cDNA privo di estremit 5;questo filamento incompleto pu essere appaiato allmRNA facendo continuare la trascrizione e in seguito si possono aggiungere al cDNA incompleto,ad esempio,le code oligo(dC) grazie alla trasferasi terminale,e il dCTP. Cosi gli oligo (dG) possono iniziare la sintesi del 2filamento,producendo un cDNA a doppio filamento,amplificato con la PCR grazie ad oligo(dG) e un oligonucleotide specifico al 3 come inneschi. REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI PCR convenzionale uso la DNA polimerasi per produrre una copia di una data regione di DNA,amplificando una regione compresa tra 2 siti predeterminati. In questa regione sono messi brevi inneschi/sequenze di DNA capaci di ibridare con il DNA,su ogni lato della regione,per dare inizio alla sintesi del DNA di quella regione. Le copie dei filamenti di queste regioni fungono poi da stampo per il ciclo di sintesi successivo e la quantit di DNA in ogni regione raddoppia per ogni ciclo. Date le elevate temperature in cui avvengono le reazioni si usano polimerasi resistenti al calore come la Taq polimerasi,mescolate in provetta con inneschi e uno stampo di DNA e sottoposti a 3 fasi: la prima a 95C in cui si ha la separazione dei filamenti;la seconda a 50C che vede lappaiamento tra inneschi e filamento stampo di DNA e la terza a 72C che consente la sintesi di DNA. Ogni ciclo dura pochi minuti e solitamente bastano 20 cicli per avere giuste concentrazioni di DNA amplificato. RT-PCR ( su prodotti di reazione della trascrittasi inversa) usata se si vuole clonare un cDNA da un singolo mRNA con sequenza nota,in modo da creare inneschi per la PCR;prima di tutto lmRNA convertito in DNA con la trascrittasi inversa per ottenere un filamento,e con un innesco per ottenere un doppio filamento. Poi si usa la PCR tradizionale per amplificare il cDNA. Si possono inoltre inserire siti di restrizione sugli inneschi per la PCR cosi che questi siti siano presenti alle estremit del cDNA,e che possano essere tagliati con enzimi di restrizione e poi inseriti in vettori di clonaggio. PCR - Real Time quantifica lamplificazione di DNA in tempo reale . Dopo che i filamenti si separano,si appaiano con gli inneschi(diretto e inverso) e con un oligonucleotide fluorescente complementare a una porzione di uno dei 2 filamenti,con la funzione di sonda reporter,con un fluorocromo(F) al 5 e un quencher(Q) al 3 che smorza la fluorescenza di F. Durante la polimerizzazione la polimerasi estende linnesco diretto e incontra la sonda degradandola per poter sintetizzare nuovo DNA in quella regione e rilasciando F che si separa da Q,e la cui fluorescenza aumenta. La reazione avviene in un fluorimetro che misura la fluorimetria liberata,e siccome esiste una certa quota di sonda reporter per appaiarsi ai filamenti,la fluorescenza aumenta ad ogni ciclo di amplificazione. METODI PER LESPRESSIONE DEI GENI CLONATI Vettori di espressione Molti vettori sono usati nella 1 fase del clonaggio,quando il DNA esogeno posto in un batterio per essere replicato e per produrre grandi quantit di DNA ricombinante. I vettori di espressione producono il prodotto proteico dei geni clonati: i vettori pUC e pBS pongono il DNA sotto il controlo del promotore lac,che a monte del sito multiplo di clonaggio e se un DNA inserito si trova nella stessa fase di lettura del gene lacZ che interrompe,si crea una proteina di fusione,con una sequenza parziale della betagalattosidasi allestremit N-terminale e unaltra sequenza proteica allestremit C-terminale. I vettori di espressione batterici hanno 2 elementi necessari per lespressione genica:un promotore forte e un sito di legame per i ribosomi vicino ad un codone dinizio ATG. Vettori di espressione inducibili I vettori di espressione hanno promotori molto forti,poich pi mRNA prodotto e > il prodotto proteico sintetizzato. Occorre per mantenere il gene clonato represso finch non espresso altrimenti,essendo molte proteine eucariotiche tossiche se presenti in quantit esigue,ostacolando la crescita batterica,se fosse continuamente espresso(gene clonato),i batteri portatori non raggiungerebbero la giusta [ ] per produrre queste proteine. Inoltre lelevata espressione nei batteri pu far s che laccumulo di queste proteine crei corpi di inclusione ; il gene clonato perci mantenuto inattivo a valle di un promotore inducibile,normalmente inattivo. Il promotore lac indotto/attivato dallinduttore sintetico IPTG (isopropil tiogalattoside),anche se vi una minima espressione del gene clonato anche in assenza dellinduttore. Una soluzione quella di esprimere un gene in un plasmide o fagmide(pBS) che ha il proprio gene lac1,e il repressore in pi,presente in questo vettore,mantiene il gene clonato inattivo finch non indotto da IPTG. Siccome il promotore lac non molto forte,i vettori sono progettati con un promotore trc ibrido che combina la forza del promotore trp(operone del triptofano)con linducibilit del promotore lac.

Vettori di espressione che producono proteine di fusione La > parte dei vettori di espressione produce proteine di fusione che da un alto impediscono la sintesi del prodotto del gene inserito,ma dallaltro lato gli Aa in eccesso presenti in esse sono utili nella loro purificazione. Ad esempio i vettori di espressione per le oligoistidine hanno una breve sequenza a monte del sito di clonaggio multiplo che codifica una sequenza di 6 istidine,e la proteine espressa avr 6 istidine allestremit N-terminale. Le regioni oligoistidiniche hanno una forte affinit per il nichel e le proteine che le contengono possono essere purificate tramite cromatografia per affinit con questi ioni di metalli bivalenti. Quindi i batteri producono la proteina di fusione,si lisano le cellule batteriche,si aggiunge lestratto batterico ad una colonna di affinit,si escludono le proteine non legate e si liberano quelle adese grazie allaggiunta di istidina o imidazolo(omologo). E semplice come procedura perch poche proteine hanno sequenze costituite d 6 istidine. Esiste un modo per eliminare le oligoistidine: a monte del sito di clonaggio multiplo vi una regione codificante per una sequenza di Aa riconosciuti dallenteroproteasi che taglia la proteina di fusione,in un sito raro,in 2 parti,lestremit delloligoistidina e la proteina dinteresse. La proteine poi passata nella colonia al nichel per separarla dalloligoistidina. CAPITOLO 5 STRUMENTI MOLECOLARI PER LO STUDIO DEI GENI E DELLATTIVITA GENICA (LABORATORIO) SEPARAZIONI MOLECOLARI Elettroforesi su gel di Agarosio Utile per separare acidi nucleici e proteine differenti. Nellanalisi del DNA si prepara un gel che crea delle fessure/pozzetti formatisi versando una soluzione calda/liquida di agarosio in un vassoio fornito di un pettine rimovibile con i denti rivolti verso il basso nellagarosio. Quando lagarosio gelifica ,il pettine rimosso e si formano pozzetti a sezione rettangolare nel gel;il DNA posto sui pozzetti si applica una corrente elettrica che induce il DNA carico (-) per la presenza dello scheletro di gruppi fosfato,a migrare verso lanodo(polo +) e la separazione avviene grazie allattrito. Elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) Per la separazione delle proteine e la determinazione delle catene polipeptidiche degli enzimi si utilizzano detergenti quali il sodio dodecil solfato(SDS)che denatura le sub unit impedendone lassociazione. LSDS ricopre i polipeptidi con cariche (-) favorendone lo spostamento verso lanodo e mascherando le cariche naturali delle sub unit,il che consente lo spostamento dettato dalla masse molecolari. I polipeptidi pi piccoli passano pi facilmente attraverso i pori del gel e migrano pi rapidamente di quelli grandi. Elettroforesi bidimensionale utilizzata quando le catene polipeptidiche sono complesse ed richiesto un elevato grado di risoluzione. La corsa avviene su gel senza denaturanti ad un determinato pH e [ ] di poliacrilammide,e poi ad un 2 e diverso pH e [ ]. Le proteine sono trattate con diverse intensit di corrente e condizioni di pH,poich la loro carica netta cambia col pH e con le [poliacrilammide]. I polipeptidi non possono per essere analizzati a causa della mancanza dellSDS che non li separa. Con lelettroforesi bidimensionale nella 1 fase la miscela di proteine sottopost ad elettroforesi in un tubo di gel contenente gli anfoliti che forniscono un gradiente di pH da unestremit allaltra del tubo. Una molecola carica (-) migra verso lanodo finch non raggiunge il punto isoelettrico( pH a cui non ha carica netta)e si ferma durante la fase di focalizzazione isoelettrica. Nella 2 fase il gel rimosso dal tubo e riposto in un apparato per SDS-PAGE che consente la risoluzione delle proteine a seconda delle dimensioni. Cromatografia a scambio ionico Usa una resina in grado di separare le sostanze in base alla loro carica. La cromatografia DEAE-Sephadex utilizza una resina a scambio anionico contenente gruppi di etilamminoetile carichi(+) che attraggono le proteine cariche (-). E stato possibile separare le 3 forme di RNA polimerasi,immettendo in una colonna,contenente la resina,un estratto cellulare con quei determinati enzimi:infine sono state rimosse le sostanze legate alla resina,facendo passare attraverso la colonna una soluzione con valori crescenti di forza ionica. Il gradiente salino usato perch i suoi ioni negativi competono con le proteine per legarsi alla resina,rimuovendo,nella discesa,le proteine dalla colonna. La soluzione eluita poi raccolta in un collettore di frazioni costituito da provette in un disco rotante in grado di ruotare dopo aver raccolto una determinata [ ] della soluzione. E possibile operare anche uno scambio cationico,usando resine (-) come la fosfocellulosa che separa le proteine (+). Le variazioni di pH portano il pH delle molecole ad un valore neutro cosiche le molecole possano staccarsi dalla resina Cromatografia per filtrazione su gel Separa le proteine in base alle loro dimensioni;le resine sono costituite da sfere provviste di fori in grado di catturare proteine con un determinato diametro,escludendo quelle pi grandi che usciranno velocemente con il volume escluso,ossia il volume di tampone che circonda le sfere. Cromatografia di affinit La resina,spesso abbinata ad un anticorpo o un enzima,ha unelevata affinit per le proteine da purificare e la molecola dinteresse pu poi essere eluita dalla colonna con una soluzione che compete con il legame tra la molecola dinteresse e il reagente di affinit. Per purificare la proteina oligoistidina si usa una colonna di nichel che produce un composto nichel-oligo,il cui legame distrutto dallimidazolo,analogo dellistidina che si legher al nichel sulla colonna. Se la molecola da purificare lunica in grado di legarsi alal rsina,basta mescolarla con lestratto cellulare,spingere la resina gi in una centrifuga,allontanare la soluzione residua lasciando la proteine dinteresse legata alla resina sul fondo della

centrifuga. Si lava poi il sedimento con tampone,la proteina rilasciata dalla resina che pu essere ricentrifugata e la proteina si ritrova nel sovranatante. TRACCIANTI MARCATI Autoradiografia Rilevazione di composti radioattivi mediante una pellicola sensibile ai raggi X. Se sottoponiamo a elettroforesi su gel dei frammenti di DNA radioattivi,ponendo poi il gel a contatto con una pellicola e incubando al buio per ore o giorni,lemissione radioattiva delle bande di DNA impressiona la pellicola,producendo su essa delle bande scure (auto radiazione perch le bande immortalano s stesse). Per aumentare la sensibilit viene utilizzato uno schermo intensificatore ricoperto di un prodotto che fluorescente se eccitato da elettroni beta basse,sempre emessi da radioisotopi. Quindi il gel radioattivo posto da un lato della pellicola e lo schermo dallaltro: siccome solo alcuni elettroni beta impressionano la pellicola e gli altri vi passano attraverso,lo schermo ne impedisce la perdita ottenendo fluorescenza. Con un densitometro possibile misurare lammontare di radioattivit di un frammento di DNA,calcolando lintensit delle bande sulla piastra:il densitometro indirizza un raggio luminoso attraverso lautoradiografia e ne misura lassorbanza;se la banda molto scura ci significa che ha assorbito la > parte della luce e lassorbanza sar elevato;se invece la banda debole,la luce lo attraversa e lassorbanza ridotta. Si costruisce poi un grafico con lasse delle X(distanza dallorigine) e lasse Y(assorbanza) e larea sottesa dei picchi sar proporzionale allintensit della radioattivit delle bande(misura indiretta). Phosphorimaging Consente di determinare la quantit di radioattivit di una sostanza,distinguendo le bande a varie disintegrazioni radioattive per minuto(dpm). Si parte da un filtro con bande di DNA ibridate con una sonda radioattiva,posta a contatto con una piastra che assorbe radiazioni beta che eccitano le molecole della piastra rimanendo eccitate finch non termina la scansione con il laser. Un PC rileva lenergia delle radiazioni beta trasformandole in unimmagine a falsi coloriin cui i diversi colori corrispondono a diversi gradi di radioattivit ( giallo /nero ). Conta a scintillazione in liquido Usa le emissioni radioattive provenienti da un campione per creare particelle fotoniche rilevate da un fotomoltiplicatore. Si pone una banda radioattiva in un tubo con il liquido di scintillazione contenente fluoro(fluoresce se bombardato con radioattivit) e si rileva la luce risultante dalle emissioni radioattive come scintillazioni registrate in conte per minuto(cpm). Traccianti non radioattivi Si sfrutta leffetto moltiplicatore di un enzima: un enzima accoppiato ad una squadra che rileva la molecola dinteresse e ne amplifica il segnale. E fruttuoso se il prodotto dellenzima chemio-luminescente cosicch ogni molecola emette fotoni amplificando il segnale. Spesso si usano dei substrati cromo genici che cambiano colore producendo bande che corrispondono alla posizione dellenzima e della molecola in esame. Lintensit di colore direttamente proporzionale alla quantit di molecole presenti ( analisi quantitativa). IBRIDAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI Southern-blot (identificazione frammenti di DNA ) Si usa un enzima di restrizione (EcoRI e HundIII) per tagliare un DNA genomico e produrre migliaia di frammenti che sono sottoposti a elettroforesi su gel di agarosio e se le bande sono visualizzate per colorazione si otterr una striscia di bande indistinguibili. Questi frammenti vengono trasferiti dal gel ad un filtro di nitrocellulosa per diffusione;il blotting consiste nel sottoporre le bande ad elettroforesi,farle uscire dal gel e approdare al blot Prima del trasferimento i frammenti sono denaturati in soluzione basica per consentire tra singolo filamento e nitrocellulosa o Gene Screen per ottenere il south blot (supporti di nylon). Il DNA clonato poi marcato aggiungendo DNA polimerasi in presenza di precursori di DNA marcati,e la sonda radioattiva (DNA) denaturata e fatta ibridare con il southern. La sonda,ovunque trover una sequenza di DNA complementare,vi si appaier formando una banda marcata corrispondente al frammento con il gene interessato. Se visibile solo una banda (con autoradiografia o phosphorimaging)allora il gene ha una sequenze complementare alla sonda di cDNA o ripetuto pi volte in tandem con un solo sito di restrizione in ogni copia(la banda scura e intensa). Se invece ci sono pi bande,esistono pi geni con la sequenza dinteresse;1 gene d bande se ha 1 o + siti di taglio per lenzima di restrizione. Tipizzazione del DNA e DNA-fingerprinting Resa possibile grazie alla scoperta diminisatelliti,sequenze di basi ripetute innumerevoli volte nel genoma: ci significa che individui diversi differiscono nel profilo delle ripetizioni di una sequenza e la possibilit di avere lo stesso profilo remota. Questi profili sono detti DNA fingerprint,analoghi delle impronte digitali. Un profilo ottenuto tagliando il DNA con un enzima di restrizione come lHaeIII il cui sito assente nella sequenza in esame,e in tal modo Hae taglier oltre le regioni del minisatellite. Il DNA in esame presenta 3 serie di regioni ripetute con,rispettivamente,4,3 e 2 ripetizioni e di conseguenza saranno prodotti 3 frammenti di diversa lunghezza con le 3 regioni ripetute. I frammenti sono poi sottoposti ad elettroforesi,denaturati e trasferiti;il blot poi sondato con 1 DNA minisatellite marcato radio attivamente e le 3 bande sono rilevate con autoradiografia e phosphorimaging. Negli animali vi sono + frammenti con la sequenza minisatellite capace di reagire con la sonda.

