~ Patologia molecolare ~

Prof. Lollini, Nanni e Grilli

Il corso sarà composto da due corsi integrati: Oncologia genetica (cause e meccanismi generali della
malattie ereditarie) e Oncologia.
Esame orale durante il quale è possibile verbalizzare il voto derivato dalla media con immunologia.

Programma/Contenuti - Pier-Luigi Lollini

LE ALTERAZIONI DEL GENOMA COME CAUSA DI MALATTIA

Tipi e cause di mutazione e loro effetti patogenetici.

BASI MOLECOLARI DI MALATTIE CROMOSOMICHE

Sindrome di Di George (CATCH). Le sindromi di Prader-Willi e Angelman e i meccanismi
dell'imprinting parentale. Metilazione del promotore.

BASI MOLECOLARI DI MALATTIE CROMOSOMICHE

Sindrome dell'X fragile, Corea di Huntignton e meccanismo di espansione delle triplette.

BASI MOLECOLARI DI MALATTIE MENDELIANE

Alterazioni di proteine del citoscheletro: la sferocitosi ereditaria. Il gene DMD, ruolo della
distrofina e distrofie muscolari di Duchenne e di Becker. Alterazioni di proteine della matrice
extracellulare: le malattie del collagene (osteogenesi imperfetta, sindromi di Ehlers-Danlos) e della
fibrillina (sindrome di Marfan).
Alterazioni di proteine recettoriali: la ipercolesterolemia familiare. Struttura del recettore delle LDL
e le diverse classi di mutazioni. Alterazioni di enzimi lisosomiali: i meccanismi di "sorting" degli
enzimi lisosomiali e le tesaurismosi. Alterazioni dei canali ionici: la fibrosi cistica. Ruolo della
proteina CFTR nel trasporto del cloro.
Alterazioni di proteine di membrana della cellula nervosa. Malattie prioniche: ipotesi di Prusiner.
Forme ereditarie della malattia di Alzheimer: ruolo della proteina APP e delle preseniline.

MECCANISMI GENERALI DI CONTROLLO E CONSERVAZIONE DELL'INTEGRITÀ

GENOMICA
Meccanismi di riparazione del danno genotossico: NER, BER, ricombinazione omologa e
"mismatch repair". Il "network" di rilevazione del danno genotossico: il ruolo dei geni ATM e p53.

SINDROMI NEOPLASTICHE EREDITARIE (ALTERAZIONI GENI GATEKEEPER)

Alterazioni di geni "gatekeeper". Il retinoblastoma: ipotesi di Knudson. Il cancro del colon
ereditario poliposico: ruolo della proteina APC nel controllo del ciclo cellulare e nella mitosi. La
von Hippel Lindau e i meccanismi di rilevazione dell'ipossia.

SINDROMI NEOPLASTICHE EREDITARIE (ALTERAZIONI GENI CARETAKER)

Xeroderma pigmentosum, atassia telangectasia, forme ereditarie di cancro mammario, Li-Fraumeni,
cancro ereditario del colon non poliposico.
lezione del 3 marzo 2011
Il genoma umano
In generale tutte le malattie sono il risultato di una combinazione tra ambiente e del nostro genoma
e ogni malattia ha proporzioni variabili di cause derivanti dall'uno o dall'altro. Nelle malattie
ereditarie è minore il contributo ambientale mentre nei tumori abbiamo una predominanza della
componente ambientale.

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Il genoma umano è organizzato in due distinti, uno grande nei cromosomi e uno piccolo
mitocondriale. Si possono avere malattie con mutazioni che colpiscono uno dei due genomi, anche
se i maggiori sono quelli che colpiscono quelle nucleari. Il genoma nucleare è composta da 3300
Mb mentre il mitocondriale è 16,6 Kb. Il DNA che codifica per proteine è il 3% del totale; il 90% è
fatto di zone non codificanti, quindi ¼ del DNA è fatto di genie e sequenze relate mentre il 75% è
formato da DNA extragenico e non ha un ruolo nella codifica delle proteine. Buona parte del DNA è
ripetuto e le ripetizioni sono fonti di errori.
Le sequenze ripetute possono appaiarsi in
maniera errata. Il DNA extragenico presenta
il 40% ripetitivo e il 60% di copia singola o
basso numero di copie.

Il 10% del 25% (2,5%) codifica per

proteine; il resto sono sequenze associate ai
geni che svolgono o un ruolo regolatorio
(promotori per esempio) e poi ci sono delle
sequenze non codificanti che però possono
dare luogo a patologie ereditarie (introni);
infine troviamo gli pseudogeni che nel corso
dell'evoluzione si sono danneggiati. Anche
questi ultimi possono dare luogo a
patologia.

Livelli di complessità del genoma

• Chimico: basi, legami e complementarietà;
• Informazionale: sequenza di un gene; le basi
sono delle lettere e non più delle strutture
chimiche.
• Strutturale: con formazione dei nucleosomi e
della cromatina. I cromosomi possono essere
considerati come organuli cellulari
• Subcellulare.

Il cromosoma mitocondriale è circolare. Il cariotipo

è la colorazione dei cromosomi e la loro messa in
ordine mentre il cariogramma è un disegno del
cariotipo. Avere i cromosomi tondi (mitocondriali) o
lineari è differente quando parliamo per esempio di
duplicazione; per esempio il cromosoma tondo non ha fine ed inizio; uno lineare ha delle estremità
e gli enzimi che duplicano il DNA, l'ultimo pezzo del DNA (telomero) non è replicabile e quindi
non ha sequenze codificanti e sono oggetto di erosione nella progressione delle mitosi. Nelle cellule
normali si accorciano. Il problema invece è per le cellule staminali e per le cellule tumorali. In
questi casi c'è un enzima chiamato telomerasi che riallunga i telomeri. I cromosomi inoltre hanno
un centromero che serve per tirare un cromosoma da una parte e uno dall'altro per evitare che vi
siano problemi nella segregazione.

L'inizio della trascrizione non corrisponde all'inizio della proteina ma ci può essere una regione
chiamata 5' non traslata che precede il primo esone. Il gene non finisce con un codone di stop
perchè possono esserci delle regioni 3' non traslate.
I geni umani sono 25000 + 37 mitocondriali; è presente 1 gene ogni 40-50 Kb, circa 3000

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geni/cromosoma e circa 130 geni/banda. Le dimensioni in media sono 10-15 Kb e gli esoni sono in
numero variabile da 1 a 80 con dimensione media di 2,5 bp. L'mRNA ha una dimensione media di
2,5 Kb che non è tutto non codificante ma la dimensione codificante è 1,5-1,8 Kb.

Il genoma è un'entità dinamica che si modifica con l'evoluzione. Ciò però comporta anche la
possibilità che si sviluppino delle patologie a carico del genoma stesso.
Vi sono molte varianti fisiologiche nel genoma:
• Alleli varianti di un gene che possono essere presente in un soggetto;
• Wild-type: singolo allele;
• Polimorfismo: 2 o più alleli, ciascuno > 1% nella popolazione (es. HLA);
• Varianti rare: < 1% nella popolazione che non danno nessuna malattia di per sé ma possono
esporci a differenti malattie.
Un tempo si parlava di polimorfismo in funzione del fenotipo ma oggi si afferma u polimorfismo
come una variante i sequenza del DNA. Possono trovarsi anche in regioni non codificanti quindi
non implicano necessariamente differenze di fenotipo ma solo di genotipo.
Gli studi dei polimorfismi sono (utilizzabili anche contemporaneamente):
• RFLP: Restricted Fragment Lenght Polymorphism. Se usiamo questi polimorfismi
dobbiamo sapere che il concetto di allele applicato ai polmorfismi acquista differenti
significati. Sono enzimi batterici che tagliano il nostro DNA in posizioni particolari. Qui
posso avere 2 alleli (o l'enzima ha tagliato o non ha tagliato con 10000 loci – che sono
poche);
• VNTR: Variable Number of Tandem Repeats. Varianti di lungghezza dovute a numero
variabile di sequenze ripetute. Comporta un elevato polimorfismo.
• SNP: Single nucleotide Polymorphism. Oggi dominano la ricerca biomedica in quanto si
studiano le differenti varianti nucleotidiche in relazione alla patologia. Comprende tutti i
RFLP. Ha un'ordine di grandezza >106.
In definitiva tutte le malattie hanno un substrato genico. Un singolo gene è causa di una malattia
mendeliana, geni multipli danno malattie complesse, i polimorfismi danno luogo a suscettibilità a
malattie non genetiche. La farmacogenetica studia la suscettibilità agli effetti dei farmaci in
relazione alla genetica.
Le patologie mendeliane sono nel 90% dei casi pediatriche, <10% post-puberali e circa l'1% dopo il
periodo riproduttivo. La prevalenza è lo 0,4% su nati vivi mentre rappresentano il 6-8% dei bambini
ospedalizzati.
Per le malattie complesse e multifattoriali c'è una prevalenza del 60% nella popolazione.

Effetti dei polimorfismi

L'isoniazide (battericida antitubercolare) è inattivata per acetilazione e nella popolazione ci sono
due velocità di acetilazione, veloce e lenta; gli acetilatori veloci comportano una scarsa risposta
all'isoniazide ed hanno rari effetti collaterali. Gli acetilatori lenti hanno buona risposta al farmaco
ma hanno anche maggiori effetti collaterali. I geni coinvolti sono N-acetiltransferasi NAT1 e NAT2
e gli acetilatori lenti hanno livelli ridotti di enzima e vi sono differenze etniche: caucasici 50-90%
slow, asiatici 5-20% slow.
Gli acetilatori lenti hanno alta incidenza di effetti collaterali da altri farmaci e sono più suscettibili a
vari cancerogeni (es. fumo da tabacco).
Secondo uno studio recente vi sono dei geni connessi al metabolismo dei cancerogeni ma questi
polimorfismi sono espressi a livello cerebrale e condizionano il nostro comportamento in relazione
al fumo da tabacco per esempio.
Ogni volta che si trova un meccanismo si trova anche un target per una terapia.
Una curiosità:
La caffeina aumenta il rischio di infarto del miocardio? Gli studi epidemiologici di popolazione su

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questa relazione hanno dato risultati contraddittori. La caffeina è catabolizzata dal citocromo
P4501A2, codificato dal gene polimorfico CYP1A2; chi ha questo allele lento hanno un aumento
quasi del doppio del rischio di infarto del miocardio mentre non notiamo alcun cambiamento in chi
ha l'enzima rapido.

Patologia molecolare 4 marzo Lollini

Dal gene alla proteina
Una mutazione è qualsiasi alterazione del DNA
I principali tipi di mutazioni sono:
– Sostituzioni di basi
– Inserzioni
– Delezioni
• Dimensioni
– Geniche (Puntiformi, parti di geni)
– Cromosomiche (Parti di cromosomi)
– Genomiche (Interi cromosomi)

Sequenze interessate possono essere:

– Singola sequenza
– Scambi tra 2 o più sequenze indipendenti

Le cause di queste mutazioni possono essere:

• Spontanee, casuali;
• Indotte da mutageni, cancerogeni.

Nomenclatura delle mutazioni (non c'è mai 0 ma si parte da 1)

• Sostituzione: c.G1444>A
• Delezione: 1524-1527del
• Inserzione: c.1277-1278insTATC

La variabilità dinamica del DNA è la base delle patologie ma anche dell'evoluzione. Avremo due
classi di mutazione:
• che colpiscono le cellule della linea germinale che sarà ereditata dalla progenie. O
(raramente) dà un vantaggio evolutivo che viene ereditato. L'evento più frequente di queste
mutazioni è l'aborto spontaneo. In alcuni la mutazione è dannosa ma non letale e darà
origine alla patologia ereditaria.
• che colpiscono le cellule somatiche. Il vantaggio evolutivo si presenta con il cancro, con
proliferazione incontrollata di una linea differenziativa. Qualche mutazione ha quindi dato
un vantaggio evolutivo ad una cellula che è diventata cancerogena. In altri casi si può avere
la morte cellulare. Se la patologia si manifesta presto si può avere una patologia congenita.

Il DNA polimerasi si può sbagliare e la fedeltà della polimerasi è incompleta:

• Una persona adulta è formata da 1014 cellule
• Occorrono 1016-1017 divisioni cellulari (includendo embriogenesi e ricambio cellulare)
• Genoma umano = 3x109 paia di basi
• Ogni replicazione del DNA richiede l’incorporazione di 6x109 nuove basi
• 6x109x1016=6x1025 nuove basi nell’intera vita
• Fedeltà delle DNA polimerasi: 1 errore ogni 109-1011 basi incorporate
• Quindi ogni persona nella sua vita accumula più di mille miliardi di mutazioni

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Quindi le mutazioni sono fenomeni spontanei che originano fin dalla replicazione cellulare.
La replicazione cellulare comporta rischio di mutazione ed il numero di mutazioni è maggiore dove
si ha maggiore replicazione. Nelle malattie genetiche le mutazioni de novo sono più frequentemente
di origine maschile. Nelle mutazioni de novo nel retinoblastoma l'88% deriva dal padre (ciò è
connesso anche all'età del padre al momento del concepimento) mentre solo il 12% dalla madre.
Zigote → Gamete ♀ ~30 divisioni cellulari
Zigote → Gamete ♂ 30-900 divisioni a seconda dell’età

Le mutazioni hanno quindi sia a mutageni esogeni (radiazioni ionizzanti, radiazioni eccitanti,
farmaci, cancerogeni chimici che possono essere ridotti nell'ambiente) che endogeni che danno
dentro di noi già delle mutazioni (Elementi trasponibili, Differenziamento dei linfociti T e B (nel
quali c'è il riarrangiamento del TCR e del recettore delle Ig e quando le cose vanno storte arriva un
gene che causa il cancro), Prodotti del metabolismo cellulare, Infiammazione (i fagociti producono
intermedi reattivi dell'ossigeno che sono a loro volta mutageni)).

Molte mutazioni non hanno conseguenze a livello di proteina perchè abbiamo visto che la parte che
codifica per le proteine è molto piccola e la maggior parte delle mutazioni cadono in zone non
codificanti (97%). In generale questo attenua l'effetto di tutto il carico mutazionale. Poi dato che il
codice genetico è degenerato si possono manifestare delle mutazioni silenti.

Mutazioni in DNA codificante

Sinonima (silente) = stesso aminoacido in quanto il DNA è degenerato (più triplette
corrispondono allo stesso AA);
Nonsenso = codone stop. La gravità delle conseguenze dipendono dalla zona che viene troncata,
se alla fine o all'inizio della regione codificante.
Di senso (missense)
conservativa = aminoacido funzionalmente simile, per esempio un amminoacido
lipofilo transmembrana lipofilo che può diventare un altro lipofilo senza grosse
differenze funzionali.
non conservativa = aminoacido funzionalmente diverso, per esempio un amminoacido
lipofilo transmembrana lipofilo che può diventare un non lipofilo con grosse
differenze funzionali. In molti casi questa alterazione può essere patologica.

Alcune mutazioni di una zona non codificante possono alterare una proteina. Possono esserci
alterazioni nel promotore o nell'enhancer del gene può essere modificata la trascrizione delle
alterazioni della trascrizione. Possono esserci delle mutazioni del sito di splicing e quindi lo splicing
può non essere corretto. Le zone di confine della zona di splicing sono dette SO (Splice Omor) e SA
(splice Acceptor); può verificarsi una ritenzione di introni (perchè gli enzimi credono che l'introne
sia un pezzo di esone) oppure emissione di esoni (si salta un esone e spesso la proteina non
funziona). Altre volte all'interno dell'introne ci può essere la formazione di un sito nuovo, definito
sito criptico di di splicing.

Lo spettro mutazionale ci fa vedere tutte le possibili mutazioni. Nella beta globina abbiamo tre
regioni rosse codificanti. La forma clinica può essere causata da una di tutte le mutazioni indicate.
Ogni barra rappresenta un allele patologico della beta globina. Ci sono differenti manifestazioni
cliniche a seconda dell'allele mutato ereditato.

Inserzioni, delezioni, inversioni

• Dimensioni variabili da 1 base a parti di cromosoma (>1 Mb).

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 • Spesso si verificano in sequenze dove sono presenti ripetizioni. Le sequenze ripetute sono
rischiose perchè le ripetizioni possono dare luogo a perdita o acquisto di moduli di triplette.
• Le sequenze ripetitive implicano il rischio di appaiamenti disallineati nel corso della
replicazione del DNA e del crossing over.
Le short tandem repeats, le piccole ripetizioni, possono dare luogo anch'esse a mutazioni.
Anche le ripetizioni invertite e l'accoppiamento di sequenze omologhe possono causare delle
delezioni. Si possono appaiare delle sequenze che in realtà non sono omologhe e le sequenze si
appaiono in maniera rovesciata con conseguente inversione cromosomica. Si possono quindi
formare degli appaiamenti errati anche con le sequenze in tandem mentre si ha la meiosi e si può
avere l'inserzione da una parte e l'omissione dall'altra.

L’effetto patogeno di piccole inserzioni e delezioni dipende dal mantenimento o meno del modulo
di lettura
• Perdita/acquisto di 1 o 2 basi altera il modulo di lettura e spesso causa la produzione di una
proteina molto alterata o troncata;
• Perdita/acquisto di triplette o multipli di tre (mutazione frameshift) basi comporta la
perdita/acquisto di 1 o pochi aminoacidi e mantenimento della sequenza aminoacidica a
valle; ciò comporta la formazione di una proteina con parziale mantenimento della funzione
(delezioni di 1,2,4 nucleotidi sono più gravi di una delezione di 3 nucleotidi).
Nel nostro corredo di proteine ce ne sono alcune codificate in quantità abbondante, maggiore di
quella necessaria per espletare la funzione. Ciò dipende dalla funzione che deve espletare la
molecola; per esempio gli enzimi sono maggiori quindi se viene a mancare un enzima spesso la sua
attività è compiuta da una altro enzima. In alcuni casi si ha una delezione del 90% di un enzima ma
non vi è una espressione fenotipica, mentre la mancanza del 50% di proteine costitutive dà già
luogo a patologie molto gravi. Nei sistemi biologici, soprattutto negli organismi superiori, il livello
di funzione normale comprende un ampio margine di sicurezza. Quindi si assiste alla ridondanza
del prodotto enzimatico.
Vi possono essere delle patologie legate all'espansione delle triplette nucleotidiche; il segmento
ripetuto n volte a causa di problemi enzimatici vi possono essere inserzioni e delezioni. Queste
danno delle patologie da triplette ripetute. In tutte queste famiglie affette dalla patologia questa
malattia inizia con una maggiore ripetizione delle triplette. All'inizio non vi è un quadro patologico
ma uno stato di pre-mutazione (le triplette aumentano ma non manifestano la malattia). I loro
discendenti possono presentare un forte aumento del numero di ripetizioni e manifestazione della
malattia. Nelle generazioni successive si può avere ulteriore aumento del numero di ripetizioni e
manifestazioni patologiche in età sempre più precoce (“anticipo”). L'anticipazione è la
manifestazione man mano più precoce nelle generazioni successive.
Le quattro principali patologie da triplette ripetute sono la corea di Huntington, la sindrome dell'X
fragile, l'atassia di Friedreich e la
distrofia miotonica. In tutte queste la
tripletta che si amplifica è localizzata
in parti differenti del gene. Nella
corea di Huntington si espande CAG
(glutammina) contenuta in un esone
che aumenta la glutammina nella
proteina che smette di funzionare.

Nelle altre tre patologie sono in

sequenze non codificanti: CGG
nell'UTR nella sindrome dell'X
fragile, CTG nella distrofia

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miotonica; in questi casi viene alterata una parte non codificante che inficia anche la codifica del
gene stesso.
La corea di H. è una correlazione genotipo-fenotipo in funzione al numero di ripetizioni presenti;
maggiore è il numero delle ripetizioni maggiore sarà l'anticipazione della patologia.

Sindrome dell’X fragile

È una ripetizione a carico del cromosoma X. I “siti fragili” sono regioni cromosomiche visibili al
microscopio in cui il DNA non è normalmente impaccato per la mitosi o si è prematuramente
despiralizzato e in quella zona di cromatina rarefatta è causata da una rande ripetizione di nucleotidi
in quella zona. Il gene si chiama FMR1 e si vede anche nel cariotipo. I siti fragili non sono
necessariamente associati a rotture cromosomiche. In questa malattia la componente genetica è
particolarmente predominante da definire il quadro clinico del paziente che sarà lo stesso in tutti i
soggetti affetti quale sia l'etnia di appartenenza.

Sindromi da geni contigui - “microdelezioni”

Delezioni (o duplicazioni) di tratti cromosomici che contengono geni multipli. Il quadro patologico
può essere dovuto ad uno solo dei geni coinvolti oppure agli effetti combinati di più geni.
La patologia è legata alle ripetizioni, Low-Copy Repeats (LCR); Blocchi di 1-200 Kb duplicati con
alta omologia (>95%) nel genoma. Origine filogenetica recente: assenti in specie evolutivamente
vicine. Sono delle famiglie di 1,5 Mb e ci può essere una delezione da 1,5 Mb o da 3 Mb.
I disordini cromosomici in 22q11 possono presentare delle delezioni (VCFS/DGS) oppure delle
duplicazioni. La prevalenza delle patologie genetiche sono definite con n°affetti/totale nati.

Sindrome di DiGeorge / velocardiofaciale

Delezione in 22q11
~1/4000 nati = media frequenza
Casi sporadici (90%) e familiari (10%) autosomici dominanti
Espressività variabile
Alterazioni facciali: Insufficienza velofaringea, palatoschisi
Ipoplasia/aplasia timica → immunodeficienza
Ipoplasia paratiroidi → ipocalcemia
Malformazioni cardiache, soprattutto del tratto efferente
Disordini psichiatrici
Sono colpiti tutti questi organi perchè sono colpiti i tessuti embrionali.
Sinonimi / sovrapposizioni: Sindrome di Sphrintzen, Sindrome di Takao, CATCH22, CATCH
(Cardiac Abnormality, T cell deficit, Clefting, Hypocalcemia)

Una nuova strategia per le sindromi umane da geni contigui

Individuare regioni nel genoma del topo che conservano la sintenia (=la proprietà dei geni di
trovarsi sullo stesso cromosoma)
Produrre topi con delezioni della regione sintetica – Hanno quadro patologico corrispondente alla
sindrome umana?

Partendo dai topi con delezione produrre transgenici per gruppi di geni umani o muriniche mappano
nella delezione – Il quadro patologico scompare?

Una volta individuati i geni candidati produrre topi con knockout (assenza) di singoli geni – Hanno
quadro patologico? Si nel topo c'è una stessa sequenza genica e producendo un topo con quella
delezione posso valutare se il topo porta quelle mutazioni somatiche. Nel topo quella mutazione
somatica (assenza di timo) corrisponde alla mutazione di un singolo gene chiamato Tbx1.

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Ma nell'uomo? Geni candidati per la sindrome di DiGeorge/velocardiofaciale:
• TBX1
• T-box1, fattore trascrizionale
• Mappa nella delezione 1.5 Mb
• Topi KO hanno fenotipo
• Altamente espresso negli archi faringei embrionali
• Non espresso nel cervello
• CRKL
• Tirosina chinasi non recettoriale
• Compreso nella delezione di 3 Mb, esterno alla 1.5 Mb
• Topi KO (Knokout) hanno fenotipo
• Può spiegare casi con delezioni distali alla 1.5 Mb
• Geni modificatori (espressività variabile), sono tutti quei geni che non causano direttamente
il fenotipo ma definiscono la gravità del sintomo:
• RALDH2 – Sintesi acido retinoico
• VEGF – Vascular endothelial growth factor che controlla la neoformazione di vasi.

Patologia molecolare – 10 marzo 2011 Lollini

Malattie ereditarie epigenetiche (atipiche)
L'esclusione allelica è l'espressione di uno solo dei due alleli con regolazione del dosaggio genico.
Il meccanismo è indipendente dal genitore di origine nel caso dell'inattivazione dell'X
(lyonizzazione), recettori per l'antigene TCR ed Ig ed infine con meccanismi ignoti (recettori
olfattivi, IL 2 e 4) e queste non si studiano molto.
Dipende invece dal genitore d'origine l'imprinting genomico. Normalmente due parti di cromosomi
che contengono 4 geni (A,B,C,D) ed abbiamo il gene materno e paterno (Ap, Bp, Cp, Dp e Am,
Bm, Cm, Dm); può accadere che sia imprintato (quindi non espresso) in maniera casuale o il gene
materno o quello paterno. Se è non espresso l'allele materno si ha imprinting materno e viceversa.
Questo meccanismo dà la metà della totalità dei geni e quindi necessita di regolazione. Questo
spegnimento dell'allele non ha nulla a che vedere con il gene. Non la possiamo chiamare mutazione
ma è un fenomeno epigenetico in cui uno dei due alleli di un gene viene silenziato ed è sempre
quello dello stesso genitore di origine. Si passa da una generazione all'altra (da maschio a maschio e
da femmina a femmina) perchè nelle cellule germinali viene tutto imprintato e poi riscritto (nel
maschio si cancella tutto l'imprinting, sia materno che paterno, e poi viene tutto riscritto in base al
sesso dell'individuo).
L'imprinting richiede un centro di imprinting del DNA ed attività enzimatica di metilazione
(metiltransferasi) del DNA. Si pensa che l'imprinting sia il maggiore ostacolo alla partenogenesi nei
mammiferi e che costringe quindi tutta la riproduzione sia sessuata.
Nel nostro genoma il fenomeno dell'imprinting non è ubiquitario ma è comune. Le maggiori
patologie riguardano il cromosoma 11 e il cromosoma 15.

Imprinting e patologia
Questo meccanismo serve per mantenere il dosaggio genico al 50%. questo ci espone a un pericolo
perchè abbiamo solo un allele ed uno dei meccnismi di patologia è che vi sia una mutazione
nell'allele espresso. Ma può accadere anche il fatto opposto, ovvero che ci sia la perdita di
imprinting (loss of imprinting) con espressione del doppio del dosaggio genico.
Avvengono, nelle forme più semplici, delle delezioni (nel caso di delezione dell'allele espresso).
La disomia uniparentale (UPD) è quando si verifica una delezione con imprinting sia materno che
paterno; l'ipotesi di questa è che vi sia una sequenza con una delezione e un tentativo di copiare
quella delezione con il materiale genetico rimasto. Quindi la sequenza è intatta ma vi sarà un

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imprinting del gene ricostruito e a livello somatico sarà completamente assente l'espressione della
proteina.

Imprinting nei cromosomi 11 e 15

Le patologie da imprinting del cromosoma 15 q11-
13 sono la sindrome di Prader-Willi e Angelman.
Prader-Willi: passa statura, obesità, ipogonadismo,
mani e piedi piccoli e ritardo mentale.
Angelman: bassa statura, ritardo mentale grave,
convulsioni, postura atipica e facilità di riso.

Queste due patologie mappano sullo stesso punto

sul quale sembrava che ci fosse un'alterazione che
causava due patologie differenti. Avveniva ciò a
seconda dell'imprinting materno o paterno. La
delezione del cromosoma materno darà origine alla
sindrome di Angelman mentre la delezione del cromosoma paterno darà luogo a sindrome di
Prader-Willi.

Prader Willi Angelman

Delezione 15q11-q13 70% paterna 70% materna
Disomia uniparentale 30% materna 3-5% paterna
Mutazione E6-AP (mutazioni epigenetiche ubiquitina- No 2-4% solo casi famigliari
proteina ligasi)
Mutazione del centro di imprinting 1-2% 7-9%
Altre - 10-20%

Quindi una mutazione puntiforme mi dà lo stesso quadro della delezione: quindi il gene della
mutazione puntiforme è il gene della patologia.

Alterazioni dell'imprinting in 11p15.5 - Beckwith-Wiedemann

Sul cromosoma 11 nella zona 11p15.5 è presente l'IGF2 (insulin grow factor 2); sul cromosoma 15
è stato mappato al centro un centro di imprinting e ci sono una serie di sequenze con annesso
UBE3A. La sindrome di Beckwith-Wiedemann presenta macrosomia, macroglossia, ipoglicemia e
sviluppo di tumori muscoloscheletrici (rabdomiosarcomi). Vi sono differenti geni imprintati e i
principali candidati sono IGF2 e H19.
La perdita di imprinting (Lol) somatica o famigliare può essere presente anche in altri tumori:
Rabdomiosarcoma, tumore di Wilms (nefroblastoma) e carcinoma del colon. Il problema sta
nell'iperproduzione del fattore di crescita IGF2 che può dare origine alla malattia.

Le malattie mendeliane
Le malattie mendeliane interessano la mutazione di un singolo gene.
L'eredità mendeliana può essere:
• Autosomica
• Dominante
• Recessiva
• Legata all’X
• Dominante

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 • Recessiva

Il fenotipo (e non il genotipo) è dominante o recessivo.

Si parla però spesso (impropriamente) di dominante o recessivo anche in riferimento a geni od
alleli. Se il fenotipo si esprime nell'eterozigote è
dominante mentre è recessivo se non si esprime
in questo. L'allele normale dà luogo alla proteina
funzionante mentre l'allele mutato può dare luogo
ad una proteina non funzionante o assenza di
proteina.
Il soggetto con i due alleli normali presenta un
fenotipo normale (100% della proteina
funzionante), il recessivo ha lo 0% della proteina
funzionante mentre nell'eterozigote posso avere
un quadro dominante o recessivo a secondo della
quantità codificata dal gene mutato. Dato che
viene codificato il 50% della proteina si deve
vedere se questa quantità è sufficiente (patologia
autosomica recessiva) o no (dominante).

Il meccanismo che si applica a tutte le patologie recessive è che il 50% delle proteine è sufficiente
in queste patologie e quindi si manifesta solo se manca totalmente l'enzima. Quindi i nostri enzimi
sono codificati in quantità ridondante e le cellule ne contengono il doppio della quantità necessaria
→ quasi tutte le enzimopatie sono recessive.

Le cose sono più complesse per la dominanza (sapere bene questa parte perchè pare che al prof
interessi):
• Dominante aploinsufficiente: il 50% di proteina funzionante non è sufficiente a garantire il
funzionamento della cellula (es patologie recettoriali o patologie proteiche strutturali,
recettori);
• Dominante negativo: la proteina funzionale è un polimero e se una delle due proteine che
codificano per questa proteina è anomala, quando si uniscono può accadere che non funzioni
il tutto. Quindi è dominante negativo nel senso che la proteina alterata (50%) mi va a
inficiare anche la restante parte della proteina (es: proteina multimerica);
• Dominante gain-of-function: ovvero guadagno di funzione. Un esempio già incontrato è
quello delle Corea di Huntington con ripetizione poliglutamminica. Questo meccanismo di
patogenesi è proprio la gain of function in quanto la proteina (huntingtina) perde la sua
funzione e ne acquisisce un'altra (ovvero la neurotossicità). Molti oncogeni seguono questa
via.

Dominanza e recessività non sono concetti assoluti, ma relativi al fenotipo esaminato; un esempio
classico è quello dell'anemia falciforme.

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L’espressione è codominante:
• Il fenotipo eritrocitario è dominante = espresso sia dall’eterozigote che dall’omozigote;
• L’anemia è recessiva incompleta = espressione e gravità diverse nell’eterozigote rispetto
all’omozigote;
• La patologia è recessiva = espressa solo dall’omozigote.
Quindi il genotipo è sempre lo stesso (non è dominante o recessivo) ed alcuni fenotipi sono
dominanti o recessivi.

Tumori ereditari – retinoblastoma (RB)

È una patologia dominante
Linea germinale: Rb
Linea somatica: Rb
Tumore: Rb
Due mutazioni: una ereditaria (“primo hit”), l’altra solo nelle
cellule tumorali (“secondo hit”). La malattia insorge quando il
genotipo è -/- e sono quindi le due mutazioni; i soggetti sono a
rischio di contrarre il tumore ma deve avvenire anche la seconda
mutazione. Fenotipo “predisposizione al tumore” è dominante: è
espresso dall’eterozigote
Fenotipo “tumore” è recessivo: è espresso solo nelle cellule
omozigoti Rb
È una forma di mosaicismo. Questo quadro si applica a quasi tutti i
modelli ereditari con “modello a doppio hit”, uno somatico e uno genetico.

Penetranza
È la probabilità di espressione fenotipica con un
dato genotipo. Può essere:
• Completa (100%): tutti i portatori del
genotipo manifestano il fenotipo;
• Incompleta (<100%): non tutti i portatori
del genotipo manifestano il fenotipo.

La penetranza può variare con l’età. Per esempio

nel cancro della mammella con i geni BRCA qual è
la probabilità di sviluppare il tumore?
Come si può vedere questi geni causano anche il cancro dell'ovaio. La penetranza incompleta non
altera la trasmissione del fenotipo alla progenie. Vi sono dei problemi legati alla penetranza
incompleta:
• Salto di generazione, per esempio una ragazza può esprimere un fenotipo espresso dalla
nonna che però non era espresso nella madre.
• Problemi di counseling genetico;
• Grande utilità della genotipizzazione molecolare per andare a vedere nel DNA quali sono le
manifestazioni molecolari.

Espressività
È la severità di espressività della malattia ed è variabile tra gli affetti. Vi possono essere quindi dei
quadri differenti a seconda dell'allele che viene ereditato. L'espressività può essere:
• Quantitativa: un solo fenotipo espresso in grado variabile;
• Qualitativa per geni pleiotropici (= che producono fenotipi multipli): ogni portatore del
genotipo può avere una diversa combinazione di fenotipi.

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Per esempio la neurofibromatosi di tipo I presenta differenti quadri clinici.
L'espressività variabile è determinata dal fatto che tutti gli individui che hanno la stessa mutazione
nel singolo gene avranno alleli differenti con annessi geni modificatori che possono quindi
modificare il fenotipo. Questo è il background genico. Il background genico ha un ruolo importante
nel determinare il fenotipo . In realtà le malattie mendeliane “pure”, dovute esclusivamente ad un
solo gene, sono rare. I geni modificatori alterano la penetranza e l'espressività.
Nella poliposi adenomatosa (si creano dei polipi nell'instestino) vi sono dei geni che codificano per
il numero dei polipi espressi dal fenotipo.

Patologia molecolare – 11 marzo 2011

Malattie autosomiche recessive
Solitamente casi isolati nel pedigree. I genitori di un affetto sono eterozigoti sani, il rischio di altri
figli affetti è 1⁄4. In genere la probabilità di malattia è
uguale in maschi e femmine.
I genitori possono essere consanguinei o appartenere ad
un gruppo (etnico, religioso, geografico) in cui si ha
inbreeding. La forte consanguineità la troviamo in gruppi
isolati (per motivi culturali o geografici) o in gruppi i cui
matrimoni sono limitati (per motivazioni prettamente
culturali).
Inbreeding (inincrocio) comprende tutti i fenomeni di
incroci tra consanguinei e i matrimoni tra non
consanguinei in senso stretto ma tra soggetti che derivano
dal medesimo gruppo etnico.
Incroci tra consanguinei → Inbreeding = incroci tra individui non imparentati, ma geneticamente
correlati. Si verifica tipicamente in gruppi geneticamente isolati: minoranze etniche e religiose,
abitanti di isole. Consanguineità ed inbreeding aumentano il rischio di malattie recessive.

Malattie autosomiche dominanti

Penetranza incompleta ed espressività variabile ci sono anche nelle malattie recessive. Circa la metà
delle malattie mendeliane sono autosomiche dominanti (~3000 patologie). Hanno frequenza globale
elevata (~10-2). Variabilità di manifestazioni fenotipiche per ridotta penetranza, espressività
variabile, effetti pleiotropici (N.B.: non limitate a malattie dominanti).
Pedigree tipico con ascendenti affetti in ogni
generazione (→). La presenza di
trasmissione da padre a figlio differenzia
autosomiche da X-linked.
Rischio per figli di un affetto: 1⁄2 (segue la
legge di Mendel).
La mancanza di ascendenti e collaterali
affetti suggerisce mutazioni de novo.
Verosimilmente nei gameti di due coniugi,
in uno dei due, si è verificata una mutazione
dominante che è stata espressa dal primo
figlio. Molte di queste malattie hanno una
fitness limitata e i soggetti non si
riproducono. La malattia non si estingue
perchè le mutazioni de novo sono spesso
presenti nella popolazione. I fatti che
favoriscono queste mutazioni de novo sono l'aumentare dell'età dei genitori (popolazioni

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occidentali)

Malattie legate all’X (X-linked)

La distinzione tra dominante e recessivo è sfumata perché:
• Il maschio ha un solo cromosoma X (è emizigote)
• Nella femmina molti geni di uno dei due X sono inattivati (spesso è inattivata l'X con la
mutazione)
La maggior parte delle malattie legate all’X sono espresse solo dalle portatrici di due alleli mutati
(recessive), in grado variabile a seconda dell’inattivazione dell’X nei vari tessuti.
Una piccolo numero di malattie è espresso dalle portatrici di un allele mutato ed uno normale
(dominanti) e possono o non possono manifestare il quadro patologico per la lyonizzazione.
La patologia è molto più frequente tra i maschi che tra le femmine.
Non c’è trasmissione da padre affetto a figlio affetto e le madri portatrici obbligate trasmettono ai
figli. Raramente si incontrano nei pedigree femmine affette omozigoti, ad esempio
per incroci tra consanguinei. A livello embrionale si verificherà l'inattivazione
quando ci saranno già un centinaio di cellule (per questa motivazione le donne sono
dei mosaici). Avremo cellule che esprimeranno
preferenzialmente uno o l'altro corredo.
La distrofia muscolare di Deuchenne e di Beker
è legato all'X. La distrofina sta sotto la
membrana plasmatica e ogni fibra ha un modulo
in cui sono riportate in bianco le molecole di
distrofina. Notare che nella donna è manifesto il
mosaicismo (alcune fibre bianche e altre nere). I
muscoli più critici per la distrofia sono i
muscoli respiratori. Alcune donne
svilupperanno un'inattivazione dell'X con molte
fibre funzionanti, altre donne esprimeranno
anche a livello fenotipico la distrofia.
Pedigree tipo autosomiche dominanti, ma non
c’è mai trasmissione da padre affetto a figlio maschio. In alcune malattie (ad es.
incontinentia pigmenti tipo 2) non si trovano mai maschi affetti in quanto la malattia è letale per il
maschio e si ha un aborto spontaneo.

Patologia Generale Molecolare

Cause delle malattie: Etiologia

Meccanismi di malattia: Patogenesi

Principali tipi di proteine alterate nelle malattie mendeliane:

• Proteine strutturali, sia intra che extracellulari (collagene per esempio);
• Recettori (che trasducono segnali) e sistemi di trasporto;
• Enzimi e loro inibitori;
• Proteine che controllano la crescita cellulare (geni oncosoppressori ed oncogeni).

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 Patologie da difetti di proteine strutturali

Sferocitosi ereditaria
È una anemia emolitica. I globuli rossi possono flettersi grazie a proteine: spectrina, anchinia che
collega il citoscheletro all'actina). Queste proteine servono a garandire l'elasticità e la resistenza del
globulo rosso che incontra nel circolo. In questa malattia si
manifesta microcitemia e sfereocitosi (perchè i globuli diventano
più piccoli, meno deformabili e tondi) ed essendo meno
deformabili vengono visti come vecchi dalla milza; per questo è
un'anemia emolitica. La distruzione avviene quando l'eritrocita
deve attraversare la milza dove i globuli bianchi diventano molto
grandi e pieni di globuli rossi.
Prevalenza 1/5000; tutti geni autosomici.
In questa malattia
abbiamo una forte
eterogeneità delle
proteine coinvolte: l'ereditarietà è quindi differente da
un caso all'altro.
Nell'Anchirina 1 viene a mancare la proteina e ci
possono essere delle mutazioni frameshift e non senso
in cui la proteina manca completamente; in questi caso
abbiamo aploinsufficienza e ho la manifestazione
patologica. Negli altri casi in cui ho la proteina
funzionante la mancanza di un solo allele non è
sufficiente per darmi la patologia perchè mi rimane il
70-75% della funzione e quindi la classifico come
recessiva.
In queste malattie devo analizzare il genoma perchè se vado a valutare la presenza delle proteine, la
mancata funzione di una proteina può implicare il mancato funzionamento di altre proteine che dato
che non funzionano vengono degradate. Quindi se vado a vedere le proteine potrei trovarmi senza
una serie di proteine che invece sono correttamente codificate.
La spettrina è costituita da una sub-unità alfa e beta; in casi fisiologici si produce il doppio di
subunità alfa rispetto beta; il deficit di alfa spettrina è quindi recessiva mentre le beta sono
dominanti (vedi tabella sopra).
La spettrina forma una rete sotto la superficie della
membrana. Le spettrine fanno parte della superfamiglia
spettrina-distrofina-alfa-actinina con annessa la distrofina.

L'anemia data dalla sfereocitosi può essere compensata da

iperproduzione di EPO e il quadro non è particolarmente
grave. Presenta scarsa riserva funzionale, e possibili crisi
aplastiche secondarie ad infezioni da parvovirus. La
splenomegalia è trattabile con splenectomia (ma aumento
di rischio di infezioni). Anche il fegato può ingrandirsi: se
si ha epato-splenomegalia bisgona pensare all'attività
comune dei due organi e saranno responsabili i macrofgi
(cellule di kupfer nel fegato).
Possibile ittero da eccessiva produzione di bilirubina
legata all'emolisi. La gravità dipende dalla mutazione
presente all'interno delle famiglie in analisi ed è simile tra

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membri della stessa famiglia.

Complesso distrofina-glicoproteine (DGC) – Distrofie muscolari

Fungono da collegamento tra citoscheletro e matrice.

Stabilizzazione della membrana durante i cicli contrazione- rilassamento. Una cellula che si contrae
esercita sulla membrana uno stress e la membrana deve essere in grado di sopportare questa
tensione. Uno qualsiasi di queste proteine può dare luogo a distrofinopatie. La distrofina è una
molecola molto lunga e gli ovali sono una serie di domini codificati da alcuni geni. Possiamo quindi
avere forme più o meno gravi a seconda che le mutazioni interessino uno o più di questi domini.
Le distrofie muscolari sono causate da mutazioni in geni che codificano componenti del complesso
distrofina-glicoproteine
• Indebolimento del sarcolemma
• Rottura della membrana
• Morte della fibra muscolare
• Degenerazione muscolare progressiva, debolezza muscolare, insufficienza respiratoria e
cardiaca

Vi sono delle cellule periferiche muscolari che possono riparare un danno. Vi sono degli elementi
mesenchimali non differenziati che possono differenziarsi in fibroblasto-adipocita-cellula
muscolare. Quando ho un danno della cellula muscolare le cellule satelliti tentano di rigenerare ma
il danno meccanico è tale che le cellule satelliti non sno sufficientemente veloci. Anche le cellule
mesenchimali iniziano ad intervenire e il danno progressivo si manifesta con l'uso del muscolo;
inizialmente la deambulazione è normale e poi regredisce.
Letale è l'espressione della distrofia sul diaframma e la morte avviene per problemi respiratori e
cardiaci.
Il gene che codifica per questa patologia è molto grande: distrofina, 79 esoni su 2.5 Mb (trascritto:
14 Kb).
Ereditarietà legata all’X
• Maschi: affetti in modo grave
• Femmine: grado variabile a seconda dell’inattivazione del X nei muscoli

Eterogeneità allelica
(all'interno della patologia ci sono alleli patologici di gravità diversa, talmente differente che prima
di conoscere la genetica molecolare erano indicate con due nomi differenti, Beker e Deuchenne):
• Distrofia muscolare di Duchenne (DMD)
• Delezioni che impediscono sintesi proteica
• Quadro clinico grave, insorgenza precoce
• Distrofia muscolare di Becker (BMD)
• Sintesi di proteina con funzionalità residua
• Quadro clinico meno grave di DMD, insorgenza più tardiva e aspettativa di vita quasi
normale.

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Sindrome di Marfan
Patologia autosomica dominante
Il gene coinvolto è quello della fibrillina 1
(FBN1) (FBN2 → aracnodattilia contratturale
congenita) che codifica per le microfibrille,
precede (probabilmente con funzione di guida) la
tropoelastina nella formazione delle fibre
elastiche.
L'espressività di questa patologia è variabile. I
tessuti elastici sono infatti presenti:
• Legamenti del cristallino: ectopia lentis,
con cristallino fuori posto
• Cuore: prolasso valvola mitrale
• Aorta: dilatazione e rottura dell’aorta
• Scheletro: alta statura, dita
affusolate, legamenti lassi ed
iperestensibili, scoliosi.
Normalmente il Ca è come quello
nell'immagine A mentre nella mutazione
di Marfan si assiste alle mutazioni dei
domini che legano il Ca, illustrato in
figura B.

Espressività variabile
È presente una forte eterogeneità delle
forme; tutte le volte che ci sono gravità
patologiche cardiovascolari la morte è
precoce. L'espressività è molto differente
tra gli individui analizzati.

18 marzo 2011, Prof. Lollini

Riguardo i difetti di proteine strutturali parliamo oggi dei difetti delle fibre collagene trattando
alcune delle tante patologie ereditarie che lo riguardano. Dobbiamo tenere presente che per
motivazioni storiche le alterazioni del collagene si distinguono in due gruppi: le alterazioni del
collagene 1 vanno sotto il gruppo di “osteogenesi imperfecta” mentre le altre vanno sotto il nome di
“sindromi di Ehlers-Danlos”.

Osteogenesis imperfecta
(esempio di patologia dominante-negativo nelle mutazioni di senso)
Ci serve per illustrare un problema sui meccanismi di dominanza. Le alterazioni di proteine
strutturali sono prevalentemente dominanti perchè le nostre cellule contengono una quantità minima
di elementi strutturali quindi anche una alterazione del 50% delle proteine inficia di molto l'attività
strutturale in genere. Vi sono malattie dominanti per aploinsufficienza e altre patologie nelle quali
abbiamo i dominanti negativi. Le patologie con dominanti negativi sono tutti quei casi nei quali una
proteina polimerica è codificata in maniera uguale da due alleli. Se un allele è alterato finisce che

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tutto il polimero (dato dalla somma delle due proteine codificate dai due alleli) è alterato e quindi
non funziona bene. L'osteogenesi imperfetta è un esempio di questa tipologia di alterazione.
Il collagene è un trimero formata da due subunità di collagene 1 (formato da due catene α1 e una
catena di α2) ed una subunità di collagene 2. Il collagene 1 è fondamentale per la formazione
dell'osso. Non importa qual è il gene alterato ma la mutazione può determinare dei quadri
rapidamente differenti e si può avere dominanza negativa o aploisufficienza.
È una patologia autosomica dominante.
Mutazioni in COL1A1 o COL1A2, catene α1 e α2 del collagene tipo I: [α1]2 α2.
Le mutazioni nonsenso in COL1A1 causa Osteogenesis imperfecta tipo I che comporta una
riduzione del 50% del collagene tipo I. Ciò comporta ossa fragili, sordità ed è il quadro patologico
non grave. Le cose cambiano radicalmente se ho mutazioni di senso in COL1A1 o COL1A2.
Queste mi danno l'osteogenesis imperfecta tipi II, III, IV. Dominante negativo - degradazione delle
molecole di collagene contenenti catene anomale e non c'è la proteina. Il 50% di riduzione del
collagene con collagene funzionante tendente a 0 e il fenotipo è decisamente più grave. Fratture
ossee alla nascita, in molti casi morte neonatale o sviluppo osseo e dentale deformi. Vi quindi una
grande differenza tra un meccanismo di aploinsufficienza e di dominante negativo dettato dal fatto
che la mutazione in alcuni casi (clinicamente meno gravi) porta un codone di stop mentre in altri
casi con la mutazione più lieve porta ad una forma clinica più grave.

Sindromi di Ehlers-Danlos
Come è possibile vedere dall'immagine si ha iperestensibilità della cute.
Ciò è dovuto al fatto che manca la riparazione
del collagene che nei soggetti normali avviene in
continuazione.
Vi sono una decina di sindromi diverse:

Tipo I – Gravis
Autosomica dominante,
Gene COL5A, interessa il collagene V° con cute
iperestensibile, articolazioni ipermobili,
cicatrizzazione cutanea alterata.

Tipo IV – Arterioso
Autosomica dominante. Anche in questo caso
può essere una quadro clinico grave perchè il
gene COL3A1 che codifica per il collagene III che è molto importante a livello cutaneo (la cute
appare sottile e facilmente danneggiata) mentre ben più gravi sono le rotture delle pareti arteriose ed
intestinali.

Tipo VI – Oculare
Abbiamo detto che tendenzialmente le patologie che riguardano le proteine strutturali sono
dominanti, non tutte, ma solitamente molte lo sono. Anche quelle che abbiamo descritto finora lo
sono. Quella di tipo sesto però non lo è. È infatti autosomica recessiva perchè è colpito un enzima.
Gene PLOD codifica per l'enzima lisina idrossilasi (legami crociati tra fibre collagene) che
stabilisce i legami crociati che stabilizza il collagene. Comporta fragilità oculare (distacco retina,
rottura cornea) e cutanea.

Patologie Enzimatiche o enzimopatie

Sono migliaia proprio perchè sono migliaia gli enzimi.
I meccanismi generali che coinvolgono tutte queste patologie sono:

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Solitamente recessive perchè deficit enzimatici del 50% non sono patogeni; ciò accade perchè gli
enzimi sono sintetizzati solitamente molto (come quantità) e quindi la parte di enzima che viene
sintetizzata negli eterozigoti lavora un po' di più ma lavora. La mancanza dell'enzima non causa il
danno ma la patogenesi non è provocato dalla molecola proteica ma dalla sua mancata attività
quindi il danno sarà dato dall'accumulo del substrato dell'enzima o deficit del prodotto enzimatico.
I substrati/prodotti piccoli o diffusibili causano la malattia sistemica perchè i substrati vanno in
circolo e intossica tutto l'organismo. Se abbiamo delle macromolecole avremo delle malattie
limitate ad un organo o distretto.
Abbiamo perdita di attività enzimatiche multiple e possono essere presenti mutazioni differenti che
hanno una stessa manifestazione clinica. Abbiamo il massimo del distacco tra eziologia (sempre
causata dalla mutazione di un gene che codifica per una proteina) e patogenesi (data da molecole
non proteiche, ovvero substrati e prodotti enzimatici) che non troviamo nelle altre malattie.

Glicogenosi
Sono patologie caratterizzate da alterazioni di enzimi che
partecipano al metabolismo del glucosio.
Tutti gli enzimi scritti in grassetto portano al medesimo
quadro patologico. Quindi avremo problemi di accumulo
del substrato (glicogeno) e mancanza dei prodotti
(energia).
Vi sono forme differenti.
Se guardiamo la colonna a destra vediamo che i tessuti
colpiti sono sempre gli stessi. Quindi possiamo dividere
in due blocchi: patogenesi epatica e muscolare.
Ciò avviene perchè il glicogeno è accumulato nel fegato e
vi sarà un accumulo di glicogeno nel fegato →
epatomegalia. Il glucosio è usato dal fegato e la carenza è
avvertita dal muscolo → forma muscolare.

Queste malattie sono autosomiche

recessive.
Vi sono quindi due cause di danno
principali:
• Danno cellulare da accumulo di glicogeno
• Mancanza di energia da carente glicolisi
Avremo quindi due forme:
• Forme epatiche – Tipi I, III, VI, VIII con epatomegalia da accumulo di glicogeno nel fegato
(e in altri organi) e conseguentemente ipoglicemia da scarsità di glucosio anche se il
problema principale e l'accumulo e l'ingombro del glicogeno.
• Forme muscolari – Tipi [II], V, VII è presente una scarsa glicolisi nel muscolo → mancanza
di energia → debolezza muscolare, crampi
Altre forme possono essere:

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 • Glicogenosi tipo II (di Pompe) – Maltasi acida lisosomiale, accumulo di glicogeno nei
lisosomi con danni prevalentemente cardiaci;
• Tipo IV (di Anderson) – Enzima ramificante, deposizione ubiquitaria di glicogeno anomalo,
danni cerebrali, cardiaci, muscolari, epatici

Malattie da accumulo lisosomiale

Il lisosoma è importante nei meccanismi di catabolismo
della cellula fino all'autofagia. Nel lisosoma avviene la
degradazione di componenti in ambiente acido. Nel
lisosoma arrivano delle componenti che devono essere
smontate e ci sono degli enzimi litici che scompongono le
macromolecole le cui sostanze vengono poi rilasciate nel
citosol. Nelle patologie lisosomiali abbiamo un blocco
delle macromolecole nel lisosoma e la cellula si riempie di
lisosomi e la malattia è progressiva. Si arriva ad un punto
in cui questo ingombro blocca la funzione delle cellule mi
dà una organomegalia.
Sono patologie recessive, autosomiche o legate all’X.
Il danno è localizzato in organi o cellule ricchi di susbtrato o specializzati nella degradazione.
Essenzialmente se è colpito un enzima chiave in una reazione lisosomiale saranno danneggiati gli
organi nei quali questa reazione è una reazione chiave oppure può essere colpito il fagocita, la cui
funzione dipende dal lisosoma, quindi abbiamo epatosplenomegalia. Possiamo avere anche
linfoadenopatia perchè i fagociti sono anche lì.

Malattia a cellule I (con inclusioni –

perchè vi sono anomalie morfologiche)
L'indirizzo per spedire una proteina al
lisosoma è il mannosio6P. Vi sono delle
proteine fosforilate nel cis-golgi dal
GlcNAc. La mancanza dell’enzima
GlcNAc fosfotransferasi comporta che e
le idrolasi acide vengono secrete invece di
essere indirizzate al lisosoma (non in tutti
i tipi cellulari – meccanismo alternativo?)
Danni scheletrici, ritardo di crescita,
ritardo mentale. Vita media 5-7 anni
perchè non funzionano i lisosomi.

Sfingolipidosi
Il grafico riporta tutti i processi che portano
alla demolizione dei lipidi. I rettangoli rossi
indicano dove sono localizzate le tre
patologie che tratteremo.
Vi è un accumulo lisosomiale di sfingolipidi
(ceramide + gruppo X). Possono quindi
essere:
• Sfingoglicolipidi – X = zuccheri
◦ Cerebroside = Ceramide + Glc o
Gal

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 ◦ Globoside = Cerebroside + zuccheri
◦ Ganglioside = Cerebroside + zuccheri + acido sialico
◦ Solfatide = Cerebroside + zuccheri + SO4
• Sfingofosfolipidi – X = fosfato + alcol aminato
◦ Sfingomielina = Ceramide + fosfato + colina
Sfingolipidi = ceramide + X ceramide = base azotata a catena lunga (sfingosina) + acido grasso
(>20 C). Sono componenti fondamentali della cellula e sono presenti molto nelle cellule nervose
(vedi cerebroside, perchè nel cervello). Sono coinvolte nel turnover nei componenti di membrana.

Malattia di Tay-Sachs – Gangliosidosi GM2

Si ha un accumulo di GM2 in tutti i tessuti.
L'esosaminidasi A converte GM2 in GM3.
Se non funziona vi sono danni
principalmente neuronali: cecità,
convulsioni, spasmi muscolari, demenza.
Vengono distinte tre patologie a seconda
delle subunità non funzionanti (vedi nomi a
fianco). Sono malattie recessive (quindi si
verificano in omozigosi) ed è
particolarmente frequente negli ebrei. In questi gruppi possiamo trovare omozigoti recessivi classici
ed hanno quindi due alleli null con insorgenza infantile. Vi sono altri soggetti che ereditano una
mutazione ipomorfica che dà una funzionalità ridotta, quindi con un allele null e uno con attività
enzimatica residua (eterozigoti compositi). In questo caso avremo insorgenza giovanile o adulta
perchè vi è una funzione in parte ancora presente. La patogenesi è principalmente a livello del SNC.

Malattia di Gaucher
Accumulo di glucocerebroside nei fagociti
(queste cellule rigonfie vengono denominate
cellule di Gaucher) e/o nel SNC, quindi due
sistemi possono essere colpiti.
La glucocerebrosidasi libera il glucosio dalla
ceramide e vi può essere un accumulo del
glucocerebroside. I fagociti infarciti di lisosomi sono chiamati cellule di Gaucher che sono
localizzati tipicamente nel fegato e nella milza. Essendoci due bersagli possiamo avere forme che si
dividono come patogenesi. La differenza lo fa il tipo di mutazione e il tipo di attività enzimatica
residua.
Nel Tipo I – Cronica non cerebrale nella quale avremo una attività enzimatica ridotta; vi sarà
epatosplenomegalia, linfadenopatia (perchè infarciti di fagociti), erosione ossea nel midollo
emopoietico (per accumulo di linfociti), fratture (non perchè l'osso è interessato direttamente ma
perchè i fagociti sono presenti anche nell'osso) → dobbiamo fare attenzione perchè questi sono tutti
luoghi dove si trova una grande quantità di macrofagi.
Nel Tipo II – Acuta neuropatica abbiamo invece attività enzimatica nulla; saranno presenti
convulsioni, deterioramento mentale e anche epatosplenomegalia, ovviamente + grave che nella
forma precedente.
Sappiamo che la ceramide è coinvolto in meccanismi apoptotici.

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Malattia di Niemann-Pick

Anch'essa è una patologia da accumulo e i residui

(sfingomielina) si localizzano nel sistema
reticoloendoteliale e nel SNC. Abbiamo due forme
(simile alla Gaucher):

Tipo A – Infantile
Attività enzimatica assente
Epatosplenomegalia, alterazioni neurologiche, ritardo di sviluppo fisico e mentale. Morte entro i 3
anni di età. Una mutazione che porta la mancanza completa dell'enzima porta a morte precoce.

Tipo II – Viscerale
Attività enzimatica residua e non è presente il coinvolgimento neurologico. Organomegalia senza
coinvolgimento del SNC. I pazienti raggiungono l’età adulta (differentemente dalla forma infantile).

Patologie da mucopolisaccaridi (o mucopolisaccaridosi)

Sono delle malattie da accumulo lisosomiale di glicosaminoglicani (i
GAG erano raggruppati sotto i mucopolisaccaridi – da cui il, oggi si
tende a privilegiare la forma di GAG). I GAG sono polisaccaridi
lunghi, non ramificati, formati dalla ripetizione di un disaccaride. Vi
sono dei componenti
strutturali importanti
quali quelli in grassetto
nella tabella a fianco. →
Solo l'acido ialuronico rimane da solo mentre gli altri
quattro sono le componenti dei proteoglicani; questi
sono importanti nelle strutture portanti a livello della
cute, derma, osso, ecc.
Vi è una varietà enorme di patologie a seconda del
GAG e dell'enzima colpito. Il quinto è stato
cancellato e non seguiamo quindi questa
classificazione.
Il quadro in queste patologie è il Gargoinismo (da
Gargoyle), faces grossolana, alterazione sviluppo strutturale. Tutte recessive tranne una leata
all’X. Vi è etereogeneità allelica: Hurler/Scheie (come Deuchenne e Becker) sono due patologie
determinate da mutazione diverse dello stesso gene. Il quadro clinico è dato da faces grossolana,
addome ingrossato, data da epatosplenomegalia, disostosi multiple: ispessimento molte ossa (anche
le ossa piatte), ritardo mentale dovuto a problemi ossei, opacità corneale.