Impiego forenze del DNA fingerprinting Nonostante lesistenza di profili diversi,alcune bande sono ereditate in maniera mendeliana,e per questo le impronte digitali del DNA sono usate per stabilire relazioni di parentela o lidentificazione a partire dalle cellule. Siccome queste impronte contengono innumerevoli bande,che possono anche migrare insieme,sono state sviluppate sonde che ibridano in 1 singolo locus(e non in + loci) di DNA che varia negli individui;in questo modo ogni sonda fornisce un profilo caratterizzato da poche bande. Tale fenomeno detto di polimorfismo di frammenti di restrizione(RFLP) ha luogo perch il profilo delle dimensioni di un frammento di restrizione in una regione cambia negli individui. Occorrono + sonde per fornire una serie di bande diverse per ottenere una tipizzazione ottimale. Occorrono poche gocce di sangue o liquido seminale per procedere ai test e nel caso in cui i frammenti di DNA siano pochi,sono amplificati con la PCR. Ibridazione in situ Le sonde radioattive possono essere ibridate con i cromosomi per rilevare in quale di esso sia localizzato il gene dinteresse. Tale ibridazione prevede lestrazione dei cromosomi da una cellula e la denaturazione parziale del DNA per creare regioni a singolo filamento che possano ibridare con una sonda radioattiva. Con una pellicola ai raggi X possibile visualizzare il sito di appaiamento dopo colorazione e reazione con la sonda;la colorazione permette di identificare i cromosomi mentre larea scura dellemulsione fotografata localizza la posizione della sonda marcata e del gene ad essa collegata. Ibridazione in situ per fluorescenza (FISH) La sonda viene marcata con di-nitrofenolo,pu essere rilevato con un anticorpo fluorescente e i cromosomi sono colorati per contrasto con ioduro di propidio cos da dare fluorescenza rossa(per localizzare il gene della glicogeno fosforilasi muscolare sul #11). Western Blot-Immunoblot Consente di quantizzare le proteine in miscele complesse tramite lelettroforesi. Si usano,come sonde,degli anticorpi specifici che si legano alla proteina ricercata:degli anticorpi secondari marcati o proteine A,poi,sono usati per marcare la banda con la proteina gi legata allanticorpo iniziale. Non si usano AB primari perch occorrerebbe marcarli singolarmente ed + economico se si usano AB primari non marcati,riconosciuti da AB secondari marcati. Sequenziamento del di DNA di Sanger Prevedeva il clonaggio del DNA in un vettore per ottenere il DNA come singolo filamento,mentre oggi possibile riscaldare un doppio filamento di DNA per ottenerne di singoli da sequenziare. Il singolo filamento poi ibridato con un innesco oligonucleotidico di circa 20 nucleotidi,in grado di ibridare con una sequenza adiacente alla regione del vettore contenente siti di restrizione multipli e con lestremit 3 rivolte verso linserto della regione. Linnesco poi allungato con il frammento Klenow della DNA polimerasi e si produce un DNA complementare a quello dellinserto. Sanger esegu queste reazioni di sintesi in 4 tubi di reazione distinti,ognuno con un terminatore di catena differente:il terminatore un dideossinucletoide come il dideossiATP(ddATP) in posizione 2 e 3 e perci incapace di creare un legame fosfodiestere col gruppo 3ossidrilico;quando viene aggiunto un terminatore,la sintesi del DNA si arresta. Ogni tubo ha un dideossinucleotide diverso:ddATP nel tubo1 in cui la catena terminata in corrispondenza delle A;ddCTP nel tubo2 ecc.; in tutti i tubi poi aggiunto dATP radioattivo per rendere radioattivi i DNA prodotti. Ogni tubo avr cos frammenti di lunghezze diversi : i frammenti nel 1 terminano con A,nel 2 con C,nel 3 con G e nel 4 con T. Poi le 4 miscele sono sottoposte ad elettroforesi in corsie parallele su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti per ottenere DNA a singolo filamento. La sequenza letta cominciando dalla 1 banda sul fondo e inizialmente ci si ritrova a leggere la sequenza di una parte della regione di clonaggio multiplo del vettore e dopo poco le catene del DNA si allungano fin dentro linserto,una regione sconosciuta. Sequenziamento automatizzato del DNA Utilizza dideossinucleotidi(inneschi) marcati con molecole fluorescenti diverse in modo che i prodotti di ognuno dei 4 tubi emetteranno radiazioni fluorescenti di colore diverso. Quando le reazioni di allungamento e terminazione della catena terminano,le 4 reazioni sono mescolate e sottoposte ad elettroforesi nella stessa corsia. Sulla parte bassa del gel c un analizzatore che eccita gli oligonucleotidi fluorescenti con un raggio laser quando gli passano davanti. Un computer rileva elettronicamente i colori della luce fluorescente: blu per C;verde per A;arancione per G;rosso per T. Mutagenesi sito diretta Le proteine possono essere modificate a livello delle basi di un gene per poi studiarne gli effetti sulla sua funzione. Se si vuole cambiare un solo codone in un gene clonato che codifica una sequenza di Aa che include una tirosina (TAC) contente un gruppo fenolico, possibile sostituire questo codone con uno codificante la fenillalanina(TTC),che possiede un gruppo fenile e non fenolico. Tale mutazione si ottiene con la PCR: si prende il codone TAC per la tirosina nel gene clonato,con una sequenza 5-GATC-3metilata che funge da riconoscimento per lenzima di restrizione DpnI(la sequenza si ripete ogni 250 coppie di basi. Prima di tutto bisogna denaturare il DNA scaldandolo,poi far appaiare il DNA a singolo filamento con inneschi oligonucleotidici mutagenici e infine operare pochi cicli di PCR per amplificare il DNA ed incorporare il cambiamento. Per evitare rischi di mutazioni si usa una DNA polimerasi nota come Pfu,estratta da un archeobatterio presente in acque calde,in grado di rileggere il DNA che sintetizza. In seguito si separa il DNA mutante da quello selvatico(che pu anche essere distrutto) e DpnI taglia i siti metilati GATC del DNA selvatico impedendogli di trasformare le cellule di E.coli e di produrre cloni. MAPPARE E QUANTIFICARE I TRASCRITTI

Northern Blot Simile alla southern,solo che coinvolge lRNA e il suo clone cDNA. E utile per scoprire quanto,un gene presente in esso,sia espresso nei tessuti di un organismo:si raccoglie lRNA da questi tessuti,si sottopone ad elettroforesi con agarosio e si ibrida con una sonda di cDNA radioattivo complementare ad un dato mRNA,e poi visibile in bande. Tali bande,di RNA sono evidenziabili se accanto agli RNA estratti si fanno correre per elettroforesi anche dei marcatori per RNA. Col northern si hanno info sulla quantit di trascritto del gene,e > la quantit di RNA di una banda,> la quantit di sonda radioattiva da utilizzare e pi scura sar la banda di cui possibile misurarla luce con un sensitometro,o la radioattivit con phosph. Mappatura S1 Serve a localizzare le estremit 5 e 3 degli RNA ,e quantificare la presenza di RNA in un dato momento. Per farlo si marca una sonda di DNA a singolo filamento che ibrida il trascritto dinteresse(e non marca il trascritto)e che si estende oltre le sue estremit;in seguito si usa la nucleasi S1 per degradare DNA e RNA a singolo filamento;quindi il trascritto protegge parte della sonda dalla degradazione. Nellestremit 5 viene eliminato un gruppo fosfato con una fosfatasi alcalina e ne aggiunto uno arcato contenente 32P,e in seguito la polinucleotide chinasi lo trasferisce dallATP al gruppo idrossilico 5 sullestremit del filamento di DNA. Sullestremit 3 la marcatura differisce perch la chinasi non fosforila i gruppi ossidrilici sul 3 e perci si utilizza il riempimento dellestremit per marcarla,ossia quando il DNA tagliato con un enzima di restrizione che lascia unestremit 3ridotta,questa estesa,con nucleotidi marcati,in vitro fino a pareggiare con la 5. La mappatura pu anche determinare la [RNA]: se la sonda in eccesso rispetto al trascritto e sapendo che lintensit della banda sullautoradiografia proporzionale alla concentrazione del trascritto che ha prodotto le sonde,bisogner solo individuare la banda che corrisponde al trascritto dinteresse. Con la Mappatura con RNasi la sonda costituita da RNA e non pu essere degradata dalla nucleasi,bens dallRNasi,e il vantaggio dato dal fatto che sulla sonda si pu includere un nucleotide marcato alla reazione di trascrizione in vitro. Estensione dellinnesco(Primer extension) La nucleasi S1 presenta per dei problemi perch tende a degradare parzialmente le estremit dellibrido RNA-DNA e le regioni A-T,che si denaturano;inoltre non sempre digerisce le regioni a singolo filamento,aumentando le dimensioni del trascritto. La primer extension per + accurata nel determinare lestremit 5(solo) di un trascritto con la risoluzione di un nucleotide. Innanzitutto si assiste alla trascrizione spontanea in vivo,poi sei separa lRNA cellulare con il trascritto contenente la 5 da mappare e si ibrida lRNA con un oligonucleotide/innesco marcato di almento12-18 nucleotidi. La specificit data dalla complementariet tra innesco e trascritto nella mappatura,e tra sonda e trascritto. Una trascrittasi inversa estende linnesco oligonucleotidico fino allestremit 5 del trascritto,producendo una copia in DNA a partire da RNA(ruolo opposto alla trascrizione). In seguito si denatura librido RNA-DNA e si fa correre il DNA marcato con frammenti di lunghezza nota,simile a quelli usasi per il sequenziamento del DNA. E utile usare lo stesso innesco adoperato nellallungamento per effettuare reazioni di sequenziamento con dideossinucleotidi e uno stampo di DNA clonato;in seguito i prodotti del sequenziamento sono usati come marcatori. La primer extension rende possibile stimare la concentrazione di trascritto poich > la sua [ ],e >sar il numero di molecole innesco che ibrideranno e produrranno pi trascritto inverso.e > il numero di questi trascritti,pi scura risulter la banda sullautoradiografia. MISURA DEL TASSO DI TRASCRIZIONE IN VIVO Trascrizione di geni reporter Sono indicatori posti sotto il controllo di un promotore specifico che producono un determinato prodotto da misurare. Per studiare un promotore eucaristico si inducono mutazioni nella regione di DNA in cui contenuto,e in seguito il DNA mutato inserito nelle cellule per misurare gli effetti delle mutazioni sullattivit del promotore(con geni reporter). Il + popolare di questi geni il lacZ che produce betagalattosidasi misurata con il substrato X-gal che,in presenza di beta,diventa blu. Altro gene quello batterico cat che codifica lenzima CAT/cloramfenicolo acetil trasferasi: la crescita della > parte dei batteri inibita dallantibiotico cloramfenicolo,che blocca la sintesi proteica;gli eucarioti invece non sono sensibili e non hanno il CAT,la cui attivit paria zero. Si pu perci introdurre un gene cat nelle cellule,controllato da un promotore eucaristico e misurare lattivit di CAT indotta dal gene. Per la misura,lestratto delle cellule transfettate mescolato con cloramfenicolo radioattivo e acetil-CoA(donatore di gruppi acetile) e in seguito si usa la cromatografia su strato sottile per separare lantibiotico dai prodotti acetilati,la cui [ ] sar proporzionale allattivit di CAT e del promotore. Lo strato sottile usato un materiale assorbente(silica gel)attaccato ad un supporto di plastica;le sostanze da separare sono depositate vicino al fondo della piastra a strato sottile e si pone la lastra in una camera con 1 strato superficiale si solventi sul fondo. Il solvente impregnato nello strato sottile fluir verso lalto facendo muovere anche le sostanze,la cui mobilit dipender dalle affinit relative per il materiale assorbente e il solvente. Un 3 gene quello per la luciferasi di lucciola che,reagendo con ATP e luciferina,converte questultima in un composto chemio luminescente che emette luce,individuato con pellicola ai raggi X o con contatore a scintillazione. I prodotti di questi geni sono il risultato della trascrizione e della traduzione: in condizioni normali se manipoliamo il promotore,che si trova fuori dalla regione codificante,il tasso di traduzione non varia tra le sequenze di DNA cosi come non varia la struttura dellmRNA. Si pu per

modificare la regione di un gene trascritto poi in mRNA ,e in seguito usare un gene reporter per determinarne gli effetti sulla traduzione. Misura dellaccumulo di proteine in vivo Si pu misurare lattivit dei geni controllando laccumulo dei suoi prodotti,ossia le proteine. Limmunoprecipitazione prevede la marcatura delle cellule contenenti proteine con metionina radioattiva;le cellule marcate sono poi omogeneizzate e una data proteina marcata fatta precipitare tramite un AB diretto contro essa,e un AB secondario/Proteina A legato a biglie di resina che possono essere sedimentate in centrifuga a bassa velocit. La proteina poi sottoposta ad elettroforesi ed individuata tramite autoradiografia,e nonostante lAB sia presente anche nel precipitato,non sar individuato perch non marcato. Pi la banda sar marcata e + la proteina sar stata accumulata in vivo. STUDIO DELLE INTERAZIONI DNA-PROTEINE Legame su filtro Filtri di membrana di nitrocellulosa possono legare DNA a singolo filamento e DNA a doppio filamento solo se associato a proteine. Si pu perci marcare un DNA a doppio filamento in una soluzione con una proteina capace di legarsi ad essa,e si trover perci anche un tasso di radioattivit legato al filtro,presente sottoforma di prodotti marcatori. Saggio di ritardo/shift della mobilit su gel Basato sul fatto che un piccolo frammento di DNA,se sottoposto a elettroforesi su gel,ha una velocit di migrazione > se non legato a proteine;quindi si pu marcare un frammento a doppio filamento,miscelarlo con una proteina e sottoporlo ad elettroforesi. La posizione del materiale marcato sar poi determinato con lautoradiografia su gel. Se un frammento di DNA legato a 2 proteine la sua mobilit ulteriormente ridotta(super-shift);la 2 proteina pu legarsi al DNA o alla 1 proteina. Footprinting con DNasi Basato sul fatto che una proteina si lega al DNA,coprendo il sito di legame e proteggendolo dallattacco della DNasi. Occorre perci innanzitutto marcare il DNA allestremit(solo su 1 filamento),poi si lega la proteina al DNA e si tratta il complesso con DNasi in condizioni blande cosi da provocare,mediamente,un taglio in ogni molecola di DNA. La proteina poi separata dal DNA e i suoi filamenti sono fatti correre su gel di poliacrilammide con dei marcatori;i frammenti,formatisi dallestremit non marcata,non saranno individuati. Il footprint rappresenta la regione di DNA protetta dalla proteina e rivela perci dove essa si lega. CAPITOLO 9 - RNA POLIMERASI,PROMOTORI E FATTORI GENERALI DELLA TRASCRIZIONE IN EUCARIOTI MOLTEPLICITA DELLE RNA-POLIMERASI EUCARIOTICHE I geni ribosomiali differiscono da quelli nucleari per una diversa composizione di basi,per linsolita ripetizione e per il fatto che si trovano nel nucleolo e non nel nucleoplasma. Ruoli delle 3 RNA polimerasi nucleari Con la cromatografia a scambio ionico su DEAE-Sephadex si scopr che negli eucarioti vi sono 3 RNA polimerasi con diversa funzione,denominate in base allordine di fuoriuscita dei picchi (I,II,III): la polimerasi I si trova nel nucleolo,e II e III nel nucleoplasma. La polimerasi I sintetizza il precursore dellrRNA,con un coefficiente di sedimentazione di 45S poi processato negli rRNA 28S,18S,5.8S maturi; la polimerasi II sintetizza gli hnRNA e gli snRNA; la polimerasi IIIsintetizza i precursori per i tRNA,lrRNA 5S e lsnRNA U6 che partecipa allo splicing dellRNA e lRNA 7SL che coinvolto nel riconoscimento del peptide di segnalazione nella sintesi di proteine di secrezione. L-Amanitina,a [ ] basse,inibisce la pol II e a [ ] estremamente elevate inibisce la pol III. Struttura e subunit dellRNA polimerasi La pol II costituita da 12 subunit; le 3 polimerasi hanno strutture complesse ( + di quelle batteriche) e contengono 2 subunit grandi e svariate piccole in relazione con le polimerasi procarioti che. Richard e Young con il metodo dellaggiunta dellepitopo legarono 1 epitopo estraneo a una sub unit della pol II di lievito (Rpb3) risalendo al suo gene che fu poi inserito in cellule di lievito prive di un gene funzionale per Rpb3 e in seguito le proteine furono marcate con un AB diretto contro lepitopo estraneo per purificare lenzima. In seguito ad immunoprecipitazione,con lelettroforesi SDS-PAGE si separarono i polipeptidi marcati delle proteine purificate,poi visualizzate con autoradiografia. E una purificazione a singolo passaggio che produce una pol II pura formata da 10 subunit divise in 3 gruppi : 1) subunit centrali : Rpb1,2,3 utili allattivit enzimatica e omologhe alle RNA pol batteriche;Rpb1 lega il dna,Rpb2 si trova vicino il sito attivo della pol II e Rpb3 ha una sequenza di 20 Aa simile alla sub unit di E.coli. 2) subunit comuni : Rpb 5,6,8,10,12 presenti in tutte e 3 le polimerasi di lievito. 3) subunit non essenziali per lallungamento : Rpb 4,7 possono essere assenti (7 in piccole quantit) e non inficiano la loro attivit. Lincorporazione di metionina e fosfato marcati nella pol II di lievito permette una stima stechiometrica delle 12 subunit; 2 subunit sono fortemente fosforilate e una leggermente. Eterogeneit della subunit Rpb1 Nello studio delleterogeneit della subunit grande della pol II si osservarono in essa 3 polipeptidi nella parte alta del gel elettroforetico (IIo,IIa,Iib) presenti in quantit ridotte rispetto a IIc e collegati tra loro. Il sequenziamento del gene di lievito RPB1 predice un prodotto polipeptidico di 210 kd (stesso PM di IIc) che risulta essere il genitore degli altri polipeptidi. Inoltre la subunit IIb priva di un tratto ripetuto di 7 Aa,presente allestremit carbossilica di Ia e nota comeDominio carbossi-terminale CTD. Un

enzima proteolitico taglia il CTD in vitro( non in vivo) convertendo IIa in IIb : infatti CTD non puo ripiegarsi in una struttura compatta,bens distesa e altamente accessibile agli enzimi proteolitici. La sub unit IIo pi grande di IIa e puo essere fosforilata sui gruppi ossidrilici dei residui di Ser-Treonina-Tir del CTD;IIo puo diventare IIa se incubata con una fosfatasi. Siccome le cellule contengono 2 diverse forme della subunit Rpb1 (IIo e IIa),esistono 2 diverse forme di pol II,ognuna con una sub unit. Tali polimerasi sono lRNA pol IIO che svolge lallungamento,eIIA (fosforilata) che lega inizialmente il promotore; lRNA pol IIB la forma non fisiologica dellenzima. Struttura tridimensionale dellRNA polimerasi II La struttura dellRNA pol II di lievito ottenuta tramite cristallografia ai raggi x: si cosi scoperto che in essa presente una profonda fessura legante il DNA,e il cui sito attivo contiene 2 ioni Mg++ ( uno dei quali legato al sito) alla base della fessura che assume la forma di una mascella; la parte superiore contiene Rpb1 e 9,e quella inferiore ha Rpb5. Lo stampo di DNA (acido) giace nella fessura dellenzima,e il legame favorito dagli Aa basici che rivestono la fessura. MANCA PAGINA 306 Struttura tridimensionale della RNA polimerasi II in un complesso di allungamento Kornberg e co. indussero la pol II a iniziare da sola senza lausilio di fattori di trascrizione e scoprirono che,mentre nella polimerasi isolata la morsa era aperta per permettere laccesso al sito attivo (allestremit del poro 1),nel complesso di allungamento invece la morsa chiusa sullo stampo di DNA e sul prodotto di RNA. In questo modo lenzima processivo,capace di trascrivere 1 gene intero senza staccarsi e terminare la trascrizione prematuramente. Lasse dellibrido DNA-RNA di 9 paia di basi forma una ripiegatura con il DNA a doppio filamento a valle da trascrivere,che forzato dalla chiusura della morsa,e facilitata dal DNA a singolo filamento tra ibrido e DNA. Lo ione Mg++ A (legato) nel complesso di allungamento lega il fosfato che lega gli ultimi 2 nt aggiunti allRNA nascente,mentre lo ione B si allontana con lultimo nt aggiunto allRNA (infatti il 2 ione aggiunto ogni volta dal nt che legato nella catena in crescita). I nt entrano dal poro 1 dal quale estrusa lestremit 3 dellRNA quando la polimerasi torna indietro nel momento in cui sono aggiunti nt sbagliati che richiedono poi lausilio di TFIIS. Nella morsa sono poi presenti 3 anse: iltimone che inizia la dissociazione dellibrido RNADNA;il coperchio che mantiene tale dissociazione e lacerniera che inizia la dissociazione dello stampo di DNA. La fessura attraversata,vicino al sito attivo,da unelica ponte che oscilla tra una conformazione dritta e una piegata (vicino i residui di treonina 831-alanina832): quando dritta,il sito attivo aperto per laggiunta dei nt che entrano attraverso il poro 1 dellenzima,che riempie lo spazio tra lestremit 3 dellRNA e lelica. Durante la traslocazione invece lelica si ripiega e in seguito riapre lestremit 3 per far procedere la trascrizione. Il legame tra -Amantina e il proprio sito di legame (vicino allelica con la quale crea legami H) impedisce la piegatura dellelica e blocca la sintesi dellRNA DOPO la formazione del legame fosfodiesterico. Struttura tridimensionale dellRNA pol II nello stato di post-traslocazione Siccome allestremit 3 la pol doveva retrocedere poich non aveva 1 sito disponibile per accettare il nt successivo,e alla 5 librido RNA-DNA non avrebbe potuto dissociarsi,Kornberg e co. agirono in questo modo : legarono alla polimerasi un oligont 15-mer di DNA e 9-mer complementare di RNA,generando un complesso sintetico di trascrizione,e indussero la terminazione della catena incorporando una molecola di 3-deossiadenosina (impedisce aggiunta dei nt). Con la cristallografia si not che alla 3 dellRNA vi era un sito libero (poi occupato dal nt successivo)e che RNA e DNA erano separati oltre la coppia basi-8,e fu perci chiaro che librido RNA-DNA si estende per 8 bp. Lansa coperchio della sub unit Rbp1 della pol II separa i filamenti di RNA e DNA interagendo con le basi 8,9,10 nellRNA grazie al timone di Rbp1 che interagisce con 9 e 10 per mantenere i filamenti separati;lansa a forcina 1 di Rpb2 invece interagisce con 5,6 e 7 dellRNA nellibrido impedendo aperture troppo estese del doppio filamento e mantenendo librido attraverso le 8 coppie di basi. Base strutturale della selezione dei nucleotidi Con i dati di diffrazione ai raggi X,K. scopr che nella porzione catalitica della pol II esistono 2 distinti siti di legame per i nt: il sito A in cui si forma il legame fosfodiesterico e il sito E in cui i nt si legano prima di entrare nel sito A. Nel sito E i nt ruotano e ci influenza la loro specificit di zucchero (ribont rispetto a deossiribont) siccome nessuna catena laterale degli Aa della polimerasi si avvicina al gruppo 2OH del ribont nel stio A e E,per formare legami H che potrebbero giustificare la specificit per i ribont. Ruolo di Rpb4 e Rpb7 Dalla struttura cristallografica a 12 subunit dellRNA pol II si scoperto che quando sono presenti Rpb4 e Rpb7 (emergono dal lato dellenzima) la morsa forzata nella forma chiusa,mentre se sono assenti la morsa puo aprirsi. Siccome linizio della trascrizione richiede lenzima di 12 subunit con la morsa chiusa,sembra che il DNA del promotore di leghi alla superficie esterna dellenzima denaturandosi,facendo discendere il filamento stampo nel sito attivo. Rpb4/7 influenzando inoltre linterazione con i fattori generali di trascrizione,estendendo la regione di attacco della polimerasi e rendendo + facile il legame di alcuni fattori e linizio della trascrizione.