Malattie Recettoriali
Questa classe di patologie sono a carico di qualunque cosa sposti molecole e segnali all'interno della
cellula. I recettori si dividono in due classi differenti:
• Recettori che trasducono segnali: il ligando non è importante perché scatena cascata
segnali. In questo gruppo rientrano anche dei recettori che trasducono segnali di crescita
cellulare, ovvero gli oncogèni. Questi li tratteremo più avanti nelle malattie neoplastiche

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 ereditarie. A questa classe appartengono:
• rodopsina: segnali luminosità e cecità oculare → retinite pigmentosa
• osteroidi;
• RET MET: fattori di crescita, coinvolte in patologie neoplastiche, componenti
strutturali;
• Recettori trasporto: il ligando è importante perché deve essere trasportato da un posto
all'altro:
• CFTR → Fibrosi cistica;
• Emoglobina Talassemie → anemia falciforme
• Recettore delle LDL → Ipercolesterolemia familare

Fibrosi cistica (mucoviscidosi)

La fibrosi cistica (FC), o mucoviscidosi, o malattia fibrocistica del pancreas, è una malattia genetica
autosomica recessiva, si manifesta pienamente soltanto negli omozigoti e con nessuna
sintomatologia clinica negli eterozigoti. Mutazione sul cromosoma 7q31.2.
Polmoni e pancreas sono invasi da muco: è più
frequente nelle popolazioni occidentali, 1 su 2500
nati, negli asiatici e sudafricani è 10000 volte
minore. È la malattia genetica più frequente nei
caucasici. La frequenza dei bambini che nascano con
patologia è pari alla probabilità che due genitori con
un allele mutato si incontrino. Di fatto dobbiamo
fare solo una radice quadrata di 1/2500, ovvero 1/50
di tutti i soggetti hanno un allele mutato. In genetica
la frequenza così alta di un allele mutato può essere
per imbreeding, oppure perchè siamo membri di una
comunità chiusa ma non è il caso della razza caucasica. La spiegazione è che questa malattia è
legata all’eterozigosi, ovvero ad un vantaggio derivato dall'eterozigosi. È un caso simile all’anemia
mediterranea, data dalla malaria e dalle zanzare, infatti il fenotipo eterozigote è resistente alla
malaria. Nel caso della fibrosi cistica si è pensato che potesse essere una cosa simile: l’ipotesi è che
questa mutazione porti resistenza al colera, che in origine è una patologia a carico di ioni. In Europa
c’è una mutazione (ΔF508) che segue tutta l'evoluzione indoeuropea dalla mesopotamia all'Europa
che ha accompagnato tutta la civilizzazione dell'uomo.
Clinica
Nei pazienti con fibrosi cistica, le ghiandole esocrine e i polmoni presentano un eccesso di
secrezione mucosa di gravità differente in relazione agli organi colpiti: i peggiori sono pancreas
esocrino (non endocrino) e il polmone. Il polmone ha anche ruolo di difesa e con un eccesso di
secrezione il muco non riesce a uscire dal polmone e i microrganismi patogeni e non patogeni
(opportunisti) riescono a proliferare dando luogo ad infezioni ricorrenti (polmonite da opportunisti).
Anche l’accumulo di particolato (polveri) è causa di alcuni problemi: nel BALT (tessuto linfoide
associato ai bronchi) porta infiammazione cronica, infezione cronica → danno tissutale, nella
componente epiteliale e mesenchimale del polmone, che l’organismo tenta di riparare portando
cicatrici → accumulo di connettivo ed epitelio → fibrosi → il 90% dei pazienti muore per
insufficienza respiratoria. Il secondo organo bersaglio è il pancreas esocrino la cui fibrosi può

22
portare ad un cattivo assorbimento, molto più grave nei bambini che negli adulti, che si manifesta
denutrimento. La sopravvivenza era di 10 anni nel dopoguerra, adesso arriva a 30 anni; ciò permette
a questi soggetti di riprodursi e rende difficile il ruolo del counseling. Il gene implicato è CFTR
(cistic fibrosis trasmembrana regulator), 7q31.2, clonato nel 1990, codifica una componente di 1480
aa del canale del Cl regolato da cAMP. Regola trasporto Cl e Na negli epiteli. Il problema è quello
di avere un secreto più viscoso del normale (il danno è quindi idromeccanico). Mutazioni nel 3%
della popolazione caucasica. Vi è una elevata eterogeneità allelica anche se nel 70% dei casi è
presente la ΔF508, con delezione di una fenilalanina (1500 mutazioni diverse nel restante 30% di
casi). ΔF508: proteina con folding alterato, ritenuta nel reticolo, potenzialmente funzionale (se ci
fosse una stampella molecolare che raddrizzi la proteina potremmo trovare il farmaco → protein
therapy). Alcune mutazioni (es. A455E, mutazione minoritaria ipomorfica) comportano un livello
funzionale di CFTR ridotto del 95%, ma sono associate a patologie lievi (prospettiva per terapia
genica) quindi abbiamo una riserva funzionale molto ampia e deve essere completamente perso il
100% della proteina. Possiamo rinunciare al 95% della proteina e avere forme cliniche minori.
Trattamento della fibrosi cistica
Nei casi di insufficienza pancreatica si possono somministrare enzimi pancreatici ai pasti. Nei casi
di problemi di assorbimento degli alimenti è invece possibile aumentare le calorie. Per le
manifestazioni polmonari (il problema più grave) possiamo utilizzare le vaccinazioni, profilassi e
terapia antibiotica, Fisioterapia (terapia espettorante), Farmaci broncodilatatori (per aumentare gli
scambi), Corticosteroidi orali (quando l'infiammazione cronica è imponente). Nei casi più gravi si
può optare trapianto di polmone che è l'unica terapia risolutiva ma non è applicabile in tutti i casi.
La terapia genica ha come obiettivo in futuro la protein theraphy.

Patologia molecolare 24 marzo e 25 marzo 2011

Oncologia
Prof.ssa Nanni Patrizia
Programma d'esame
Introduzione, definizioni, classificazioni
• Dimensioni del problema cancro
• Tumori benigni e tumori maligni
Il tumore come malattia genica
• Oncogèni e geni oncosoppressori “gatekeeper” e “caretaker”
• Meccanismi di attivazione di oncogèni o inattivazione di geni oncosoppressori - Effetti di
attivazioni/inattivazioni
• Implicazioni terapeutiche di oncogèni e geni oncosoppressori
• Predisposizione genetica
Il fenotipo tumorale
• Crescita – Differenziamento – Morte cellulare
• Instabilità genomica
• Caratteristiche morfologiche e metaboliche,
Storia naturale
• Monoclonalità – Eterogeneità
• Lesioni preneoplastiche
• Progressione
Rapporti tumore-ospite
• Angiogenesi
• Il processo metastatico

23
 • Sindromi paraneoplastiche
• Immunologia dei tumori

I termini tumore e neoplasia indicano una massa/tumefazione/popolazione cellulare che si accresce

in modo non coordinato con il resto dell'organismo.
Tumore e neoplasia sono impiegati sia per i k benigni
che maligni, sia peri i tumori solidi che fanno massa sia
per le leucemie (una volta chiamati liquidi). Il
termine cancro è impiegato per le forme maligne.
Il cancro non è di origine recente perchè vi sono segni
di masse tumorali anche nei dinosauri e sono
presenti in tutte le classi di vertebrati ed invertebrati.
Ogni anno si ammalano di cancro nel mondo 12 milioni
di persone l'anno (6.660.000 maschi e 6.038.000
femmine) e la mortalità è elevata (4.225.662
maschi e 3.345.839 femmine).
I tumori più frequenti colpiscono il polmone, il seno,
il colon-retto, stomaco e prostata. I tuori hanno
incidenza differente. Inoltre il rapporto
incidenza/mortalità non è lo stesso.
La prima causa di decesso nei paesi sviluppati sono
le malattie vascolari (45%) e poi al secondo posto c'è il cancro (21%) mentre nei paesi in via di
sviluppo abbiamo le malattie infettive (43%) seguite dalle malattie cardiovascolari (25%) e poi i
tumori (9,5%). Ogni anno sono 600000 i morti in Italia da tumore. I maschi hanno il 50% del
rischio di ammalarsi di tumore nel corso della propria vita, e 1 su 2,6 nelle femmine. In totale 1
persona su 5 muore di tumore.
In Italia circa 160.000 morti totali ogni anno per cancro.
Anche la mortalità negli anni è variata per ogni organo. Nei maschi quello al polmone è aumentato
di recente (anche se il picco è passato) a causa del fumo mentre quello allo stomaco è diminuito
grazie alla migliore conservazione dei cibi grazie al frigorifero. Nelle femmine il primo tumore è
quello al polmone ed è in crescita.
Per ridurre l'incidenza o la mortalità del tumore si può fare prevenzione, ricerca, screening e
ricercare nuovi farmaci. In Italia ci sono 80000 morti all'anno per il fumo.

Morti per il fumo

Nel mondo circa 6 milioni di morti per il fumo (neoplasie, m. cardiovascolari, m. respiratorie, altro)
ogni anno. Circa 850.000 morti per neoplasie dovute al fumo, ogni anno = 2.329/giorno
In Italia 80.000 morti per fumo /anno = 220 morti al giorno. 27.000/80.000 morti di tumore tra i 35-
69 anni = 74 al giorno, con una perdita media (tra questi pazienti) di 22 anni di attesa di vita
Metà dei fumatori regolari sono uccisi dal tabacco. Un quarto dei fumatori moriranno
prematuramente tra i 35 e i 69 anni. Fortemente aumentato il rischio di cancro rispetto ai non
fumatori. Smettere di fumare serve a ridurre l’aumento del rischio

PREVENZIONE PRIMARIA:
• Esposizioni sul lavoro
• Agenti biologici
• Stile di vita
• Fumo
• Alcol
• Alimentazione

24
 • Esposizione al sole

CHEMIOPREVENZIONE
• Endogeni
• Proliferazione cellulare
• Ormoni
• Fattori di crescita

Nel caso del fumo si può prevenire riducendo l'esposizione (anche in alcune malattie professionali è
così).
Metà dei fumatori regolari sono uccisi dal tabacco
Un quarto dei fumatori moriranno prematuramente tra i 35 e i 69 anni ed è fortemente aumentato il
rischio di cancro rispetto ai non fumatori. Smettere di fumare serve a ridurre l’aumento del rischio
Un altro metodo di prevenzione è la vaccinazione (es. Papovavirus nelle dodicenni contro il tumore
del collo dell'utero). Più del 15% di tutti i tumori umani sono causati (direttamente od
indirettamente) da agenti biologici come virus e batteri. È possibile prevenire questi tumori
mediante vaccini che proteggono dall’infezione. Sono già disponibili vaccini per prevenire:
• tumore del fegato (virus dell’epatite B, HBV)
• tumore del collo dell’utero (virus papilloma, HPV).

EFFICACIA DEL VACCINO CONTRO HPV:

Prevenzione dell’infezione: 96.9%
Prevenzione dell’infezione cronica: 100%
Prevenzione della formazione di cellule anomale nel collo dell’utero: 93%-96%
Prevenzione del carcinoma della cervice uterina: 100%

Interventi per ridurre l’incidenza:

Prevenzione
• individuazione di fattori che favoriscono insorgenza e sviluppo tumorale.
Eliminazione/riduzione
• individuazione di persone a rischio di sviluppare tumore
Esposizione
• predisposizione genetica
• Interventi per ridurre la mortalità:
• Prevenzione con l'individuazione di fattori che favoriscono insorgenza e sviluppo tumorale.
• Eliminazione/riduzione dell'agente.

Interventi per ridurre la mortalità:

• Diagnosi precoce
• Terapie
• Terapie del tumore primario
• Terapie delle metastasi
• Terapie di supporto
• Chirurgia
• Radioterapia
• Chemioterapia
• Limitazione di tossicità
◦ Riduzione della tossicità delle terapie
◦ Individuazione di pazienti responsivi alle terapie

25
 ◦ Individuazione di pazienti a rischio di sviluppare metastasi

TERAPIA MIRATA (TARGETED THERAPY)

è necessario studiare le differenze molecolari tra cellule normali e tumorali ed individuare le
molecole da cui dipende la sopravvivenza delle cellule tumorali. Inoltre è importante stabilire quali
molecole tumorali possono essere bersaglio di strategie terapeutiche.
Disegnare e produrre nuovi farmaci che colpiscono le cellule tumorali che esprimono il bersaglio.
Iperplasia fisiologica e iperplasia patologica sono due termini differenti da tumore:
Iperplasia fisiologica = aumento della proliferazione quando è necessario un aumento della funzione
o la compensazione di una sua diminuzione.
Iperplasia patologica = aumento della proliferazione come risposta reattiva ad “insulti” persistenti di
vario tipo.
L’iperplasia sia fisiologica che patologica è un aumento numerico che permane entro limiti
controllati. E’ un aumento reversibile e non progressivo.

Definizioni di neoplasia
“Crescita di tessuto relativamente autonoma e alterata in modo ereditabile.”
“Si intende per neoplasia una crescita tissutale relativamente autonoma e progressiva.”
I tumori maligni sono invasivi e possono dare metastasi; i tumori benigni no. Alcuni tumori benigni
non evolvono mai a maligno.
I tumori benigni non metastatizzano ma possono causare la compressione di vasi, organi,
produzione maggiore di sostanze (adenoma ipofisario).
Crescita di tessuto come risultato di una alterata omeostasi, dovuta ad alterazioni ereditabili dalle
cellule nel
• controllo della proliferazione
• controllo della morte cellulare
• controllo del differenziamento
I tumori possono originarsi in tutti i tessuti da cellule che mantengono una capacità proliferativa.
Sono un gruppo di malattie che condividono caratteristiche fondamentali.

Tumori benigni
Sono localizzati e non infiltrano il tessuto normale.
Producono danni rilevanti solo per compressione od ostruzione di strutture anatomiche importanti o,
quando hanno capacità secernente, a causa della grande quantità di sostanza prodotta (ad es.
insulinoma, tumore pancreas che può dare gravi crisi ipoglicemiche)

Tumori maligni
Sono invasivi, cioè infiltrano i tessuti normali circostanti e possono metastatizzare in organi/tessuti
distanti dal punto d’origine.
Presentano anche caratteristiche proprie delle cellule di origine e dell’ambiente d’insorgenza.

La differenza tra tumori benigni e maligni è molto importante per la prognosi e la terapia.
La valutazione che si basa su di una correlazione storica (probabilità) tra determinate caratteristiche
istologiche e citologiche e l’evoluzione del tumore.
Alcuni tipi di lesioni possono evolvere, altri mai.

Nomenclatura
Le neoplasie benigne spesso, ma non sempre, vengono indicate con un prefisso che identifica il
tessuto o la cellula d’origine e dal suffisso –oma (ad esempio adenoma, epitelioma, condroma).
Esiste qualche eccezione per alcuni maligni es: melanoma. I teratomi originano da più foglietti

26
germinali e quindi contengono tipi cellulari diversi. Si formano principalmente nelle gonadi.

Le neoplasie maligne sono indicate con il suffisso -oma + l'origine del tessuto tumorale;
Se da cellule nervose: retinoblastoma, neuroblastoma
Se da astrociti: glioblastoma
- carcinoma se di origine epiteliale es. adenocarcinoma
- sarcoma se di origine mesenchimale es. fibrosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma
osteosarcoma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma,
- blastoma per neoplasie di possibile origine embrionale es. retinoblastoma.
Se dal tessuto emopoietico
• leucemie → per neoplasie che originano nel midollo osseo
• linfomi → per neoplasie che originano nei linfonodi e milza

I tumori vengono classificati anche in base all’aspetto macroscopico, (polipo papilloma).

In base alle caratteristiche dello stroma più o meno scarso o alla produzione di mucina vi sono
sottoclassificazioni: midollare, scirroso, mucinoso.
Vi sono tantissimi i sottotipi descritti.

Grading e Staging dei tumori

Ricerca di quantificazione dell’aggressività dei singoli tumori.
Grading: sistema basato sul differenziamento, indice mitotico e altre caratteristiche cito-istologiche
di lontananza dalle cellule normali di riferimento.
Staging: dimensioni della neoplasia primaria, coinvolgimento dei linfonodi e diffusione metastatica
Implicazioni prognostiche e predittive della risposta alle terapie, valutazione dei risultati di terapie

Frequenza dei vari tipi di neoplasie maligne:

I carcinomi rappresentano la grandissima parte delle neoplasie:circa 85-90%
I sarcomi sono poco frequenti: circa 1-2%
Le leucemie circa il 3%
I linfomi circa il 4%
Altri (melanomi, tumori cellule del sistema nervoso,) circa il 5%.

IL TUMORE COME MALATTIA GENICA

I tumori sono il risultato di alterazioni nella struttura o nell’espressione di determinati geni.
Le alterazioni colpiscono le cellule somatiche.
Se colpiscono una cellula germinale si possono ereditare alterazioni che predispongono al cancro.

Funzioni dei geni che possono essere alterati

I geni che vengono alterati sono coinvolti nei fenomeni di:
● Regolazione della crescita cellulare
● Proliferazione cellulare
● Morte cellulare
● Differenziamento
● Controllo della stabilità del genoma
● Corretta duplicazione del genoma
● Riparazione del DNA
Eventi esogeni o endogeni possono provocare alterazioni strutturali o di espressione in questi geni.

In un organismo pluricellulare le cellule devono:

• collaborare con altre cellule

27
 • interagire col microambiente
• avere un comportamento coordinato sottoposto a controllo sociale.
Vi è un fluire di informazioni da microambiente alla cellula e viceversa nella quale è fondamentale
la trasduzione del segnale. Le informazioni, cioè i segnali, sono ricevuti da parte di strutture
indicate come recettori. La cellula risponde modificando attività come proliferazione, morte,
movimento, produzione specializzata etc. Tutto il macchinario è indicato come trasduzione del
segnale o signalling. Esso controlla sviluppo embrionale e, nell’adulto, turnover ed omeostasi
Deve essere un sistema affidabile e preciso, quindi molto complesso e finemente regolato.
La cellula riceve segnali positivi o negativi per quanto riguarda:
• Proliferazione
• Morte cellulare
• Differenziamento
Sono fenomeni strettamente interconnessi e finemente controllati, dipendenti da controllo della
integrità del genoma.
Quando un’alterazione di struttura o di funzione interessa uno o più geni coinvolti in questi
processi regolati si può avere insorgenza e crescita tumorale.
Le alterazioni strutturali o dell’espressione possono colpire due tipi di geni:
• geni la cui aumentata e non regolata attività favorisce la crescita tumorale
► Oncogèni
• geni la cui mancata attività favorisce la crescita tumorale
► Geni Oncosoppressori

Oncogèni
Regolano positivamente la crescita cellulare e possono essere:
• Fattori di crescita;
• Trasduzione del segnale;
• Recettore di fattore di crescita;
• Fattore trascrizionale;
• Regolatore positivo del ciclo cellulare;
• Inibitori di apoptosi.

Geni oncosoppressori
Si dividono in geni che regolano negativamente la crescita cellulare (geni Gate keeper) e in geni che
controllano la stabilità del genoma (geni care taker). Questi possono essere:
• Fattore di inibizione
• Recettore di inibitore
• Inibitore di trasduttore del segnale
• Regolatore negativo di fattore trascrizionale
• Regolatore negativo del ciclo cellulare
• Regolatore positivo di apoptosi
• Corretta duplicazione del genoma
• Riparazione del DNA

I geni alterati nei tumori

Oncogéni: Sono geni che accelerano la moltiplicazione delle cellule. Nei tumori sono attivati in
modo sregolato.
Geni oncosoppressori: Sono geni che frenano la moltiplicazione delle cellule. Nei tumori sono
disattivati.

28
I topi da laboratorio nei quali si iniettano
gli oncogeni devono essere
immunodepressi e topi nudi (perchè
hanno un'atrofia timica che impedisce lo

Questa immagine (→) piace molto alla

prof: descrive tutti i livelli ai quali è
possibile che ci sia una alterazione
nella trasduzione del segnale mitogenico
nei quali possono essere implicate
alterazioni dei fattori di crescita, del
recettore del fattore di crescita, dei
trasduttori del segnale o dei fattori
trascrizionali (bisogna sapere i bottoncini
intermedi che veicolano il messaggio

Funzioni di Oncogèni
Geni la cui accresciuta e non regolata
attività favorisce la crescita tumorale

Principali oncogèni
Fattori di crescita (GF)
sis catena B di PDGF (Platelet derived growth factor)
int-2 FGF-basico (Fibroblast growth factor)
wnt fattore di crescita WNT, prec INT-1

Recettori di fattori di crescita

di membrana (tirosin chinasi)
erbB1 EGF-R (Epidermal growth factor-Receptor)
erbB2 neu, HER-2, tirosin chinasi di membrana
fms CSF-1R (Colony stimulating factor-1-Receptor)
kit SCF-R (Stem cell factor-Receptor)
met HGF-R (Hepatocyte growth factor-Receptor)
ret recettore di GDNF (Glial derived neurotrophic factor)
trk-A recettore di NGF (Nerve growth factor)
recettori nucleari
erbA recettore ormoni tiroidei

Funzioni di Oncogèni
Trasduttori del segnale
src tirosin chinasi
abl tirosin chinasi
ras GTP-asi (proteina G)
Fattori trascrizionali
myc
jun
fos
Regolatori positivi del ciclo cellulare
CCND ciclina D
CCDK4 chinasi ciclina-dipendente 4

29
Inibitori di apoptosi
bcl-2

Oncogèni/Protooncogèni e tumori
La scoperta degli oncogèni (fine anni ‘70-inizio anni ’80) è nata da 2 osservazioni:
• in retrovirus oncogeni sequenze geniche responsabili della trasformazione neoplastica erano
omologhe a sequenze del normale genoma cellulare
• sequenze geniche di tumori trasformavano in senso neoplastico cellule normali
Gli oncogèni virali (v-onc) = analoghi alterati di geni cellulari (c-onc) sono rimasti inseriti nel
genoma virale in seguito ad una infezione. Nel genoma i geni cellulari che, se alterati nella struttura
o nella espressione (attivati), diventano oncogèni venivano chiamati protooncogèni. Comunemente
si usa il termine oncogèni anche per i protooncogèni non attivati, normalmente regolati.

Meccanismi di attivazione di Oncogèni

Meccanismi che determinano alterazioni nella struttura o espressione di oncogèni tali che
favoriscono crescita tumorale:
• Mutazione puntiforme: porta a un prodotto alterato (livelli aumentati, molecola più attiva,
molecola meno inibita). es. RAS: carcinomi (H-RAS, K-RAS), alcune leucemie (N-RAS)
• Amplificazione: porta a un prodotto normale ma iperespresso
◦ N-MYC Neuroblastoma, microcitoma polmonare
◦ ERB-B1 Glioblastoma multiforme
◦ ERB-B2 Carcinoma della mammella, ovaio
◦ MET Carcinoma gastrico, colon
◦ Ciclina D Carcinoma mammella
• Traslocazione: può avere due conseguenze:
◦ porta a un prodotto normale, ma iperespresso: es. MYC Linfoma di Burkitt t(8;14)
◦ porta a una proteina chimerica (più attiva) es. ABL Leucemia mieloide cronica
t(9;22) cromosoma Philadelphia BCR-ABL proteina chimerica;
• Mutagenesi inserzionale: Retrovirus trasformanti “lenti”, ad es. MMTV provoca
carcinoma mammario topo perché promotore virale attiva oncogèni; si è verificata qualche
rara volta nell'uomo a seguito della somministrazione della terapia genica.
• Meccanismi Epigenetici: es. perdita di imprinting (LOI) di IGF-II porta a iperespressione
nel rabdomiosarcoma.

Come effetti degli oncogèni attivati si manifesta nei fattori di crescita con aumento dei livelli del
fattore di crescita e Diminuita dipendenza della cellula da apporto esterno di fattore di crescita.
Autocrinia per esempio sis: catena B di PDGF, Iperespresso nell’astrocitoma – Autocrinia.
Si ha un aumento dei livelli e maggiore suscettibilità della cellula a livelli di fattori di crescita
fisiologici ma al contempo ndipendenza dal ligando.
Nei seguenti si manifesta un prodotto più duraturo:
• erbB1 EGF-R Iperespresso (amplificato) carcinoma mammario. Deleto dominio
extracellulare nel glioblastoma: indipendente dal ligando;
• erbB2 tirosina chinasi di membrana, iperespresso (amplificato) nel carcinoma mammario;
• kit, SCF-R Mutazione puntiforme e piccole delezioni. Iperespresso nei sarcomi
gastrointestinali, e nella leucemia mieloide.

Meccanismo di attivazione di RAS

Possiamo avere un prodotto più duraturo nei trasduttori del segnale: per esempio RAS GTP-asi
(proteina G) ancorata al versante citoplasmatico della membrana è presente come mutazione 10-

30
20% dei tumori ed è difficile la sua inattivazione. Ras segue la via delle MAP chinasi. Il legame al
recettore tirosin chinasico provoca dimerizzazione del recettore, autofosforilazione, legame a
proteine adattatrici come GRB2 e SOS, attivazione della proteina RAS p21ras, proteina ad attività
GTPasica ancorata alla membrana. Nella sua forma inattiva RAS lega il guanosin-difosfato (GDP).
Dopo essere stata attivata la proteina rilascia il GDP per legare il GTP.
L’attivazione di RAS è contrastata da proteine con attività GAP (GTPase activating protein) che
promuovendo l’idrolisi del GTP riconduce RAS allo stato inattivo, legato al GDP.
RAS attivata lega la proteina RAF che lega e fosforila MEK (una MAP chinasi); ERK (altra MAP
chinasi) che trasloca al nucleo dove fosforila JUN e FOS che attivano la trascrizione. Con RAS
mutato la proteina rimane permanentemente in uno stato attivato, in quanto non è in grado di
idrolizzare il GTP. H-RAS mutazione puntiforme nei codoni 12 o 13 sono siti ad alta mutabilità
chiamati anche hot spots.

Effetti degli oncogeni attivati

Abl: tirosin chinasi (ancorata al versante citoplasmatico della membrana, nucleo, citoplasma).
Traslocazione reciproca (9;22) ABL dal cromosoma 9 al 22 si fonde con BCR formando gene
chimerico. Determina una attività tirosin chinasica maggiore. È associata alla leucemia mieloide
cronica 95% dei casi ha traslocazione (9;22), nel 90% dei casi di LMC si evidenzia il cromosoma
22 più corto= cromosoma Philadelphia. Proteina di fusione p210bcr/abl. Un’altra proteina di
fusione (p185) traslocazione (9;22) con un punto di rottura BCR diverso. 20-25% della leucemia
linfoblastica acuta e nel 2.5% di leucemia mieloide acuta. La traslocazione 9-22 comporta un
accorciamento del 22 perchè si tratta di una traslocazione reciproca.
Inoltre Abl normale quando ha localizzazione nucleare induce apoptosi; BCR/ABL resta sequestrata
nel citoplasma quindi non induce apoptosi.
Se la funzione è quella di fattore trascrizionale abbiamo un altro effetto degli oncogèni attivati.
Possiamo avere un aumento dei livelli o un prodotto più duraturo o attivo. Un esempio è il gene
myc (traslocazione 8-14) che viene traslocato in vicinanza delle catene pesanti delle Ig (enancher) e
viene prodotto in grandi quantità. Quindi la traslocazione di myc t(8;14) (q24;q32) anche t(8;22) o
t(2;8) nel causa il linfoma di Burkitt [cell B]. Il gene MYC dal cromosoma 8 trasloca vicino al gene
che codifica la porzione costante delle catene pesanti (CH) delle Ig sul cromosoma 14 risentendo
dell’effetto attivante di suoi elementi enhancer. L’espressione costitutiva di MYC altera il sistema di
controllo della trascrizione basato su dimeri MAX/MYC attivanti o MAD/MAX repressivi. Si
manifesta amplificazione N-MYC nel neuroblastoma.
Riassumendo possiamo parlare di:
• acquisto di funzione (gain of function);
• prodotto iperespresso che può essere dato da amplificazione, traslocazione senza formazione
di proteina di fusione o meccanismi epigenetici;
• prodotto alterato iperfunzionante o per mutazione puntiforme o per traslocazione con
formazione di proteina di fusione;
• effetto dominante.

Le implicazioni terapeutiche di questi meccanismi è che si può ridurre la funzione acquisita

attraverso anticorpi, inibitori specifici e strategie antisenso.

31
 Patologia molecolare 31 marzo 2011 – Prof.ssa Patrizia Nanni

GENI ONCOSOPPRESSORI
Sono geni la cui mancata attività all’interno della cellula favorisce la crescita tumorale.
L’alterazione nella struttura o nell'espressione di questi geni (inattivazione) se è a carico di entrambi
gli alleli determina perdita di funzione e fenotipo tumorale.

Prime identificazioni di geni oncosoppressori

A volte si presentavano delle cellule che presentavano ibridi tumorali se erano stimolati gli
oncogeni ma altre volte il fenotipo normale comportava la presenza di oncosoppressori. Spesso
quindi gli ibridi tra cellule tumorali e cellule normali spesso mostravano fenotipo normale; in
determinati tumori erano evidenziabili delezioni cromosomiche costanti e quindi in queste delezioni
c'erano geni che controllavano in modo negativo la proliferazione (oncosoppressori). L'insieme di
questi dati sperimentali hanno portato a scoprire gli oncosoppressori. Sono quindi necessari 2 eventi
inattivanti, uno per ciascun allele.

Oncosoppressori Gatekeeper e Caretaker

Gli oncosoppressori si dividono due categorie (Gatekeeper o Caretaker) – (secondo la prof non c'è
questa suddivisione ma è da sapere). Quindi in base alla prevalenza della funzione avremo:
• Gatekeeper: Funzione di regolazione negativa della proliferazione e positiva dell’apoptosi.
Vengono inattivati se sono inattivati entrambi gli alleli. In questo caso si ha perdita di
funzione ovvero un vantaggio selettivo nella crescita poiché viene perso un
oncosoppressore. È caratterizzato da relativa tessuto specificità
Possiamo avere differenti tipi di inibitori e geni oncosoppressori possono avere una di queste
funzioni:
◦ Fattore di inibizione
◦ Recettore di inibitore
◦ Inibitore di trasduttore del segnale
◦ Regolatore negativo di fattore di trascrizione
◦ Regolatore negativo del ciclo cellulare
◦ Regolatore positivo di apoptosi
Questi geni sono geni di controllo della stabilità del genoma e ogni cellula deve passare un
genoma non alterato.
Vi sono due funzioni di base degli oncosoppressori Caretaker:
• Funzione di controllo dell’integrità del genoma - Corretta duplicazione del genoma
• Riparazione del DNA)
L’inattivazione di entrambi gli alleli determina instabilità genomica e conseguente maggiore
frequenza di alterazioni (100-1000 volte più frequenti) anche a carico di oncogèni o altri geni
oncosoppressori. In questo caso c'è un'assenza di un diretto vantaggio selettivo nella crescita.
L'inattivazione di questo tipo di geni rende più probabile l'alterazione di altri geni e pertanto di per
sé comporta l'assenza di un diretto vantaggio selettivo nella crescita.
Si può quindi parlare di due tipi di funzioni più che due tipi di geni. Secondo alcuni, i veri geni
oncosoppressori sono quelli dotati di entrambe le funzioni, come ad es. APC.

I principali geni oncosoppressori

 RB: Funzione prevalentemente Gatekeeper → Controllo trascrizione dei geni di fase S in
mitosi (G1→S) ed è coinvolto direttamente nel ciclo cellulare con un controllo negativo
sullo stesso.
 APC: Funzioni Gatekeeper + Caretaker quindi da un lato ha un ruolo di soppressione della
trasduzione del segnale e dall'altro stabilità cromosomica.
 PTEN: Funzione prevalente Gatekeeper, Regolazione della segnalazione via

32
 fosfatidilinositidi
 VHL: Funz prev Gatekeeper, Degradazione di HIF-alfa
 p53 (TP53) detto anche “guardiano del genoma” e viene attivato quando ci sono dei danni
al DNA. Funzione prevalentemente Caretaker. È un fattore di trascrizione che sorveglia
l'integrità del genoma. È un sensore di danni al DNA, induce blocco del ciclo e apoptosi.
 BRCA-1: Funzione prevalente Caretaker, sorveglia l'integrità del genoma (stabilità
cromosomi riparazione DNA);
 BRCA-2: Funzione prevalente Caretaker, sorveglia l'integrità del genoma (stabilità
cromosomi, riparazione DNA);
 NER (sistema) Funzione prevalente Caretaker. Sorveglia l'integrità del genoma (riparazione
DNA per escissione dei nucleotidi);
 MSH2: Funzione prevalente Caretaker. Sorveglia l'integrità del genoma (riparazione DNA
da errato appaiamento);
 MLH1:Funzione prevalente Caretaker. Sorveglia l'integrità del genoma (riparazione DNA da
errato appaiamento);
 ATM: Funzione prevalente Caretaker. Sorveglia l'integrità del genoma, attiva sistemi
riparazione (controlla lunghezza telomeri), attiva p53 (con meccanismo post traduzionale
aggiunge un gruppo fosfato al residuo Ser15 di p53) e rallenta ciclo mitotico in fase G2.

Quindi se volessimo fare una proporzione tra oncogeni, oncosoppressori e una macchina:
Acceleratore : oncogeni = freno : oncosoppressori gatekeaper

Meccanismi di inattivazione di geni oncosoppressori

Il meccanismo per l'inattivazione è la perdita del prodotto o formazione di prodotto inattivo
(troncato) che può essere dovuto a:
• Delezioni (perdita gene, perdita intero cromosoma);
• Mutazioni (non senso, di senso, frameshift);
• Alterazioni epigenetiche (es metilazione - ipermetilazione del promotore di MLH1
impedisce il mismatch repair del promotore PTEN, fosfatasi che contrasta PI3K
degradandone il prodotto portando ad un aumento del segnale di PI3K).
• Prodotti virali che possono inattivare gli oncosoppressori.
Quindi deve essere a carico di entrambi gli alleli.
Per esempio RB (Funz prev Gatekeeper) è inattivato in retinoblastoma, osteosarcoma, ca
polmonare, mammella, prostata, vescica, qiuindi in vari tipi di tumore. È presente una
delezione/mutazione non senso anche forma ereditaria (retinoblastoma). C'è questa associazione
perchè c'è una forma ereditaria di inattivazione di RB. Per questi geni oncosoppressori si eredita
l'alterazione in uno dei due alleli (si eredita quindi la probabilità) e quindi aumenta la probabiltà di
ereditare la mutazione. Ovviamente dipende da quale cellula (se della linea germinale
o somatica) viene colpita. È ovviamente peggio la germinale perchè la
caratteristica viene ereditata da tutte le cellule.
In G1 la RB ipofosforilata si lega a fattori di trascrizione E2F/DP →
Il complesso RB-E2F/DP si lega a promotori e reprime la
trascrizione di geni di replicazione del DNA cellulare → La proteina
RB viene iperfosforilata dalle chinasi ciclina-dipendenti di fase G1 e
si dissocia dal complesso E2F/DP → quest’ultimo può espletare la
sua funzione transattivante.
Le varie p... inserite nell'immagine sono degli oncosoppressori e le cicline sono
oncogeni perchè non sono controllate dagli oncosoppressori. Se RB viene fosforilato
E2F è libero di dare la trascrizione e di portare avanti il ciclo.
L'inattivazione può essere data anche da prodotti di geni virali (E1A, E7 e SV40)
sequestra RB e lascia E2F libero di continuare la mitosi.

33
Funzioni di APC
Ha una duplice funzione:
• Funzione gatekeeper:
◦ Promuove degradazione di β catenina, (βcatenina + Tcf4= coattivatore trascrizionale) β
catenina è un oncogène (un attivatore trascrizionale), APC è uno dei pochi veri
“antioncogèni”
◦ Adesione cellulare (migrazione, apoptosi): la β catenina è componente essenziale delle
giunzioni aderenti collegamento tra caderine e α catenina che lega actina (citoscheletro)
• Funzione caretaker:
◦ Regola assemblaggio dei microtubuli nel fuso mitotico

Se manca l'attività di APC come caretaker avremo dei fusi mitotici alterati con divisione
cromosomiale differente con alterazioni cromosomiche ed instabilità genomica. Le mutazioni di
APC permettono la traslocazione al nucleo di - catenina anche in assenza di Wnt (dx). In presenza
di Wnt (sn) la β-catenina va al nucleo ed il complesso β-catenina-TCF avvia la trascrizione di
MYC, ciclina D1, MDR1, ecc. In assenza di Wnt la β-catenina rimane nel citoplasma ed è avviata
alla degradazione ma la β-catenina non viene degradata e svolge la sua funzione di
fattore trascrizionale. La β-catenina potrebbe essere
classificata quindi come un
oncogene per cui un'alterazione
a carico della β-catenina può
essere anche con APC.
Questa a fianco rappresentata
schematicamente è una cellula
intestinale (e il fenomeno
descritto è caratteristico della
poliposi).

Inattivazione di APC
APC è inattivata per mutazione
con formazione di proteina
troncata.
Questa inattivazione comporta
la mancata distruzione della β
catenina e conseguente
trascrizione di geni.
Vi sono dei difetti nella segregazione dei cromosomi
che porta ad instabilità cromosomica.
L'instabilità cromosomica, dovuta anche ad altre cause, è presente nell’85% dei ca colon mentre nel
15% c’è difetto nella riparazione del DNA.

Inattivazione dei principali geni oncosoppressori

 PTEN: Funzione prevalente Gatekeeper, inattivato in glioblastoma, carcinomi (prostata,
tiroide, mammella, endometrio). Mutazione frameshift.
 VHL: Funzione prevalente Gatekeeper, inattivato in carcinoma renale, emangioblastoma.
Delezione/mutazione missenso anche forma ereditaria (sindrome Von Hippel-Lindau).
Questa classificazione vi deve far pensare che non c'è un solo oncosoppressore per tipo di
tumore ma più di uno.
 p53: Funzione prevalente Caretaker, inattivato in carcinomi e sarcomi tramite mutazione
missenso. Esiste anche una forma ereditaria (sindrome Li-Fraumeni). P53 è un fattore di
trascrizione ed è attivata solo se c’è danno al DNA (attivazione trascrizionale,
fosforilazione). La fosforilazione di certi residui serinici o la defosforilazione di altri
34
 determina maggiore affinità di p53 per le sequenze di legame dei bersagli di p53 o minore
affinità per inibitori come MDM2. Ma cosa fa p53?
◦ Fattore di trascrizione che controlla stabilità genoma tramite
arresto in fase G1 di cellule con DNA alterato,
mediante transattivazione del gene CIP-
1/WAF-1 (p21 – da non confondere con il p21
di RAS) inibitore di chinasi ciclina-dipendente.
Questa sarà una funzione di p53 come
gatekeeper.
◦ promozione dell’attività riparativa
del sistema NER (mediante
transattivazione del gene GADD-45 e
interazione con le proteine del complesso TFIIH)
◦ promozione dell’apoptosi di cellule con DNA alterato (mediante attivazione della
trascrizione del gene BAX e inibizione della trascrizione del gene BCL2)
◦ Regolazione dell’angiogenesi nella vascolarizzazione dei tumori.

Quindi P53 ferma la proliferazione, prova a riparare il danno e se si ripara il danno tutto riparte (e
quindi deve essere inattivata). Se il danno non si ripara si avrà apoptosi e p53 favorirà l'apoptosi.

Inattivazione di p53
P53 normale agisce come omotetrameri. La p53 mutante inattiva forma tetrameri con la p53
normale determinando scarsa affinità del tetramero per il DNA. Quindi basta che sia mutato anche
solo uno dei quattro per dare mutazione (dominante negativo). Quindi è un caso particolare tra gli
oncosoppressori che necessitano solitamente di una doppia alterazione.
P53 wt emivita di circa 20 minuti, p53 mutata emivita di circa 3-7 ore. Degradazione, colorabilità.
Quindi p53 normale si comporta da oncosoppressore recessivo, mentre il gene mutato da oncogène
dominante (infatti all'inzio della sua scoperta era stata classificata come oncogene). p53 mutato in
circa il 60% di tutti i tumori umani.

P53 è inattivata da
− proteine E6 del papilloma, perchè viene portata alla degradazione
− T grande dell’SV40, stabilizzando lo stato inattivato
− E1e E4 dell’adenovirus che blocca la trascrizione della p53
− prodotto del gene MDM2, quindi l'insieme della regolazione è ancora più frequentemente
alterato.

Inattivazione di altri geni oncosoppressori

 BRCA-1: Funzione prevalente Caretaker. Inattivato in carcinoma della mammella e
dell’ovaio, (raramente negli sporadici) con mutazione non senso/missenso /delezione. È
presente anche in forma ereditaria (ca mammario e ovaio).
 BRCA-2: Funzione prevalente Caretaker, inattivato in carcinoma della mammella
(raramente negli sporadici). Delezione/mutazione non senso anche in forma ereditaria (ca
mammario anche maschile e ovaio);
 NER (sistema): Funzione prevalente Caretaker, inattivato in tumori cutanei. Mutazione
anche forma ereditaria (sindrome Xeroderma pigmentoso);
 MMR (sistema - MSH2, MLH1): Funzione prevalente Caretaker, Inattivato in carcinomi;
Mutazione, Metilazione dei promotori anche forma ereditaria (sindrome HNPCC);
 ATM: Funzione prevalente Caretaker, inattivato in leucemie, carcinoma mammario.
Mutazione anche forma ereditaria (sindrome Atassia telangectasia).

35
Quindi riassumendo i geni oncosoppressori essi sono soggetti a:
 Perdita di funzione (loss of function)
 Inattivazione di entrambi gli alleli (in alcuni casi aploinsufficienza) – eccetto p53
 Effetto recessivo (salvo i casi con prodotto alterato che funge da dominante negativo)

Clinicamente lo studio di oncogeni e oncosoppressori sono che questi ci danno dei suggerimenti per
la terapia, diagnosi, prognosi e predittività della risposta terapeutica.
È elevata la segnalazione di oncogeni come RAS, RAF, MYC che può indurre la cellula con effetto
paradosso con risultato di senescenza o apoptosi. Ci sono quindi casi in cui questi oncogeni se
espressi a livelli altissimi possono dare una controrisposta nella cellula per mantenere l'omeostasi e
quindi la cellula entra in senescenza dando un effetto paradosso → o senescenza o apoptosi. Quindi
deve esserci una determinata concentrazione di RAS, RAF e MYC tale da non scatenare questa
risposta (effetto paradosso) nella cellula.
Le implicazioni terapeutiche degli oncogeni è la ricerca dell'inattivazione della risposta acquisita
(tramite anticorpi diretto contro gli oncogeni [per esempio RB2, recettore maggiormente espresso
nei tumori mammari], inibitori specifici della trasduzione del segnale [dell'attività tirosinchinasica]
e oligonicleotidi antisenso per il prodotto di questi oncogeni).

Modelli per lo studio di geni implicati nelle neoplasie

FASE1: definizione dose massima tollerabile.
I trial terapeutici devono prevedere dei gruppi controllo randomizzati e doppio cieco. Ci dovrebbe
essere un gruppo placebo (trattato con placebo). È l'insieme di queste condizioni che ci dice se un
farmaco è efficace o no.
Le informazioni sulla funzione dei geni implicati nelle neoplasie possono venire da studi su:
 topi transgenici nei quali sono stati inseriti oncogèni
 topi knock out nei quali sono stati inattivati geni oncosoppressori
◦ modelli animali di cancerogenesi virale
◦ Lieviti
◦ Caenorhabditis elegans
◦ Drosophila melanogaster

Ma come abbiamo agito nello specifico?

KIT: ha attività tirosin chinasica che è inibita da STI571 piccola molecola che inibisce BCR-ABL.
Nelle leucemia mieloide cronica e negli epatocarcinomi gastrici hanno avuto buoni effetti.
RAS: si è cercato di inattivarlo rompendo il suo ancoraggio alla membrana. Il legame è catalizzato
dall'enzima farnesiltrasferasi. Si è cercato di utilizzare delgi inibitori della farnesiltrasferasi per
disattivare RAS ma i risultati sono un po' scarsi.

Implicazioni terapeutiche oncosoppresori

Dobbiamo ripristinare la loro attività. Ciò non è facile. Si possono attuare delle terapie geniche con
wild type, oppure utilizzare degli inibitori della proteina mutata. Infine sarebbe utile cercare
molecole per superare lo stop nella trascrizione.
Un'altra strategia è quella dei virus oncolitici, ovvero virus che penetrano selettivamente le cellule
tumorali per causare apoptosi. Adenovirus viene visto come potenziale danno al DNA e quindi
viene attivata p53. E1B dell'adenovirus blocca p53 consentendo al virus di replicarsi senza
restrizioni. Virus effettivi per E1B non riescono quindi a replicarsi nelle cellule normali perchè è
attivata p53 ma riescono a replicarsi nelle cellule con p53 inattivata e quindi neoplastiche. Era una
strategia quindi selettiva per il tumore. Questo era uno dei primi virus oncolitici.
Quindi l'individuazione di oncogeni e oncosoppressori è importante per unificare i meccanismi
molecolari di cancerogenesi, per le implicazioni terapeutiche e per le forme ereditarie (per capire
perchè ci sono delle forme ereditarie di neoplasie).

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Possibile domanda all'esame → Meccanismi attivazione oncogeni/oncosoppressori

Patologia molecolare – venerdì 1 aprile 2011 – Prof.ssa Nanni

FENOTIPO TUMORALE MALIGNO

Il fenotipo tumorale maligno è un accumularsi di alterazioni della struttura o dell’espressione di
oncogèni, geni oncosoppressori e altri geni. Si manifesta con l’acquisizione di alcune caratteristiche
fenotipiche delle cellule tumorali maligne quali segnali di crescita autosufficienti, insensibilità ai
segnali antiproliferativi, ridotta apoptosi, potenziale replicativo illimitato, instabilità
genomica, capacità angiogenica, invasione e metastasi e antigeni tumore-associati.

Segnali di crescita autosufficienti

Questi sono fattori di crescita diffusibili, componenti della matrice extracellulare e molecole di
adesione/interazione tra cellula e cellula.
La cellula neoplastica può aver ottenuto i segnali di crescita autosufficienti come produzione di
propri fattori di crescita positivi (denominata autocrinia), iperespressione/iperfunzionalità di
recettori di GF, vie di segnalazione costantemente attive, alterata espressione di strutture
recettoriali/adesive/di comunicazione per la matrice extracellulare (integrine) per altre cellule
(caderine) oppure per induzione di segnali positivi da parte delle cellule vicine.
Le cellule normali per crescere in vitro hanno bisogno di un terreno di coltura ricco di GF e
nutrienti (glucosio, sali, aminoacidi, pH, nutrienti, temperatura e terreni di coltura che forniscono
alla cellula quello che le serve per crescere). I fattori di crescita sono spesso forniti sotto forma di
siero bovino. IGF-I (fattore di progressione del ciclo cellulare) alti livelli nel siero.
Le cellule neoplastiche hanno meno bisogno di GF (autocrinia), cioè crescono anche in bassa
percentuale di siero.
Quindi riassumendo:
Cellule normali → Alti livelli di siero
Cellule neoplastiche → Bassi livelli di siero perchè producono già da sole i loro fattori di crescita
ed hanno maggiore indipendenza.

Insensibilità ai segnali antiproliferativi

Altra caratteristica delle cellule tumorali è l'insensibilità ai segnali antiproliferativi.
Le cellule normali sono sottoposte a segnali di crescita negativi date da inibitori di crescita
diffusibili, componenti della matrice extracellulare e molecole di adesione/interazione cellula-
cellula. Le cellule neoplastiche possono evadere questi controlli perchè manifestano inattivazione
della segnalazione di inibitori (quali TGFβ per esmpio) e perchè evadono segnali di
differenziamento perchè noi abbiamo una programmazione di una cellula le quale ha uno strato
proliferante differenza fino ad uno stato non più proliferante (per esempio la cellula muscolare
all'inizio si sviluppa e poi termina la proliferazione quando ha raggiunto il suo livello finale di
differenziamento. In questi casi la cellula diventa insensibile alle spinte differenziative che riceve.
Inoltre si può manifestare l'inattivazione di geni gatekeeper (come Rb per esempio).
Le cellule normali in coltura risentono della inibizione da densità/contatto, le cellule neoplastiche
no. Le cellule normali crescono aderenti e fanno un monostrato; se ci sono delle cellule anomale
queste non crescono solo su uno strato ma si sviluppano su più strati e manca l'inibizione da
contatto.

Ridotta apoptosi
In tutte le cellule è presente (a volte latente) un programma di apoptosi; le cellule neoplastiche
possono avere una ridotta apoptosi perché presentano un aumento di segnali di sopravvivenza (es.
IGF-I e IGF-II, BCL2) e una diminuzione di segnali proapoptotici (es p53 che aumenta BAX e
diminuisce BCL2). I segnali possono essere
• fattori di crescita diffusibili

37
 • componenti della matrice extracellulare
• molecole di adesione/interazione cellula-cellula
Le cellule normali (non emopoietiche) in coltura crescono se sono ancorate ad un substrato,
altrimenti attivano un programma di apoptosi. Hanno bisogno di un segnale di sopravvivenza che
viene dall’adesione ad un substrato o da cellule vicine (chiamato anoikis). Se le cellule non si
attaccano muoiono e questo substrato fornisce l'indicazione di non morire ma di rimanere attaccate
al terreno.
Le cellule neoplastiche in vitro crescono anche in sospensione o in terreno semisolido (per esempio
l'agar), in assenza di substrato o a bassa densità (se prendo poche cellule normali in un terreno e le
dispongo molto lontane le une dalle altre queste non proliferano ma si fermano; le cellule tumorali
riescono a crescere anche se seminate a bassa densità).

Autofagia
In caso di stress cellulare (ad esempio dato dalla scarsità di nutrienti) si ha la distruzione di
organelli come mitocondri e ribosomi per ricavare dai cataboliti energia e biosinteisi. Non porta a
morte la cellula anzi ne consente la sopravvivenza. Vi sono delle alterazioni nella reflazione nelle
cellule neoplastiche. Sono coinvolti i parhway, coinvolti in apoptosi, e la sopravvivenza è inibita da
PI3K, AKT (gli stessi coinvolti nell'apoptosi) che in caso di scarsità di nutrienti sono down-regolati
da PI3K, AKT, ecc.
Radioterapia e chemioterapici possono indurre alti livelli di autofagia che si oppongono alla morte
delle cellule cancerose.

Potenziale replicativo illimitato

Gran parte dei tipi cellulari hanno un programma di autolimitazione della replicazione. Uno dei
sistemi di autolimitazione è dato dall’accorciamento dei telomeri. I telomeri fanno parte di sistemi
di conservazione dell’integrità del genoma
Ad ogni replicazione i telomeri si accorciano fino ad una lunghezza critica che non è più
compatibile con la replicazione e la sopravvivenza della cellula determinando la senescenza
cellulare.
Nelle cellule germinali e staminali (e in pochi altri tipi cellulari come i linfociti e macrofagi) la
lunghezza dei telomeri viene mantenuta costante ad opera di un enzima, chiamato telomerasi
Nelle cellule somatiche la telomerasi è poco espressa.
Dopo un certo numero di replicazioni i telomeri sono talmente accorciati che partono segnali di
danno con attivazione di p53, blocco della proliferazione e apoptosi.
Nell’85% delle cellule tumorali la telomerasi è espressa → immortalizzazione della cellula
tumorale.
Vie alternative (ALT). Per mantenere una cellula per molto tempo si può congelare (metodo
utilizzato in laboratorio – abbiamo cellule tumorali isolate anche trent'anni fa).

Instabilità genomica
La stabilità del genoma è dipendente dal corretto funzionamento dei meccanismi di duplicazione e
segregazione dei cromosomi e di riparazione del DNA.
Nei tumori è presente una maggiore instabilità genomica a causa di una mancata attività di geni
caretaker, della telomerasi, un'ipossia (ridotta pressione d’ossigeno incrementa tasso di mutazione).
Infine anche i minori contatti cellula-cellula sono importanti nella determinazione dell'instabilità
genomica.
L'instabilità genomica è collegata anche alla metilazione. Nei tumori spesso sono metilati i
promotori, ad esempio i promotori di Rb (retinoblastoma), VHL (ca. renale), MTS1 e MTS2
(codificano p16 INK4A p16 INK4B inibitori di chinasi ciclina dipendenti 4 e 6).
L'instabilità genomica si manifesta nella predisposizione ad alterazioni quali:
- perdita o acquisizione di interi cromosomi
- delezioni di ampi tratti di cromosoma

38
- riarrangiamenti cromosomici
- mutazioni puntiformi
- amplificazioni geniche
- alterazione del pattern di metilazione
- aumentata suscettibilità a mutagenesi indotta

L'instabilità genomica favorisce l'insorgenza di nuovi sub-cloni con diverse combinazioni di lesioni
critiche quali la perdita o acquisizione di interi cromosomi, delezioni di ampi tratti di cromosoma,
riarrangiamenti cromosomici, mutazioni puntiformi, amplificazioni geniche, alterazione del pattern
di metilazione oppure aumentata suscettibilità a mutagenesi indotta.
L’instabilità genomica favorisce quindi l'insorgenza di nuovi sub-cloni con diverse combinazioni di
lesioni critiche attivazione di oncogèni, inattivazione di geni oncosoppressori e alterazioni di altri
geni importanti per la malignità tumorale.
La capacità angiogenica, l'invasione e metastasi e gli antigeni tumore-associati sono specifici dei
rapporti tumore-ospite per cui li tratteremo a parte.

Caratteristiche morfologiche e metaboliche

Le alterazioni molecolari che abbiamo visto si manifestano anche come caratteristiche morfologiche
e metaboliche.
Le caratteristiche morfologiche cellulari sono la forma cellulare (polimorfismo), il rapporto
nucleo/citoplasma aumentato, il cariotipo (alterazione nel numero, alterazioni in singoli
cromosomi), il numero e forma di nuclei o di nucleoli, le alterazioni dei mitocondri e il citoscheletro
disorganizzato.

Metabolismo del glucosio

Si assiste ad un aumento dell’uptake e del metabolismo del glucosio nei tumori (effetto Warburg,
glicolisi anaerobia). Gioca un ruolo importante in ciò una forma di splicing della piruvato chinasi
PKM2 (M2 forma fetale, M2 forma adulta). Geni oncosoppressori ed oncogeni possono determinare
questa variazione nel metabolismo: p53 down-regola dei trasportatori del glucosio.
Il tessuto proliferativo e il tessuto tumorale anche se è presente ossigeno utilizza la via del lattato,
con minor produzione di ATP. Questa caratteristica metabolica è sfruttata nella PET, tomografia a
emissione di positroni, impiegata per indagare la presenza di tumori e di metastasi.

STORIA NATURALE DEI TUMORI

LA CANCEROGENESI È UN PROCESSO MULTIFASICO
Più eventi sono necessari per la transizione da tessuto normale a tumore maligno. Eventi più
numerosi nel caso di tumori frequenti nell'età adulta/anziana (colon, mammella, polmone,vescica)
rispetto a quelli frequenti in età pediatrica (retinoblastoma, leucemie).

I vari tipi di tumori sono diversi fra loro per quanto riguarda la storia naturale, cioè
• insorgenza monoclonale, oligoclonale o policlonale
• presenza di lesioni preneoplastiche più o meno definite
• numero e tipo di eventi necessari per l’acquisizione della malignità
• durata dell’intera storia e delle sue fasi
• evoluzione ed aggressività
• sedi metastatiche
• interazioni con l’ospite
Tumori appartenenti a uno stesso tipo istologico e con agente cancerogeno simile presentano
generalmente storie naturali simili:

39
 _______________________________________________________
cellula normale/ lesioni lesioni lesioni lesioni
microambiente normale preneoplastiche benigne invasive metastatiche

↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑

_______________________________________________________
EVENTI GENETICI ED EPIGENETICI

La progressione è il passaggio da un tessuto normale ad un tumore maligno.

In una cellula si accumulano attivazione di oncogèni, inattivazione di geni oncosoppressori, e
alterazioni di geni coinvolti nella malignità. La progressione è quindi un succedersi di alterazioni
che conferiscono vantaggio di crescita e/o metastatizzazione. Si origina una progenie di cellule a
sempre maggiore malignità. Di male in peggio. Anche le terapie esercitano pressione selettiva e vi
sono implicazioni importanti per la terapia. È importante intervenire il prima possibile (combinare
terapie appropriate per ridurre lo sviluppo di farmaco resistenza)

Modello colon-retto (Modello di Vogelstein e Kinzler) –

progressione tumorale
Epitelio normale
↓ ← Inattivazione APC (cr 5)
Epitelio iperproliferativo
↓ ← Ipometilazione del DNA
Adenoma lievemente atipico
↓ ← Attivazione K-RAS (cr12)
Aden. moderatamente atipico
↓ ← Inattivazione di
DCC/SMAD4 (cr 18)
Adenoma fortemente atipico
↓ ← Inattivazione TP53 (cr 17)
Carcinoma
↓ ← Altre alterazioni ?
Metastasi
Monoclonalità Eterogeneità Dominanza clonale

Per esempio le lesioni preneoplastiche possono essere:

• iperplasia atipica della mammella
• certe atrofie gastriche
• nervi displastici
• cirrosi epatica
• cheratosi attinica
Ma qual è il numero di eventi (hits) necessari perchè si manifesti la progressione? Dipende dal
tumore: retinoblastoma 2?, colon > 7, ca polmone 10-20?
Alcuni tipi di tumori presentano però una evoluzione favorevole: per esempio l'emangioma infantile
regredisce nel 80-90% dei casi; rari casi, ma ben documentati, di guarigioni spontanee in melanomi
e ca renali; infine il neuroblastoma infantile da maligno può evolvere a benigno differenziando
(comprese metastasi).
Vi è una combinazione di alterazioni genetiche a carico di oncogeni e oncosoppressori, fenomeni
epigenetici anche nello stesso tipo di tumore.

STORIA NATURALE DEI TUMORI

LA CANCEROGENESI E’ UN PROCESSO MULTIFASICO
Più eventi sono necessari per la transizione da tessuto normale a tumore maligno

40
Eterogeneità: fra i tipi di tumore dipendente dalle cellule di origine che hanno dato il k. Parliamo
prevalentemente di eterogeneità intratumorale, cioè riferito al singolo paziente. Il tumore non è
qualcosa di omogeneo ma vi sono differenti tipi tumorali anche all'interno dello stesso ospite.
Si ritiene che la maggiorparte dei tumori abbia origine monoclonale
(da una singola cellula) e un intervento terapeutico può essere mirato
al blocco di una cellula e lasciare che si sviluppino le insensibili a
quel farmaco.
Si ha la dominanza clonale della specie che replica più velocemente.
Abbiamo detto che la gran parte dei tumori ha un’origine
monoclonale, cioè da una sola cellula. Degli esempi sono il mieloma
multiplo (dato da alterazione della glucoso-6-fosfato deidrogenasi).
Ogni mieloma, neoplasia maligna costituita da plasmacellule,
produce un solo tipo di anticorpo con una sola specificità dimostrando
che tutte le cellule derivano da un solo precursore con quella
specificità.
Anche i linfomi B o T esprimono immunoglobuline di membrana o Tcell receptor di identica
specificità idiotipica, cioè sono di origine monoclonale.
Per quanto riguarda la glucoso-6-fosfato deidrogenasi essa può essere studiata mediante le donne.
Nella donna durante la vita embrionale in ciascuna cellula viene inattivato uno dei due cromosomi
X quindi le donne adulte sono dei mosaici per quanto riguarda i geni presenti sul cromosoma X.
L’inattivazione (lyonizzazione) colpisce casualmente o il cromosoma X di origine materna o quello
di origine paterna. Se prendiamo le donne eterozigoti (variante materna e paterna differenti) si è
visto che è presente una forma sola l'anomalia della 6glucosio fosfato deidrogenasi → ha avuto un
origine cellulare unica. Sappiamo anche questo non è un'isoforma che favorisce l'insorgenza perchè
anche nei tumori vi è una sola isoforma rappresentata.
La glucoso-6-fosfato deidrogenasi, codificata da un gene del cromosoma X , esiste in forme diverse
alcune donne hanno cellule con una variante ed altre cellule con l’altra variante, una di origine
paterna e l’altra di origine materna. La gran parte dei tumori di queste donne presenta una sola
variante della glucoso-6-fosfato deidrogenasi. Se l’origine della neoplasia non fosse monoclonale
dovrebbero essere presenti nel tumore sia cellule con una variante sia cellule con l’altra variante.
Se capiamo com'è l'evoluzione del tumore possiamo anche sapere come fermarlo. È importante
intervenire precocemente, combinare delle strategie terapeutiche per evitare la resistenza ad una
singola terapia.
Quindi durante la storia naturale dei tumori insorge una eterogeneità cellulare, nonostante l’origine
monoclonale.
L'eterogeneità intratumorale nell'espressione di molte caratteristiche: cariotipo, caratteristiche
morfologiche, sensibilità agli ormoni, caratteristiche differenziative, recettori, sensibilità ai farmaci,
(possono colpire una parte delle cellule e non le altre), immunogenicità, sensibilità a difese
dell'ospite e capacità metastatica. Tutte queste hanno implicazioni importanti in vivo, in vitro.

La generazione di eterogeneità
Eterogeneità nell'espressione di molte caratteristiche è stata dimostrata nelle cellule normali. Cellule
normali sono relativamente uniformi quando organizzate in tessuto, ma diventano eterogenee per
molte caratteristiche quando vengono disperse in colture monostrato:
es. fibroblasti embrionali dispersi in coltura
dopo 2 ore >> uguali dimensioni
dopo 24 ore >> diverse dimensioni
es. contenuto di albumina in epatociti normali è distribuito uniformemente nel fegato
intatto,mentre è eterogeneo 24 ore dopo l'espianto e la messa in vitro
Questo effetto delle colture cellulari indica che la morfologia e il comportamento delle cellule
normali è ordinato dalle loro relazioni topologiche nel tessuto e da altre influenze omeostatiche
dell'organismo. L'indebolimento di queste relazioni (minore presenza di controlli, minore

41
suscettibilità..) potrebbe contribuire alla trasformazione maligna
Eterogeneità nell'espressione di molte caratteristiche è stata dimostrata nelle cellule tumorali
nell'organismo e in coltura.

GENERAZIONE DI ETEROGENEITÀ
È data principalmente da instabilità genomica, fenomeni epigenetici (es metilazione) e dalla
presenza di cancer stem cell (cellule a diversa capacità differenziativa e di rinnovamento).