PROMOTORI Le 3 polimerasi eucariotiche riconoscono promotori diversi :

Promotori di classe II Formati dal promotore centrale e da elementi a monte dotati di differenze funzionali. Il promotore centrale puo contenere TATA-box in posizione 25,un elemento di riconoscimento per TFIIB(BRE) a monte del box,un iniziatore (Inr)sul sito dinizio della trascrizione e un elemento a valle (DIE). Il promotore centrale riconosciuto da fattori generali di trascrizione che si associano alla polimerasi per formare il complesso di preinizio della > parte dei promotori,mentre gli elementi a monte sono riconosciuti da fattori che operano in un gruppo ristretto di promotori. La TATA-box una sequenza di basi contenente la sequenza consensus TATAAA nel filamento non stampo che si trova a 25-30 coppie di basi a monte del sito dinizio,invece che a 10 come quella procariotica. Tali sequenze possono mancare ingeni ubiquitari attivi in tutte le cellule (per sintesi di nt),che contengono invece le GC-box,e in geni omeotici che controllano lo sviluppo del moscerino della frutta,o in geni del sistema immunitario nei mammiferi. I geni specializzati che codificano per proteine esclusive di taluni tipi di cellule,hanno invece le TATA-box,il cui ruolo essenziale nella determinazione del punto dinizio; se fosse rimosso il box,la trascrizione inizierebbe in + siti,senza diminuire lefficienza ( a parte alcuni casi). Lattivit del promotore dipende dallassemblaggio di vari fattori di trascrizione che creano con la pol II un sito di preinizio che fa partire la trascrizione: nei promotori di classe II la TATA funge da sito dinizio dellassemblaggio dei fattori proteici; il 1 a legarsi TFIID grazie a TBP (proteina legante il box),assente in promotori privi di TATA-box. Alcuni promotori di classe II hanno sequenze conservate intorno ai siti dinizio della trascrizione,note comeiniziatori (Inr). Nella Drosophila vi sono elementi a valle (DPE),30 coppie di basi a valle del sito dinizio,che compensano la mancanza di T-box: la loro somiglianza sta nella capacit di legare il fattore TFIID;TFIIB si legame,come TFIID alla pol II grazie a elementi di riconoscimento (BRE),a monte della T.box,per creare un complesso di preinizio. Elementi a monte Si riscontrano a monte dei promotori di classe II,e legano fattori di trascrizione gene specifici: le GC-box sono a monte della T-box,sono indipendenti dallorientamento (poich ruotano di 180,e ciononostante funzionano)e legano il fattore di trascrizione Sp1. Le CCAAT-box legano il fattore CTF. Tali elementi non sono indipendenti dalla posizione poich,se allontanati dalla propria TATA-box,perdono la capacit di stimolare la trascrizione. Promotori di classe I Quasi tutte le specie hanno un solo tipo di gene riconosciuto dalla pol I,ossia il gene precursore dellrRNA( ad eccezione del tripanosoma) presente in centinaia di copie identiche in ogni cellula. I promotori di classe I hanno una sequenza conservata,liniziatore ricco in AT (rINR)che circonda il sito dinizio della trascrizione. Tale promotore presenta 2 regioni: lelemento centraleallinizio della trascrizione e lelemento promotore a monte (UPE) 100 bp a monte,e la spaziatura tra loro molto importante. Promotori di classe III Le RNA pol III trascrivono geni codificanti piccoli RNA e sono distinti in : classici (rRNA 5S,tRNA,RNA.VA di Adenovirus) con promotori allinterno dei geni,e non classici(RNA7SL,7SK e snRNA U6) con promotori simili a quelli dl classe II,ossia nella regione fiancheggiante lestremit 5 del gene. Geni classici Il promotore dellrRNA 5S localizzato allinterno del gene che controlla ed costituito da 3 regioni: boxA,elemento intermedio e boxC. Il promotore del gene per il tRNA suddiviso in boxA e boxB. Esistono perci diversi tipi di promotori di classe III: nel tipo I vi sono i geni del 5S;nel tipo II i promotori simili a quelli del tRNA e dellRNA-VA;nel tipo III i promotori non classici che controllano elementi ristretti alla regione fiancheggiante lestremit 5 del gene. Il promotore 7SL umano possiede sia elementi interni che esterni utili. Geni non classici di classe III con promotori simili a quelli della pol II Nei geni dellRNA7SL la regione fiancheggiante il 5 serviva per un alto livello di trascrizione e per questo si cap che lelemento di DNA pi importante si trovasse a monte di questo gene. Siccome per la trascrizione avveniva in geni mutanti privi della regione fiancheggiante il 5,doveva esistere un promotore interno debole. infatti i pseudo geni di 7SL (copie non funzionali),cosi come le Alu,sono poco trascritte in vivo in quanto prive dellelemento a monte richiesto per un alto livello di trascrizione. il gene dellRNA 7SK non ha sequenze interne simili al promotore III,bens contiene una regione fiancheggiante il 5 omologa a quello di 7SL e per questo fu promossa lidea di 1 promotore esterno. ENHANCER E SILENZIATORI La trascrizione influenzata da elementi di DNA agenti in cis e non facenti parte del promotore . Glienhancer,come la ripetizione di 72 bp,stimolano la trascrizione anche se invertiti o spostati sul lato opposto del genoma,e per questo sono indipendenti per orientamento e posizione. Agiscono grazie adattivatori e fattori generali di trascrizione che creano sul promotore un complesso di preinizio,e possono trovarsi a monte dei promotori o allinterno. I silenziatori inibiscono la trascrizione inducendo la croamtina ad avvolgersi a spirale in una forma condensata,inaccessibile e inattiva,impedendo la trascrizione dei geni adiacenti. Uno stesso elemento di DNA puo fungere sia da enhancer che da silenziatore,a seconda delle proteine che vi si legano. FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI

Si combinano con le RNA pol per formare un complesso di preinizio che comincia la trascrizione appena sono disponibili i nt,e che forma un complesso promotore aperto con il DNA denaturato nel sito dinizio della trascrizione (per permettere il legame della polimerasi). Fattori e complesso di preinizio di classe II Tale complesso contiene la pol II e 6 fattori: TFIIA,B,D,E,F,H che si legano in un preciso ordine:

Aggiungendo solo TFIID e A al DNA con il promotore tardivo > delladenovirus si formava un complesso DA; Se si aggiungeva TFIIB ,si formava il complesso DAB; Se si aggiungeva TFIIF,non si legava indipendentemente da DAB,e il complesso era simile a DAB,aveva perci bisogno della pol II; In seguito aggiunsero la polimerasi e apparvero 2 complessi che includevano anche TFIIF: DBPolF (che migra + veloce poich privo di A,che in vitro opzionale) e DABPolF che senza F perde la sua resa in quanto TFIIF e Pol II sono necessari insieme per tenere unito il complesso di preinizio. TFIID il 1 fattore a legarsi alla TATA-box e TFIIB serve per laggiunta di TFIIF e della polimerasi (in sua assenza si forma solo DA).TFIIE e H possono essere aggiunti a DBPolF producendo un complesso con < mobilit noto come DBPolFEH. Lordine di legame in vitro : TFIID(o TFIIA+ D)B,F+ Pol II,E,H. TFIID e A proteggono la TATA-box e anche il complesso DA protegge la TATA sul filamento non stampo; TFIIB forma DAB,copre la TATA,e rende il DNA + sensibile alla DNAsi,non coprendo per una regione molto grande. La Pol II,essendo grossa,copre unampia regione di DNA e insieme a TFIIF estende tale regione di altre 34 basi sul filamento non stampo. Struttura e funzione di TFIID un complesso proteico contenente: 1) TBP (proteine di 38 kd legante la TATA-box) = altamente conservata evolutivamente,presenta un dominio utile per legare la TATA,e costituito da 1 filamento C-terminale di 180 Aa,prevalentemente basici. TBP si lega al solco < delle TATA.e si comporta come una sella poggiata sul cavallo,che si allinea con lasse lungo del DNA. La parte inferiore della sella/TBP forza il solco < ad aprirsi (2 catene laterali di TBP si inseriscono tra le coppie di basi forzando il DNA ad incurvarsi) e piega la TATA secondo un angolo di 80. TBP altamente versatile e funziona sia con promotori contenenti la TATA che con quelli sprovvisti,fungendo da fattore universale,indipendente dal contenuto di TATA e di polimerasi. E coinvolta anche nella trascrizione degli Archea,il cui apparato trascrizionale simile a quello eucariotico. 2) Fattori associati a TBP(TAF)= Le funzioni + importanti dei TAF sono linterazione con il promotore e i fattori di trascrizione gene-specifici. I TAF legati a TBP estendono il legame di TFIID oltre la TATA-box in alcuni promotori,proteggendo 20 coppie di basi intorno a TATA;TFIID invece protegge una regione di 36 coppie di basi dopo il sito dinizio. In tal modo i TAF e TFIID contattano liniziatore e gli elementi a valle dei promotori. I TAF aiutano TBP a facilitare la trascrizione con iniziatori e DPE:in particolare sono TAF 250 e TAF 150 a legare liniziatore e i DPE. La componente TBP di TFIID riconosce i promotori di classe II contenenti la TATA-box,e i promotori privi di essa riescono comunque a legare TBP grazie ad altri elementi (Inr e DPE),oppure elementi a monte che legano fattori di trascrizione gene-specifici che interagiscono con le TAF per ancorare TFIID al promotore. Lattivatore Sp1 si lega agli elementi a monte (GC-box) interagendo con TAF-130 umana,o 110 di lievito. Le TAF stimolano inoltre la trascrizione grazie agli attivatori. alcuni fattori in TFIID servono per linterazione con proteine agenti a monte (come Sp1) non presenti in TBP e noti come coattiva tori. Struttura e funzione di TFIIH Elultimo fattore ad associarsi al complesso di preinizio e svolge 2 funzioni: fosforilazione del CTD delRNA pol II e formazione della bolla di trascrizione. 1)Fosforilazione del CTD dellRNA Pol II = LRNA Pol II esiste in forme :IIA (non fosforilata) che si unisce al complesso di preinizio e IIO che posside molti Aa fosforilati nel dominio C-terminale CTD,che svolge lallungamento della catena di RNA. La fosforilazione avviene perci tra il momento in cui la pol II si unisce al complesso di preinizio,e il momento in cui si libera dal promotore,e potrebbe essere levento che permette di passare dalla fase dinizio a quella di allungamento. Infatti il CTD non fosforilato nella Pol IIA si lega + saldamente a TBP,rispetto a IIO e per questo la fosforilazione del CTD potrebbe rompere il legame della Pol con TBP sul promotore,permettendo linizio dellallungamento trascrizionale. Ciononostante in vitro la trascrizione puo procedere senza la fosforilazione del CTD. TFIIH fosforila la pol II solo se legato al DNA e fornisce lattivit chinasica utile per la fosforilazione della RNA Pol II,e gli altri fattori possono stimolare la sua capacit fosforilante,in particolare TFIIE. Il CTD della sub unit IIa il sito di fosforilazione perch la pol IIB,priva del CTD,non fosforilata dal complesso TFIIDBFEH. Lattivit chinasica di TFIIH aggiunge gruppi fosfato sulle serine in posizione 2 e 5 del CTD della pol II,per dare inizio alal trascrizione,e nella fase di allungamento la fosforilazione sulla Ser-5 rimossa da una fosfatasi. Se manca anche la fosforilazione della Ser-2,la polimerasi si arresta finch non rifosforilata dalla chinasi P-TEFb(in lievito).

2)Formazione della bolla di trascrizione = TFIIH contiene 9 subunit in 2 complessi:un complesso chinasico di 4 subunit e uno di 5 subunit,contenente 2 attivit separate DNA elicasi/ATPasi,una delle quali contenuta nella sub unit + grande di TFIIH,essenziale per la vitalit e la trascrizione. Infatti se nel lievito il gene di TFIIH (RAD 25) muta,lorganismo non sopravvive. Lattivit DNA elicasica richiesta nel rilascio della polimerasi,dal promotore,che fa iniziare la trascrizione e segna il confine tra inizio e allungamento. Per capire se TFIIE e H fossero richieste nellinizio o nel rilascio della polimerasi,fu escogitato un saggio che misurava la produzione dei trascritti abortivi (trinucleotidi). Se compaiono trascritti abortivi,allora si forma un complesso di inizio di trascrizione produttivo,il DNA si denaturato localmente ed stato sintetizzato il 1 legame fosfodiesterico. Nella produzione dei trascritti non servivano F e H,bens erano utili TBP,B,F e la PolII;ciononostante TFIIH richiesta per la denaturazione completa del DNA a livello dei promotori. Goodrich e Tijan saggiarono lallungamento misurando leffetto di E e H: lasciarono fuori il nt della 17 posizione e permisero linizio della trascrizione (senza E e H)su uno stampo superavvolto,che prosegu fino al 16 nt. In seguito linea rizzarono lo stampo tagliandolo con un enzima di restrizione e aggiunsero ATP per far continuare la trascrizione in presenza/assenza di E e H e siccome E e H non avevano effetto sullallungamento,n sullinizio,allora essi erano implicati nel passaggio di liberazione del promotore. Complesso del Mediatore e loloenzima della polimerasi II Le proteine del complesso delMediatore rappresentano un fattore generale di trascrizione che prende parte ai complessi di preinizio di classe II,e sono richiesti quando la trascrizione attivata. E presente in lievito (20Aa) e nei mammiferi (+ complessa) e forse tutti i complessi di preinizio di classe II si assemblano legando al promotore unoloenzima dellRNA pol II contenente molti polipeptidi + le sub unit della polimerasi,tranne TFIIE e TBP. Fattore di allungamento TFIIS Gli eucarioti controllano la trascrizione allinizio e durante lallungamento (nei geni di classe II)ed essenziale fu la scoperta del fattore S,che stimola lallungamento della trascrizione in vitro e la sintesi di RNA,ma non linizio. Essenzialmente TFIIS agisce limitando le pause delle polimerasi che,non trascrivendo a velocit costante,si fermano talvolta prima di riprendere la trascrizione. Le interruzioni avvengono in siti di pausa in cui librido RNA-DNA destabilizzato,facendo retrocedere la polimerasi ed estrudendo la 3 dellRNA nascente in un poro dellenzima. Se la polimerasi retrocede di molti nt dal sito di pausa,allora occorre TFIIS che risolve questo blocco della trascrizione. In vitro possibile sottoporre i trascritti ad elettroforesi,trovando bande + corte dei trascritti completi : siccome TFIIS riduce la comparsa dei trascritti corti,le pause della polimerasi sono minimizzate. La RNA Pol II ha una debole attivit RNasica intrinseca attivata da TFIIS quando la polimerasi,retrocedendo,fa fuoriuscire la 3 dal sito attivo. Siccome assente un terminale nucleotidico al 3 da estendere,TFIIS attiva lRNasi che taglia la porzione sporgente dellRNA e genera una nuova estremit 3 nel sito attivo dellenzima. TFIIS corregge anche i trascritti stimolando la RNasi a rimuovere i nt incorporati erroneamente;in questo modo la polimerasi indietreggia,estrude la 3 allesterno della polimerasi bloccando la trascrizione e TFIIS attiva la RNasi facendo riprendere la trascrizione. Ruolo di TBP Nei geni non classici privi di blocchi A o Ba cui si lega TFIIIC,TBP si lega alla TATA-box ancorando TFIIIB al suo sito di legame a monte;nei geni classici della pol III,privi di TATA,agisce TFIIIB contenente 3 subunit: 1 TBP e 2 TAF. Nella trascrizione dei geni di tRNA,rRNA 5S e snRNA U6 essenziale TRFI e non TBP,e perci la trascrizione da parte della pol III nel moscerino della frutta uneccezione alla generalit della dipendenza da TBP. Nelle 3 polimerasi lassemblaggio di un complesso di preinizio inizia con un fattore di assemblaggio che riconosce un sito di legame specifico nel promotore e che recluta gli altri componenti. Nei promotori di classe II dotati di TATA il fattore dassemblaggio TBP che ha il suo sito di legame nella TATA (anche per promotori di classe III);nei promotori di classe I il fattore UBF che si lega allelemento UPE,attirando SL1 che contiene TBP nellelemento centrale. Anche se TBP non il 1 a legarsi, importante nellorganizzare la costruzione del complesso ed inoltre la sua specificit regolata dai TAF con cui si associa.