Cancer Steam Cell (CSC)

Sono cellule presenti nel tumore e danno origine a cellule tumorali che differenziano, sono poche
(<1%), hanno una duplicazione più lenta e limitata e sono le più lente ad avere una capacità
tumorigenica. Possono autorinnovarsi e hanno un'alta capacità di riparazione del DNA e maggiore
resistenza ai farmaci convenzionali. Avrebbero anche una combinazione di marcatori che
permetterebbero di individuarli.
Ciò è stato evidenziato in origine nelle leucemie.
La combinazione di marcatori specifici positivi e negativi (ad esempio nel carcinoma della
mammella CD24-/low/CD44+)
Implicazioni terapeutiche:
• Vera popolazione bersaglio
• Elevata resistenza ai farmaci

Il modello stocastico (utilizzato fino a qualche anno fa) affermava che c'erano differenti
sottopopolazioni che potevano dare tumori eterogenei, anche se quantitativamente differente. Il
modello gerarchico (più in voga ai giorni nostri) dice che nell'eterogeneità del tumore ci sono
poche cellule che riescono a ridare eterogeneo e si autorinnova e che a sua volta permette il
rinnovamento del tumore; tutte proliferano per un po' e poi si fermano se non ci sono queste steam
cell.
Quindi basterebbe/è necessario colpire quelle cellule per avere un risultato clinico efficace. Queste
però hanno anche elevata resistenza ai farmaci. Quindi se prendo come bersaglio tutte le cellule
salvo le staminali ho una iniziale remissione del tumore perchè colpisco le cellule che sono la
maggioranza ma poi il tumore recidiva; se invece colpisco le staminali all'inizio non ho un grande
effetto e la massa rimane ma alla fine avrei comunque una cura. L'ideale sarebbe prendere entrambe
per avere un effetto più rapido.
Vi sono ancora delle critiche sulle cellule staminali del tumore perchè non si sa quali siano i
rapporti con le cellule staminali normali. Non si sa neanche qual è la cellula alla base degli eventi.
Non si sa neanche quale sia il livello di staminalità colpita (totipotente, pluripotente, ecc). La sua
entità inoltre dipende dal modello che utilizzo per valutarlo; i marcatori per esempio sono spesso
diversi nei vari casi esaminati e quindi il rilevamento pratico delle CSC può essere molto variabile
es: [marcatori diversi – capacità tumorigenica relativa]

Anche se il discorso dei marcatori non torna e non è chiaro noi sappiamo comunque che nei tumori
ci sono cellule a differente grado di differenziamento e con differenti set di alterazioni e che
esistono cellule con differenti capacità e abilità replicativa e tumorigenica e ci sono popolazioni più
o meno resistenti ai farmaci, maligne. Sembra che ci siano anche popolazioni di cellule
estremamente tumorigeniche (bastano anche 1, 100 cellule per creare un tumore in un topo in vivo).
Inoltre aggiungiamo che anche nel tumore una piccola percentuale di cellule raggiunge un
differenziamento che impedisce alla cellula stessa di differenziarsi ulteriormente (→ si possono
applicare delle terapie differenziative che stimolano il raggiungimento di questi stadi).

42
 Patologia molecolare, Lollini 7 aprile 2011

Ipercolesterolemia famigliare
In fisiologia sappiamo che l'epatocita sintetizza dei complessi lipidici (ovvero colesterolo e
trigliceridi) alcune delle quali sono chiamate VLDL.
Queste contengono ApoC, B-100 e ApoE e servono per
trasportare al muscolo i trigliceridi. Nell'endotelio si
verifica la lipolisi delle VLDL ovvero la dissociazione
dei trigliceridi che possono essere diretti al muscolo in
caso di necessità di energia o all'adipocita per
immagazzinare l'energia. Ovviamente la densità cambia
e la VLDL si trasformerà in IDL e rimane attaccato a
questa molecola solo B-100 e ApoE. IDL può eseguire
un ulteriore passaggio che comporta la perdita di
trigliceridi (e perdita di ApoE) e si arriva a LDL che
rimane solo con una apoproteina (B-100). LDL viene
ricaptato dal fegato (anche IDL subisce il medesimo
processo) e il colesterolo che rientra nel fegato agisce da
feedback negativo (tramite la HMGCoA reduttasi)
sulla sintesi di nuovo colesterolo. Ovviamente tutto il
procedimento funziona se funziona il recettore delle
LDL. →

Se IDL e LDL rimangono

nel sangue si manifesta ipercolesterolemia. Nella stessa maniera se il
fegato non riceve il feedback del colesterolo (se non funziona il
recettore delle LDL) aumenta produzione di colesterolo.

← Ovviamente questa mutazione riguarda due alleli e avremo forme

differenti a seconda del numero di alleli mutati. Chi non ha entrambi
gli alleli funzionanti arriva ad avere nel sangue una concentrazione di
colesterolo pari a 800 mg/dl (altrimenti se è solo un allele si va intorno
ai 400).

Si possono formare degli xantomi e arcus cornae, ovvero dei depositi

di grasso sotto l'epidermide o all'interno dell'occhio.
In realtà però è pericolosa la sindrome metabolica in quanto in
presenza di ipercolesterolemia si hanno delle alterazioni dei vasi → i
formano delle placche aterosclerotiche (tra intima e media dei vasi)
con presenza di colesterolo, fagociti (cellule schiumose perchè sono
infarciti di colesterolo) cellule stromali, muscolatura liscia, ecc. Il tutto assume anche una
connotazione infiammatoria in quanto vi sono i fagociti che rilasciano dei fattori infiammatori. Vi
saranno quindi problemi di flusso all'interno del vaso (flusso che diventa turbolento) e si possono
avere fenomeni coagulativi e trombotici. Si possono avere infarti del miocardio e infarti muscolari.
Le conseguenze letali di questa patologia ereditaria sono quindi ictus e infarto.
Questa malattia è autosomica dominante. Come si manifesta negli eterozigoti e negli omozigoti:

Eterozigoti
Prevalenza 1/500, 5% degli ipercolesterolemici, 5% degli infarti del miocardio <60 anni
Colesterolemia 200-400 mg/dl
Xantomi: depositi di colesterolo nei tendini e nella cute
Arcus corneae: deposito alla periferia della cornea

43
Aterosclerosi, coronaropatia, infarto miocardico, ictus

Omozigoti
Prevalenza 1/1.000.000
Colesterolemia >600 mg/dl
Infarto miocardico <20 anni

Modificatori genetici ed ambientali che influiscono

sulla patologia
• Sesso (femmina < maschio)
• Gruppo etnico
• Dieta, estremamente importante questo aspetto
• Attività fisica
• Farmaci ipocolesterolemizzanti

È una patologia ereditaria dovuta ad una alterazione del recettore del colesterolo. Funzionano quindi
i farmaci che riducono il colesterolo. I modificatori sono indicativi anche della sindrome metabolica
del soggetto (cioè per quanto riguarda l'aterosclerosi).

Recettore delle LDL

Ha una costituzione modulare e lo
spettro mutazionale è molto vario.
È rilevante che mutazioni in punti
differenti causano mutazioni
differenti ma possono quasi tutte
portare ad una proteina anomala e
quindi non funzionante.
A seconda del punto di mutazione
si hanno alterazioni molecolari
differenti. Per esempio accanto a
mutazioni con scomparsa della
proteina in altri casi abbiamo delle
alterazioni nel sito di legame con le
LDL. Altre proteine possono essere
alterate nel sito di sgancio
all'interno del fegato, per cui
funziona bene il processo di
endocitosi nel fegato mentre una
volta all'interno del fegato il recettore non rilascia la molecola di colesterolo. Inoltre dobbiamo
sapere che i recettori non sono distribuiti a caso sulla membrana ma la loro distribuzione segue un
ragionamento logico. Il recettore per le LDL è localizzato nelle fossette rivestite (si chiamano in
questo modo perchè sono rivestite di clatrina tramite interazioni latero-laterali tra gli epatociti). Può
quindi essere alterata anche la localizzazione che invece di essere sulle fossette rivestite è disperso e
quindi tutto il processo funziona poco e male.

Tumori ereditari
Il rischio relativo di parenti di primo grado di pazienti oncologici hanno rischio maggiore rispetto
alla popolazione generale di sviluppare lo stesso tumore. Ciò si evidenzia in tutti i tumori (in misura
differente come possiamo notare dalla tabella alla pagina seguente) quindi cerchiamo di capire qual
è la componente genetica di queste alterazioni.
I tumori ereditari sono una minoranza; nel tumore della mammella e del colon in cui la componente
ereditaria è maggiore rispetto tutti gli altri tipi di tumori dobbiamo sapere che solo 1/20 è di origine

44
ereditaria.

Ovviamente vi sono delle alterazioni di geni che controllano la

crescita cellulare e la stabilità del genoma. Questi sono:
Oncogèni, le cui caratteristiche sono:
• Controllo positivo della proliferazione
• Mutazioni gain-of-function
• Dominanti a livello cellulare
• Ereditarietà rara
Oncosoppressori, le cui caratteristiche sono:
• Geni gatekeeper: controllo negativo della
• proliferazione
• Geni caretaker: controllo della stabilità del genoma,
• riparazione dei danni al DNA
• Mutazioni loss-of-function
• Recessive a livello cellulare
• Ereditarietà frequente

Caratteristiche dei tumori ereditari

La caratteristica più importante nei tumori ereditari è il cluster familiare dello stesso tipo tumorale
nelle famiglie che presentano tumori ereditari di k frequenti nella popolazione. Per tumori ad alta
incidenza (es. colon o mammella) si posso avere casualmente più casi sporadici nella stessa
famiglia. Sono necessari algoritmi per definire la probabilità di un cluster ereditario. Quindi l'albero
genealogico deve essere solo un indice e si deve approfondire con indagini genetiche. Cioè avere
più casi di un tumore come colon o mammella nella stessa famiglia non ci permette di affermare
con certezza che lo stesso è di origine ereditaria ma il tutto deve essere approfondito. Ciò però
dipende dall'incidenza del tumore che consideriamo. Per esempio il RB (retinoblastoma) è un k raro
ma se nella stessa famiglia abbiamo 2-3 casi allora è più probabile che vi sia una componente
genetica. Questo è un algoritmo molto importante da tenere in considerazione quando facciamo
diagnosi genetica.
Un altra caratteristica importante è l'età di comparsa precoce rispetto ai tumori sporadici (es. <30
anni per carcinomi della mammella o del colon): se abbiamo un danno nel genoma il tempo
richiesto dal tumore per manifestarsi è minore. Tutti i tumori ereditari tendono a comparire prima
dei corrispondenti tumori nei casi sporadici. Il picco di incidenza del RB è per esempio a 3 anni di
età mentre nella forma genetica esso è presente già a 6 mesi. Ma non sempre l'insorgenza è in
relazione all'età; per esempio la comparsa del k della mammella è in relazione alla vita fertile della
donna: è solitamente post menopausale nei casi sporadici mentre si sviluppa a 30 anni nelle forme
ereditarie. Il k del colon tende ad aumentare dopo i 50 mentre nella forma ereditaria a 25-30.
Altra caratteristica è che i tumori primitivi bilaterali o multipli sono dello stesso tipo mentre nelle
forme sporadiche c'è una forma singola. Ciò si verifica perchè c'è già un danno presente in tutte le
cellule. Nel RB possono comparire foci multipli di cellule tumorali nello stesso occhio, oppure nella
mammella possono essere bilaterali. Anche nel colon possono esserci centinaia di tumori. Di fatto la
probabilità di sviluppare un k sporadico nella vita è del 20% circa mentre la probabilità di
svilupparne due sporadici è praticamente nulla. Nei casi ereditari non è affatto così. Vi è una elevata
probabilità di svilupparne uno singolo e la possibilità di svilupparne anche più di uno.
Inoltre possono essere sviluppati più tumori di diverso istotipo nello stesso individuo, ovvero delle
vere e proprie sindromi con tumori ricorrenti. Come nel k della mammella si può avere
frequentemente il k dell'ovaio. Nel RB (retinoblastoma) possono comparire k differenti ovvero degli
osteosarcomi (in quanto la mutazione del gene implicato nel RB controlla anche lo sviluppo osseo)
durante la pubertà.
Infine si può assistere alla comparsa di tumori anche nel sesso normalmente non affetto (es.
mammella maschile).
45
I k ereditari sono in alcuni casi legati ad oncogeni: sono pochi
perchè gli oncogèni sono ereditari e si ha letalità intrauterina. →

Differentemente i k ereditari legati a geni oncosoppressori sono

recessivi (devono essere alterati entrambi). Di fatto quindi sono
presenti un numero maggiore di mutazioni e sono più
frequenti. →
Ereditarietà di Knudson (a doppio meno – “two hits”) nel
RB: viene ereditato 1 allele mutato, eterozigoti. Vi è una
mutazione in via verticale perchè ha colpito la via germinale
e uno sviluppo a livello somatico. Il K è -/-. In rari casi
abbiamo aploinsufficienza.
Questi sono alcuni esempi di tumori ereditari dati da geni gatekeeper. Il RB è quello su cui è stata
formulata l'ipotesi di Knudson, quindi è un po' come il padre di tutte le classificazioni.

Sindromi neoplastiche ereditarie – alterazioni dei geni gatekeeper

Retinoblastoma (RB)
Vi sono tumori multipli nell'occhio della bambina (uno è
quello grande e poi ce ne sono altri piccoli a dx). Potrà
avere rischio di osteosarcomi dopo anni con
l'accrescimento. I tumori
ereditari sono dominanti o
recessivi in relazione al
fenotipo che osserviamo.

In questo caso abbiamo due fenotipi: dominante e recessivo.

Nell'albero genealogico è dominante la predisposizione al tumore. La
penetranza è elevata. Il k si sviluppa quando si perde anche il secondo
allele. Il fenotipo è recessivo nelle cellule tumorali (vedi modello a
doppio meno).
RB è un k raro. Ipotesi di Knudson “two hits”:
Prima mutazione: ereditaria - Rb
Seconda mutazione: somatica, solo in cellule tumorali - Rb
Fenotipo “predisposizione al tumore”: dominante
Fenotipo “trasformazione neoplastica”: recessivo

I k intestinali sono i più frequenti e sono di quattro tipi. Faremo i primi due:

46
 Poliposi familiare (FAP)
Alterazione APC e predispone alla formazione di un adenoma, tumore benigno, ma possono
progredire verso la malignità. Il numero delle
lesioni benigne è indice di probabilità di
progressione. Il fenotipo primitivo è quindi
benigno (non metastatizza) mentre si può
avere letalità perchè gli adenomi possono
evolvere a carcinomi.
Questi adenomi originano sul villo e, come
ben sappiamo all'interno del villo c'è un
capillare; possono esserci quindi dei
sanguinamenti e i pz possono diventare
anemici.

Prevalenza 1:800
Ereditarietà: 2-hit classica, autosomica
Penetranza completa, espressività variabile
(quantitativa da qualche a tantissimi). Fa la
differenza:
• le mutazioni che possono essere in
punti differenti del gene e possono
portare a funzionalità differente del gene.
• Background genico: famiglie che hanno la stessa mutazione o soggetti che hanno differenti
mutazioni nella stessa famiglia → gravità del fenotipo.
Adenomi (polipi) multipli (anche migliaia) nel tratto colorettale. Il rischio di carcinoma è
proporzionale al numero di adenomi. Altri tumori che si accompagnano a questo tipo di tumori:
polipi duodenali, carcinomi tiroidei, adenocarcinomi pancreatici.
Vi sono inoltre anche delle sindromi correlate:
• Gardner: poliposi + osteomi + fibromi
• Turcot: poliposi + tumori SNC
In alcuni casi i geni sono gli stessi. APC (5q21-22) è spesso alterato nei tumori sporadici (80-90%).
Le mutazioni possono essere in comune 1309 o non legate. Codifica un componente del complesso
molecolare APC-GSK3β-Axin che fosforila β-catenina e la avvia alla degradazione.
La β-catenina ha un doppio ruolo:
• Collega E-caderina ad α-catenina e citoscheletro
• Trasduce al nucleo segnali della via Wnt- Frizzled
Mutazioni di APC sono presenti in ~80% dei carcinomi
colorettali sporadici.
Mutazioni di β-catenina sono state documentate in carcinomi
del colon, ma solo in casi rari (1- 2%). Quindi β-catenina è un
oncogene. Inoltre APC deve avere altre funzioni di
oncosoppressore
Interagisce con i microtubuli, partecipa all’organizzazione del
cinetocore → instabilità cromosomica
Associato alla membrana plasmatica → migrazione e adesione
cellulare

47
 Sindrome di von Hippel-Lindau (VHL)
Sindrome neoplastica ereditaria molto rara (prevalenza 1/30000-40000 nati).
Ereditarietà: 2-hit classica, autosomica.
Penetranza completa, espressività variabile

Presentazione:
• Emangioblastomi retina, cervelletto, midollo spinale
• Carcinomi renali
• Feocromocitoma (=tumore endocrino della surrenale)
• Altri tumori
• Cisti viscerali (pancreas, rene)

Ve ne sono 4 tipi (1, 2A, 2B, 2C) caratterizzati da proporzioni diverse dei vari tumori.
Il nostro gene VHL si è visto come agisce lo S.Cerevisiae (comune lievito di birra); in questo lievito
il VHL lega l'ubiquitina a proteine bersaglio. Viene colpito da questa mutazione il meccanismo
dell'ipossia; VHL evita che partano i meccanismi dell'ipossia perchè HIF-alfa viene distrutta da
VHL. Se manca l'ossigeno si stabilizza HIF alfa e si lega a HIF beta e inizia la trascrizione di geni
della risposta ipossica e aumenta
EPO e VEGF per avere più vasi
e più eritrociti. Ciò normalmente
è controllato. Se VHL scompare
HIFalfa non è degradato e
vengono prodotti i fattori di
crescita con proliferazione della
cellula endoteliale →
meccanismo paracrino di trasformazione neoplastica (una cellula produce il fattore di crescita e
un'altra è sensibile → il fenotipo nel quale si manifesta l'alterazione non è sulla stessa cellula nella
quale l'alterazione genetica è presente!)
VHL è importante anche nei carcinomi renali sporadici.
renale sporadico. Le delezioni spesso comprendono anche il gene FHIT (3p14).
pVHL ha funzioni multiple
• Degradazione di HIF- α
• Degradazione di altri target proteici
• Controllo assemblaggio fibronectina in matrice extracellulare
• Legame e stabilizzazione microtubuli
L’espressività variabile dei tumori nella sindrome è connessa a mutazioni che alterano
selettivamente le diverse funzioni di pVHL. L'espressione di pVHL è ubiquitaria. Perché si formano
tumori solo in un insieme ristretto di tessuti? (stesso problema di RB1 e retinoblastoma)

Sindromi neoplastiche ereditarie – alterazioni dei geni caretaker

Geni caretaker e tumori ereditari

Sindrome di Li-Fraumeni → possono avere tutti i tipi
di tumori perchè vi è una alterazione di p53. Si ha
Blocco proliferazione e induzione apoptosi dopo
danno al DNA.
Sindrome di Lynch (HNPCC, hereditary non-
polyposis colorectal carcinoma) e Carcinoma
mammario familiare i tratteremo.

48
I caretaker controllano l'instabilità del genoma.
Un danno deve essere riparato. Vi sono dei
sensori molecolari che percepiscono il danno. In
presenza di danno si ferma il ciclo cellulare
(checkpoint) e quindi vi sono dei geni adibiti a
fare ciò; poi sono attivati i sistemi di riparazione.
Nel corso dell'evoluzione sono aumentati i sistemi
per riparare il DNA. Poi alla fine bisogna
controllare se il danno è stato riparato. Se il danno
è riparato si continua mentre se no apoptosi. Nei k
le cellule proseguono anche se hanno delle
alterazioni fino a quando non si colpiscono gli
oncogeni.

Conseguenze di alterazioni nella risposta al

danno al DNA
Replicazione della cellula in presenza di danni al DNA, quando notiamo eterogeneità tra le cellule
di uno stesso tessuto.
Si può avere instabilità genomica e sensibilità aumentata ai cancerogeni/mutageni ambientali (es.
fumo di tabacco, dieta)
Infine si può avere resistenza a terapie antitumorali che tendenzialmente inducono morte cellulare
dipendente dal danno al DNA (es. radioterapia, chemioterapia). Il gene in questo caso mi può
portare resistenza alle terapie.

A seconda del tipo di danno al DNA

abbiamo differenti meccanismi di
riparazione. [tabella]
L'unico sistema che rimuove il danno è
l'achiltrasferasi (un po' come un
vecchio artigiano). Tutti gli altri
tagliano e risintetizzano parti più o
meno lunghe di DNA. NER è contro i
danni da UVA UVB.
Il danno a doppio filamento è il più
grave delle lesioni (spaghetti da
riunire). Il cross-link repair si rifà al
DSBR.
Ogni alterazione corrisponde ad un
incremento dei k.

49
 Carcinoma mammario familiare
BRCA1 e BRCA2: ereditarietà 2-hit, penetranza (probabilità di esprimere il fenotipo dato il
genotipo) 40-80%. ciò è un problema a livello di counseling. i geni sono stati scoperti 20 anni fa e
prendono il nome dalla malattia. La penetranza è variabile in funzione dell'età, del gene e del K.
Anche la probabilità di sviluppare altri tumori è differente da BRCA1 e BRCA2.

Se il backgound genico è più favorevole la

penetranza è minore. →
BRCA1/2: ereditarietà 2-hit, penetranza 40-80%
ma non esauriscono la totalità dei k della
mammella.
Mutazione di BRCA1 (~50% delle famiglie)
comporta ca. mammella, esordio precoce, ER,
aggressivi e ca. ovaio
Mutazione di BRCA2 (~35% delle famiglie)
Ca. mammella femminile e maschile
Altri carcinomi, ma ovaio più raro che in BRCA1
“BRCA-X” - non esiste il gene X ma è un nome
di comodo per dire che esiste un 15% delle
famiglie nelle quali non si sa quale sia il gene. È
probabile che non esista perchè se esistesse un
terzo gene lo avremmo già scoperto. Quindi non
dovrebbe essere un gene singolo ad alta
penetranza ma geni multipli a bassa penetranza.
~15% delle famiglie non ha mutazioni BRCA1/2

Altre sindromi con rischio di ca. mammario

• Li-Fraumeni (p53)
• Atassia-telangectasia (ATM)
• Cowden (PTEN)

Solo il 5% di tutti i carcinomi ha mutazioni BRCA1/2

50
BRCA1 porta all'accumularsi di errori che possono portare al K della mammella. In questo caso il
rapporto tra k ereditario e sporadico ci fa vedere geni differenti. Nei casi sporadici non è mutato
BRCA.

Xeroderma pigmentosum

Autosomica recessiva
Prevalenza 1/105-106
Lesioni cutanee ed oculari da UV
Tumori cutanei (~50% dei pazienti)
Degenerazione neuronale (~20%)
10 gruppi di complementazione
(eterogeneità di locus)

Vi è una alterazione dei geni della

riparazione del DNA con escissione di nucleotidi (NER) e quindi possiamo avere
eterogeneità di locus perchè vi è una cascata enzimatica. Questi geni non
controllano la proliferazione delle cellule cutanee ma quando siamo colpiti da UV-
A si formano nel DNA dei dimeri di timina ma questa cascata enzimatica (sn)
sistema il tutto. Se vi è una alterazione di questi enzimi ogni volta si ha una
alterazione della cute con k cutanei multipli. Non è l'alterazione genetica che causa
alterazioni epidermiche ma la radiazione solare. Se non si espongono al sole si
abbassa la prevalenza della patologia.

Sindrome di Lynch - Carcinoma ereditario del colon senza poliposi (HNPCC)

È differente dalla FAP.
La più comune forma ereditaria di carcinoma del colon (~6% di tutti i casi)
Ereditarietà: 2-hit classica
Penetranza 85-90%, quasi completa con espressività variabile perchè il numero di k varia da una
forma all'altra.
Adenocarcinomi del colon scarsamente differenziati, non preceduti da poliposi, età ~45 anni, cosa
che normalmente accade dopo i 60 anni.
Altri tumori, soprattutto carcinomi (eccetto polmone)
Sindromi collegate (geni che controllano la riparazione in altri tipi di tessuti):
• Muir-Torre: adenomi sebacei
• Turcot: poliposi + tumori SNC

I geni alterati nell'HNPCC sono i geni del mismatch repair

Eterogeneità di locus
• MLH1 (nomi da batteri per la semplicità) ~50% delle mutazioni in HNPCC
• MSH2 ~35% → questi due sono i maggiori responsabili
• MSH6 ~10%
• Altri: PMS1, PMS2, MLH3

Principale conseguenza: instabilità genomica

• Fenotipo “mutator” - RER+ (replication error)
• Instabilità dei microsatelliti, le sequenze ripetute di DNA non codificante. In queste
sequenze si accumulano le mutazioni perchè non sono codificanti. Questi individui hanno
una grande variabilità di questa parte → instabilità dei microsatelliti.
Alterazioni di geni del mismatch repair sono state oseervate in tumori umani sporadici, ad es.
metilazione del promotore MLH1 e MSH2 in carcinoma del polmone non a piccole cellule.

51
 Patologia molecolare 8 aprile 2011, Prof.ssa Nanni

RAPPORTI TUMORE-OSPITE
In questa sezione parleremo di:
• Interazioni delle cellule tumorali con il microambiente di insorgenza del tumore
• Interazioni con altri microambienti (metastasi)
• Interazioni sistemiche

Angiogenesi
La vascolarizzazione nell'adulto è relativamente quiescente; il turnover delle cellule endoteliali è di
anni mentre quello dell'intestino è di giorni (ed è quello che si ricambia con maggiore velocità
all'interno delle cellule epiteliali).
La nuova vascolarizzazione fisiologica si ha nell'adulto nei processi inerenti la riproduzione nella
femmina (ovulazione, mestruazioni, impianto, gravidanza) oppure quando c’è un aumento di massa
muscolare (con esercizio fisico). La neovascolarizzazione è inoltre importante nei processi riparativi
delle ferite e nei processi riparativi di danni da occlusione vascolare.
Durante la vita embrionale i vasi ematici si formano da elementi cellulari precursori dell’endotelio
(processo chiamato vasculogenesi) ed in seguito anche da vasi già formati (processo di
angiogenesi). La neovascolarizzazione è, sostanzialmente, la risposta ad una maggiore richiesta di
ossigeno e nutrienti dovuta generalmente ad incremento fisiologico o patologico della massa
tissutale.
Nell’adulto quando si verifica necessità di nuovi vasi si attiva soprattutto l’angiogenesi. Il
contributo dei precursori è molto limitato. Si è evidenziata anche la partecipazione a questi processi
di neovascolarizzazione di precursori dell’endotelio midollari e circolanti.

Processo di angiogenesi fisiologica

L’angiogenesi è un processo complesso che include
come primo passaggio lo stimolo angiogenico
(ipossia-HIF) dal quale parte tutto il processo e
molecole angiogeniche con conseguente
• attivazione dell’endotelio esistente in cui
aumentano le proteasi che rimodellano la
matrice extracellulare,
• rottura della membrana basale vascolare,
• migrazione delle cellule endoteliali,
• proliferazione delle cellule endoteliali,
• formazione di strutture tubulari
• deposizione di membrana basale
• reclutamento di periciti e cellule muscolari
lisce
• collegamento alla rete vascolare esistente
Le molecole angiogeniche avranno quindi un ruolo prevalentemente come fattori di crescita per
l'endotelio e vi saranno poi enzimi che degradano la matrice. Questi fattori angiogenici sono VEGF,
EGF (fattore crescita fibroblasti), MMps, PDGF che recluta i periciti.
Il reclutamento dei precursori delle cellule endoteliali circolanti è eseguito da VEGF che può essere
prodotto dalle cellule dello stroma (interazione con il microambiente); anche le cellule stromali
possono produrre fattori angiogenici.
L'angiogenesi avviene in presenza di molecole inficenti che agiscono tramite recettori specifici e
sono controbilanciate da molecole che inibiscono l'angiogenesi. L'entità dell'angiogenesi è
determinata dalla risultate delle attività delle molecole induttrici e quelle inibitorie.
Questi segnali di stimolo ed inibizione sono prodotti da:
• dalle cellule tumorali stesse
52
 • da fibroblasti
• da cellule endoteliali
• da cellule dell’infiltrato infiammatorio che a volte arriva anche ad essere il 50% del k stesso.

Induttori
• VEGF - Vascular endothelial growth factor . Induce proliferazione delle cellule endoteliali e
formazione di strutture tubulari, aumenta la permeabilità dei vasi. Molti tumori solidi
sovraesprimono il gene VEGF. È il principale induttore di angiogenesi. Viene anche
chiamato VEGF-A (è stato il primo ad essere scoperto) e agisce tramite recettori specifici
presenti su cellule endoteliali. Si parla di famiglia che agisce sia sull'endotelio ematico ma
anche su quello linfatico.
• bFGF- basic fibroblast growth factor. Ampio spettro di azione; induce migrazione,
proliferazione, chemiotassi e produzione di collagenasi nelle cellule endoteliali. È prodotto
in molti tipi di tumori.

Inibitori
• TSP-1 Trombospondina 1: inibisce la proliferazione delle cellule endoteliali
Diminuisce anche l’attività proteasica e il riparo delle ferite
• PF-4 Platelet Factor 4: Inibisce attività collagenasica, inibisce proliferazione delle cellule
endoteliali
• Angiostatina: Viene clivata dall’elastasi a partire dal plasminogeno. Inibisce la
proliferazione e migrazione delle cellule endoteliali.
• Endostatina: Clivata enzimaticamente a partire dal collagene XVIII. Inibisce la
proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali.
Ci vuole un controllo rapido sull'angiogenesi.

Angiogenesi e tumori
I tumori solidi per sostenere la propria crescita oltre 1-2 mmc hanno bisogno di nuova
vascolarizzazione. Sotto questa dimensione non è necessaria l'angiogenesi.
L’apporto vascolare fornisce:
• ossigeno e nutrienti,
• fattori di crescita, prodotti anche dalle cellule endoteliali,
• via di disseminazione metastatica
La formazione di nuova vascolarizzazione si origina soprattutto da vasi preesistenti tramite
angiogenesi.
Ciò è dato dall'evidenza dei tumori che sono
stati fatti in passato; si è verificato
sperimentalmente per esempio tramite
l'impianto di k nella camera anteriore
dell'occhio del coniglio: si inserisce un k nella
camera anteriore del coniglio; se veniva messo
solo nella camera anteriore (dove on vi era
vascolarizzazione) il k non cresceva mentre
sull'iride, riccamente vascolarizzato, cresceva.
Ciò ci spiega quale sia la grande importanza
della presenza della vascolarizzazione nei k.
I vasi tumorali però non sono proprio identici
a quelli fisiologici; sono infatti scarsamente
organizzati, malformati: non maturi, tortuosi,
dilatati, fenestrati, pochi periciti, poco presente la membrana basale perchè nel tempo e nello spazio
non vi sono rapporti ottimali tra i mediatori. La vascolarizzazione del k non sarà uniforme quindi
neanche all'interno del k; i k benigni sono vascolarizzati così come i k maligni (quindi la presenza o
53
meno di vascolarizzazione non è indice di malignità del k). L'angiogenesi tumorale però è
leggermente differente da quella dei vasi normali ma purtroppo i vasi del tumore non sono
distinguibili da quelli normali (avremmo in questo caso potuto colpire solo questi vasi
selettivamente per bloccare la vascolarizzazione del k). Per capire quali sono questi vasi si sfrutta il
fatto che nell'adulto di nuova angiogenesi ce n'è poca e quindi si una questa caratteristica come
bersaglio. Il talidomide era un farmaco antiangiogenico e quindi si aveva focomelia. Oggi viene
impiegato come farmaco antiagiogenico.

Gli inibitori dell'angiogenesi non agiscono sulle cellule tumorali (in vitro) ma inibivano la crescita
in vivo. Di fatto invece gli induttori dell'angiogenesi aumentano la crescita tumorale in vivo perchè
stimolano la formazioni di nuovi vasi che nutrono le cellule tumorali.

Il numero e la densità dei microvasi dà però un significato di malignità ed è quindi un significato

prognostico. Anche qui però una intensa vascolarizzazione in un tumore non è sempre indice di
malignità (condizione necessaria ma non sufficiente), anche tumori benigni possono essere molto
ricchi di vascolarizzazione come ad esempio l’adenoma delle surrenali.

Anche gli oncogèni e oncosoppressori possono influenzare l’angiogenesi.

Per esempio Ras mutato induce VEGF quindi favorisce la formazione dei vasi dei tumori.
Anche HER-2/ErbB2/neu se attivato induce VEGF.
Invece gli oncosoppressori fanno l'opposto. L’attività di p53 inibisce la produzione di VEGF e
induce trombospondina (inibitore dell'angiogenesi) e agisce su entrambi i fronti. Quindi se manca
l'attività di p53 l'angiogenesi è favorita.
L’attività del gene oncosoppressore VHL porta alla degradazione di HIF (fattore trascrizionale,
inducibile da ipossia, che induce produzione di VEGF).

Vi sono ancora dei punti da chiarire (nei futuri anni) nel fenomeno dell'angiogenesi. Il principale di
questi è quello del mimetismo vascolare: in alcuni tipi di k sembra infatti che siano le stesse cellule
tumorali che facciano i vasi che permettono la vascolarizzazione del k. Ciò complica le cose perchè
nei vantaggi che si individuavano nella terapia angiogenica perchè si pensava che i bersagli fossero
cellule endoteliali che non avevano possibilità di modificarsi mentre in questo caso c'è questa
complicazione.

Implicazioni terapeutiche dell'angiogenesi

L'obiettivo terapeutico è ridurre l’apporto vascolare per inibire la crescita e la metastatizzazione dei
tumori. Vi sono quindi strategie contro formazione di nuovi vasi e strategie contro vasi già formati.
Quindi nella formazione di nuovi vasi vi sono essenzialmente di due tipi:
1) Modalità terapeutiche che vogliono sopprimere i segnali pro-angiogenici
2) Modalità terapeutiche che vogliono aumentare i segnali di inibizione dell’angiogenesi

Vantaggi e limiti
Vantaggi
• Facilità di accesso se il bersaglio è l’endotelio;
• Assenza di fenomeni di resistenza se il bersaglio è l’endotelio per assenza di instabilità
genomica;
• Effetto bystander.

Limiti
• Interazioni con i processi fisiologici (ferite, gravidanza, mestruzioni);
• Ridondanza dei fattori angiogenici prodotti dalle cellule tumorali perchè si è visto che nella
progressione le cellule k producono fattori che cambiano nel tempo quindi non ho un unico
bersaglio ma più di uno;

54
 • Complessità del processo.
Dati preclinici anche recenti suggeriscono cautela nell'applicazione clinica delle terapie
angiogeniche. Con una vascolarizzazione più omogenea posso infatti raggiungere tutta la superficie
del k, posso evitare delle zone di ipossia (che sono fattori di nascita di ulteriori mutazioni). Ad una
ridotta crescita tumorale potrebbe accompagnarsi una maggiore metastatizzazione dovuta a:
• ridondanza di fattori: la downmodulazione di uno porta ad upmodulazione di un altro;
• l'ipossia upregola l'espressione di molecole come HGF e MET che favoriscono invasione e
metastasi.
L'ipossia inoltre recluta cellule staminali. Un altro approccio era quello di impedire la degradazione
della matrice (uno dei primi approcci) per impedire anche la formazione delle metastasi.
Ha senso fare della terapia antiangiogenica in seguito all'asportazione chirurgica, periodo durante il
quale si possono sviluppare delle metastasi che necessitano di neovascolarizzazione per svilupparsi.
Su un tumore locale la prima scelta è l'asportazione chirurgica perchè è la terapia maggiormente
efficace.
Quindi vi sono risultati preclinici discreti o buoni mentre i risultati clinici sono complessivamente
mediocri.
I migliori risultati sono stati ottenuti nel carcinoma del colon metastatico (autorizzazione FDA): in
pazienti con carcinoma del colon metastatico l’anticorpo anti VEGF associato a chemioterapia
aumenta la sopravvivenza di 5 mesi rispetto alla sola chemioterapia.

Effetti collaterali: anticorpo antiVEGF associato a chemioterapia raddoppia la morte per infarto o
ictus, rispetto alla sola chemioterapia, a causa di coaguli in arterie importanti (oltre a vene).
Risultati negativi di studi su k mammario. Preliminari positivi associato a chemio in NSCLC, ca
renale. Le terapie sperimentali devono essere inizialmente eseguiti su pazienti che non sono stati
responsivi alle terapie.

Rapporti tumore-ospite
Fenomeni coinvolti:
• adesione
• comunicazione
• angiogenesi
• produzione di fattori autocrini/paracrini
• suscettibilità a fattori autocrini/paracrini
• stimolazione di risposte immunitarie
• suscettibilità a risposte immunitarie
• invasività
• diffusione ad altri ambienti
• suscettibilità alle terapie
Quindi vi sono tanti fenomeni di interazioni tra cellule e microambiente extratumorale.
Nelle cellule tumorali vi può essere una minore espressione di molecole normalmente espresse dalle
cellule tessuto d'origine. Vi può essere l'espressione di molecole normalmente non espresse dalle
cellule del tessuto d'origine.
Vi è una mancanza di comunicazione tra cellule tumorali. Mancano le Gap-Juction che sembrano
importanti per il mantenimento del fenotipo trasformato.
Sono prodotti fattori di crescita; il TGFα/EGF famiglia sono fattori e/o recettori prodotti in molte
linee tumorali (soprattutto epiteli): polmone, glioblastoma, mammella, vescica.
Nel glioblastoma EGF-R è mutato. Probabile è l'autocrinia nel carcinoma gastrico. Nel 25% dei k
gastrici abbiamo EGF+. La positività ad EGF è correlata a cattiva prognosi.
Anticorpi anti EGF-R inibiscono la crescita di xenotrapianti. TGFα è prodotto dal k mammario
primario e dalle metastasi. Circa 2/3 dei tumori è TGFα+. Il 30% esprime il recettore per TGFα.
PDGF è prodotto da varie linee tumorali ed agisce sui fibroblasti. È quindi un fattore paracrino che

55
causa fibrosi nel k della mammella.
TGF-β ha un'azione di inibitore mentre in altri casi pare che sia autocrino. La sua produzione da
parte di cellule normali può ridurre la produzione di enzimi litici, aumentare gli inibitori di proteasi
(tutto contrario al cuore), blocco di angiogenesi.
I CSFs sono molecole che regolano proliferazione e differenziamento delle cellule emopoietiche.
Numerosi k oltre a quelli ematologici producono CSFs in vivo e in vitro e reazioni leucemoidi
nell'ospite. L'infiltrato leucocitario non sempre significa prognosi favorevole e poi vedremo il
motivo. Questi fattori possono indurre la formazione di cellule mieloidi soppressive della risposta
immunitaria.

Metalloproteasi
Sono un altro tipo di molecole che possono favorire o sfavorire la crescita del k.
Metalloproteasi (MMP) prodotte da cellule tumorali, cellule endoteliali, fibroblasti e miofibroblasti,
cellule dell’infiltrato immunitario promuovono: iniziazione, proliferazione, sopravvivenza,
migrazione, angiogenesi, invasività, transizione epitelio-mesenchima, infiammazione, metastasi.
Anche inibizione degli stessi fenomeni.
Crescita tumorale
• Promozione tramite il clivaggio di IGF da IGFBP, e lo shedding di TGFalpha
• Inibizione rendendo disponibile TGFbeta
Sopravvivenza
• Promozione rendendo disponibile IGF e clivaggio di FASL dal suo recettore.
• Promuove l’apoptosi modificando la segnalazione di integrine
Angiogenesi
• Promozione tramite aumentata disponibilità di VEGF e FGF e degradazione della matrice
• Inibizione tramite disponibilità di endostatina e angiostatina per clivaggio da collageno
XVIII e plasminogeno

Rapporto complesso tra Metalloproteasi e loro inibitori (TIMP1,TIMP2 ..).

Nell’angiogenesi eccesso od assenza di MMP possono avere effetti negativi per l’ospite.
MMP possono causare il rilascio di inibitori dell’angiogenesi come angiostatina e endostatina
Livelli elevati di TIMP2 in alcuni tumori sono associati a cattiva prognosi

Nel microambiente tumorale abbiamo ipossia (si generano radicali liberi dell'ossigeno che portano a
un danno del DNA ed instabilità genomica → evoluzione verso la malignità e contemporaneamente
vengono selezionate le cellule che sopravvivono a condizioni critiche, magari non proliferanti ma
che sopravvivono ad un ambiente sfavorevole e quindi più probabilmente anche alla terapia
farmacologica), basso pH e massiva morte cellulare; quindi non tutte le cellule presenti dentro il k
sono vive e proliferanti. Tutto ciò porta a mutazioni e disorganizzazione. Anche le cellule normali
presenti all'interno del k sono soggette a questi fattori e allora non sono proprio normali.

Interazione con macrofagi

Si pensava inizialmente che l'infiltrato macrofagico fosse indice prognostico favorevole. In realtà si
è visto che non è sempre così. Possiamo distinguere due sottopopolazioni di macrofagi:
• M1: attivazione del sistema immunitario e attività antitumorale.
• M2: è maggiormente rappresentato nei tumori, favorisce la riparazione tissutale e
l'angiogenesi e quindi anche il k. Downregolano l'immunità adattativa.
A seconda degli stimoli che il macrofago riceve si crea l'uno o l'altro tipo.

Autofagia (già fatta prima nel testo ma la prof l'ha ripetuto)

In caso di stress cellulare (ad esempio scarsità di nutrienti) si assiste alla distruzione di organelli
come ribosomi e mitocondri per ricavare energia consentendo la sopravvivenza della cellula. Questa
è spesso presente nelle cellule neoplastiche. Sono coinvolti PI3K, AKT. Radioterapia,

56
chemioterapici possono indurre alti livelli di autofagia.

Lezione di giovedì 14 aprile 2011 – Prof.ssa Nanni

Metastasi e sindormi praneoplastiche
Interazioni con i fibroblasti
Sono cellule stromali e sono importanti nella proliferazione e nel differenziamento delle cellule
epiteliali durante il normale sviluppo mammario. Le interazioni tra queste cellule e le cellule
tumorali sono importanti anche nella cancerogenesi. I fibroblasti appartengono a diverse sotto-
popolazioni con fenotipo e funzioni peculiari (marker di superficie, sintesi di collageni, produzione
di citochine). Cellule stromali nei tumori o immediatamente adiacenti hanno caratteristiche diverse
dalle altre cellule stromali.
La presenza dei fibroblasti, infatti, migliora l'aderenza del k al tessuti. Si è visto per esempio che
l'impianto simultaneo di MCF7 e fibroblasti mammari aumenta incidenza e dimensioni del tumore.
Terreni condizionati da fibroblasti ottenuti del tumore sono più efficaci in vitro nel promuovere la
crescita di cellule del carcinoma mammario rispetto a terreni condizionati da fibroblasti provenienti
da tumori benigni o da mammelle normali. IGF-1 solo parzialmente responsabile della
proliferazione, non sembrano coinvolti EGF, TGFα, bFGF.
Tra queste molecole rilasciate dai terreni condizionati vi sono MMP, HGF, IGF, EGF, IL1, TGFbeta,
ovvero fattori che possono aumentare la crescita tumorale.
Le cellule senescenti accumulano e secernono enzimi degradativi, citochine infiammatorie e growth
factor che rompono la struttura tissutale che così permette a cellule iniziate di esprimere il fenotipo
neoplastico

[figura slide 56 file 11-microambiente] Se prendiamo un epitelio possiamo avere una cellula iniziata
che ha delle alterazioni che la portano ad essere tumorale ma in un ambiente normale può anche che
il fenotipo non si manifesti. Con l'invecchiamento del soggetto invecchiano anche i fibroblasti che
possono produrre più fattori di crescita e viene così a mancare il controllo e la cellula iniziata
prolifera e dà origine al tumore. Quindi anche uno stroma più vecchio può contribuire al fatto che
anche l'invecchiamento può contribuire alla nascita del k.

Interazioni con cellule endoteliali

Possono produrre:
• attivatore del plasminogeno
• collagenasi
• TIMP-1
• TIMP-2
• IL-6
• IL-8
• GCSF
• GMCSF
• SCF stem cell factor
• HGF
• MCP1 monocyte chemotactic protein 1

Interazioni
3 esempi:
Cellule tumorali producono fattori che agiscono sui fibroblasti inducendoli a produrre la
chemochina CCL5/RANTES che agisce sulle cellule tumorali aumentandone l’invasività.
Cellule tumorali producono IL-4 che agisce su macrofagi e li induce a produrre proteasi che
favoriscono l’invasività
Macrofagi associati al tumore (TAM) producono EGF che induce proliferazione delle cellule

57
tumorali (carcinoma mammario) le quali producono CSF-1 che stimola i macrofagi.

Infiammazione e cancro
Sappiamo che comunque l'infiammazione può costituire una condizione che facilita la nascita del k
a causa della presenza delle molecole: soprattutto carcinoma gastrico, colon fegato e cervice
uterina.
Anche le cellule necrotiche del k possono reclutare delle cellule infiammatorie del SI.
Il microambiente può contribuire all'insorgenza del k sia positivamente ma può altrettanto
contribuire anche alla minore o maggiore risposta del tumore alla terapia somministrata. Le
metastasi sono in differenti microambienti e in questi microambienti le metastasi potranno essere
sensibili a differenti tipologie di farmaci. Uno dei fattori è anche la distribuzione del farmaco nei
diversi distretti dell'organismo che può essere differente; inoltre abbiamo una differenza nel
metabolismo del farmaco e la possibilità di insorgenza di resistenza: alcune molecole di resistenza
possono essere più presenti in determinati ambienti.
Il k è un organo costituito da vari tipi cellulari in una matrice extracellulare in uno spazio
tridimensionale. Vi è quindi la necessità di mettere a punto modelli in vitro che sempre di più
ricostruiscano la complessità e la tridimensionalità del k. Per migliorare ulteriormente le colture è
possibile coltivare più tipi cellulari (cellule tumorali e cellule dei tessuti → colture 3D). Le colture
3d sono differenti da quelle coltivate in monostrato perchè si modifica l'architettura del k,
l'espressione di molecole tumorali, vi è una polarizzazione delle cellule e la sensibilità ai farmaci è
quindi differente.

Macroambiente e interazione tumore – ospite

Il macroambiente è l'ospite nel complesso e vi saranno quindi dei parametri propri dell'ospite che
potranno influenzare positivamente o negativamente l'evoluzione del tumore. Un esempio è
l'influenza dell'età: maggiore è l'età maggiore è l'incidenza dei tumori in genere per vari fattori che
poi elencheremo. Negli USA l'età media dei pz con k è 70 anni. 60% dei casi e 69% delle morti per
cancro è nelle persone > 65 anni, che rappresentano solo il 13% della popolazione.

Il modello di cancerogenesi a più tappe è sufficiente per spiegare l'aumentata incidenza dei tumori
con l'età ? Questo modello coinvolge:
- Maggiore esposizione
- Maggiore tempo per accumulare eventi multipli

L'invecchiamento sembra influenzare anche alcuni parametri che rendono un individuo più
suscettibile ( o più resistente) al cancro:
− Immunità (declino di certe risposte T e diminuita o aumentata produzione di citochine
(es. IL-2 o IL-6) (IL-6 può essere GF per alcune cellule tumorali)
- Riparazione DNA meno efficiente
- Microambiente nel quale controllo meno stringente a causa della presenza di cellule
senescenti
- Declino risposta p53
- Angiogenesi (minori stimoli angiogenici o minore risposta a tali stimoli)

C'è maggiore periodo di esposizione e maggiore tempo per accumulare degli eventi multipli.
L'invecchiamento sembra influenzare anche alcuni parametri:
• immunità
• riparazione del DNA

Microambiente
nell'anziano c'è maggiore incidenza ma la crescita dei k è meno veloce perchè l'angiogenesi è
inibita.

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Nell'anziano vi è anche un metabolismo più lento e quindi l'assorbimento è più lento e si può avere
maggiore tossicità e maggiori effetti collaterali. Negli anziani vi sono anche più frequentemente k
immunogenici.
Sperimentalmente animali giovani o vecchi differiscono nella suscettibilità ai cancerogeni.
Con l’aumentare dell'età si può avere più rapida induzione di tumori da cancerogeni una minore
crescita. In genere insorgono più rapidamente nei vecchi i tumori indotti da cancerogeni chimici o
virali, altamente immunogenici: in questi un deficit immunitario può avere più rilievo

IL PROCESSO METASTATICO
La metastasi è definita come la diffusione di cellule dal tumore primitivo e formazione di un tumore
secondario in altra sede. È la principale causa di morte del paziente oncologico (90%).
Circa 1/3 dei pazienti con tumore ha metastasi alla diagnosi mentre un altro 33% lo svilupperà in
seguito. Obiettivo è la diagnosi prima che si sviluppino metastasi mentre negli altri casi l'obiettivo è
che non si sviluppino. Notare che il 33% dei soggetto con k maligno non sviluppa metastasi.

Sequenze del processo metastatico

Sono necessarie certe tappe e solo quelle cellule che arrivano alla fine hanno possibilità di diventare
metastatiche. Ciò è importante clinicamente perchè ho più possibilità di impedire lo sviluppo di
queste metastasi.
La prima cosa che deve fare una cellula tumorale per diventare metastatica è l'invasione primaria,
poi c'è la diffusione per via ematica o linfatica (vi saranno quindi anche delle interazioni con le
cellule ematiche). Poi la cellula tumorale si deve fermare da qualche parte. Poi c'è l'invasione
secondaria e l'interazione con il nuovo microambiente che deve dare la possibilità alla metastasi di
svilupparsi.
Alcune i queste caratteristiche sono proprie anche di altre cellule:
• Leucociti (spostamento nel sangue e nei tessuti)
• Osteoclasti
• Fibroblasti
• Melanociti
• Cellule endoteliali
• Trofoblasto
• Numerosi tessuti embrionali

Lesione primaria
Vi sono delle alterazioni delle caderine e delle molecole di legame cellula-cellula che permette il
distacco della cellula tumorale (fenomeni adesivi che vengono a mancare all'interno della massa
tumorale stessa).
I meccanismi per permettere la mobilità della cellula nella matrice e la sua migrazione verso un
vaso sono quindi:
• proliferazione/compressione
• minore coesione cellulare (alterazione sistemi adesione)
• minore adesione cellula-matrice
• alterata deposizione della matrice extracellulare
• degradazione della matrice extracellulare è fatta dalle proteasi ed è un bilancio tra enzimi
litici e loro inibitori fisologici e migrazione in risposta a fattori chemiotattici o di movimento

Fattori che permettono il distacco dal tumore primario:

• Attacco a componenti della matrice extracellulare (recettore per laminina diffuso su tutta la
superficie)
• Degradazione della matrice (metalloproteasi)

59
 • Migrazione (fattori di motilità autocrini prodotti da cellule tumorali e fattori paracrini –
HGF, SCF- prodotti dallo stroma) perchè possno produrre dei fattori autocrini di motilità
come HGF.

Però non sempre invasività e metastatizzazione vanno di pari passo. Alcuni tipi di tumore sono
invasivi, ma non metastatici es. carcinoma basocellulare della cute, molti tumori del sistema
nervoso centrale
Altri sono molto metastatici, es. osteosarcoma metastatizza rapidamente, e già alla diagnosi il 50%
dei pazienti ha metastasi (polmonari).

Diffusione per via linfatica ed ematica

Disseminazione tramite differenti vie, quali:
• Linfatica → soprattutto per carcinomi es: metastasi linfonodali
• Ematica → sarcomi e carcinomi
• In cavità → carcinoma ovarico in peritoneo
• Altre → Per contatto, per esempio il k della lingua che dà metastasi al palato

Metastasi linfonodali
Invasione dei linfonodi come fattore prognostico. Ingrossamento dei linfonodi non vuol dire sempre
che sono invasi, a volte sono reattivi. Linfonodo sentinella: identificare il primo linfonodo che
riceve linfa dal tumore iniettando un tracciante radioattivo. A questo punto si esaminava solo quel
linfonodo. Se quello era negativo era ok mentre se quello era positivo vi è maggiore probabilità di
metastasi a distanza. La pratica chirurgica si è spostata da fare trattamenti molto mutilanti. Ora gli
interventi chirurgici sono molto più limitati; per esempio un tempo si eseguiva una mastectomia
radicale si rimuoveva anche il piccolo pettorale e tutti i linfonodi accessori fino a quelli del cavo
ascellare ma vi erano delle problematiche di circolo linfatico con formazione di edema che
comprometteva anche i movimenti dell'arto superiore; ora non viene svuotato il cavo ascellare della
pz con migliori esiti funzionali.
Vi è una buona correlazione tra positività del linfonodo sentinella (presenza di cellule tumorali) e
metastatizzazione a distanza (25% con linfonodi negativi non sviluppa metastasi mentre chi non ce
l'ha il 75% non li sviluppa).
Importanti sono anche i recettori per chemochine (homing dei leucociti) (es. CXCR4 e CCR7 nel
ca mammario): alti livelli guidano a siti metastatici ricchi della relativa chemochina (linfonodi,
polmone, fegato, midollo osseo).

Cellule tumorali circolanti

Possono essere singole o a gruppi. Se ne staccano molte di cellule neoplastiche dal k primario (a
milioni) e queste però non sopravvivono tutte in circolo. Le interazioni che avvengono in circolo
possono portare infatti a:
• Distruzione delle cellule tumorali per mancato ancoraggio, per fattori fisici (vasi stretti), per
lisi immune dalle cellule NK.
• Possono esserci delle interazioni che proteggono le cellule tumorali e nasconderle da
attacchi immunitari tramite la formazione di emboli di cellule tumorali, emboli di leucociti
e cellule tumorali o trombi.

Arresto ed uscita dai vasi

Un arresto efficiente è favorito dalla circolazione in aggregati e dove vi è una estesa rete capillare.
Devono aderire all'edotelio, adesione all'endotelio (tramite interazioni delle cellule tumorali con
fibrina piastrine e fattori di coagulazione; deve inoltre esserci un'adesione a recettori), retrazione
dell'endotelio (nelle venule e capillari) adesione alla membrana basale dei vasi, dissoluzione della
membrana basale e di locomozione (Fattori autocrini di motilità, Fattori chemiotattici).

60
Arresto, invasione secondaria, interazione col nuovo microambiente
I tumori colonizzano di preferenza organi o distretti caratteristici (preferenza d’organo). Per
esempio:
Tumore Siti comuni di metastasi
Carcinoma del colon Fegato, polmone
Carcinoma della mammella Ossa, cervello
Melanoma cutaneo Cute, cervello, fegato, intestino
Microcitoma polmonare Cervello, fegato, ossa

Le sedi di metastasi sono spesso i primi filtri capillari incontrati dalle cellule tumorali. Quindi sono
questioni emodinamiche che spiegano la scelta d'organo del tumore. Le ossa sono una sede
frequente ed è una localizzazione molto dolorosa. Anche le metastasi cerebrali sono frequenti.
Le metastasi sono numericamente molte e a volte, per esempio nel colon, ma si può avere anche
solo una metastasi per esempio al fegato → in questo caso asportazione. Se le metastasi sono molte
invece si deve optare per un trattamento con chemioterapici sistemici che ne diminuiscono il
numero e la gravità.
Fattori emodinamici, sede e quantità di sangue/flusso definiscono la preferenza del k.

Sedi metastatiche prevalenti

Tumori del colon: al fegato tramite linfatici mesenterici e il sistema venoso portale dal fegato al
polmone tramite la cava inferiore, il ventricolo destro e l’arteria polmonare
Tumori della mammella: ai polmoni tramite il sistema linfatico e la vena cava superiore, o allo
scheletro tramite il sistema del plesso di Batson delle vene paravertebrali
Tumori del polmone: al cervello, fegato, ossa e altro, tramite vena polmonare e ventricolo sinistro
ha accesso al circolo arterioso

Metastasi sincrone o metacrone

NEOPLASIA
----------------------------------------------------------------------
↓ ↓ ↓ ↓

FEGATO FEGATO POLMONE ALTRI SITI

↓
POLMONE
↓
ALTRI SITI
------------------- -----------------------------------------------
Disseminazione Disseminazione sincrona
metacrona

È possibile che da una metastasi si formi un'altra metastasi. Semplici considerazioni emodinamiche
non sono però sufficienti a spiegare il pattern metastatico di parecchi tumori umani, ad es. metastasi
cerebrali da carcinoma della mammella o da melanoma.
La teoria del seed and soil (seme e terreno) di Paget (1889) si ipotizza che la metastasi sia il
risultato dell’incontro di una cellula tumorale (il seme) con un organo o distretto che fornisca
l’ambiente appropriato (terreno) per la presenza di fattori di crescita in un determinato terreno,
oppure per fattore di morte. Può essere anche una questione di arresto ovvero di adesione a
molecole endoteliali organo-specifiche o inducibili (es. Vascular Cell Adehsion Molecule, VCAM,
controreccettore dell’integrina α4β1). Anche l'invasività è importante e vi deve essere uno
sbilanciamento tra fattori inducenti prevalgono su quelli inibenti.
Crescita/morte cellulare – Fattori di crescita e di sopravvivenza organo-specifici

61
Reattività immunitaria – Difese immunitarie organo-specifiche che impedisce lo sviluppo della
metastasi. Vi può essere anche la resistenza alla terapia con diversa espressione di farmaco-
resistenza (es. MDR1) a seconda del sito metastatico. È importante per il tumore anche
l'angiogenesi che gli sono utili per ottenere nutrimento e ossigeno.
Clinicamente non tutte le metastasi danno delle metastasi clinicamente evidenti e la maggior parte
di queste rimangono quindi dormienti.

Dormienza
Metastasi di carcinoma della mammella o di melanoma possono diventare evidenti oltre venti anni
dopo la rimozione del tumore primario. Si pensa che un po' di cellule proliferino mentre altre
muoiano. Quindi cellule metastatiche possono rimanere per lungo tempo allo stato di
micrometastasi.
Possibili meccanismi alla base della dormienza:
• Bilanciamento di proliferazione e perdita cellulare
• Mancata vascolarizzazione
• Dipendenza da fattori di crescita o di inibizione della crescita
• Contenimento immunologico
Riguarda circa il 10% dei casi.
Si evidenza anche cambio dell'ospite (invecchiamento) e anche della cellula cancerogena (dopo
anni produce un fattore di crescita o un fattore angiogenico. Anche la presenza di una ferito poteva
dare luogo a metastasi in un tessuto già colpito da k.

Inefficienza della metastatizzazione

è legata a:
• Vita in circolo limitata
• Risposte immunitarie
• Incompatibilità tra seed e soil
• Molte rimangono dormienti
• Condizioni fisiche critiche con i vasi

GENI E METASTASI
Il processo metastatico è determinato da geni multipli con attività prometastatica e antimetastatica.
Un piccolo numero di geni è stato scoperto e clonato dal confronto di cellule a diversa capacità
metastatica, ad esempio Nm23 e Kai1 (soppressori di metastasi).
Molti geni sono già noti e ben caratterizzati: ad es. fra gli induttori di metastasi vi sono alcuni
oncogeni (MET, RAS), i geni di fattori proangiogencici e i geni di enzimi che idrolizzano la matrice
Tra i geni antimetastatici vi sono ad esempio i geni che codificano gli inibitori dell’angiogenesi o
gli inibitori di metalloproteasi.

Terapia antimetastatica
Il modello sequenziale offre numerosi bersagli per nuove terapie selettive antimetastatiche.
C'è chi affermava in passato che nel tumore primario ci fossero solo alcune cellule che potessero
dare metastasi. Poi si è visto che in realtà l'aspetto molecolare è differente tra i tumori che danno
metastasi e tumori che non ne danno, ovvero che vi sono geni specifici nei tumori che
tendenzialmente danno metastasi mentre questi mancano in tumori che ne danno. Però anche questa
teoria è superata ed ora si afferma che di fatto ci sono molte cellule che hanno la possibilità di dare
metastasi all'interno di un tumore ma che ognuna ha un pattern per un homing (un tessuto)
specifico.
Dal punto di vista clinico – terapeutico possiamo intervenire con dei farmaci per impedire
l'evoluzione da micrometastasi a macrometastasi con terapia adiuvante per impedire lo sviluppo di
metastasi. Può anche essere però che il pz non sviluppi mai metastasi (sono quindi importanti i
fattori prognostici di sviluppo di metastasi per valutare il rischio del pz e i fattori predittivi di
62
efficacia di una terapia per avere un'idea dell'efficacia e appropriatezza della terapia che
somministriamo). Nel cervello i farmaci che non passano la barriera emato-encefalica
(tendenzialmente quelli con Ig) non impediscono lo sviluppo delle metastasi cerebrali, tant'è che
spesso non vengono scelte.