CAPITOLO 10 ATTIVATORI TRASCRIZIONALI NEGLI EUCARIOTI CATEGORIE DI ATTIVATORI Gli attivatori stimolano ed inibiscono la trascrizione da parte dellRNA polimerasi II ,e hanno strutture composte da 2 domini:dominio di legame al DNA e di attivazione trascrizionale,pi un 3 detto di dimerizzazione. Domini di legame al DNA Regione della proteina,con un ripiegamento indipendente specializzato nel legarsi al DNA. Esistono varie classi: 1) moduli contenenti zinco che usano 1 o + ioni zinco che creano una forma che permette allalfa elica di legarsi al solco > del DNA(comprendono dita di zinco,recettori nucleari e moduli con 2 ioni e 6 cisteine); 2)Omeodomini (HD) contenenti circa 60 Aa e che assomigliano,per struttura e funzione,ai

domini di legame al DNA elica-giro-elica di proteine procarioti che; 3)motivi bZIP e bHLHaltamente basici legati a 1 o entrambi i domini di dimerizzazione proteica e noti come motivi elica-ansa-elica(HLH) o cerniere di leucina. Domini di attivazione trascrizionale Domini acidici come quello dellattivatore di lievito GAL4,che ha 49 Aa di cui 11 sono acidici;domini ricchi di glutammina come quello dellattivatore Sp1 che possiede 2 domini con il 25% di glutammine;domini ricchi di proline come quello dellattivatore CTP che ha un dominio di 84 Aa,di cui 19 sono proline. STRUTTURE DEI MOTIVI DI LEGAME AL DNA DEGLI ATTIVATORI La > parte delle proteine che legano il DNA sono incapaci di legarlo in forma monometrica e hanno bisogno di dimerizzare. Dita di zinco Periodicit nella struttura di una proteina,costituita da 2 cisteine vicine,seguite,dopo 12Aa da 2 istidine anchesse vicine e complessate con 1 ione zinco. E la specifica sequenza amminoacidica delle dita a determinare la sequenza di DNA a cui la proteina si legher,come nel dito Xfin dellattivatore dei promotori di classe 2,in cui unalfa-elica ha diversi Aa basici in contatto con il DNA. La proteina di topo Zif 268 (appartenente alla classe TF3A) invece una proteina precoce immediata,ossia uno dei primi geni a essere attivato quando cellule quiescenti sono stimolate a dividersi. Questa proteina ha 3 dita di zinco adiacenti che si posizionano nel solco > della doppia elica di DNA. La parte sx di ogni dito un filamento alfa-elica connesso da unansa al filamento dx beta-antiparallelo;lo zinco si trova nel mezzo,coordinato da 2 istidine nellalfa elica e da 2 cisteine nel nastro beta. Le dita si collegano al DNA con la stessa geometria di contatto,secondo una curva che mima quella della doppia elica e il legame dovuto ad interazioni dirette Aa(alfa-elica)-base(solco > del DNA). La proteina GAL4 un attivatore di lievito che controlla i geni che regolano il metabolismo del galattosio:ogni gene ha un sito bersaglio per GAL4 a monte del sito di inizio di trascrizione,noto comeUASg/sequenze attivanti a monte,che forma un dimero con il GAL4. Non presenta dita di zinco,bens ogni monomero contiene un motivo di legame al DNA costituito da 6 cisteine e 2 ioni zinco (rapporto 1:3),che formano un gruppo bimetallo tiolato e ogni motivo possiede inoltre unalfa-elica che,ad unestremit, penetra nel DNA stabilendo interazioni specifiche;allaltra estremit invece unalfa-elica ha la funzione di dimerizzazione. Queste eliche formano spirali parallele,nella dimerizzazione interagendo con lalfa elica sullaltro monomero GAL4,e puntano verso il solco < del DNA. I recettori nucleari Interagiscono con molecole di segnalazione endocrine (steroidi e ormoni) che diffondono attraverso la membrana cellulare, Creano complessi ormone-recettore che fungono da attivatori legandosi agli enhancers( elementi di risposta allormone),e stimolando la trascrizione dei geni a loro associati. Questi attivatori devono perci legarsi ad 1 ormone specifico e possedere un dominio aggiuntivo,per attivare i rispettivi geni(ormoni sessuali,progesterone,glucocorticoidi,vitamina D). Irecettori di tipo 1 includono i recettori degli ormoni steroidei,rappresentati dal recettore dei glucocorticoidi e,in assenza del ligando ormonale,risiedono nel citoplasma,accoppiati ad una proteina. Quando il recettore si lega allormone,rilascia la proteina e migra nel nucleo legandosi allenhancer;il recettore dei glucocorticoidi complessato con la proteina da shock termico hsp90 e quando si lega al glucorticoide si dissocia da hsp;inoltre attiva nel nucleo i geni controllati dallenhancer noti comeGRE/elementi di risposta a glucorticoidi. Questi recettori ha un dominio di legame al DNA con 2 moduli contenenti zinco(ogni ione complessato con 4 cisteine): uno N-terminale possiede la > parte dei residui di legame al DNA (in unalfa-elica di riconoscimento) e laltro fornisce la superficie di interazione proteina-proteina per la formazione di un dimero. I recettori di tipo 2,ai quali appartiene il recettore dellormone tiroideo,si trovano nel nucleo dove formano dimeri con una proteina detta RXR/recettori X dellacido retinoico,il cui ligando lacido retinoico 9 cis. Si possono legare a siti bersaglio anche in assenza dei loro ligandi (il che pu reprimere la trascrizione)mentre la loro presenza la stimola. La proteina agisce perci da attivatore e da inibitore. I recettori di tipo 3 sono detti orfani perch i loro ligandi non sono stati identificati. Omeodomini Domini di legame al DNA codificati in regioni geniche dette omeobox. Negli attivatori eucaristici hanno un motivo di legame elica-giro-elica come quello procariotico;ogni dominio ha 3 alfa-eliche in cui la prima funge da riconoscimento per il solco > e le altre due formano il motivo elica-giro-elica. Vi poi un altro elemento,assente nei domini elica-giro-elica,ossia il dominio N-terminale che si inserisce nel solco <. Siccome gli omeodomini sono poco specifici per il DNA,occorrono altre proteine che li aiutano. I domini bZIP e bHLH Sono in grado di legarsi al DNA e dimerizzare e i nomi si riferiscono alle regioni a cerniera di leucina ed elica-ansa-elica che rappresentando i domini di dimerizzazione; la b si riferisce alla regione basica presente nella > parte di questi domini. bZIP costituito da 2 polipeptidi,ognuno con met cerniera,ossia unalfa-elica con residui di leucina(o altri Aa (idrofobici)ogni 7 Aa;la spaziatura degli Aa idrofobici su un monomero li fa interagire con una sequenza simile di Aa sullaltro monomero(le 2 eliche sono 2 met di una cerniera). Il dominio dimerizzato ha una struttura a spirali parallele,ossia con lorientamento dallestremit amminica a quella carbossilica che lo stesso. I domini bHLH-ZIP sono presenti in oncogeni quali Myc e Max con entrambi i motivi adiacenti a un motivo basico. Le proteine bHLH dimerizzano attraverso un motivo elicaansa-elica che permette alle parti basiche di ogni elica di afferrare il sito di DNA bersaglio;i domini ZIP hanno un potenziale di dimerizzazione in pi a causa delle loro cerniere di leucina.

CAPITOLO 11 STRUTTURA DELLA CROMATINA E SUOI EFFETTI SULLA TRASCRIZIONE ISTONI Nella maggior parte delle cellule eucariotiche vi sono 5 diversi tipi di istoni (H1,H2A,H2B,H3,H4) abbondanti,la cui massa nei nuclei uguale a quella del DNA. Sono basici ( 0% degli Aa sono arginina e lisina) con carica (+) a pH neutro,e per questo sono estratti con acidi forti(HCl 1.5 M ). Se sottoposti ad elettroforesi non denaturante,migrano verso il catodo (-) a differenza delle proteine (-) che migrano verso lanodo. Sono evolutivamente conservati in questoordine H4(il meno variabile),H3,H2A,H2B,H1 (ricco in lisine,il + variabile negli organismi). I geni degli istoni non sono presenti in singola copia,ma si ripetono pi volte in modo uguale o con differenze considerevoli. Le varianti di un istone hanno lo stesso ruolo,anche se ognuno pu influenzare le propriet della cromatina diversamente. La modificazione istonica pi comune lacetilazione sui gruppi Nterminali e -amminici delle lisine;si possono verificare anche metilazione e fosforilazione dei gruppi -amminici e la N-fosforilazione di lisine e istidine (possono essere aggiunte o rimosse).

NUCLEOSOMI Siccome il DNA umano/eucariotico ha una lunghezza di circa 2 metri ed contenuto nel nucleo con un diametro di 10 m,la cromatina mostra numerosi ordini di ripiegamento. Il 1 ordine di ripiegamento ilnucleosoma che contiene un nucleo di istoni intorno al quale si avvolge il DNA. In soluzione gli istoni H3 e H4.H2A e H2B possono legarsi covalentemente tra loro: H3 e H4 esistono come tetramero e H2B e H2A come dimero. La quantit di istoni e DNA pressoch uguale: la [H1] la met rispetto agli altri istoni che rappresentano un ottamero che si complessa con circa 200 paia di basi. Leliminazione di H1 con tripsina e alte [ ] saline permette di ottenere la cromatina a filo di perle (nucleosomi). Con lanalisi di diffusione dei neutroni Baldwin scopr che il nucleo centrale dellottamero forma una sfera e il DNA avvolto attorno alla superficie esterna,mentre H1 posizionato allesterno ( per questo facilmente rimovibile);in questo modo minimizzato il grado di piegamento. Con la cristallografia ai raggi X si scoperto che lottamero assume diverse forme se osservato da direzioni differenti,con unarchitettura tripartita : un core centrale (H3-H4) di 147 paia di basi unito a due dimeri H2AH2B. Il DNA si adagia in una scia elicoidale sinistrorsa presente sullottamero,ed ogni nucleosoma contiene circa 200 paia di basi (i cui frammenti sono ottenibili con nucleasi). Ogni istone presenta un tipico ripiegamento istonico/histone fold che consiste di 3-eliche unite da 2 giri,e quelli dellottamero presentano anche code protrudenti che contribuiscono per il 28 % alla massa del core: le code di H2B e H3 attraversano il core in corrispondenza di una fenditura formata da 2 solchi minori del DNA adiacenti; una delle code di H4 esposta sul lato della particella centrale e per la presenza di residui basici pu reagire con la regione acida di un dimero H2B-H2A. Fibra da 30nm Il 2 ordine di organizzazione del nucleosoma produce una fibra di diametro di 30 nm,osservata tramite microscopio elettronico. Aumentando la [ ] salina,aumenta anche la condensazione della collana di nucleo somi nel formare la fibra. Secondo Klug la fibra aveva una struttura a solenoidecon i nucleo somi disposti in unelica cava compatta;Richmond invece scopr,con la cristallografia,un tetranucleosoma (4 nucleosomi) formato da 2 blocchi di nucleo somi,con il DNA linker che ha andamento a zig-zag tra i 2 blocchi. Tale conformazione incompatibile con il modello a solenoide,ma si adatta al modello di unelica doppia a linker incrociato,in cui ogni blocco si avvolge intorno allaltro formando una doppia elica sinistrorsa. MANCANO LE PAGINE 426 E 427 Ordine di ripiegamento superiore della cromatina La fibra la struttura di base della cromatina in un nucleo interfasico,ma in cromosomi mitotici visibili al microscopio,il grado di condensazione maggiore,e assume la forma di anse radiali. Con studi di sedimentazione si scoperto che le anse sono formate dal ripiegamento delle fibre e lavvolgimento del DNA nei nucleo somi produce la tensione necessaria per il superavvolgimento. Il rilassamento di unansa superavvolta produce una cromatina meno compatta con un pi basso coefficienti di sedimentazione. Effetto degli istoni sulla trascrizione dei geni di classe II Laybourne e Kadonaga studiarono il ruolo degli istoni nella trascrizione da parte della pol. II in vitro. Gli istoni del core formano il core se posti in presenza di DNA clonato causando una riduzione dellattivit trascrizionale di 4 volte,il che non migliora se si aggiungono fattori di trascrizione. Laggiunta di H1 aumenta la repressione di 25-100 volte che,per,pu anche essere annullata aggiungendo attivatori trascrizionali. L. e K. Ricostituirono la cromatina partendo da un plasmide contenente un

gene clonato noto insieme agli istoni ,con/senza gli attivatori trascrizionali operanti sul promotore del gene in questione. Aggiunsero poi la topo isomerasi I per mantenere il DNA rilassato e usarono la primer extension per saggiare se la cromatina ricostituita potesse essere trascritta da un estratto nucleare. In un esperimento sul gene Kruppel di Drosophila si ottenne che la repressione ottenuta in seguito allaggiunta di istoni del core,fosse uguale al 25% dellottamero del DNA nudo,che corrisponde al 75% di repressione. Quindi o gli istoni rallentano il progredire della RNA pol del 75% senza fermarla,o il 75% delle polimerasi bloccata dai nucleo somi e il 25% dei promotori restanti non coperto da istoni. Istone H1 Laggiunta di H1 alla cromatina ricostituita diminuisce lattivit trascrizionale, legandosi nel sito di trascrizione tra 2 nucleosomi),a meno che non sia presente in quantit di 0.5 molecole per nucleosoma;in questo caso laggiunta di attivatori ha unazione antirepressiva contro lazione repressiva di H1. Sp1 eGAL4 agiscono come attivatori trascrizionali e antirepressori;il fattore GAGA prevalentemente un antirepressore,se aggiunto prima di H1,e agisce legandosi a sequenze di DNA ricche di residui GA. Posizionamento dei nucleosomi Affinch i fattori trascrizionali siano antirepressivi (rimuovendo i nucleosomi che bloccano 1 promotore o impedendo il legame istone-promotore),occorre che gli attivatori forzino i nucleo somi a posizionarsi INTORNO alle sequenze promotrici. Le regioni regolative dei geni attivi presentano tratti liberi dai nucleosomi: ci stato scoperto analizzando la regione regolatrice del DNA del virus SV40. In cellule di mammifero infettare,tale DNA presente come minicromosomi,alcuni dei quali hanno regioni prove di nucleo somi nello stadio tardivo dellinfezione. In questa regione vi sono promotori precoci e tardivi vicini,con 1 enhancer di 72 bp nel mezzo;siccome si tratta di 1 # circolare difficile capire la regione che si sta esaminando e per questo si usano enzimi di restrizione come marcatori. Un sito di restrizione posizionato vicino ad unestremit della regione regolativa,e gli altri siti sullaltro lato del circolo: se la regione libera da nucleosomi include quella regolativa,lenzima taglier in questa zona asimettricamente,lasciando una coda priva di nucleosomi a unestremit del mini# linea rizzato,ma non nellaltro. Ci avviene se si considera il tratto libero corrispondente ad 1 promotore di SV40,asimmetrico rispetto al sito. Se la zona libera invece corrispondesse allorigine di replicazione virale,coincidente con il sito,ci non avverrebbe. Acetilazione degli istoni Gli istoni esistono sia acetilati che non;lacetilazione avviene sui residui di lisina delle estremit N-terminali delle code istoniche ed correlata allattivazione genica (reprimono di meno la trascrizione,se aggiunti in vitro). Esistono perci enzimi nei nuclei che acetilano e de acetilano gli istoni: Brownell identific una acetilatrasferasi specifica per gli istoni (HAT) che aggiunge gruppi acetilici agli istoni da un donatore (acetil-coA). Lenzima fu isolato dal protozoo ciliato Tetrahymena che presenta istoni altamente acilati e in seguito si sottoposero i macronuclei ad elettroforesi su SDS con AcetilcoA marcato radio attivamente nel gruppo acetilico. Se il gel avesse presentato una banda proteica con attivit HAT,il gruppo acetilico sarebbe stato trasferito agli istoni che avrebbero presentato una banda radioattiva in corrispondenza dellattivit HAT. Leccesso di Acetil fu eliminato e il gel fu sottoposto a fluoro grafia,rilevando una proteina di 55 kd (p55) corrispondente ad una banda con forte attivit HAT. Si ottenne poi la sua sequenza amminoacidica per elaborare un set di oligonucleotidi degenerati codificanti tale sequenza e in grado di ibridare al DNA genomico o allRNA cellulare. I nucleotidi furono poi usati nella RT-PCR sullRNA cellulare per ottenere prodotti a DNA,poi clonati e sequenziati,la maggior parte dei quali codificava per regioni conosciute della sequenza amminoacidica di HAT. Siccome nessun clone conteneva una sequenza completa del cDNA,questi furono estesi verso 5 e 3,usando la RACE (amplificazione delle estremit)ottenendo un cDNA completo codificante per lintera sequenza di 421 aa di p55,simile alla proteina di lievito Gcn5p,un coattivatore di fattori trascrizionali acidi;per questo si pens che fosse un HAT coinvolta nellattivazione trascrizionale. Lacetilazione avviene sia nel nucleo che nel citoplasma: le HAT-A(p55 e Gcn5p) sono nel nucleo e acetilano i residui di lisina delle code N-terminali e sono coinvolte nella regolazione genica;le HAT-B sono nel citoplasma,rendono gli istoni H3-H4 neosintetizzati in grado di essere assemblati nei nucleo somi,e i gruppi acetilici sono rimossi da deacetilasi istoniche nel nucleo. Le HAT-A presentano un bromo dominio che permette alle proteine di legare le lisine acetilate anche in code parzialmente acetilate;tale dominio assente nelle HAT-B poich devono riconoscere gli istoni core neo sintetizzati non acetilati. Deacetilazione degli istoni Lacetilazione comporta attivazione trascrizionale la de acetilazione causa repressione: i repressori interagiscono con corepressori che interagiscono con le deacetilasi degli istoni. Tali enzimi rimuovono i gruppi acetilici dalle code basiche degli istoni di nucleasi adiacenti rafforzando il loro legame sul DNA e ottenendo un silenzia mento/repressione: fra i corepressori vi sono : SIN3,3A,3B eNCoR/SMRT che interagiscono col recettore dellacido retinoico,un recettore nucleare eterodimerico. Il fattore di trascrizione Max agisce come attivatore trascrizionale se associato nel dimero Myc.Max,e come repressore se nel dimero Mad-Max. Quindi i repressori della trascrizione come i recettori nucleari non associati ai rispettivi ligandi o il dimero Mad-Max,si legano a specifici siti sul DNA interagendo con corepressori come NCoR/SMRT e SIN3 che si legano poi alle deacetilasi istoniche HDAC1 e 2. Lassemblaggio in complessi ternari (repressorecorepressore-deacetilasi) porta le deacetilasi in prossimit dei nucleo somi permettendogli di de acetilare gli istoni del core (non H1) cosi che le code basiche e gli istoni si leghino saldamente al DNA e ai nucleo somi

adiacenti,tra coda N-terminale di H4 e la tasca acidica del dimero H2A-H2B,inibendo la trascrizione. Inoltre la deacetilasi rimuove i siti di attacco per le proteine contenenti il bromo dominio,essenziali per lattivazione trascrizionale. Rimodellamento della cromatina Consiste nella mobilizzazione dei nucleo somi ad opera di diverse proteine che li allontanano dai promotori,rendendo il DNA accessibile;in questo modo possono verificarsi sia lattivazione trascrizionale che la sua repressione,a seconda della posizione in cui avviene lo spostamento. Le proteine che realizzano questo rimodellamento fanno parte di complessi comprendenti 1 ATPasi che usa lenergia di idrolisi dellATP per il rimodellamento;i complessi sono distinti in base alle componenti ATPasiche. Il complesso SWI/SNF nei mammiferi ha BRG1 come ATPasi e 9-12 fattori BAF associati a BRG1: il fattore pi conservato BAF 155 o 170 con un dominio SANT responsabile del legame agli istoni e che aiuta il complesso a legarsi al nucleosoma. Nel complesso ISWI vi sono 2 domini : SANT e SLIDE che permette di legare il DNA. Eterocromatina e silenziamento Leucromatina relativamente rilassata e potenzialmente attiva mentre leterocromatina molto condensata e inattiva (DNA inaccessibile) e negli eucarioti assume la forma di aggregati al microscopio. Il silenzia mento pu interessare anche geni ad una distanza di 3 kb. Leterocromatina si trova nei telomeri,nei centromeri e in alcuni loci repressi che determinano il tipo sessuale. Leffetto di posizione telomerico (TPE) indica il silenzia mento di geni non oltre i 3 kb dai telomeri. Nei telomeri di lievito leterocromatina si forma grazie alla proteine RAP1 che si lega alla sequenza C1-3 sui telomeri,e che recluta le proteine SIR(3-4-2) che si legano alle RAP e agli istoni H3-H4 nella regione subtelomerica(per questo motivo leterocromatina si trova sia nei telomeri che nelle regioni subtelomeriche). Le interazioni proteina-proteina provocano il ripiegamento del telomero sulla regione subtelomerica. Lipoacetilazione degli istoni correlata alla repressione genica e infatti lH4 delleterocromatina ha solo la lisina-12 acetilata:siccome la lisina-16 di H4 fa parte del dominio che interagisce con SIR,se fosse acetilata,verrebbe bloccata linterazione con SIR3 evitando la formazione delleterocromatina e prevenendo il silenzia mento.