63
 Lollini integrazione da slide
Atassia-telangectasia (A-T)
Autosomica recessiva
Prevalenza 1/40000 nati
Atassia cerebellare progressiva (degenerazione postnatale delle cellule di Purkinje). Incapacità di
movimento a partire da 1 anno di età
Telangectasie (dilatazioni dei piccoli vasi) della congiuntiva, naso, padiglione auricolare
Radiosensibilità
Aberrazioni cromosomiche
Immunodeficienza combinata T e B
Tumori nel 40% degli omozigoti A-T, soprattutto leucemie e linfomi
Aumentata incidenza di tumori anche negli eterozigoti (carcinomi, melanoma)  aploinsufficienza

ATM
ATM = A-T mutated
Serina-treonina cinasi nucleare attivata da rotture a doppio filamento
Fosforila e attiva numerosi substrati che si accumulano nei “foci” di riparo (quindi associati alla
riparazione del danno) o bloccano il ciclo cellulare: p53, BRCA1, FANC D2, NBS1, istone H2AX

Anemia di Fanconi
Autosomica recessiva
Prevalenza 1/100000 nati
Progressiva insuffcienza dell’emopoiesi con anemia, trombocitopenia, neutropenia
Aberrazioni cromosomiche
Mielodisplasia e leucemia mieloide acuta
Alterazioni non neoplastiche in molti organi e sistemi: scheltro, cute, cuore, reni, intestino
8 gruppi di complementazione basati su ibridi cellulari e sensibilità al crosslinking del DNA da
diepossibutano o mitomicina C.
Geni FA (o FANC) A, C, D2, E, F, G. “FANC B” e “FANC D1” identificati con BRCA2

Gruppi di complementazione
Il test di Complementazione viene effettuato incrociando fra loro individui che presentano
mutazioni le quali danno luogo allo stesso fenotipo. I geni, infatti, regolano singoli eventi di una
catena metabolica, per cui la presenza di un fenotipo mutato può essere causata da una mutazione su
uno qualsiasi dei geni che appartengono alla catena metabolica che risulta essere mutata.
Il test della complementazione permette di evidenziare se due individui o due cellule che presentano
la stessa mutazione fenotipica abbiano subito una mutazione sullo stesso gene o su geni diversi.
Nell'incrocio, infatti, se le mutazioni sono su geni differenti si ottiene un fenotipo non mutato e le
due mutazioni si dice che "complementano"; viceversa se esse sono sullo stesso gene, il fenotipo
rimane mutato e le mutazioni "non complementano" proprio perché riguardano il medesimo gene e
di conseguenza il medesimo enzima.
Complementazione: la combinazione di due alleli mutanti ripristina il fenotipo normale

Elicasi RecQ
Geni omologhi a RecQ di E. coli, presenti in tutti gli eucarioti. Srotolamento (unwinding) del DNA,
sia integro che danneggiato
Nel genoma umano 5 geni
BLM - Sindrome di Bloom
Autosomica recessiva
Bassa statura, sensibilità al sole
Predisposizione a tumori di tutti i tipi cellulari
Aberrazioni cromosomiche

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WRN - Sindrome di Werner
Autosomica recessiva
Progeria (invecchiamento precoce): aterosclerosi, cataratta, osteoporosi, diabete
Instabilità genomica
RTS (RecQ4) - Sindrome di Rothmund-Thomson
Autosomica recessiva
Atrofia cutanea, cataratta, difetti ossei
Osteosarcoma
Aberrazioni cromosomiche
RecQ1, RecQ5 - Non associati a patologie ereditarie

Nanni integrazione da slide

Fattori di crescita
TGFα/EGF famiglia
Fattore e/o recettore prodotto in molte linee tumorali (soprattutto epiteliali): polmone, glioblastoma,
mammella, head and neck, vescica. Nel glioblastoma EGF-R mutato.
Probabile autocrinia nel carcinoma gastrico. 25% dei tumori gastrici è EGF+. EGF positività correla
con cattiva prognosi
• Anticorpi anti EGF-R inibiscono la crescita di xenotrapianti.
TGFα prodotto da cancro mammario primario e da metastasi. Circa 2/3 dei tumori è TGF  +. 30%
esprime recettore per TGF (EGF-R). Meno del 30% contemporanea presenza di fattore e
recettore, possibile autocrinia. EGF-R correla con cattiva prognosi. Maggior parte di EGF-R+ è ER
negativo.

PDGF
Prodotto da varie linee tumorali.
Il ca mammario produce PDGF, ma non ha PDGF-R.
Probabilmente agisce in modo paracrino sui fibroblasti concorrendo alla fibrosi. I fibroblasti, che
assieme a miofibroblasti, istiociti e cellule infiammatorie costituiscono il compartimento cellulare
dello stroma tumorale, necessitano di IGFI e PDGF per proliferare.

TGF-β
Conferisce fenotipo trasformato (proliferazione in agar) a fibroblasti normali, ma inibisce
proliferazione di cellule epiteliali normali, di molte linee tumorali epiteliali, di cellule endoteliali,
neuronali, emopoietiche.
A volte effetti opposti sullo stesso tipo cellulare ( es. fibroblasti in diverse condizioni di coltura)
forse tramite induzione di altri fattori
Osteoblasti in coltura sono indotti a proliferare
In linee di glioma è autocrino (stimola la proliferazione). Oligonucleotidi anti-senso inibiscono la
proliferazione (più degli anticorpi, quindi probabilmente circuito interno)
TGF-β coinvolto nel differenziamento (di adipociti, mioblasti)
− Potente fattore chemiotattico e attivatore di macrofagi
− Stimola la produzione di componenti della matrice extracellulare (collagene, fibronectina)
− Riduce la produzione di enzimi proteolitici
− Up-regola produzione di inibitori di proteasi
− Up-regola espressione di integrine aumentando adesione a proteine della matrice.
Frequenti mutazioni in cellule di carcinoma le rendono non più suscettibili alla sua azione.
La perdita del recettore per TGF- β o alterazioni nella sua via di segnalazione possono rendere le
cellule insensibili all'azione inibitoria e favorire lo sviluppo tumorale anche rendendo le cellule
tumorali più competitive rispetto alle cellule normali inibite dal TGFβ .

IFNs

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Modulano proliferazione e differenziamento di molti tipi cellulari
Viene attivata la sintesi di decine di proteine in risposta al trattamento con IFNs .
Inibiscono proliferazione di ampia varietà di cellule
Spesso citostatici piuttosto che citotossici
A volte stimolano la proliferazione
Up-regolano espressione MHC e altre molecole di membrana

CSFs
Molecole che regolano proliferazione e differenziamento delle cellule emopoietiche.

Numerosi tumori (oltre a quelli ematologici) e linee cellulari producono

CSFs in vitro e in vivo e reazioni leucemoidi nell'ospite
Producono G-CSF
• carcinomi della vescica
• epatomi
• mesoteliomi
• carcinomi squamo-cellulari
• glioblastomi
• sarcomi
Producono GM-CSF
• carcinomi polmonari
• carcinomi mammari
• epatocarcinoma
Producono M-CSF
• tumori ovaio
• tumori endometrio
• carcinomi mammari
Tumori umani che in vitro producono CSF, se inoculati in topi nude
inducono alterazioni ematologiche
La produzione di CSF può indurre la formazione di cellule mieloidi soppressive della risposta
immunitaria.

Suscettibilità ai CSF
Recettori per CSFs presenti anche su cellule non emopoietiche
es. G-CSF-R presente nella placenta, trofoblasto,cellule endoteliali, cellule di small cell lung cancer,
carcinoma della vescica, osteosarcoma
Nel carcinoma della vescica vi è simultanea presenza di G-CSF e di G-CSF-R: autocrinia
Linee da tumori ovaio producono CSF-1 (M-CSF) ed alcune hanno il recettore (c-fms). La
produzione di M-CSF è fattore di cattiva prognosi. CSF-1 esogeno stimola invasività.

Invasione
I meccanismi con cui le cellule tumorali riescono ad insinuarsi tra cellule normali e ad oltrepassare
barriere acellulari come le membrane basali sono:
• proliferazione/compressione
• minore coesione cellulare (alterazione sistemi adesione)
• minore adesione cellula-matrice
• alterata deposizione della matrice extracellulare
• degradazione della matrice extracellulare

Microambiente
Differenze tra microambiente tumorale e microambiente normale

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Nel microambiente tumorale si ha:
• Ipossia (bassi livelli di ossigeno)
• Basso pH (condizioni acide)
• Massiva morte cellulare con rilascio di proteine

Microambiente tumorale
Ipossia:
• genera radicali liberi dell’ossigeno che portano a danni nel DNA
• causa minore efficienza dei sistemi di riparazione
Ne segue:
• aumento delle mutazioni e grande variabilità nella popolazione tumorale
• selezione delle cellule in grado di sopravvivere in condizioni critiche

Influenze del microambiente sulle cellule normali

Anche le cellule normali circostanti il tumore sono influenzate dal microambiente tumorale
• Ipossia (bassi livelli di ossigeno)
• Basso pH (condizioni acide)
• Fattori di crescita, Causano:
◦ Mutazioni
◦ Disorganizzazione
Danno cellulare ed ipossia attraggono macrofagi.

La polarizzazione di TAM a M2 è dovuta principalmente all’assenza di segnali che portano a M1

come
• IFN-gamma
• componenti batterici
alla presenza di fattori di polarizzazione M2 come
• IL-4 e IL-13 (prodotte da Th2),
• TGF-beta e IL-10 (prodotti da cellule neoplastiche, fibroblasti o Treg)

TAM
Favoriscono la proliferazione di cellule neoplastiche: producono fattori di crescita come EGF
Favoriscono l’angiogenesi e la linfoangiogenesi: produzione di VEGF, PDGF, TGF-beta, FGF,
MMP2, MMP7, MMP9, MMP12, cicloossigenasi 2. modulano la risposta infiammatoria e
l’immunità adattiva.
Causano modifiche nella matrice extracellulare: producono
• proteine della matrice,
• TNF-alfa che induce MMP,
• IL-1 beta che aumenta la metastatizzazione.
• proteasi (serin-proteasi, MMP, catepsine)
Si localizzano nelle zone ipossiche del tumore : ipossia induce espressione di molecole dipendenti
da HIF1 come VEGF, CXCL12 e CXCR4 che inducono la migrazione di TAM nelle zone poco
vascolarizzate ipossiche.
Livelli elevati di TAM correlano con cattiva prognosi
TAM si attaccano alle cellule tumorali e possono trasportarle in circolo
Le cellule tumorali producono fattori che inibiscono azioni positive di TAM
Alcuni macrofagi favoriscono la crescita tumorale promuovendo:
• la proliferazione
• la migrazione
• l’alterazione della MEC
• l’angiogenesi
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 • rilasciando radicali liberi e altri mutageni

MDSC (myeloid derived suppressor cells) lungo la via M2? Condividono alcuni marcatori.
Fenotipo di membrana CD11b+, CD11c+, Gr1+, IL-4Ra+.
MDSC sono attratte al sito tumorale da proteine S100 (proteine proinfiammatorie, prodotte anche
da MDSC stesse), sono attratte da GM-CSF agli organi linfoidi
Sopprimono la proliferazione di CD8 antigene specifici.
La loro attività è modulata da M-CSF, IL-6, VEGF, IL-10.

Interazione con i fibroblasti

Cellule stromali sono importanti nella proliferazione e nel differenziamento delle cellule epiteliali
durante il normale sviluppo mammario
Le interazioni cellule epiteliali-cellule mesenchimali sembrano importanti anche nella
cancerogenesi. I fibroblasti appartengono, come i linfociti, a diverse sottopopolazioni, con fenotipo
e funzioni peculiari (marker di superficie, sintesi di collageni, produzione di citochine)
Cellule stromali nei tumori o immediatamente adiacenti hanno caratteristiche diverse dalle altre
cellule stromali.
L'impianto simultaneo di MCF7 e fibroblasti mammari umani in topi nudi aumenta incidenza e
dimensioni tumore.
Fibroblasti infiltranti il cancro mammario facilitano la crescita delle cellule tumorali, inoculate nei
topi nudi, con maggiore efficienza rispetto ai corrispettivi fibroblasti della mammella sana
Terreni condizionati da fibroblasti ottenuti dal tumore o da cute sono più efficaci in vitro nel
promuovere la crescita di cellule di carcinoma mammario rispetto ai terreni condizionati da
fibroblasti provenienti da tumori benigni o da mammelle normali.
IGF-I solo parzialmente responsabile della proliferazione, non sembrano coinvolti EGF.TGFα,
bFGF.
Fibroblasti associati al cancro (CAF) hanno varie funzioni critiche:
• Deposito di matrice extracellulare,
• Regolazione del differenziamento delle cellule epiteliali
• Regolazione dell’infiammazione
Molecole prodotte dai fibroblasti:
MMP, HGF, IGF, NGF, EGF, WNT1, IL-1, MCP1(chemochina, monocyte chemotactic protein 1),
TGFbeta, FAP (fibroblast activation protein).
Cellule senescenti accumulano e secernono enzimi degradativi, citochine infiammatorie e growth
factor che rompono la struttura tissutale che così permette a cellule iniziate di esprimere il fenotipo
neoplastico.

Interazioni con cellule endoteliali

• Attivatore del plasminogeno
• collagenasi
• TIMP-1
• TIMP-2
• IL-6
• IL-8
• GCSF
• GMCSF
• SCF stem cell factor
• HGF
• MCP1 monocyte chemotactic protein 1
Stato di attivazione e diversi distretti

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Infiammazione e cancro
L’infiammazione facilita l’insorgenza di certi tumori: carcinoma gastrico, del colon, del fegato,
della cervice uterina.
Infiammazione cronica dovuta a infezione:
• Carcinoma epatocellulare come evoluzione di epatite virale B e C.
• Carcinoma cervice uterina come evoluzione di infezione da Papilloma virus.
• Carcinoma gastrico come evoluzione di Helicobacter pylori
Altre infiammazioni:
• Carcinoma del colon come evoluzione della colite ulcerosa o morbo di Crohn
• Tumore all’esofago come evoluzione di reflusso esofageo
L’infiammazione facilita l’insorgenza di certi tumori: carcinoma gastrico, del
colon, del fegato, della cervice uterina.
Due legami tra infiammazione e cancro:
• alterazioni geniche che portano a infiammazione e cancerogenesi,
• infezioni virali/batteriche o patologie autoimmuni che innescano infiammazioni croniche
associate con lo sviluppo del cancro.
• Entrambe le vie attivano fattori trascrizionali di mediatori dell’infiammazione (ad esempio
NF-kB, STAT3, HIF-1) e leucociti dell’infiammazione.

Infiammazione
Cellule necrotiche (non apoptotiche o autofagiche) rilasciano nel microambiente segnali
proinfiammatori che possono reclutare cellule infiammatorie del sistema immunitario.

Sensibilità alle terapie

Il microambiente condiziona anche la risposta alle terapie:
• Diffusione del farmaco
• Metabolismo del farmaco
• Insorgenza di resistenza

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 Prof. Grilli
Programma/Contenuti
Cancerogenesi chimica: Generalità. Cancerogeni diretti e indiretti. Attivazione metabolica e
polimorfismo genico. Plurifasicità del processo di cancerogenesi. Iniziazione e promozione. Esempi
selezionati di cancerogeni chimici sintetici e naturali, organici e inorganici appartenenti alle classi
chimiche principali (benzo(a)pirene, aminodifenile, benzene, dimetilnitrosamina, aflatossine,
asbesto). Livelli di informazione necessari per la classificazione della pericolosità cancerogena per
l'uomo.
Cancerogenesi da agenti fisici: Radiazioni ionizzanti; tumori indotti nell'uomo e stima di potenza
di tale effetto e del rischio cancerogeno per esposizione definite.
Radiazioni eccitanti (UV); tumori cutanei indotti (epiteliali e melanocitari). Pericolosità in senso
mutageno e cancerogeno della luce solare e di UV-A, UV-B, UV-C.
Radiazioni non ionizzanti. Principio di cautela per i campi magnetici indotti dalla corrente elettrica,
limiti di esposizioni al campo elettrico prodotto dalle radiazioni a frequenza molto alta.
Cancerogenesi virale: Differenze di infezione, produttività virale, trasformabilità cellulare tra
virus a DNA e a RNA, acuti e lenti. I virus oncogeni più rilevanti per la specie umana (HBV, HCV,
HPV, EBV, HHS-8, HTLV-I. HTLV-II, HIV) e i tumori ad essi associati. Altri agenti biologici.
Epidemiologia e prevenzione: Andamento della mortalità per cancro nel tempo. Relazione tumori
ed età. Dati standardizzati e indicatori per l'epidemiologia analitica dei tumori. Incidenza,
prevalenza, mortalità. Studi caso controllo e a coorte e rischi relativi e assoluti. Le principali cause
di morte per cancro nei Paesi più sviluppati: fumo e dieta. Distribuzione geografica, fattori di
rischio e prevenzione relativamente ai tumori più diffusi
Curve di crescita dei tumori: Curve di crescita: modello teorico. Curve di crescita di colture
cellulari in vitro. Andamento della crescita in vivo: fattori limitanti. Frazione proliferante, frazione
non proliferante e perdita cellulare. Tempi di raddoppiamento. Modificatori della curve di crescita.
Basi biologiche delle terapie E CHEMIOPREVENZIONE: Radioterapia: basi biologiche e
meccanismo di azione. Chemioterapia: basi biologiche; meccanismo di azione delle principali classi
di farmaci antiblastici. Meccanismi di resistenza a livello cellulare e molecolare. Ormonoterapia:
basi biologiche. Cenni su terapie innovative. Chemioprevenzione.

Grilli 5 maggio 2011

Cancerogenesi Chimica
Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA)
I cancerogeni indiretti, noti anche come cancerogeni secondari o procancerogeni (ammine
aromatiche, IPA), devono essere prima attivati da metabolizzazioni per esplicare la loro attività
cancerogena.
Il glutatione è uno spazzino perchè ha lo zolfo che riesce a catturare della cisteina.
Cancerogeni diretti non hanno bisogno di nulla mentre i cancerogeni indiretti hanno bisogno dei
citocromi p450 (superfamiglia di circa 100 geni in cui alcuni sono importanti per manipolare queste
sostanze che vi sto presentando e modificarli e renderle più solubili e meno tossiche). Ci sono dei
casi in cui questa modificazione non porta alla detossificazione ma alla tossificazione (nel 2% dei
casi) ovvero a seguito del metabolismo viene prodotto un prodotto che è tossico per l'organismo.
La molecola iniziale la chiamiamo pre-cancerogena mentre la molecola finale la chiamiamo come
ovvero il cancerogeno finale. Può anche essere il prodotto minore del metabolismo però c'è ed è il
risultato del fatto che la terapia è efficace (se non fosse efficace non avremmo la tossigenicità). Non
possiamo modificare i citocromi p450 perchè sono conservati filogenicamente e sono importanti
nella sintesi degli ormoni steroidei (funzione primaria). La sottofunzione più importante è la
detossificazione mentre la sottofunzione ulteriore è la tossificazione presente però solo in alcuni
casi.
Dobbiamo ricordarci di non dire mai che una classe di composti comprende composti tutti
cancerogeni ma abbiamo solo dei singoli composti che sono cancerogeni. La classe più importante
da questo punto di vista come numero di composti appartenenti ad una singola classe sono le

70
idrazine ma sono poco presenti in natura e sono prodotte da alcuni funghi, propellenti per missili e
sono bruciate e diventano nitrosammine. Nell'ambito delle idrazine la probabilità che una molecola
sia cancerogena è del 90% mentre nelle nitrosoammine è pari a 80%. In altri casi la percentuale è
molto più bassa.
Le sostanze sono trasformate seguendo un indice di potenza. Negli idrocarburi policiclici
aromatici (IPA) presentano 7 molecole che hanno un potenzialità cancerogena. Il meccanismo di
azione è l'assorbimento; in seguito devo essere modificati tramite il metabolismo soprattutto nella
regione VAIA (?) ed ottenere quindi un epossido. Vengono inseriti 2 gruppi OH in relazione
all'azione ossidasica del citocromo p450 e si viene a creare un ossigeno caricato positivamente ed è
un epossido e quindi un alchilante a può attaccare qualsiasi cosa che sia idrofilo e nel DNA si
appaia alla guanina in posizione 2 (anello a cui è attaccato il gruppo aminico con legame covalente).
A quel punto si forma una guanina con legame stabile e si possono avere 2 conseguenze:
1. il danno viene riparato;
2. la cellula riesce ad andare in duplicazione e fissa l'errore → iniziazione del processo.
Tutti si convertono in benzoapirene equivalenti a seconda della potenza (il benzoapirene ha
potenza pari a 1). La concentrazione di ciascuno moltiplicato per il fattore di potenza inferiore al
benzoapirene li trasforma in benzoapirene-equivalente e alla fine si somma il contributo dei singoli
composti (7). 1 ng/m3 di benzoapirene equivalente è il limite massimo di esposizione.
Gli idrocarburi policiclici aromatici danno differenti tipologie di k. Se inalati danno k polmonare
(esempio tipico dei lavoratori in siderurgia come i lavoratori della fusione del ferro e dell'acciaio
che non c'entrano nulla ma il carbon coke viene impiegato per potare la temperatura a livello
elevatissimo – i lavoratori inalano i vapori e quindi devono portare delle maschere per ridurre il
rischio di contrarre k polmonare), se applicati sulla cute danno epiteliomi nel punto di applicazione
o sarcomi locali se iniettati sotto-cute. Si è visto che se si iniettava intramuscolo uno di questi IPA,
il ipolartrene (?), si sviluppava nei ratti femmine il k della mammella, ciò significa che la molecola
è entrata in circolo e ha esplicato la sua azione cancerogena a distanza.
Per ingestione non abbiamo dei bersagli mirati ma possono andare in circolo, nel fegato sono
metabolizzati e possono dare degli effetti a livello epatico. Anche coloro che lavorano con asfalti e
bitumi sono esposti a rischio perchè gli IPA si producono per combustione e gli IPA sono presenti
anche nel petrolio. Se distilliamo termicamente il petrolio ottengo la pece che è piena di IPA.
Occorre quindi proteggere i lavoratori esposti.

Ammine Aromatiche e Azotici

Sono insieme perchè il meccanismo di azione è lo stesso. Ci sono gruppi NH 2: possono essere uno
come nel caso della aminoadifenile oppure due come nella benzidina. In realtà ci sono 3 molecole
note perchè è certo che determinano nell'uomo il k della vescica. Queste molecole non sono solubili
in acqua ma il metabolismo che ci interessa è quello che riguarda il gruppo amminico.
Il gruppo amminico viene idrossilato sempre dal citocromo p450 e si forma il gruppo NH-OH e il
gruppo idrossile viene sostituito poi dal O-SO 3 e si coniuga con l'acido solforico e l'N-
idrossiderivato solfarato è il cancerogeno mutageno. L'unica via che porta alla cancerogenesi è
quindi il gruppo aminico. Le tre amine responsabili del k alla vescica nell'uomo e nel cane sono (da
ricordare):
• benzidina;
• aminodifenile;
• beta-naftin-amina
Nel ratto non dà il k. Tutto arriva al fegato dove avvengono le reazioni del metabolismo. Nel
roditore di forma il gruppo N-H-OH e il suo solfato derivato è un alchilante che si lega con la
guanina come abbiamo visto prima. Nell'uomo e nel cane questo invece si lega all'acido glucuronico
e quindi si impedisce all'epossido di agire come tale. Dalla bile viene riassorbito dal sistema
digestivo e viene portato per essere escreto sotto forma liquida tramite il rene e arriva alla vescica
dove si libera il derivato modificato caricato positivamente in quanto l'acido glucuronico si spacca.
Allora il bersaglio della vescica si spiega in quanto l'acido glucuronico protegge il fegato ma non la

71
vescica. L'urina ristagna nella vescica per qualche ora e per questo motivo si avrà una maggiore
incidenza di k nel trigono vescicale. Le amine aromatiche sono tante, 3 cancerogene per l'uomo,
alcune forse ma altre no. Molte amine aromatiche sono coloranti, o alimentari o tinture per capelli.
Le tre ammine tossiche sono state impiegate nelle aziende di pneumatici (fino agli anni 50) ma non
si usano più perchè sono state sostituite da molecole che non vengono poi metabolizzate e
trasformate in N-idrossiderivati solfatati e quant'altro. La benzidina si usava anche per trovare
tracce di sangue ma è un colorante ancora impiegato in anatomia patologica ma con esposizioni
limitate.
Gli azotici sono meno tossici e non ce n'è uno cancerogeno ma alla fine il meccanismo di
attivazione è lo stesso e questi sono utilizzati come coloranti alimentari per avere effetti cromatici
particolari.

Altri cancerogeni indiretti

Il cloruro di vinile monomero è un composto organico clorurato. I composti clorurati o alogenati
(Br, I) sono tantissimi. Il cloruro di vinile monomero è un gas ed è un cancerogeno per l'uomo e dà
il PVC, una delle plastiche impiegate. Il PVC non è cancerogeno ma è cancerogeno il monomero.
Sappiamo che ha bisogno di attivazione metabolica e dà lo stesso k (caso raro) sia nell'uomo che
nell'animale ovvero l'angiosarcoma del fegato, un k raro non epatocellulare.
Il DDT era un insetticida che in Italia è vietato dal 1973 (siamo stati i primi a vietarlo) ma nei paesi
in via di sviluppo è impiegato ancora in agricoltura. Il DDT appartiene al cui gruppo delle
organoclorurati (?) appartengono anche le diossine, i più potenti cancerogeno conosciuti. Sono una
famiglia quindi ci saranno alcune diossine più cancerogene (diossina di seveso) che altre. Questi
composti necessitano l'attivazione metabolica con citocromo p450. La diossina dà k epatico
(epatocarcinoma) ed è stato osservato per la prima volta nel Vietnam quando c'era la guerra.
Altri composti sono clorurati; il Cl viene impiegato come disinfettante per l'acqua.
Poi ci sono le nitroso-ammine (appartengono alla classe dei nitroso-comporti). La più semplice da
ricordare è anche la più potente, ovvero la di-metil-nitrosammina. Hanno un gruppo NO e due
gruppi metilici dei quali uno viene staccato e demetilato in maniera ossidativa e se ne va via con il
gruppo acido e rimane la monometilnitrosammina che essendo un composto instabile si rompe e
libera N e O e si può attaccare anche in posizione nucleofila in proteine e nel DNA nella 7-
metilguanina. Queste nitrosammine si formano spesso nel nostro organismo perchè a pH acido
nitrito e ammine secondarie che sono in tutti i cibi si coniugano e formano le nitroso-ammine. Sono
cancerogeni per l'animale, per l'uomo probabilmente per tutte le vie aereo-digestive superiori fino al
fegato. Possiamo limitare la coniugazione del sodio-nitrito (presente nella carne in scatola per
evitare che si formi la tossina botulinica, nell'insalata in quanto sono impiegati come fertilizzanti). I
nitrati assorbiti entrano in circolo e sono ridotti dagli enzimi a nitriti e poi vanno nello stomaco per
essere secreti. Possiamo aumentare la quantità di vit C con la dieta che impedisce la coniugazione e
la formazione di nitroso-ammine.
La cicasina e la floxina-b1 sono prodotte in natura; la cicasina è nei semi e nelle foglie di alcuni
vegetali (noi non ne facciamo uso) ma non c'è prova di cancerogenesi epatica nell'uomo mentre
nell'animale si. La cicasina ha una porzione di molecola legata al glucosio che fintanto che è legata
al glucosio è inattiva. Se un animale ha una flora batterica in grado di rompere il legame e attivare
quindi la cicasina che dà carcinoma epatico. Se nell'animale togliamo la flora batterica non avremo
l'azione alchilante dell'altra parte della molecola e non svilupperà malattia. Nell'uomo si vede solo
un po' di cirrosi ma nulla di più.
La floxina(?) fa parte delle aplotossine(?) alla quale appartengono altre molecole naturali. Molte
sono metaboliti e varianti che si formano come intermedi del metabolismo. La più importante è la
fluoruxina b1(?) prodotta dall'aspergillus claurus (muffa) che attacca le granaglie nei climi caldo
umidi tropicali. Il prodotto del metabolismo della muffa è la tossina b1 (potenza elevata con potenza
simile a quella della diossina di Seveso e della tossina botulinica per tossicità). Importando
granaglie dall'Africa morivano dei pesci che venivano nutriti con il grano importato. Il limite fissato
per questa molecola è di 50 parti per miliardo. Gli americani hanno provato con un fungicida a

72
togliere la muffa ma ad oggi non c'è un fungicida che possa essere vantaggioso, ovvero la cui azione
contro la tossina sia maggiore rispetto la tossicità per l'uomo del fungicida stesso.
Anche l'alcool ha degli effetti cancerogeni ma per dosaggi molto alti e cronici.

Alchilanti – cancerogeni diretti

Si chiamano così perchè attaccano a qualche cosa e sono cancerogeni diretti. Sono mostarde ed
epossidi. Sono tutti caricati positivamente. Le mostarde possono essere o solforate o azotate su due
bracci. Sono nate come gas bellici nella prima guerra mondiale quindi sono gas nervini.
L'esposizione causa tumore del polmone per inalazione. La stessa cosa si era vista nei lavoratori
giapponesi in fabbriche per ordigni per la produzione di mostarde.
Le mostarde azotate presentano un H che può essere sostituito; con la sostituzione di questi sono
nati farmaci per il trattamento di tumori (e anche fitofarmaci e pesticidi) come ciclofosfamide
(attivo in molti tumori), bifosfamide, ecc. Tutti derivano dalla mostarda azotata. Sono somministrate
per via sistemica. La ciclofosfamide causa leucemia acuta linfoide e tumore della vescica. Quindi il
k alla vescica fa pensare sia all'esposizione alle amine aromatiche ma anche che sia stato fatto un
ciclo di chemioterapia con ciclofosfamide.

Ormoni steroidei
Siamo di fronte a molecole fisiologiche. È chiaro che diventano cancerogene quando sono a dosi
molto più elevati di quelle fisiologiche. Non sono mutageni ma nel lungo periodo causa la
promozione del k. Gli estrogeni sono cancerogeni ad alta quantità. I k da estrogeni sono alla
mammella e all'endometrio (dove ci sono anche recettori progestinici). Prevalentemente nelle
persone obese di sesso femminile.
Ci sono k della prostata trattati con estrogeni fisiologici ma c'era la femminilizzazione del maschio,
ora non si tratta così.
Per quanto riguarda la classificazione dei progestinici dobbiamo pensare al fatto che sono
antagonisti degli estrogeni e sono più protettivi.
Gli androgeni riguardano entrambi i sessi; k del fegato sono stati osservati in chi ha fatto abuso di
androgeni. Sono tumori silenti benigni ma facilmente emorragici. Questo vale per entrambi i sessi.
Nel sesso maschile gli androgeni promuovono il k della prostata. A valori non fisiologici quindi gli
ormoni possono dare problemi.
Si possono somministrare degli anti-ormoni oppure estrogeni sostitutivi a seconda della patologia.
Questi sono cancerogeni organici.