CAPITOLO 12 IL PROCESSING DELLRNA MESSAGGERO. FASE I : SPLICING Allinizio lRNA polimerasi trascrive un gene di un operone,e in seguito i ribosomi legano lmRNA traducendolo in proteine (trascrizione). Negli eucarioti la trascrizione avviene nel nucleo e la traduzione nel citoplasma,e non avvengono contemporaneamente come nei procarioti;la trascrizione deve terminare prima che il trascritto passi nel citoplasma per essere tradotto,e tra trascrizione e traduzione vi la fase post-traduzionale. Siccome lRNA pol non puo distinguere le regioni codificanti da quelle non codificanti,trascrive ogni cosa: per questo deve avvenire lo splicing,ossia la rimozione di sequenze di RNA dal trascritto originario. GENI A PEZZI In un gene sono presenti alcune sequenze dette introni (interposte/IVS) prive di senso ,e esonicodificanti;negli eucarioti semplici i geni sono privi di intorni,e altri ne sono ricchi. Evidenze di geni interrotti Per evidenziare gli introni deli mRNA usata la tecnica dellR-Looping(formazione di anse/loop) che prevede libridazione dellRNA con il suo stampo di DNA. I filamenti di DNA stampo sono separati per consentire la formazione di un ibrido a doppio filamento,tra un filamento e lRNA prodotto,pi stabile del doppio filamento di DNA. In seguito librido osservato con il microscopio elettronico. O si usa un DNA con i filamenti separati appena,in modo da consentire libridazione,oppure un DNA con i filamenti completamente separati: Sharp us il 2 metodo ibridando il filamento di DNA di Adenovirus con lmRNA di una proteina del rivestimento virale (Hexon). Se nel gene non ci sono introni,tra mRNA e DNA stampo si forma un ibrido lineare e ovviamente nellmRNA maturo non vi sono introni,altrimenti verrebbero codificati codoni non senso poi convertiti in prodotto proteico;gli introni sono perci assenti nellmRNA e presenti sul DNA,e di conseguenza tra i 2 filamenti usati non si puo creare un ibrido lineare,poich le regioni introniche del DNA,non trovando alcuna controparte sul filamento dellmRNA,formano anse non ibridate che corrispondono a zone introniche. In un ibrido contenente 3 anse rappresentanti gli introni accade che : ogni ansa preceduta da una corta regione a doppio filamento e lultima seguita da una lunga regione;in questo modo il gene ha 4 esoni,3 brevi allinizio e uno lungo terminale. Quindi se vi sono 3 anse avremo 3 introni e 4 esoni;con 6 anse avremo 6 introni e 7 esoni e cosi via,i geni codificanti per mRNA possono contenere da 0 a 362 introni, a differenza di quelli codificanti per i tRNA che ne contengono da 0 a 1,e sono relativamente piccoli e adiacenti alle basi del DNA corrispondente allanticodone del tRNA. Spesso gli introni sono pi lunghi degli esoni,in particolare negli eucarioti superiori. Lo Splicing del tRNA Gli introni sono presenti nei geni ma non nellRNA maturo poich sono trascritti in un trascritto primario di dimensioni maggiore che funge da precursore dellmRNA,e che poi ridotto in seguito alleliminazione degli introni e alla fusione degli esoni (splicing del tRNA). Questi precursori fanno parte di piccoli RNA nucleari,gli hnRNA,dotati di un turnover rapido,ossia rapidamente prodotti e convertiti in RNA pi piccoli. La

prova a sostegno dellipotesi del ruolo dei precursori fu ottenuta dallibridazione tra il gene della beta-globina di topo e il suo precursore (un hnRNA,2 volte pi grande dellmRNA maturo). Segnali di splicing Nei precursori nucleari degli mRNA tali segnali sono conservati,ossia cominciano e finiscono alla stesso modo : le prime due basi di un introne sono,quasi sempre, GU e le ultime due sono AG,quindi un introne tipico conterr molte coppie GU-AG allinterno,e in aggiunta usiamo sequenze consensus che si estendono oltre le coppie GU e AG,utili per uno splicing corretto in quanto,se mutati,inibiscono lo splicing.

IL MECCANISMO DI SPLICING DEI PRECURSORI NUCLEARI DELLmRNA Un intermedio ramificato Nello splicing del precursore dellmRNA lintermedio ramificato,apparendo come un lariat(laccio di cowboy. 1)dapprima si forma lintermedio a forma di lariat quando lOH-2 di unadenosina al centro dellintrone attacca il legame fosfodiesterico tra il 1 esone e la G allinizio dellintrone,creando lansa del lariat e separando contemporaneamente il 1 esone dallintrone; 2) il gruppo OH-3 alla fine del 1 esone attacca il legame fosfodiesterico che tiene legato lintrone al 2 esone,inducendo la formazione di un nuovo legame fosfodiesterico esone-esone e rilasciando lintrone lariat. A sostegno di ci Sharp scopr infatti che lintrone rimosso possiede un gruppo OH-3,formatosi per rimozione del gruppo fosfato (2 fase). Nel prodotto di splicing latomo di fosforo tra i 2 esoni deriva dal sito di splicing al 3. Inoltre lintermedio (esone 2 + introne) e lintrone rimosso contengono 1 nt ramificato con gruppi Oh2-3-5 legati ad altri nt.,e la ramificazione coinvolge lestremit 5 dellintrone che si lega ad un sito specifico nellintrone stesso. Sharp tagli lintermedio di splicing (esone 2+ introne) con RNAasi T2 e P1 che rimuovono 1 nt alla volta e creano nucleosidi monofosfato: T2 e T1 creano un nucleoside 3P ,e P2 crea nucleosidi 5P. Ogni legame fosfodiesterico ha una carica (-) e ogni fosfato terminale ne ha 2,e per questo i prodotti di digestione della P1 furono trattati con periodato e anilina per rimuovere i nucleosidi in 3 e 2 con la beta-eliminazione; i prodotti di tale reazione furono sottoposti a cromatografia bidimensionale su strato sottile e si scopr che comigravano con ladenosina 2,3,5-3P,dimostrando lesistenza di 1 nt ramificato (in questo caso era ladenina). Il segnale di ramificazione Oltre alle sequenze consensus su 3 e 5 degli introni nucleari,esistono sequenze consensus di ramificazione UACUAAC(come ladenina),che nel lievito sono altamente conservate intorno al sito di ramificazione. Tale sequenza contiene il nt adenina su cui avviene la ramificazione,e indica al macchinario di splicing quale coppia AG a valle deve essere selezionata come sito di splicing al 3. Negli eucarioti invece la consensus + variabile,ma in tutti i casi il nt di ramificazione lultima A della sequenza. Spliceosomi In lievito gli intermedi a forma di lairat non sono liberi in soluzione,ma legati a complessi proteici detti spliceosomi,che nei lieviti sono di 40 S e nei mammiferi di 60 S. Contengono pre-mRNA,RNA e piccole ribonucleoproteine,note come snRNPs (snurps) formate da snRNA( piccoli RNA nucleari),e individuate con elettroforesi su gel in 6 gruppi (U1,U2,U4,U5,U6). Le consensus alla fine degli introni sul punto di ramificazione sono riconosciute da proteine e acidi nucleici. 1) U1 snRNP = possiede una regione la cui sequenza quasi complementare a entrambe le consensus dei siti di splicing al 5 e 3,con i quali si appaia,tenendoli uniti durante lo splicing. Lo splicing coinvolge un sito di ramificazione nellintrone,anche se lappaiamento tra snRNA U1 e sito di splicing 5 necessaria ma non sufficiente per lo splicing. 2) U6 snRNP = anchesso si appaia col sito 5 e in particolare il legame avviene prima della formazione degli intermedi tra la sequenza ACA della ACAGAG di U6,e la sequenza UGU nelle posizioni da + 4 a + 6 nel sito 5 di splicing. Il legame tra U6 e substrato di splicing avviene prima e dopo la prima reazione di splicing grazie alla presenza dellibrido/accoppiamento U2-U6. 3) U2 snRNP = in lievito una sua sequenza complementare alla consensus del sito di ramificazione e ci essenziale per lo splicing. U2 inoltre si appaia anche con U6 creando una regione nota come elica I,e determinando lorientamento di queste snRNP nello splicing. Lestremit 5 di U2 interagisce anche con la 3 di U6 creando un altro dominio di appaiamento noto come elica II,necessario per lo splicing in cellule di mammifero,ma non di lievito (mutazioni in U2 possono essere soppresse da mutazioni in U6). 4) U5 snRNP = coinvolta nel legame con la 3 del 1 esone (ultimo nucleotide) e il 5 dl 2 esone( 1 nt) che consente il posizionamento dei 2 esoni per la 2 reazione di splicing. 5) U4 snRNP = si lega con U6,creando 2 sequenze appaiate,stelo I e stelo II,e durante lo splicing si dissocia da U6;il suo ruolo perci di legare U6 finch non entra a far parte dello spliceosoma. Alcune basi di U6 che si

appaiano con U4 nello stelo I sono coinvolte anche nel legame con U2,nel momento in cui U4 rimosso con trattamento blando. In 2 specie di lievito il gene codificante per U6 interrotto da un mRNA tipo-introne. Il coinvolgimento delle snRNP nello splicing dellMrna Alcuni introni fanno auto-splicing,ossia posseggono lattivit catalitica per lo splicing,senza lausilio dello spliceosoma. Ne sono un esempio gli introni di gruppo II che usano un intermedio a forma di cappio simile a quello dello splicing degli mRNA nucleari. Gli snRNP coinvolti nello splicing quindi sostituiscono alcune sequenze degli introni di gruppo II nella formazione delle strutture che permettono il corretto posizionamento degli esoni 1 e 2 nello splicing. Queste regioni (come lansa U5) sono dette sequenze guida interne poich guidano altre regioni di RNA nella corretta posizione per un passaggio catalitico. Siccome gli introni di gruppo II sono RNA catalitici (ribozimi),le snRNP che sostituiscono gli elementi degli introni di gruppo II nel centro dellattivit di splicing,sono responsabili anche dellattivit catalitica delle reazioni di splicing. Ognuna delle 2 reazioni di splicing una reazione di transesterificazione in cui un legame fosfodiesterico si rompe tra il 1 esone e lintrone,e uno si forma tra la A del sito ramificazione e il sito al 5 dellintrone,creando un intermedio a cappio. I catalizzatori di queste reazioni devono perci attivare il nucleofilo (gruppo 2OH del sito di ramificazione) e stabilizzare il gruppo uscente (lossigeno che diverr lestremit 3-OH alla fine del 1 esone) grazie a ioni metallici,quali il magnesio (cofattori) di cui sono ricchi gli introni di grupo II. Se lo zolfo aggiunto a U6,al posto dellossigeno,sono bloccati lo splicing e il legame di U6 con il Mg;per risolvere questo problema si pu aggiungere del manganese che pu legare lRNA con lossigeno sostituito e svolgere le attivit catalitiche. U6 si lega perci al Mg2+ nel sito catalitico dello spliceosoma. Una miscela di frammenti di U2 e U6 prodotti in vitro con un oligont di 1 introne di lievito contenenti una sequenza del sito di ramificazione,pu catalizzare una reazione di transesterificazione simile a quella nella prima reazione di splicing. Accade pero che,siccome manca un sito di splicing 5 in vitro,la A del sito di ramificazione stacca un legame fosfodiesterico di U6,creando un oligont ramificato. Il sito catalitico dello spliceosoma comprende quindi 3 RNA appaiati : U2,U6 e il sito di ramificazione dellintrone con un atomo di Mg2+ . In assenza dei proteine tali frammenti potrebbero partecipare alle reazioni catalitiche simili alla prima reazione di splicing in vitro. Assemblaggio e funzione dello splicing Lo spliceosoma formato da proteine e RNA,e il suo assemblaggio e disassemblaggio fanno parte del ciclo dello splicesoma grazie al quale sono regolate quantit e qualit dello splicing e dellespressione genica. Nel lievito il 1 complesso a formarsi ilcomplesso predisposto CC/commitment complex,formato dal substrato di splicing + U1,e predisposto alla rimozione dellintrone sul quale si assembla. In seguito si lega U2 che,con lATP,forma il complesso A; U4-U6 e U5 si associano formando il complesso B1; U4 si dissocia da U6 e permette 1) la sostituzione di U1 con U6 sul sito di splicing al 5 mediante una reazione ATP-dipendente che attiva lo spliceosoma; 2) luscita di u1 e u4 dallo spliceosoma;3) lappaiamento di U6 con U2 . Lo splicing attivato chiamato anche complesso B2 e la prima reazione di splicing ,di separazione dei 2 esoni e formazione dellintermedio,usa lenergia fornita dallATP. Una seconda molecola di ATP permette di legare i 2 esoni e rimuovere lintrone a cappio in un complesso C2. In seguito lRNA maturo esce dal complesso lasciando lintrone legato al complesso I che si dissocia nei suoi componenti primari,ossia le snRNP che possono essere riciclate e formare un altro complesso di splicing, e lintermedio che deramificato e degradato. La struttura delle snRNP Le 5 snRNP dello splicing posseggono lo stesso corredo di 7 proteine Sm,bersaglio di anticorpi in pazienti con malattie autoimmuni,e che si legano a un sito Sm (AAUUUGUGG) comune agli snRNA;sono poi presenti alcune proteine specifiche. Dallo studio su U1 si scoperto che le Sm hanno una struttura a ciambella con un buco nel mezzo in cui sono attaccate le altre proteine. La regione di RNA con il sito di legame per le Sm in una zona a singola elica che puo attraversare il buco della ciambella,ricco di Aa basici. Reclutamento,selezione del sito di splicing al 3 e splicing alternativo Le snRNP legano i legami esone-introne grazie a fattori addizionali. Durante la 2 reazione dello splicing il gruppo OH-3 dellesone 1 attacca il legame fosfodiesterico legando AG (alla fine del 1 introne) al 1 nt dellesone2. Siccome la sequenza AG tra 18 e 40 nt a valle del sito di ramificazione,la scelta di quello pi corretto determinato dal fattore di splicing Slu-7 che seleziona la coppia AG corretta al 3. Inoltre sempre al 3 vi un altro fattore di riconoscimento,U2AF composto da 2 subunit:la pi grande si lega al tratto di polipirimidine vicino al sito di splicing 3,mentre la pi piccola si lega allAG del sito al 3. Commitment Un solo fattore di splicing puo avviare la formazione complesso di commitment: quello studiato SC35 e fa parte delle proteine leganti lRNA,dette proteine SR,poich ricche in serine e arginina,che reclutano U1 sul complesso di commitment. (FINIRE PAGINA 483)

Ruolo del CTD della polimerasi II Lo splicing,la formazione del cap e la poliadenilazione sono coordinate dal dominio carbossi-terminale (CTD) di Rpb1 (subunit > della pol II). CTD puo legare le snRNP e le proteine SR,e facilita lo splicin aiutando lassemblaggio dei fattori di splicing sugli esoni,sintetizzati dalla RNA pol,solo su

substrati che contengono esoni completi. Lo splicing di un dato pre-mRNA puo essere determinato dalla definizione dellesone o dellintrone: nella definizione esonica i fattori di splicing riconoscono le estremit degli esoni ed eliminano gli introni compresi tra essi;nella definizione intronicasono riconosciute invece le estremit degli introni. Splicing alternativo Tre trascritti di molti geni eucariotici (60%) sono soggetti a splicing alternativo,ossia 1 premRNA puo essere maturato in modi diversi producendo mRNA alternativi codificanti proteine differenti. Ad esempio nella catena pesante dellIg di topo puo fare la differenza tra una proteina legata alla membrana (che presenta una regione idrofobica che la ancora alla membrana) e una proteina secreta privo di questo dominio di ancoraggio. Le 2 proteine sono codificate da 2 mRNA separati identici al 5,e differenti al 3 : clonando il gene della linea germinale per la regione costante della catena pesante ,si scoperto che esso codifica la regione 3 di entrambe le forme,ognuno contenuto in 1 esone differente. Da 2 diversi splicing di 1 stesso pre-Mrna si originano 2 alternativi mRNA maturi che codificano 2 diverse catene . Anche la determinazione del sesso della Drosophila caratterizzato da splicing alternativo dellmRNA,prodotto da 3 diversi geni che funzionano in un sistema a cascata. Lo splicing dei trascritti Sxl nelle femmine da un prodotto attivo che potenzia lo splicing femmina-specifico dei trascritti Sxl e causa lo splicing femmina-specifico dei trascritti tra che generano un prodotto attivo. (MANCA 489)

Meccanismi di controllo dello splicing Lo splicing alternativo permette di ottenere + prodotti dello stesso gene e serve a controllare lespressione genica nelle cellule grazie a fattori di splicing che stimolano il commitment in specifici siti di splicing. Lo splicing puo essere stimolato anche da enhancers di splicing esonici (ESEs),e inibito da silenziatori di splicing esonici (ESSs) che legano fattori proteici prodotti in alcune cellule o in risposta ad agenti esterni,attivando o reprimendo lo splicing nei siti vicini. In particolare gli ESEs interagiscono con le SR e gli ESEs con le proteine hnRNP che legano gli hnRNP. GLI RNA CHE FANNO AUTO-SPLICING Introni di gruppo I La ciclizzazione dellintrone comporta la perdita di 15 nucleotidi dallestremit 5 dellintrone lineare,ma in seguito si riapre in corrispondenza del legame fosfodiesterico che aveva formato il ciclo creando 1 introne pi corto. Quindi lintrone riciclizza rimuovendo 4 nt al 5 e si apre in corrispondeza dello stesso legame. Durante lo splicing,per ogni legame fosfodiesterico che si pre,se ne forma un altro,e non richiesta energia/ATP,poich il cambio di energia libera del sistema = 0. Mentre gli introni di gruppo I usano 1 nt esogeno nella prima reazione di splicing,gli introni nucleari usano 1 nt facente parte dellintrone stesso. Yorus studi la conformazione dellintrone rRNA 26 S di Tetrahymena associato al GMP e scopr che una parte si ripiega in una doppia elica con una tasca che trattiene il nt guanosinico on legami H. La guanina associata allintrone agisce come ladenina degli introni nucleari,ma siccome non legato covalentemente,non forma un lariat. In passato si pensava che la parte catalitica enzimatica fosse composta soo da proteine: ad esempio la RNasi P elimina i nt al 5 dei precursori dei tRNA e comprende un RNA chiamato M1 che ha funzione catalitica,e perci tale enzima detto ribozima (RNA catalitici). Introni di gruppo II Molti geni di mitocondri e cloroplasti contngono introni I e II in grado di fare autosplicing in modo diverso. Nel gruppo Ilo splicing inizia con lattacco di una guanina esogena e nel gruppo II con lattacco intramolecolare di una A dellintrone per formare un lariat (come negli introni nucleari). Esiste infatti unorigine evolutiva tra le snRNP e la parte catalitica degli introni di gruppo II,ossia gli introni nucleari discendono da quelli batterici di gruppo II. La struttura secondaria del complesso di splicing che coinvolge lo spliceosoma,e quella degli introni di gruppo II sono estremamente somiglianti.

CAPITOLO 13 IL PROCESSING DELLmRNA. FASE II = CAPPING E POLIADENILAZIONE CAPPING Gli mRNA di diverse specie eucariotiche (anche virus) sono metilati,prevalentemente allestremit 5,in strutture dette cap. Struttura del cap Il 1 cap studiato fu quello dellRNA virale e nel caso di marcatura con -32 ATP,nel cap era incluso il -fosfato;siccome tale fosfato un nucleoside trifosfato che rimane solo nel 1 nt di un RNA,il cap posizionato al 5 dellRNA. Il -fosfato ricoperto da un fatore di protezione che eliminato con una

fosfodiesterasi che taglia i legami fosfodiesteri e fosfoanidride (tra e -fosfati in un nt): questo fattore carico rilasciato la 7-metilguanosina legata al 2-O-metil-AMP nel cap. Tra i 2 vi un legame trifosfato:l-fosfato che deriva dal GTP e il e fosfato dallATP,e si instaurano tra il nt del capping (7 metil guanosina) e il nt successivo. Siccome ATP e GTP hanno i loro fosfati in 5,questo legame probabilmente 5-5. Sintesi del cap Per studiare la produzione dei cap furono usate particelle di virus come donatori di enzimi in grado di fare capping,e siccome questi virus umani si replicano nel citoplasma delle cellule ospiti,la trascrizione e il capping dei propri trascritti devono avvenire allinterno della particella vironica. Nei virus studiati si osserva che :1)lRNA trifosfatasi (fosfoidrolasinucleotidica) taglia l-fosfato del trifosfato al 5 dellRNA nascente lasciando un difosfato;2) una guanil trasferasi attacca 1 GMP del GTP al difosfato allestremit dellRNA,formando il legame 5-5 trifosfato;3)una metiltrasferasi trasferisce il gruppo metilico dalla 5-adenosil metionina (Adomet) allazoto in posizione 7 della guanina del cap;4) una seconda metil-trasferasi usa unaltra Adomet per metilare lidrossile in 2 del penultimo nt. La trascrizione dipende dal cap come suggerito dal fatto che,in alcuni virus,la mancanza di Adomet blocca la trascrizione. Il capping in questi virus avviene perci subito dopo la formazione del 1 legame fosfodiestere del pre-mRNA. In altri virus invece la trascrizione puo avvenire senza Adomet. Darnell mostr come il capping del messaggero delladenovirus avvenisse precocemente durante la trascrizione,in quanto tale virus si replica nel nucleo approfittando del macchinario di capping della cellula ospite. Il cap aggiunto nel pre-mRNA del trascritto tardivo > di adenovirus prima che il trascritto nascente raggiunga i 70 nt di lunghezza;negli eucarioti invece il capping avviene prima che lmRNA raggiunga i 30 nt. Funzioni del cap 1) protezione degli mRNA dalla degradazione= il cap legato allmRNA mediante un legame trifosfato,cosi da proteggerlo dallattacco di Rnasi che partano dal 5 e che sono impossibilitati a tagliare i legami trifosfato; 2) aumenta la traducibilit degli mRNA = poich lmRNA eucariotico entra nel ribosoma per essere tradotto mediante una proteina che riconosce e si lega al cap; 3) facilita il trasporto degli mRNA dal nucleo al citoplasma = la presenza del cap permette laggiunta del monometil,agli snRNA,nel nucleo;questi snRNA poi migrano nel citoplasma dove legano diverse proteine per formare le snRNP e per trimetilare i loro cap;in seguito rientrano nel nuclo per partecipare allo splicing. Ci avviene per i prodotti genici della polimerasi II e non per la III; 4)aumenta lefficienza dello splicing degli mRNA;

POLIADENILAZIONE Gli hnRNA sono i precursori degli mRNA ed entrambi condividono alla 3 una lunga catena di residui di AMP detta poli(A),aggiunta nel processo di poliadenilazione,e assente negli rRNA e tRNA. Poli(A) Lo studio su questa catena fu effettuato con lausilio dellRNasi A specifica per i nt pirimidinici (C,U) e lRNasi T1 specifica per G,in modo da lasciare come nt soloA. Tramite elettroforesi si scoperto che questa catena ha un coefficiente di sedimentazione di 7S e una lunghezza media di circa 250 nt. La Poli(A) presente alla 3 cosid a poter essere rimossa velocemente da un enzima he degrada gli RNA (RNasi) che produce una molecola di adenosina e circa 200 di AMP. La catena non trascritta dal DNA,poich priva di ripetizioni T abbastanza lunghe e poich lactinomicina D che inibisce la trascrizione del DNA non inibisce la poliadenilazione. Per questo la Poli(A) aggiunta dopo la trascrizione dallenzima Poli(A) polimerasi PAPnel nucleo,che aggiunge residui di AMP ai pre-mRNA,e che sono poi riscontrabili negli hnRNA (o in precursori non soggetti a splicing). E assente invece neli mRNA degli istoni. Funzioni del Poli(A) 1)protegge gli mRNA dalla degradazione = e ha un notvole ruolo per unefficiente traduzione; 2)favorisce la traduzone degli mRNA a cui attaccata = poich,durante la traduzione,allmRNA si lega la proteina PAB1 a livello della Poli(A) aumentandone lefficienza. La Poli(A) facilita lassociazione dellmRNA ai ribosomi (pronti a leggere il contenuto dellmRNA): un RNA con + ribosomi che lo traducono detto polisoma,e gli mRNA con Poli(A) producono polisomi + facilmente. La poli(A) inoltre puo legare proteine citoplasmatiche che,a turno,legano un fattore dinizio della traduzione (eIF4G)che a sua volta lega una proteina legante il cap,legato al cap. In questo modo la Poli(A) al 3,e il cap al 5 dellmRNA risultano legati insieme per far circolarizzare lmRNA in unansa chiusa in cui lmRNA risulta + stabile di quando assume una conformazione lineare e priva di proteine. Di conseguenza lmRNA ad ansa pronto per essere tradotto poich leIF4G,che lega le anse insieme,aiuta a convogliare i robosomi su esso. Meccanismo di base della poliadenilazione Prevede il taglio di un pre-mRNA ,prima che la trascrizione sia terminata,e laggiunta della Poli(A) alla 3. In tal modo la polimerasi puo ancora allungare la catena di RNA. Per studiare la correlazione tra terminazione della trascrizione e poliadenilazione,Dornell e nevins arrivarono alla conclusione che la trascrizione procede almeno fino alla fine dellultima regione codificante,e la poliadenilazione puo avvenire su ogni sito di poliadenilazione,prima che la trascrizione dellintera unit di trascrizione sia terminata. In definitiva il processo di trascrizione puo procedere a lungo (in eucarioti e virus) oltre il sito di

poliadenilazione,prima che il trascritto venga tagliato e poliadenilato alla 3 creata dal taglio. Tale processo sembra essere uno spreco poich lRNA trascritto a valle del sito di poliadenilazione sar distrutto e non utilizzato. Segnali di poliadenilazione Nei mammiferi un efficiente segnal di poliadenilazione la sequenzaAAUAAA localizzata a circa 20 nt a monte/prima della coda di Poli(A) in un pre-mRNA . Una sua variante AUUAAA ha l80% di efficienza. La sequenza non per necessaria a dirigere la poliadenilazione,altrimenti avverrebbe a valle delle sequnze; perci necessario lausilio di una sequenza ricca in GU(24,24 bp),seguita da un motivo ricco in U a valle del sito di poliadenilazione.e la cui distanza un fattore importante per il corretto riconoscimento del sito. Nelle piante solitamente presente la stessa sequenza,anche se + soggetta a cambiamenti. I lieviti invece contengono raramente questa sequenza e presentano > differenza dei mammiferi/eucarioti. Taglio dei pre-mRNA Nei mammiferi sono richieste molte proteine,come la CPSF,importante nel taglio e nella poliadenilazione,che si lega alla sequenza AAUAAA;CstF (fattore di stimolazione del taglio) che si lega alla regione G/U,e che con CPSF lega siti fiancheggianti il sito di taglio e poliadenilazione. I 2 sono instabili se legati singolarmente,e + stabili se cooperano. Altre 2 proteine coinvolte sono i fattori di taglioCFI e CFII. Vi partecipano inoltre la Poli(A) polimerasi,in quanto il taglio subito seguito dalla poliadenilazione,lRNA pol II provvista di cap e dominio CTD (estremamente importante nel taglio). Inizio della poliadenilazione Comincia appena il pre-mRNA tagliato a valle della sequenza AAUAAA e consta di 2 fasi :1)aggiunta di 10 residui al pre-mRNA stimolata dalla sequenza segnale;2) allungamento indipendente dalla sequenza segnale,ma che necessita della serie di A aggiunte nella prima fase e che aggiunge 200 o + A allRNA. Il segnale che guida la poliadenilazione diversa da quella di taglio,ed rappresentata dalla sequenza AAUAAA seguita da almeno 8 nt alla fine dellRNA. Questo processo puo essere mimato in vitro da piccoli RNA marcati contenenti AAUAAA posizionate a una distanza di almeno 8 nt dalla 3,e che si comportano come premRNA tagliati e pronti ad essere poliadenilati. Sottoponendo gli RNA ad elettroforesi,quelli con la Poli(A) aggiunta saranno + lunghi e migreranno + lentamente. Appena la Poli(A) raggiunge una lunghezza di circa 10 A/nt,lallungamento dipende dalla Poli(A) stessa al 3 e non + dal CPSF o dallAAUAAA. Quindi il processo dinizio dipende da 2 proteine : la Poli(A) polimerasi e il CPSF che legano la sequenza AAUAAA sul pre-mRNA. Allungamento del Poli(A) La Poli(A) polimerasi riconosce la Poli(A) grazie alla PABII che facilita la poliadenilazione legandosi alla Poli(A) piuttosto che ad AAUAAA,e che ha una preferenza di substrato diversa da quella del CPSF. Quindi CPSF funge da fattore di inizio e PABII dirige la poliadenilazione del substrato di 250 nt o +,indipendentemente dalla sequenza AAUAAA. In definitiva abbiamo: 1)Fase dinizio = PAP,CPSF,CstF,CFI,CFII,2sequenze del segnale di poliadenilazione (AAUAAA e sequenze G/U fiancheggiante il sito di poliadenilazione); 2) Fase di allungamento = PAP,PABII,oligo(A) lungo 10 nt;CPSF facilita il processo. Poli(A)polimerasi Dal clonaggio e il sequenziamento di cDNA codificanti la Poli(A) polimerasi bovina (PAB) risultano 2 diversi cDNA derivanti da splicing alternativi che portano alla formazione di 2PAP (I e II) che differiscono nella loro regione carbossi-terminale. La PAPII possiede: un dominio di legame allRNA(RBD);un dominio di attivit polimerasica (PM);2 segnali di localizzaione nucleari (NLS1 NLS2) e diverse regioni ricche in serine/treonine (S/T). Si scopr poi che una regione di 150 Aa presso lestremit C-terminale del dominio di polimerizzazione richiesta per lattivit del dominio sullestremit N-terminale. Turnover del Poli(A) La Poli(A) processata e accorciata nel citoplasma:una RNasi la accorcia,e la Poli(A) polimerasi la allunga,e la risultante finale comunque un accorciamento. Nel momento in cui la Poli(A) degradata,anche lmRNA va in contro a degradazione. Poliadenilazione citoplasmatica Lesempio + conosciuto quello degli oociti di Xenopus in cui la poliadenilazione degli mRNA dipende da 2 motivi di sequenza: la sequenza AAUAAA vicino la fine dellmRNA e lelemento di poliadenilazione citoplasmatica (CPE) contenente la sequenza UUUUUAU o una simile. La sequenza AAUAAA richiesta sia per la poliadenilazione nucleare che citoplasmatica. COORDINAZIONE DEGLI EVENTI DI PROCESSAMENTO DELLmRNA Effetto del cap sullo splicing Il cap puo stimolare lo splicing del 1 introne poich quello + vicino,ed aiutato in ci dal complesso che lega il cap (CBC),formato da 2 proteine che legano il cap (CBPs). Il cap in particolare facilita lassemblaggio sul 1 introne nella formazione dello spliceosoma. Effetto della Poli(A) sullo splicing La poliadenilazione avviene sia prima che dopo lo splicing e infatti in certi premRNA alcuni introni sono rimossi prima o dopo la poliadenilazione. La poliadenilazione promuove la rimozione dellultimo introne di 1 pre-mRNA vicino alla coda di Poli(A),ma negli altri introni lo splicing avviene normalmente anche in assenza di poliadenilazione. Il legame del CTD di Rpb1 alle proteine che processano lmRNA Gli eventi del processamento avvengono durante la trascrizione e sono : 1) il capping appena lmRNA nascente di circa 30 nt ossia quando la 5 dellRNA fuoriesce dalla polimerasi;2)la poliadenilazione avviene quando,durante la sintesi, tagliato in corrispondezna del sito di poliadenilazione; 3) lo splicing influenzato dai precedenti.

I fattori delle 3 attivit si legano al CTD della subunit Rpb1 della pol II aumentando lefficienza del processamento. La forma fosforilata di CTD stimola maggiormente la poliadenilazione in vitro. I cambiamenti nellassociazione tra i fattori di processamento dellRNA e il CTD sono correlati ai cambiamenti dello stato di fosforilazione del CTD Le proteine si associano col CTD a seconda della necessit e in linea con gli stati di fosforilazione del CTD durante la trascrizione. La guanilil trasferasi del cap associata col CTD vicino al promotore dopo linizio della trascrizione e non allinterno del gene,mentre la cap metil-trasferasi e il fattore di poliadenilazione Hrp1/CFIB sono associati con il CTD vicino e lontano dal promotore. Quindi tali fattori sono sul complesso di trascrizione durante linizio e lallungamento. Quando il complesso vicino ai promotori,la serina 5 del CTD fosforilata (non lo + durante lallungamento),a differenza della serina 2 che fosforilata durante lallungamento,e non lo quando la polimerasi vicina al promotore. Di conseguenza g.trasferasi si associa col complesso di trascrizione ,se questo vicino al promotore,mentre il fattore di poliadenilazione vi si associa sia vicino che lontano. Le proteine quindi si avvicendano sul complesso di trascrizione e lo stato di fosforilazione del CTD cambia durante la trascrizione : la serina 5 fosforilata presente nei complessi vicino al promotore,mentre la serina 2 lontana da esso;il cambio nella fosforilazione provoca il distacco dal complesso di alcune proteine che processano lRNA per attrarre nuove proteine. Accoppiamento tra terminazione della trascrizione e processamento dellestremit 3 dellmRNA La terminazione della trascrizione dei geni di classe II un evento difficile poich lestremit 3 matura dellmRNA non corrisponde al sito di terminazione;inoltre quando il pre-mRNA tagliato e poliadenilato,la 3 instabile dellmRNA prodotto deve essere degradato. Recenti studi hanno dimostrato che il taglio dellRNA nascente sul sito di terminazione puo anche precedere il taglio sul sito di poliadenilazione. Nel lievito la terminazione della trascrizione richiede un sito di poliadenilazione intatto e proteine/fattori coinvolti nel taglio sul sito di poliadenilazione;infatti questi fattori sono anche quelli della terminazione e si associano col CTD della Rpb1 della pol II. Quindi la terminazione accoppiata al taglio e non alla poliadenilazione in s. Meccanismo della terminazione Studiando questo processo nelle e globine umane si scopr che :1)la regione a valle del sito di poliadenilazione essenziale per la terminazione;2) necessario anche il taglio del trascritto nascente su siti multipli a valle del sito di poliadenilazione;3) tale taglio avviene contemporaneamente alla trascrizione forse precede il taglio sul sito. Cosa + importante: il taglio del trascritto nascente un evento auto-catalitico (lRNA taglia s stesso)favorito dal CoTC (elemento di taglio co-trascrizionale,a valle del sito di Poli(A) negli eucarioti)che codifica in un dominio auto-catalitico capace di tagliare lRNA nascente. Il taglio per non sufficiente per la terminazione e occorre anche che la polimerasi estenda i trascritti oltre i siti della Poli(A). La terminazione prosegue in questo modo : lRNA tagliato valle della Poli(A) su un sito di CoTC,poi una esonucleasi lega lRNA libero creato e comincia a degradarlo,seguendo la polimerasi che allunga lRNA. Appena lesonucleasi raggiunge il promotore ,lo distrugge terminando la trascrizione e nella - globina occorre che il taglio intorno al trascritto nascente permetta lingresso di una esonucleasi 5-3 che distrugge la polimerasi. Una di queste esonucleasi umane la Xrn 2 che necessita,nel sito dingresso,di un gruppo fosfato al 5,come quello fornito da CoTC,per degradare lRNA a valle. Nel lievito questa esonucleasi la Rat1 che entra grazie al taglio sul sito della Poli(A). (manca CoTC) CAPITOLO 14 ALTRI EVENTI DI PROCESAMENTO DELLRNA EDITING DELLRNA I tripanonomatidi contengono mitocondri insoliti detti chinetoplasti contenenti 2 tipi di DNA circolare: tali DNA sono contenuti in 25-30 maxicircoli e 10000 minicircoli importanti nellespressione genica mitocondriale. Studiando la sequenza dellmRNA per la citocromo ossidasi si scopr che essa non coincideva con la sequenza del gene corrispondente poich lmRNA conteneva 4 nt assenti nel gene corrispondente. Tale situazione per avrebbe dovuto causare un frameshift ,ossia uno slittamento della cornice di lettura del ribosoma sullmRNA,che avrebbe inattivato il gene. I non siccesse e la conclusione fu che lmRNA era copiato da criptogeni incompleti,e poi modificato per aggiunta di nt mancanti del tipi UMP. Meccanismo dellediting E un fenomeno post-trascrizionale che procede in direzione 3-5 e che interessa le code della Poli(A) degli mRNA e infatti i trascritti non modificati sono ritrovati contemporaneamente alle versioni modificate alla 3 degli stessi mRNA. Importante fu la scoperta nei maxicircoli di 7 brevi sequenze che producevano corti RNA guida(gRNA) complementari a porzioni di 5 diversi mRNA mitocondriali modificati. Questi gRNA possono guidare linserzione o la delezione di UMP lungo 1 tratto di diverse dozzine di nt dellmRNA e terminata questa fase un altro gRNA potrebbe ibridizzare alla 5 della regione modificata e dirigere lediting di un nuovo segmento. Partendo dalla 3,successivi gRNA possono legare regioni gi modificate dal gRNA precedente dirigendo ulteriori modificazoni;solo i gRNA alla 3 possono ibridizzare con sequenze non modificate mentre gli altri ibridizzano con sequenze modificate e ci funziona solo se lediting in direzione 3-5 Lediting inoltre caratterizzata da appaiamenti G-U,tra gRNA e mRNA,+ deboli di quelle di Watson e crick,e in questo

modo la 5 di un nuovo gRNA,formando coppie di basi W-C con le regioni neomodificate di 1 mRNA,puospiazzare la 3 di un vecchio gRNA in cui lappaiamento con lmRNA coinvolge coppie deboli G-U. I chinetoplasti contengono una uridil trasferasi terminale (TUTasi) che aggiunge gli UMP extra (urudilati) agli mRNA e,siccome lmRNA deve essere tagliato per accettare gli UMP,sar ricongiunto da unRNA-ligasi contenuta nei chinetoplasti. Gli UMP possono essere forniti dallUMP o trasferiti i pre-mRNA per transesterificazione. La delezione degli UMP richiede:1) una endonucleasi,guidata dal gRNA,che taglia il pre-mRNA nel sito dove necessario rimuovere lUMP;2) una 3-esonucleasi specifica per le uridine terminali;3)una ligasi. Linserzione degli UMP invece richiede : 1) unendonucleasi guidata dal gRNA che taglia nel sito dove richiesta linserzione di UMP;2) una TUTasi che trasferisce UMP da UTP ( e non da gRNA);3) una RNA ligasi che rocongiunge i 2 pezzi di RNA. I gRNA sono codificati dal DNA mitocondriale e le proteine per lediting nel nucleo,per poi essere importate nei mitocondri. Editing attraverso deaminazine nucleotidica Nei mammiferi lediting avviene grazie allADAR (adenosina deaminasi agente su RNA) che deaminizza /converte ladenosina in inosina,che presenta un atomo di ossigeno al posto del gruppo amminico delladenina. Siccome linosina,come la guanosina,forma appaiamenti con la citidina,la deaminazione delladenosina cambia il senso di un codone. Lediting ttraverso ADAR essenziale per il normale sviluppo del SNC ed interessante che alcuni tumori perdano lattivit di questa enzima. Un altro editing prevede la (citidina deaminasi agente du RNA) CDAR che converte la citidina a uridina (C-U),ed difettivo in tumori dei nervi periferici e attivo in trascritti HIV in cellule umane. CONTROLLO POST TRASCRIZIONALE DELLESPRESSIONE GENICA Il metodo + conveniente di controllo quello in fase di trascrizione poich la cellula non disperde energia producendo mRNA per proteine non necessarie. Ciononostante uno dei controlli piost-trascrizionali + importante quello riguardante la stabilit dellmRNA,i cui livelli sono correlati con la stabilit del trascritto (e non con il tasso di trascrizione). Stabilit dellmRNA della caseina Se i tessuti della gh.mammaria sono stimolati con prolattina,essi producono la proteina del latte caseina,poich aumenta la [ ] di mRNA per queste proteine. Non aumenta per il tasso di sintesi,ma solo il livello e lemivit/stabilit dellmRNA. Stabilit dellmRNA per ilrecettore della trasferrina Altro esempio del controllo post-trascrizionale riguarda lomeostasi del ferro,ossia il controllo della sua [ ]. A tal proposito nei mammiferi sono impiegate 2 proteine: il recettore per la trasferrina Tfr utile per limporto,e e la ferritinadeputata allaccumulo. La trasferrina entra nelle cellule grazie al Tfr,lega il ferro e lo importa,e se presente in [ ] elevate lo accumula sotto forma di ferritina;se invece vi necessit di ferro,aumenta la [Tfr] e diminuisce quella di ferritina. Per svolgere questi ruoli,la cellula,post-trascrizionalmente,regola il tasso di traduzione dellmRNA della ferritina,e la stabilit delmRNA per il Tfr ,la cui emivita aumenta di ore quando le risorse di ferro scarseggiano. Interferenza dellRNA Per anni sono stati usati RNA antisenso e senso complementari allmRNA per inibire la traduzione e bloccare lespressione di un particolare gene. Oggigiorno si usano invece RNA a doppio filamento (dsRNA) ,di origine virale sperimentale,contenuti negli RNA senso/antisenso;inoltre si osserv che se negli organismi erano inseriti dei transgeni,questi sono disattivati insieme alla copia normale dele gene. Un esempio tipico dato dal tentativo di intensificare il colore porpora delle petunie,fornendo copie extra dei geni per il pigmento,e che aveva come risultato 174 di fiori bianchi. Tale evento dettoPTGS(silenziamento genico posttrascrizionale)nelle piante,RNAi(interferenza dellRNA) negli animali,e quelling nei funghi. Meccanismo dellRNAi Se in C.elegans sono inserite gonadi con dsRNA(trigger) includenti regioni esoniche,negli embrioni si osserva la comparsa di RNAi e la perdita dellmRNA(bersaglio). I dsRNA corrispondenti a introni e promotori non causano RNAi. LRNAi quindi un processo post-trascrizionale che coinvolge la degradazione dellmRNA. Il dsRNA trigger puo essere degradato in brevi frammenti di circa 25 nt(siRNA short interfering RNA) da una nucleasi detta Dicer (in Drosophila)simile alla RNasi II. I frammenti possono poi associarsi con una nucleasi e fornire una sequenza guida che le permetta bersagliare il corrispondente mRNA. Dicer ha anche attivit elicasica che permette di separare i 2 filamenti degli siRNA che crea;non gestisce per la seconda fase dellRNAi,ossia il taglio dellmRNA bersaglio,che invece svolto dallo slicer,che risiede nel complesso di silenziamento indotto dallRNA RISC,insieme alla proteina Argonauta (dotata di attivit di taglio) FORSE FARE ANCHE DA 548 A 552. Amplificazione dello siRNA Le cellule usano lRNA polimerasi diretta da RNA (RdRP) che amplifica gli antisenso di siRNA durante lRNAi quando gli siRNA ibridizzano con lmRNA bersaglio,promuovendo la sintesi di RNA antisenso. In seguito questo nuovo dsRNA digerito da Dicer in nuovi pezzi di siRNA. MicroRNA e silenziamento genico Negli animali e nelle piante i miRNA sono piccoli RNA di 18-25 nt ottenuti per taglio di un RNA precursore da parte di una RNasi Dicer. Essi si appaiano con regioni non tradotte al 3 (3UTR) di specifici mRNA e silenziano lespressione genica bloccando la traduzione degli mRNA. Studiando le mutazioni nel gene lin-4 si scoperto che esse alterano lo sviluppo,e sono presenti nel gene codificante il precursore di un miRNA e non nella regione del gene codificante la proteina. Di conseguenza i miRNA ricudono lespressione(inibendo la traduzione) e sono parzialmente complementari alle sequenze del 3UTR dellmRNA. I

miRNA regolano i geni delle piante e degli animali e ognuno controlla molti geni. Negli animali il grado di appaiamento tra un piccolo RNA(siRNA o miRNA) e lmRNA bersaglio determina il genere di silenziamento che si verifica,e se lappiamento perfetto lmRNA tende ad essere degradato,mentre se lappaiamento insufficiente la traduzione dellmRNA bloccata. Mammiferi ed altri animali possiedono gruppi di geni homeobox/Hox che codificano fattori trascrizionali che contengono omeodomini importanti nello sviluppo embrionale;i geni sono regolati da miRNA trascritti da geni che risiedono nei gruppi Hox. I miRNA causano la rottura /taglio dellmRNA nella regione di appaiamento tra i 2 RNA se si appaiano perfettamente o quasi agli mRNA bersaglio. Esistono distinzioni tra le azioni dei siRNA e dei miRNA animali: 1) I siRNA silenziano i geni inducendo la degradazione di mRNA bersaglio,mentre i miRNA li silenziano interferendo con laccumulo dei prodottiproteici degli mRNA bersaglio,e se lappaiamento miRNA/mRNA bersaglio prossimo alla perfezione il miRNA taglia lmRNA. 2) I siRNA si formano grazie ai Dicer agenti su RNA a doppio filamento,uno dei quali estraneo alla cellula,o deriva da trasposoni. I miRNA sono invece prodotti da Dicer agenti su porzioni a doppio filamento di strutture a stelo-ansa di RNA,normalmente prodotte dalle cellule. 3) I siRNA si appaiano perfettamente con gli mRNA bersaglio e i miRNA in maniera quasi perfetta. Il silenziamento operato da 2 piccoli RNA dipende dal complesso RISC: in Drosophila vi sono 2 Dicer (1 e 2) e 2 complessi RISC (siRISC,miRISC),ma il silenziamento attraverso siRNA richiede siRISC + Dicer1 e 2,e in particolare la Dicer 2 importante nella produzione dei siRNA. Il silenziamento attraverso miRNA richiede miRISC + Dicer 1,importante nella produzione degli mRNA. Quindi la degradazione degli mRNA simile per entrambi poich richiesta una Dicer per generare siRNA/miRNA a doppio filamento (che forniscono RNA a singolo filamento)e che si lega a RISC contenenti Argonauta. Quindi i siRNA o i miRNA attraggono gli mRNA con sequenzecomplementari,frammentatie dal complesso RISC; importante per sapere che i miRNA negli animali possono o agire a livello traduzionale,o ridurre le [ ] di mRNA destabilizzandolo. Nella destabilizzazione hanno un ruolo importante,oltre alle Dicer,glielementi ricchi di AU(ARE)presenti sulle 3-UTR di alcuni mRNA instabili;mi-R16 uno specifico miRNA umano complementare alla sequenza ARE.

CAPITOLO 15- IL MECCANISMO DELLA TRADUZIONE : LINIZIO Con la traduzione i ribosomi leggono il messaggio genetico degli mRNA producendo proteine,e i tRNA fungono da adattatori in grado di legare 1 Aa a un capo,e interagire con lmRNA allaltro capo. INIZIO DELLA TRADUZIONE NEI BATTERI Prima dellinizio si formano amminoacil-tRNA,con i corrispondenti Aa legati covalentemente,grazie al caricamento del tRNA;inoltre i ribosomi si dissociano nelle subunit costituenti poich la cellula deve assemblare il complesso dinizio sulla subunit ribosomiale piccola. Il caricamento del tRNA Tutti i tRNA hanno alla 3 le stesse 3 basi (CCA) in cui lA funge da bersaglio per il caricamento. Un aa aggiunto con legame esterico tra il suo gruppo carbonilico e il gruppo OH 2 o 3 dellA del tRNA grazie allammino acil-tRNA sintetasi in 2 fasi: 1) lAa attivato con lATP formando amminoacil-AMP(ricco di energia fornita dallATP) e pirofosfato;2) lenergia dellamminoacil usato per trasferire lAa al tRNA formando amminoacil-tRNA + AMP. La sintetasi quindi catalizza la produzione dellamminoacil-tRNA e ne determina la specificit,in quanto esistono 20 tRNA(1 per ogni Aa),che portano 1 Aa sul rispettivo tRNA. Dissociazione dei ribosomi Ogni ribosoma consta di 2 aubunit; quello di E.coli 70 S diviso in 30 S e 50 S ognuna composta da 1 o r RNA ribosomiali e proteine associate. La 30 S lega lmRNA e lanticodone del tRNA,mentre la 50S lega lestremit del tRNA caricata con lAa e ha unattivit peptidil trasferasica che lega gli Aa attraverso legami peptidici. In eucarioti e procarioti le 2 subunit si dissociano dopo ogni ciclo di traduzione affinch si formi un nuovo complesso dinizio. La dissociazione dei ribosomi batterici richiede la partecipazione di agenti esterni: in E.coli sono presenti i fattori dinizio IF2,IF1,IF3 e gli ultimi 2 partecipano alla dissociazione. Grazie a tecniche con tamponi a [ ] di Sali crescenti si scopr che IF3 permette la dissociazione di 70 S: esso lega le particelle 30 S ma si stacca quando 30 S e 50 S si associano a formare 70 S;quindi presente soltanto legato a 30 S e si dissocia prima che venga inclusa nel ribosoma. Con ulteriori studi si scoperto che IF1 promuove la dissociazione di IF3 e si lega alle 30 S libere prevenendo la loro riassociazione con la 50 S. Formazione del complesso di inizio 30 S Appena IF1 e IF3 terminano la dissociazione dei ribosomi,la cellula costruisce un complesso dinizio 30 S che include lmRNA,lamminoacil-tRNA e i fattori dinizio. IF3 si lega da solo a 30 S ed stabilizzato da IF2 e IF1: IF1 non puo legarsi da solo ma ha bisogno degli altri 2 per associarsi sulla subunit 30 S nei pressi della 3 dellrRNA 16 S. Appena i fattori si legano attirano lmRNA e il 1 amminoacil-tRNA.

Il primo codone e il primo amminoacil-tRNA Dalla digestione del leucil-tRNA con una RNasi si ottiene un estere adenosilico della leucina,in quanto tale Aa legato al gruppo 3OH dellA terminale del tRNA. Se tale procedimento applicato al metionil-tRNA si ottengono 2 esteri:ladenosil metionina e lN-formil metionina (fMET) che un derivato della metionina. In E.coli esistono 2 diversi tRNA che possono essere caricati con la metionina e solo su quello con la mobilit minoore (tRNAmetf)la metionina viene formilata (la formilazione avviene sul tRNA). Cercando di capire a quali codoni questi tRNA corrispondessero,si scoperto che il tRNAm risponde al codone AUG,e tRNAf a AUG/GUG/UUG,e siccome tRNAf coinvolto nellinizio,allora questi 3 codoni serviranno come codoni dinizio (AUG = 90%;GUG=8%;UUG=1%). In definitiva il codone dinizio nei procarioti AUG e lamminoacil tRNA iniziatore lN-formil-metionil-tRNAmetf,che incorpora nella prima posizione del polipeptide,e lN-formil-metionina che poi rimossa durante la sua maturazione. Lincorporazione del 1 Aa per non favorita dalla formilazione ma dalla porzione tRNA del tRNAmetf Formazione del complesso di inizio 70 S Si forma per far avvenire lallungamento e durante la sua formazione IF1 e IF3 si dissociano. Quando IF2 lasciail complesso,il GTP idrolizzato a GDP e guida il rilascio di IF2 che potrebbe interferire con la formazione di un complesso di inzio 70 S attivo. GTP fa parte del complesso dinizio 30 S ed rimosso quando 50 S si aggiunge al complesso,grazie a IF2 che contiene unattivit GTPasica ribosoma-dipendente che idrolizza il GTP a GDP e fosfato inogranico. La GTPasi formata dallunione dei ribosomi e dellIF2. La 30 S non puo complementare IF2 poich il GTP non idrolizzato finch la 50 S non raggiunge il complesso. Lidrolisi del GTP serve a rimuovere IF2 dal complesso 70 S cosi che possa legare unaltra molecola di formil-metionina-tRNA in un altro complesso di inizio 30 S;tale riciclo unattivit catalitica vera e propria. Se il fattore rimane legato alla 70 S,a causa di una mancata idrolisi di GTP,non puo riciclarsi. Se aumenta lIF2,si lega pi fMet-tRNA,ma i ricercatori ebbero lo stesso effetto aggiungendo subunit 30 S e 50 S,permettendo lidrolisi del GTP e il rilascio di IF2 cosi da farlo agire cataliticamente. La vera funzione del GTP perci di rimuovere IF2 e lo stessp GTP dal 70 S,cosi che possa iniziare lallungamento della catena polipeptidica. INIZIO NEGLI EUCARIOTI Avviene usando la metionina,ma il tRNA iniziatore diverso da quello che aggiunge Met nei polipeptidi,poich trasporta metionine non formilate ed chiamato tRNAmeti. Inoltre lmRNA eucariotico non contiene sequenze Shine-Dolgarno che indichino ai ribosomi da dove iniziare a tradurre,ma al suo posto contiene un cap al 5,che dirige i fattori a legarsi e cercare un codone dinizio. Modello di scansione dellinizio La > parte degli mRNA batterici sono policistronici,ossia contengono informazioni per geni multipli (cistroni) ognuno dei quali ha il proprio codone dinizio e sito di legame al ribosoma;sono rari negli eucarioti,a parte alcuni virus e per questo gli mRNA eucariotici riconoscono il sito dinizio sul cap al 5,ed eseguono la scansione dellmRNA in direzione 5-3finch non incontrano il codone dinizio. Kozak us tale tecnica poich: 1)in nessun caso la traduzione iniziava su un AUG interno (come per i batteri);2) linizio non avveniva ad una distanza fissa dallestremit 5 di 1 mRNA;3)negli mRNA studiati il 1 AUG a valle del cap era usato per linizio;4)il cap al 5 dellmRNA facilita linizio. Nel 10% dei casi il ribosoma non riconosce il 1 AUG,ma ne salta 1o 2 prima di incontrare quello giusto. Linizio migliore avviene,secondo la regola di Kozak (secondo cui linizio + efficiente si ha con una G/A in posizione -3,e una G in posizione +4) con la sequenza ACCAUGG. Gli mRNA che,nonostante abbiano a monte 1 AUG favorevole,cominciano comunque su un AUG a valle,posseggono codoni di stop tra i 2 AUGm,e di conseguenza linizio a valle rappresenta un re-inizio da parte dei ribosomi che cominciano a monte,si fermano al codone di stop e ripartono a valle. Lo spazio che intercorre tra 1 codone dinizio e 1 di terminazione a valle,nello stesso registro di lettura, definito ORF/cornice di lettura aperta,che potenzialmente codifica una proteina e che per funzionare ha bisogno che la ORF a monte sia breve (perch i fattori utili per il reinizio sono gi diffusi altrimenti). Le strutture secondarie dellmRNA,come le forcine,possono influenzare (positivamente e negativamente)linizio: infatti una forcina dopo un AUG puo forzare una subunit a fermarsi sullAUG stimolando linizio;invece una struttura a stelo-ansa,tra il cap e il sito dinizio,puo bloccare la scansione operata dalle subunit,e inibire linizio. Alcuni mRNA virali e cellulari presentano sequenze di entrata ribosomiale interne (IRES) in grado di attrarre i ribosomi allinterno dellmRNA senza laiuto del cap. Fattori di inizio eucariotici Sono necessari per riconoscere il cap al 5 di un mRNA e legare la subunit ribosomiale 40 S pi vicina.

eIF2 = come lF2 batterico, responsabile del legame dellamminoacil-tRNA iniziatore con il ribosoma grazie al GTP,che idrolizzato a GDP quando il fattore si dissocia dal ribosoma. In seguitoeIF2B/GEF (fattore di scambio del nt guanidinico) scambia GTP con GDP sul fattore per permetterne il successivo funzionamento e attivare eIF2. eIF3 = somiglia a IF3 poich lega la subunit 40 S impedendone la riassociazione con la subunit 60 S. eIF4F = una proteina complessa che lega il cap permettendo alla particella 40 S di legare lestremit 5 dellmRNA.

eIF1/eIF1A = aiuta 40 S,dopo che ha legato il cap,ad attuare la scansione del codone dinizio/anticodone. eIF5 = non ha una controparte batterica nota,e stimola lassociazione della 60 S con il complesso dinizio 40 S (chiamato anche 48 S poich include mRNA,met-tRNA e altri fattori). eIF6 = un fattore antiassociativo(come eIF3) che lega la subunit 60 S bloccando la sua riassociazione con la 40 S. Funzione di eIF4F Il cap al 5 stimola lefficienza di traduzione di un mRNA ed riconosciuto dal complesso eIF4F,costituito da 3 polipeptidi : eIF4E (24kd) che lega il cap ed la vera parte catalitica;eIF4A (50kd) ed eIF4G (220kd). Funzioni di eIF4A ed eIF4B eIF4A ha unattivit indipendente,fa parte delle proteine DEAD(Asp,Glu,Ala,Asp) ed ha unattivit di RNA elicasi,poich svolge le forcine nelle sequenze leader al 5 degli mRNA eucariotici. Nel suo compito aiutato da eIF4B che ha un dominio di legame allRNA,stimolando linterazione di eIF4A con lmRNA,con lausilio dellATP. Funzioni di eIF4G Gli mRNA virali privi di cap posseggono proteine IRES che favoriscono il legame ai ribosomi,e inoltre la coda poli(A) al 3 dellmRNA stimola la traduzione. In lievito la proteina Pab1p (lega poliA) recluta i ribosomi sul messaggero. 1) Nella traduzione sugli mRNA provvisti di cap lammino terminale di eIF4G lega eIF4E,che lega il cap;la parte centale di eIF4G lega eIF3(capace di legare 40 S) e,formando un ponte tra eIF4E ed eIF3,porta la subunit 40 S vincino la 5 dellmRNA dove ha inizio la scansione. 2) Nella traduzione dei virus privi di cap (poliovirus) e dotati di IRES,una proteasi virale taglia il dominio ammino-terminale di eIF4G,che non interagisce pi con eIF4E nel riconoscimento del cap. Quindi gli mRNA cellulari con cap restano non tradotti. La restante parte di eIF4G per non capace di legare il dominio V delle IRES del poliovirus,in modo che le 40 S possano essere reclutate sullmRNA virale. Nel vaccino di Sabin infatti,in ogni ceppo,ogni evento di attenuazione rappresentato da unalterazione nel dominio V delle IRES virali,che riduce laffinit per eIF4G compromettendo la traduzione delmRNA virale. Struttura e funzione di eIF3 Collabora con eIF4E e eIF4G nel reclutare 40 S sugli mRNA provvisti di cap,e con eIF4G recluta 40 S sugli mRNA virali provvisti di IRES. LeIF3 inoltre impedisce che la particella 60 S si riassoci con 40 S prima che il processo di inizio sia completo. Con la microscopia crio elettronica si p scopero che eIF3 una proteina complessa penta-lobata costituita da 12 polipeptidi. (PAGINA 591-592) Funzioni di eIF1 ed eIF1A I loro geni sono essenziali per la vitalit del lievito,e i 2 fattori agiscono sinergicamente per formare un complesso 48 S stabile. Sembrano agire dissociando i complessi non corretti tra la subunit 40 S e lmRNA,permettendo a 40 S di effettuare la scansione fino al codone dinizio e favorendo la formazione di 48 S stabili. In loro assenza la 40 S fa la scansione solo di alcuni,o nessun,nt,e resta legato allmRNA debolmente. Funzioni di eIF5 ed eIF5B Appena eIF2 consegna Met-tRNA alle subunit 40 S,e lmRNA forma il complesso di inizio 48 S.eIF2 si dissocia dalla subunit 48 grazie allidrolisi del GTP indotta da eIF5,legato a eIF2. Dopo lidrolisi per il complesso 48 S ha bisogno del fattore eIF5B per accettare 60 S e terminare il processo di inizio. Il fattore eIF5B somiglia al fattore IF2 nella modalit di legame al GTP,poich ha bisogno del GTP per essere rilasciato dal ribosoma,e poich la loro attivit GTPasica stimolata dal ribosoma,ed entrambi stimolano lassociazione delle subunit ribosomiali. Il fattore eIF5B per non puo stimolare il legame di Met-tRNA,a differenza di IF2 che ha tale ruolo nei batteri,mentre negli eucarioti tale compito spetta a eIF. CONTROLLO DELLINIZIO Il controllo dellespressione genica avviene anche a livello traduzionale (non solo post),in modo che i nuovi progetti genici siano sintetizzati rapidamente. Controllo della traduzione nei batteri Avviene principalmente a livello trascrizionale,in linea con lemivita breve degli mRNA batterici (1-3 minuti) che permette ai batteri di rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali. Cambiamenti nella struttura secondaria dellmRNA Le strutture secondarie dellRNA possono governare linizio della traduzione,come nel gene per la replicasi della classe di fagi MS2,il cui codone dinizio nascosto in una struttura secondaria finch i ribosomi,traducendo il gene per il rivestimento,non aprono la struttura secondaria che nasconde il codone del gene. Altro esempio di controllo attraverso la struttura dellmRNA nella sintesi di 32 in E.coli : se queste cellule sono sottoposte ad un aumento della temperatura,il gene per 32,che normalmente ripiegato con il codone dinizio nascosto in una struttura secondaria e appaiato con unaltra regione dellmRNA a valle, interessato dalla fusione dellappaiamento della struttura secondaria,smascherando il codone e facendo tradurre lmRNA. Il fattore perci sempre disponibile,ma traducibile solo se la cellula interessata da uno schock termico. Lespressione genica stimolata perci dal termosensore intrinseco allmRNA. Cambiamenti nella struttura secondaria dellmRNA indotti da proteine ed RNA Negli eucarioti la traduzione e la stabilit degli mRNA sono controllati da microRNA,mentre nei batteri tale ruolo svolto da smallRNA (sRNA) agenti sulla struttura secondaria dellmRNA. Linizio della traduzione puo essere regolata anche

da riboswitch (regioni alinterno degli mRNA) che possono legare piccole molecole,cambiare conformazione e provocare modificazioni dellespressione genica. La regione dellRNA che lega la piccola molecola detta aptamero.

CAPITOLO 16 IL MECCANISMO DELLA TRADUZIONE II : ALLUNGAMENTO E TERMINAZIONE DIREZIONE DELLA SINTESI E DELLA TRADUZIONE DELLmRNA Dintzis forn la prova per la direzione amminocarbossilica studiando la sintesi di e globine in reticolociti di coniglio.marc le catene nascenti delle globine per tempi brevi con [ 3H] leucina,e per tempi lunghi con [14 C] leucina. In seguito separ le 2 globine e individu le quantit relative di [ 3H] leucine incorporate nei peptidi in funzione della loro posizione nella proteina. La marcatura sar evidente nel 1 peptide solo nelle proteine in cui linizio della sintesi combacia con il momento in cui marcata,mentre la fine della marcatura sar ricca in marcatura ache se brevemente esposta: se la traduzione parte dallestremit ammino-terminale,la marcatura sar intensa nella C-terminale. La lettura degli mRNA avviene in direzione 5->3,ossia la stessa direzione in cui sono sintetizzati,poich gli Aa N-terminali sono aggiunti per primi. CODICE GENETICO E costituito da codoni di 3 basi/nt correlati ai 20 Aa: siccome i codoni non sono sovrapponibili,ogni base deve far parte al massimo di 1 codone,e nel caso in cui avvenga un cambio di base nellmRNA (mutazione di senso),nella proteina risultante cambier 1 solo Aa. Il codice inoltre non presenta interruzioni e nel cso di mutazioni frameshift (per slittamento della cornice di lettura) di inserzione e delezione,si assiste a errori che persistono fino alla fine del messaggio. Codice a triplette Khorana sopr che i codoni contengono 3 basi sullmRNA e istruiscono il ribosoma a incorporare specifici Aa in un polipeptide. Decifrazione del codice Niremberg scopr che 1 trinucleotide simile ad 1mRNA nel causare il elgame di 1 amminoacil-tRNA al ribosoma e in molti casi + di una tripletta codifica un dato Aa (codice degenerato). Esistono 64 codoni e solo 20 diversi AA,e ciononostante tutti i codoni sono usati. Tre di questi sono codoni di stop (UGA.UAG,UAA) e gli altri 61 sono specifici per gli Aa ,e per questo motivo il codice altamente degenerato. Appaiamenti insoliti tra codone e anticodone La presenza di + codoni potrebbe essere spiegata con lesistenza di tRNA multipli (specie isoaccettori,circa 60) per lo stesso Aa che riconoscono diversi codoni anche se ci si potrebbe accontentare di meno tRNA. Crick ha ipotizzato che le prime 2 basi di un codone si appaiano correttamente con lanticodone,mentre lultima base forma un appaiamento insolito (ipotesi del vacillamento). Uno dei nucleosidi trovati nel tRNA da Crick linosina,simile strutturalmente alla guanosina,che puo legarsi con C,U e A (basi terminali). In questo modo lo stesso amminoacil-tRNA puo accoppiarsi con + di 1 codone:le coppie vacillanti sono G-U/O e I/A. IL MECCANISMO DELLALLUNGAMENTO Comincia con lmRNA e un fMet-tRNAf legati al ribosoma,su cui ci sono 3 siti di legame per lamminoacil-tRNA: 2 siti P (peptidilici) e 1 sito A (aminoacidico) + 1 sito E (di uscita) per il tRNA deacilato;l fMet-tRNAf nel sito P. 1) Il processo inizia grazie al fatto di allungamento EF-Tu che,grazie al GTP,lega al 1 Aa un amminoacil-tRNA al sito robosomale A;il legame specificato dal codone. 2) Si forma poi il 1 legame peptidico: la peptidil trasferasi,elemento della subunit ribosomale grande,trasferisce lfMet dal suo tRNA nel sito P,allaminoacil-tRNA,appena giunto,nel sito A. Forma cosi un dipeptide legato al tRNA nel sito A che prende il nome di dipeptidil-tRNA. Il tRNA privo del suo Aa,che resta nel sito P, deacilato. La trasferasi negli eucarioti inibita dal CLORAMFENICOLO nei mitocondri degli eucarioti,e in particolare nei batteri. 3) Durante la traslocazione EF-G,con GTP,tralosca il peptidil-tRNA crescente,con il suo codone sullmRNA,in avanti verso sx e in questo modo:il tRNA deacilato nel sito P lascia il ribosoma attraverso il sito E;il dipeptidetRNA nel sito A,con il suo codone corrispondente,si muove nel sito P e il codone in attesa sulla dx si muove nel sito A,per interagire con 1 aminoacil-tRNA. Il processo si ripete per aggiungere un altro Aa:EF-Tu e GTP combinano laminoacil-tRNA con il nuovo codone nel sito A;la peptidil trasferasi porta il dipeptide nel sito P congiungendolo allaminoacil-tRNA nel sito A,creando un tripeptidil-tRNA;EF-G trasloca il tripeptide ,con il suo codone sullmRNA,sul sito P. Fase I: legame di un aminoacil-tRNA al sito A del ribosoma Nishizuka e Lipmam,attraverso la cromatografia a scambio ionico,scoprirono 2 fattori utili nella creazione del legame peptidico: T (trasfer) e G (per attivit GTPasica); T esiste come Tu (instabile) e Ts(stabile) e i 3 sono chiamati EF-Tu,EF-Ts,EF-G. EF-Tu ed EF-Ts cooperano per trasferire laminoacil-tRNA al ribosoma:EF-Tu e GTP formano il complesso binario,poi laminoacil-tRNA si aggiunge al complesso creando un complesso ternario che depone laminoacil-

tRNA nel sito A del ribosoma.mentre EF-Tu e GTP restano legati al ribosoma. In seguito il GTP idrolizzato e il complessoo EF-Tu-GDP si dissocia dal ribosoma e lEF-Ts scambia il GDP con GTP sul complesso per riformare EFTu-GTP. ET-Ts riesce in ci poich indebolisce il legame tra Ef-Tu e il Mg2+,permettendo la dissociazione del GDP,che a sua volta permette il game del GTP a EF-Tu. EF-Tu necessario per il trasporto dellaminoacil-tRNA poich lo protegge da uneventuale idrolisi del legame esterico tra gli Aa e i rispettivi tRNA,e per tale motivo presente in quantit abbondante nelle cellule. La prima fase di allungamento responsabile della correzione delle bozze,ossia di eliminare aminoacil-tRNA non corretti prima che questi diano Aa errati al polipeptide in crescita. Esiste un equilibrio tra acuratezza e velocit7tasso di traduzione: se procede velocemente,il ribosoma non ha abbastanza tempo per far allontanare il complesso ternario e laminoacil-tRNA prima che un Aa scorretto sia incorporato nel polipeptide in crescita;se invece la traduzione procedesse lentamente ,sarebbe + accurata ma non sarebbero prodotte abbastanza proteine da consentire la sopravvivenza. Lequilibrio concesso dal tasso didrolisi del GTP da parte di EF-Tu:in E.coli la correzione avviene nellintervallo tra formazione del compelsso ternario/idrolisi di GTP e dissociazione di EF-Tu-GDP dal ribosoma. Fase II: formazione del legame peptidico Dopo lazione dei fattori di allungamento,il ribosoma presenta lfMettRNAf nel sito P,e 1 aminoacil-tRNA nel sito A,e crea il legame peptidico grazie allattivit enzimatica intrinseca/peptidil trasferasi contenuta nella subunit 50 S. La 50 S contiene lrRNA 23 S e le proteine L2,L3,L12,L22 + altre proteine ma lattivit minima della trasferasi svolta dal 23 S,da L2 e L3;con studi di cristallografia a raggi X (Steitz)si scoperto che la 23 S si trova nel centro catalitico e sembra contenere lattivit della trasferasi in vivo. Fase III:la traslocazione Dopo lazione della trasferasi,il ribosoma presenta un peptidil-tRNA nel sito A e 1 tRNA deacilato nel sito P,e la traslocazione prevede il movimento dellmRNA e del peptidi-tRNA di un codone (3nt) in avanti attraverso il ribosoma. In tal modo il peptidil-tRNA posizionato nel sito P,mentre il tRNA deacialto espulso grazie allEF-G che catalizza GTP. Ruolo di GTP ed EF-G In E.coli la traslocazione dipende dallEF-G e dal GTP:negli eucarioti lEF(omologo di EFG) esegue lo stesso processo. Kaziro dimostr che EF-G e GTP devono agire sinergicamente e che lidrolisi del GTP ( che avviene prima della traslocazione) riduce il rilascio di EF-G dal ribosoma cosi che EF-G e il ribosoma possano partecipare ad un altro ciclo di allungamento. In vitro,per,un certo grado di traslocazione puo avvenire in assenza di EF-G grazie allantibiotico Sparsomicina:il ribosoma puo perci effettuare la traslocazione indipendentemente,grazie allenergia contenuta in s stesso,nel tRNA e nellmRNA Le GTPasi e la traduzione Alcuni fattori di traduzione usano lidrolisi del GTP per i movimenti molecolari e fanno parte della famiglia delle proteine-G che:legano GTP e GDP;si alternano in 3 stati a seconda che leghino o meno i nt;hanno attivit GTPasica intrinseca stimolata dalle GAP nel tagliare il GTP legato,e sono inoltre attive se legate a GTP. LA TERMINAZIONE Lallungamento della catena polipetidica continua finch il ribosoma incontra un codone di stop. Benzer e Champ identificarono il 1codone di terminazione,detto codone ambra che causava una mutazione nel fago T4,provocando la perdita dellattivit della fosfatasi alcalina. Esistono anche:codone ocra ecodone opale. Siccome la mutazione ombra causata da mutageni che provocano mutazioni di senso,allora anche le mutazioni ambra derivano dalla conversione di un codone ordinario in uno di stop,tramite il cambio di una base. Nel codice genetico tale mutazioni creano 3 codoni di terminazione: UAG-ambra;UAA-ocra;UGA-opale,e talvolta possono essere presenti anche 2 codoni stop in fila,cosi da consentire una terminazione sicura nel caso in cui la terminazione venga soppressa in un codone. POST-TRADUZIONE La terminazione seguita da processi post-traduzionali o co-traduzionali: Ripiegamento delle proteine nascenti (co-traduzionale) le proteine sono ripiegate sul polipeptide nascente per nascondere allinterno le regioni idrofobiche finch non prodotto il loro partner specifico,con cui legarsi. Gli chaperone molecolari svolgono tale ruolo avvolgendo queste regioni in una tasca idrofobica,prevenendone lassociazione con altre regioni. In E.coli esiste lo chaperone fattore trigger che si associa alla 50 S del ribosoma e accoglie le regioni idrofobiche neo-sintetizzate in un canestro idrofobico per proteggerle dallacqua. Il sito di legame per questo fattore altamente conservato in archea e batteri,ma il fattore non essenziale per la vita in E.coli,in quanto esiste un ulteriore chaperone detto Dna K,una proteina freestanding che possiede un arco idrofobico che protegge le regioni idrofobiche esposte delle proteine nascenti,cosi da permetterne un efficace ripiegamento. Eucarioti ed archea usano invece gli chaperone freestanding,poich sono sprovvisti del trigger. Rilascio dei robosomi dalmRNA Il fattore di riciclo ribosomale RRF,secondog li studi fi Kaji e Ciljas,si lega al sito A,come laminoacil-tRNA (in un orientamento diverso da quello dellRNA nel sito A) permettendone la traslocazione in presenza di EF-G,e rilasciando poi il ribosoma o la 50 S,grazie allaiuto di EF-G.