Cancerogeni inorganici
Sono differenti:
• Arsenico: è un veleno ma a dosi molto piccole compatibili con la vita quindi senza effetto
tossico letale dà effetti dimostrati di tossicità. Si usava come fungicida per la vite e davano k
del polmone e dello stomaco perchè i contadini bevevano il vino che producevano.
• Asbesto: si chiama anche amianto in Italia ed è un silicato. Sono microaghi del diametro
inferiore di 0,25 micrometri e lunghi tra 5 e 100 micrometri e passano tutti gli epiteli ciliati.
I macrofagi non riescono a eliminare la fibra e quindi richiamano fibroblasti e si crea una
difficoltà di ventilazione e minore funzionalità respiratoria e si ha una pneumoconiosi. In ¼
di coloro che sviluppano l'asbestosi si sviluppa anche il k del polmone o il mesotelioma
pleurico. L'amianto dal 1992 non è più commercializzato. Se l'amianto è friabile allora perde
fibre e va demolito in sicurezza. Quindi si misurano quante fibre ci sono ogni m 3 di aria. Al
suo posto sono state utilizzate delle fibre di lana di vetro ma non abbiamo prova che sia del
tutto sicuro ma lo avremo tra 20 anni (perchè la latenza di questi tumori è fino a 50 anni). Al
momento non ci sono eccessi di k, quindi è necessario aspettare. I danni che si conoscono
per amianto sono solo per inalazione. Nelle fibre di lana di vetro la via inalatoria è inefficace
per cancerogenesi ma le fibre di lana di vetro sono classificati come possibili cancerogeni
perchè negli animali per insillazione intratracheale c'è un eccesso di k al polmone. Ma è una

73
 metodica alla quale non è esposto l'uomo quindi non è valida.
• Cromo esavalente;
• Cadmio berilio;
• Silice cristallina: abbiamo prova nei lavoratori che causa k del polmone. La silice della
sabbia è amorfa e non è cancerogena.
• Nichel: è cancerogeno
• Piombo: non è cancerogeno per l'uomo ma ha una tossicità sullo sviluppo cognitivo ma non
è cancerogeno. Questo effetto si associa anche ad altre molecole quali la diossina di Seveso.
Molte molecole possono interferire anche con la fertilità, maggiormente nel maschio che nella
femmina.
Grilli 6 maggio 2011
Radiazioni Ionizzanti
Le radiazioni ionizzanti possono essere suddivise in due categorie:
• HIGH LET: tutte le altre (α, positroni, neutroni)
• LOW LET: radiazioni X e γ
Solo nelle radiazioni Low Let se la dose non è data istantaneamente ma è frazionata nel tempo con
somministrazione di energia inferiore che però sommata per tutte le somministrazioni sarebbe pari
ad una dose mutagena o cancerogena ma con le somministrazioni ripetute l'effetto è minore. Questo
ragionamento funziona solo per le low let. La giustificazione è che frazionando la dose l'esposizione
non è continua e si dà tempo ai sistemi di riparazione e c'è tempo per poter riparare parte dei danni
alla cellula compreso il DNA. Le radiazioni High Let che sono ad alta efficienza biologica questo
ragionamento non è valido. Questo si vede per esempio perchè in radioterapia la cobalto-terapia con
cobalto-60 che emette radiazioni γ mentre in radiodiagnostica sono X.

Effetti quantitativi delle radiazioni ionizzanti. Sono facilmente misurabili a livello di 1

disintegrazione per secondo (= Bequerel) e i dati nella tabella derivano dagli studi dei giapponesi su
Hiroshima perchè è necessario un follow-up di 50 per studiare gli effetti delle radiazioni in quanto
l'incidenza di chi in Giappone non ha subito una quantità elevata di radiazioni direttamente; queste
persone hanno subito un incidenza statisticamente significativa aumentata di tumori quali leucemie
mieloidi specialmente nei bambini che sono più sensibili a parità di esposizione alla cancerogenesi.
Dopo le leucemie si sono sviluppati eccessi di k alla tiroide, alla mammella, polmone, osteosarcomi,
tratto gastroenterico e così via. Tutti questi sono bersagli provati che possono sviluppare k con le
radiazioni.
A parità di esposizione vi sono dei tessuti che sono più sensibili alle radiazioni. Questi tessuti sono
per esempio midollo rosso che dà origine ai linfociti (leucemia mieloide nella cancerogenesi).
Mediamente sensibile è in tratto gastrointestinale. Lieve suscettibilità invece per quanto riguarda le
ossa.
In qualunque specie animale con radiazioni ionizzanti si ha un eccesso di tumori.
Dopo 45 anni si è visto che non ci sono più k correlabili con l'esposizione alle radiazioni (della II a
Guerra Mondiale). Si è visto per la stima quantitativa (misurata con % · Sievert, il Sievert è la
misura dell'effetto biologico provocato dalle radiazioni sull'organismo ed è il Gray moltiplicato per
un fattore di qualità (pari ad 1 per X e γ). Per X e γ Sievert e Gray sono identici mentre per le
radiazioni α il fattore di qualità è 20, ovvero 1 Gy dà 20 Sievert e quindi un effetto biologico sui
nostri tessuti molto amplificato). Nei lavoratori adulti è 4 % · Sievert mentre la popolazione
generale è pari a 5. La potenza è diversa fra i lavoratori e la popolazione generale perchè questo
numero deve essere moltiplicato per l'esposizione e i lavoratori sono esposti a maggiori dosi (1000-
10000 volte di più) rispetto la popolazione generale. La potenza intrinseca è differente perchè i
lavoratori adulti vanno da 20 anni a 65 anni mentre la popolazione generale va da 0 a 85 anni e la
fascia 0-20 anni è la fase di maggiore suscettibilità alle radiazioni che viene esclusa quando
parliamo di lavoratori. Il feto è il massimo della suscettibilità. Il motivo quindi della differenza di 4
e 5 tra i due gruppi perchè la popolazione generale dobbiamo coprirla per tutta la vita compresa la
fase di maggiore suscettibilità.

74
Quindi nella popolazione generale 5 % · Sievert sono i morti per tumori fatali, poi ci sono tumori
non fatali quali k dell'epitelio e della cute e molti k della tiroide, poi ci sono anche effetti mutageni
severi ed ereditari. Il 4 o il 5% · Sievert devono sempre essere moltiplicati per l'esposizione che
deve essere sempre stimata in quanto quella è l'unità di rischio.
Chernobil, disastro nucleare, ha avuto nella zona dell'Ucraina (Kiev compresa) effetti delle
radiazioni che dovranno essere stimati tra 20 anni.
Se si volesse fare una previsione per bersagli per singolo organo si utilizzerà questa tabella. Fatta
esclusione per le gonadi che non riportano effetti neoplastici ma effetti mutageni trasmissibili severi
ed ereditari, l'unità di rischio deve essere moltiplicata per un fattore di peso proprio del tessuto (0,12
o 0,05 o 0,01 a seconda dei tessuti). Per esempio per lo stomaco – colon - midollo rosso avremo
0,12 · 5% · Sievert; se invece consideriamo il k di vescica, mammella, fegato, esofago dobbiamo
moltiplicare per 0,05; oppure per 0,01 per la pelle, superficie dell'osso. Il risultato ci dà la
possibilità di prevedere il numero di soggetti che andranno incontro a decesso per le radiazioni in un
determinato k.
Per quanto riguarda la nostra attuale esposizione se ci sottoponiamo ad una RX diagnostica dipende
dal tipo di indagine. Per esempio RX torace: è quello che da la minor quantità di dose. Il rischio è
pari a 1/1.000.000. Quindi una donna gestante non deve essere irradiata perchè la suscettibilità è
elevata e si può avere leucemia. Dovremmo avere un tesserino che dice quante radiazioni ci sono
state somministrate. Coloro che sono addetti alla preparazione del pasto sono controllati per non
avere la TBC e viene detto loro di fare ogni anno un RX torace. Non è codificato da nessuna legge e
andrebbe benissimo fare l'Amantoux. L'effetto della radiazione è differente in ogni fase della vita.
L'effetto è amplificato tanto è precoce la somministrazione di radiazioni e si vede nella curva
esponenziale della relazione ètà-k. Altri esami come TAC danno rischi di 95-100 volte superiori
rispetto l'RX torace in quanto la dose di radiazioni è maggiore e il rischio diventa 1/10.000. È
necessario evitare indagini inutili.

Radon
Anche sul radon abbiamo delle conoscenze. Il radon decade a Pb 210 ed emette radiazioni α che
non passano un foglio di carta ma se vengono inalate e arrivano agli alveoli danno un effetto. I
lavoratori delle miniere di uranio e ferro inalano quantità elevate di questo gas che decade nei
polmoni e hanno un rischio maggiore di k al polmone rispetto la popolazione normale. La stima di
rischio viene da questi minatori facendo delle estrapolazioni con le dosi a partire da quelli dei
lavoratori in miniera fino ad arrivare a noi. Anche noi siamo esposti al radon perchè è presente
ovunque così come l'uranio. L'uranio 238 va a finire a radio 226 che arriva a radon 222 che arriva a
piombo 210 stabile. È stata misurata quindi la radiazione α emessa. L'unità di rischio è pari: 1
Bequerel/m3 di aria inalata per tutta la vita (le stime di rischio sono per tutta la vita) è pari a 1·10 -4
ovvero 1 morte in più su 10000 persone che per tutta la vita inalano un'aria in cui la concentrazione
di radon gas o di uno delle sue sostanze di decadimento di 1 Bequerel/m 3. Questa è la potenza
unitaria. Nelle nostre case abbiamo il legno che spara meno radon gas ma la casa non è fatta solo di
legno quindi bisogna vedere con quali sostanze è fatta la casa. Quindi la legge dice che per le nuove
case dobbiamo stare sui 100 Bequerel/m3 mentre per le vecchie case sui 200 Bequerel/m3 e per
concentrazioni maggiori dobbiamo bonificare.
In Italia la media geometrica è di 78 Bequerel/m 3 di radon, nei paesi nordici è bassa mentre a sud è
più bassa. Se moltiplichiamo l'esposizione di 78 (che possiamo arrotondare a 100) 1·10 -4 diventa
1/100 ovvero 1%: quindi l'1% delle morti per k è da radon il cui bersaglio è il polmone che
rappresenta in mortalità 1/5 di tutte le morti per k, allora lo possiamo moltiplicare per 5 =
1%·5=5%. Quindi le morti per tumore polmonare in Italia sono ogni anno 35000 e ogni anno il 5%
di queste è attribuibile al radon gas e non possiamo fare nulla per modificarlo. Il radon rappresenta
la metà del fondo ambiente al quale noi siamo esposti. In Italia 2 millesimi di Sievert/anno derivano
fondo ambiente. Le nostre normative dicono che in aggiunta al fono ambiente per la popolazione
generale può essere aggiunti 1 milliSievert/anno mentre per i lavoratori possono essere aggiunti 20
milliSievert/anno. La differenza tra i due gruppi è di 20 volte ed è la più piccola quindi i tecnici di

75
radiologia sono più tutelati rispetto quelli che lavorano con cancerogeni chimici (dove il rischio non
è di 20 volte ma di 1000-10000 volte in più).

Radiazioni UV
L'UV da 200 a 400 nm. Sono onde elettromagnetiche e sono suddivisibili in 3 bande:
• UV-A: 400-315 nm;
• UV-B: 315-280 nm;
• UV-C: 280-100 nm.
L'UV-C non arriva sul suolo terrestre perchè viene fermato prima mentre arrivano gli A e i B. le
lampade solari hanno UV-A ma queste sono mutagene. C'è una scala di suscettibilità (albini) così
come per la radiazione solare (gli albini e gli scozzesi sono più sensibili mentre i neri sono più
protetti dalla melanina nei confronti dell'epitelioma cutaneo). In Australia c'è una zona dove c'è una
forte radiazione UV-B e lì venivano portati i prigionieri inglesi (e anche scozzesi) che sono
suscettibili all'UV-B. Si è visto che sviluppavano molti k cutanei ma non morivano; è elevata
l'incidenza ma solo il 5% di questi diventa aggressivo e porta al decesso. Inoltre la cute è
osservabile e può essere fatta una prevenzione secondaria.
In genere i marinai e i contadini si espongono alla radiazione UV e in età tardiva può determinare la
possibilità di incremento di questo k. I dati più recenti dicono che gli UV-B danno anche il
melanoma cutaneo che porta a morte. L'esposizione in questo caso però non è cronica ma acuta con
(talmente forte da creare ustione) in bambini; ciò può aumentare la probabilità di melanoma.
Sono mutagene e cancerogene e i più sensibili sono gli albini, sia umani che animali. Poi ci sono
anche i soggetti affetti da Xeroderma Pigmentoso che non hanno capacità di riparazione della cute.
Il danno in questi soggetti porta alla formazione di dimeri di timina che porta alla cancerogenesi.
Non si ha un'unità di rischio in quanto non è stato possibile ancora calcolarla.
(vedi tabella con due gruppi di pazienti) 2A vuol dire che c'è una probabile cancerogeno.
Le lampade a fluorescenza non si sa nulla mentre i lettini solari (UV-A) sono probabili cancerogeni
per l'uomo. L'abbronzatura determina un invecchiamento precoce della pelle.

Campi elettromagnetici
Comprendono le onde radio, le onde televisive, i forni microonde, i radar e i cellulari (da 3000000 a
3000000000 Hz). Fanno parte della radiazione non ionizzante.
La corrente elettrica crea dei campi magnetici ed elettrici. L'importanza ce l'ha più il campo
magnetico che l'elettrico per l'effetto sulla salute. L'induzione magnetica si misura in Tesla (in
sottomultipli). Una Risonanza Magnetica da 2 Tesla ma sono statici (non oscillanti) e non crea
nessun problema. Non sappiamo classificarla. C'è un tentativo di classificazione della corrente
elettrica per quelle abitazioni in cui vivono bambini vicino a linee aeree ad alte tensione. È
importante che queste non passino vicino ad asili ovvero dove ci sono bambini per molto tempo al
giorno. C'è un eccesso di rischio di leucemia linfoide acuta secondo alcuni studi mentre secondo
altri no. Lione l'ha classificato nel gruppo 2B (possibile rischio). Probabilmente ci sono altri fattori
cancerogeni che possono causare in questi studi l'aumento delle leucemie. Nelle nostre case invece
non è nota la media geometrica di micro-Tesla del campo magnetico. I valori però non dovrebbero
essere piccoli perchè non c'è solo l'illuminazione ma ci sono anche gli elettrodomestici. (www.lilt.it
→ valutazione disponibile per capire la valutazione della corrente elettrica e per radiofrequenza).
I limiti espositivi per gli effetti a lungo termine sono stati varati il 29 agosto 2003. I limiti sono 100
micro-Tesla da non superare mai (oltre i quali si hanno problemi di salute). 10 micro-Tesla è il
limite per le linee ad alta tensione (sono i valori più bassi al mondo). Inoltre 3 micro-Tesla sono per
le linee future ad alta tensione (entro un centinaio di metri dalla linea elettrica stessa). Questi limiti
non sono per le abitazioni ma per le linee elettriche.
In casa dobbiamo spegnere tutti gli elettrodomestici senza tenerli in stand-by perchè il campo
magnetico in questo caso viene lo stesso prodotto. I campi magnetici non sono mutageni (quindi
sono differenti dagli UV). Non possiamo dire nulla della cancerogenesi verso l'uomo ma il fatto che
non sia mutageno rassicura.

76
Qualora cambiasse la classificazione e venisse considerato come mutageno se anche lo sarà questo
sarà molto debole e molto più bassa di quella del radon.
Per quanto riguarda le radiofrequenze abbiamo ancora meno dati ma considerato che non sono
mutageni quello che è importante è il campo elettrico che si misura in Volt/metro. Nel 1998 è stato
posto il limite a 20 volt/metro e si scende a 6 volt/metro negli ambienti in cui i giovani sono
esposti per più di 4 ore al giorno. Gli effetti sono poco conosciuti.
I ripetitori televisivi e radiofonici devono essere tenuti sotto controllo.
Per quanto riguarda i cellulari si è cercato di ridurre i watt riducendo la potenza e quindi il campo
elettrico che viene prodotto. Molti dicono che le stazioni radio-base dei cellulari siano pericolosi ma
in realtà il fascio delle onde viene orientato longitudinalmente per disperdersi all'orizzonte.
Lateralmente nelle due direzioni il campo elettrico viene abbattuto già a distanza di 1m. Quelle che
sono sul tetto non danno problemi perchè il tetto scherma tutto. La Danimarca ha dal 1968 un
registro tumori e sta studiando i casi di k in chi usa il cellulare ma sono necessari ancora 15 anni. Al
momento non c'è nulla di certo. Ci sono altri studi multicentrici e multinazionali (per es uno si
chiama Interphone) che cercano di vedere se c'è correlazione tra tumori della mammella, tumori del
SNC e neurinomi del nervo acustico e l'uso di cellulare ma non c'è nulla di chiaro ad oggi. Non
abbiamo neanche dati sugli animali. Oggi se dobbiamo classificare le radiofrequenze sono non
classificabili per assenza di dati.
È buona norma non stare davanti ai forni microonde quando scaldano.

Cancerogenesi virale
Ci sono tanti virus che inducono k nei roditori ma per l'uomo la rilevanza è differente.
Non è stimabile quantitativamente il numero di morti per questi agenti e quindi la rilevanza per
l'uomo è molto bassa. Dal punto di vista dell'esposizione per k maligni che portano al decesso.
Quali sono questi virus:
• Herpes simplex: non è responsabile del carcinoma del collo dell'utero.
• Hepstein Barr virus: dà il linfoma di Burkitt nei bambini dell'Africa equatoriale e dà nei
cinesi adulti della Cina meridionale dà il carcinoma rinofaringeo. Quindi è importante
l'ambiente. Da noi dà la mononucleosi infettiva quindi non crea problemi.
• HBV e HCV: carcinoma epatico, è in crescita ma la mortalità da noi è ancora molto bassa a
differenza dell'Africa (flotossina b1).
• HPV: cancro della cervice uterina con ceppi particolari quali 16, 18, 5, 11, 32, 35, 37 (sono
8 ceppi). Ci sono dei ceppi (1, 3, 5, 7) che danno k benigni che escono dalla valutazione che
stiamo facendo. Questi sono 3:
• polipo faringeo;
• verruca volgare;
• condiloma.
Di queste patologie non si muore. Questi sono virus a DNA.
Poi c'è l'HIV (RNA) che causa, oltre all'AIDS, il sarcoma di Kaposi, linfoma non Hodking ma non
c'è una prova provata. Le persone che sviluppano l'AIDS c'è un aumento di linfoma non Hodking
ma c'è il dubbio che sia dovuto o all'immunosoppressione o alla presenza del virus stesso. Non
sappiamo se l'HIV è cancerogeno o no.
Altri due virus a RNA sono HTLV1 e HTLV2 (l'HIV si chiamava in passato HTLV3) che sono
cancerogeni in Giamaica e in Giappone. Sono delle nicchie modeste in certe regioni. In Italia non ci
sono.
Grilli 12 maggio 2011
Evidenza epidemiologica
Livello 1 - epidemiologico
Il primo punto quando andiamo ad osservare uno studio è definire il rischio relativo, ovvero la
probabilità che un soggetto, appartenente ad un gruppo esposto a determinati fattori, sviluppi la
malattia, rispetto alla probabilità che un soggetto appartenente ad un gruppo non esposto sviluppi la
stessa malattia. Il secondo punto da tenere in considerazione è cosa dicono studi diversi che hanno

77
indagato il medesimo aspetto. Se tutti concordano vuol dire che c'è consistenza (nel tempo e nello
spazio) ma se non vi è consistenza allora è un po' un problema. La relazione causa-effetto si ha
quando si confrontano i dati epidemiologici. Sono rari i casi in cui vi sia specificità tra cancerogeno
e tipo di k (per esempio l'amianto con i mesotelioma pleurico) quindi non consideriamo questo
punto (che c'è nelle fotocopie).
Per il terzo punto è la temporalità: prima l'esposizione e poi la malattia. Se facciamo uno studio di
coorte entrano persone che si espongono ad un certo agente e se sviluppano un k dopo 2 anni
dobbiamo pensare che l'esposizione sia stata precedente al nostro studio (in inglese logged, sono
tagliati via quei pz che sviluppano un k troppo presto). Se si valuta un'esposizione questa deve
essere iniziata molto tempo prima. La latenza media di un k è 16 anni con un range da 10 a 50.
Il quarto punto è la relazione dose-risposta con una proporzionalità diretta tra l'aumento della dose
e la presenza della patologia. Questo dovrebbe aumentare l'incidenza (nuovi casi/anno) della
patologia.
Ci si può basare solo su dati umani e non animali.

Livello 2 – studi di cancerogenesi

Ogni prova che facciamo ha la possibilità che si fa può essere falsamente positivo o falsamente
negativo. Si possono avere errori di tipo 1 (falsamente positivo) o errore di tipo 2 (falsamente
negativo). Nel caso di tipo 1 ci si accontenta di stare tra l'1-5% di probabilità di errore, per il tipo 2
in genere si sta sul 10-20%. L'errore dipende anche dalla dimensione del campione
(tendenzialmente un campione più grande riduce entrambi gli errori). Se abbiamo un campione fisso
possiamo diminuire il tipo 1 ma di conseguenza aumenta il tipo 2 e viceversa quindi non si possono
influenzare entrambi se non ampliando il campione (cosa difficile da fare). C'è quindi il problema
del falso positivo e falso negativo.
Ci sono inoltre due limiti tecnici ovvero che debbano esserci 2 anni di esposizione ad un agente e 4
anni per avere un risultato. Inoltre il costo è molto elevato (1 milione di € per una singola
molecola). Inoltre i laboratori che possono fare questa procedura nel mondo sono poche e quindi
dobbiamo selezionare le molecole che vogliamo analizzare.
I soldi se il prodotto è nuovo sono forniti dall'azienda farmaceutica che ha prodotto la molecola.
La potenza dello studio è abbastanza bassa: si fanno dei gruppi di 100 animali (50M, 50F): 100 che
non sono trattati (gruppo di controllo), 100 per la dose bassa, 100 per la dose media e 100 per la
dose alta. Quindi ci sono molti animali che sono impiegati.
Il limite di questi studi è che prendendo 50 animali per gruppo il controllo spontaneo può
controllare un'incidenza pari a 0 (non lo vedo nei 50 animali maschi) e ho che fino al 15,4% di
incidenza negli animali trattati è come se fosse 0, ovvero non c'è differenza statisticamente
significativa. All'aumentare dell'incidenza nei controlli si alzano i valori nel gruppo di trattamento.
Si parla sempre di significatività statistica. I rischi piccoli non sono individuati in questo studio.
Questo studio è simile al caso-controllo. La differenza è che nell'animale posso aumentare la dose
ma se la molecola è un cancerogeno indiretto devo fare attenzione che non vi sia una via di
salvataggio che nell'uomo non si verifica in quanto le dosi sono inferiori. Non è possibile quindi un
confronto acritico.
Per interpretare questi studi possiamo prendere lo studio C6C3F1 (incrocio di prima generazione
(F1) tra due ceppi differenti di topi) e se incrociamo per 20 volte questi topi (fratello e sorella) per
20 volte portano ad animali singenici e sono gli unici studiati per la cancerogenesi. Questi topi
hanno una dozzina di geni chiamati HCS che controllano l'epatocancerogenesi suscettibilità.
Qualsiasi cosa somministro quindi avrò un aumento dell'incidenza dei k epatica; nell'uomo questi
geni non ci sono e quindi questi tumori non hanno valenza per l'uomo. Fino al 1991 si
consideravano poi le classificazioni sono cambiate. Questi topi vanno bene per tutti gli altri k
escluso quello epatico.
Il ratto è più robusto del topo ma ha la tiroide fragile.

Tossicocinetica

78
Penetrare nell'organismo e subire il metabolismo ed infine capacità di escrezione (feci, urine o
respiro). Nel contesto del metabolismo dobbiamo sapere se le cellule coltivate in vitro della specie
nella quale abbiamo assistito un aumento di k in vivo e di tante specie che si avvicinano all'uomo
noi capiamo qual è la dose e i tempi. Il topo è l'animale che ha il metabolismo più veloce di tutti e
quindi negli studi dobbiamo considerare ciò. Quindi la cancerogenesi nell'uomo sarà anche più lenta
di 100 volte. Quindi si può ridurre la dose nel topo per dimostrare la minore efficienza metabolica e
quindi la potenza viene ridotta. Se nell'uomo la via non c'è il dato non è trasferibile all'uomo. Più
spesso nell'uomo la via c'è ma è più lenta. La sostanza nell'uomo può essere metabolizzato
diversamente rispetto all'animale.

Saggi a breve termine – saggi di mutagenesi

Questi saggi sono utili perchè ci dicono se una sostanza è mutagena. Servono sia per i rischio
genetico nella progenie sia per dire se il cancerogeno è completo o è un promotore. Sono richiesti
per una nuova sostanza 2 saggi di mutazione genica in vitro (e non per forza in vivo), 2 saggi a
livello di mutazioni cromosomiche (uno dei quali in vivo) e un saggio di effetti sul DNA (possibile
farlo in vitro). Si testa sulla salmonella che passa dalla dipendenza di istidina; se torna indietro
allora è positivo. Nel secondo saggio dobbiamo utilizzare cellule eucariotiche e si usa il
Saccaromyces Ceremisie. In genere però si usano cellule umane. Poi a livello cromosomico si fa
un'analisi citogenetica in vivo e in vitro. Si valutano se c'è stata un'attività clastogenica della
sostanza, ovvero se la sostanza ha spezzato il cromosoma.
Il micronucleo (punto 9) è una palla adesa al nucleo di ¼ di diametro del nucleo che può contenere
o un cromosoma o un frammento di cromosoma. Se contiene un cromosoma intero significa che c'è
stato un errore nella divisione del fuso mitotico dopo replicazione. Allora si ha un disturbo del fuso
mitotico ma non è detto che la sostanza impiegata sia per forza mutagena. Invece se c'è solo un
frammento di cromosoma è chiaramente il prodotto di un'azione clastogenica mutagena di un
agente. Gli studi più moderni vanno a vedere il numero di micronuclei e se è presente il centromero.
Ciò si fa con il CREST test tramite fluorescenza con anticorpi. Se c'è la fluorescenza e quindi è
presente il centromero vuol dire che il cromosoma non è spezzato mentre se non si fissa significa
che la molecola studiata ha un'attività clastogenica. Lo studio dei micronuclei oggi viene accettata
solo se implementata da questa studio.

Il danno e la riparazione del danno sul DNA sono studiati in modo differente. Si fanno solitamente 5
saggi. Se sono tutti negativi il discorso è finito e si dice che non è mutageno. Se sono positivi alcuni
di questi 5 si possono prendere due posizioni: o si chiedono ulteriori saggi o si escludono. Questi
sono meno costosi e fanno da pre-screening della cancerogenesi. Non c'è una buona corrispondenza
tra mutagenesi e cancerogenesi (anche se in realtà si pensava che fosse così anni fa perchè i
composti che si studiavano erano sia mutageni che cancerogeni).
Da quando ci sono i filtri ovvero i pre-screening basati sulla mutagenesi le molecole mutagene sono
state fermate. Facendo ciò facciamo passare i promotori del cancro che sono aumentati in
proporzione. Ci consola il fatto che i promotori hanno una dose soglia e un'intensità di
somministrazione elevata. È sufficiente andare quindi sottosoglia.
Ci sono cellule di topi che nel 1978 sono state immortalizzate; sono fibroblasti che in vitro si
orientano e poi di duplicano fino a riempire tutto il vetrino e poi si fermano. Se mettiamo queste
cellule in coltura con un agente in differenti dosi (anche il gruppo controllo) dopo 5 settimane si
possono osservare dei foci di trasformazione cellulare in vitro ovvero fibroblasti disorganizzati che
se presi ed inoculati in un topo immunosoppresso producono k. Sono quindi k ottenuti in vitro che è
l'analogo della cancerogenesi in vivo. La correlazione tra la trasformazione in vitro e la
cancerogenesi nel topo è nell'ordine dell'85%. È quindi un metodo alternativo alla cancerogenesi in
vivo nel piccolo roditore (non ancora ma tra poco sarà così). Si potrà pensare allora se fare un
saggio del genere. C'è quindi un'evoluzione in atto per test alternativi. Questo permette anche di
scomporre l'iniziazione dalla promozione.

79
 Potenziale quantitavo alla valutazione dei cancerogeni
Ci sono modelli matematici: moltiplicare l'unità di rischio per l'esposizione. L'esposizione può
essere lavorativo o per tutta la vita. Si ragiona per ordini di grandezza.
La stima del rischio è un giudizio scientifico basato sui dati. La gestione del rischio è un processo
politico e le due cose devono rimanere scisse (lo scienziato dal politico). Le norme sono
determinate dai meccanismi legislativi mentre gli esperti dicono la loro.
La potenza cancerogena o unità di rischio è indicata nel grafico. La dose è in ascissa e in ordinata la
risposta, ovvero il k. I triangolini sono punti sperimentali. Più alta è la dose tollerabile e maggiore è
la possibilità che la curva vada a plateau con metabolismo sovraccarico perchè il citocromo p450 è
saturabile. Il rettangolo con “?!” serve per essere prudenti; occorre estrapolare con modelli
matematici che hanno una soglia o che vanno linearmente a 0 in modo che l'eccesso di una quantità
di dose dia una risposta?! In questa zona non abbiamo la sensibilità per misurare gli effetti e
dobbiamo essere prudenti. I modelli lineari in questo tratto con basse dosi sono cautelativi e
ammettiamo che non ci sia una dose soglia per l'effetto 0 se non una dose pari a 0. A dire ciò ci
aiutano degli studi sperimentali sugli animali e si vede che la formazione di addotti (prerequisito per
la cancerogenesi) è lineare. Quindi il cancerogeno mutageno si comporta in maniera lineare. Il
modello matematico lineare è corretto; la pendenza della retta corrisponde alla potenza quindi è
l'unità di rischio.
I modelli matematici che ci possono aiutare sono vecchi (1960) chiamati “multistage” ovvero
“attacchi multipli”. Dice che la probabilità di sviluppare il tumore “p” in funzione della dose
(ovvero in funzione dell'incidenza) e i dati sperimentali devono essere adattati alla formula fino a
che non si trova da questo polinomio l'adattamento della curva ai dati sperimentali interpolati.
Bisogna vedere a quale dose si riesce ad avere l'adattamento. I dati sperimentali sono a dosi alte e
quindi noi dobbiamo usare questo modello per valutare i bassi dosaggi a modello lineare. Mettiamo
i dati in un software della NCEA-multistage-cancer che è la linearizzazione del multistage nelle
basse dosi e si eliminano tutti i dati con esponente > 2. In questo modo definisco una retta e il
multistage è linearizzato. K1 mi indica l'unità di rischio (pendenza della curva) ed è un intervallo;
prendiamo il maggiore livello di confidenza nell'intervallo calcolato. Il limite in Italia è la dose di
1/1000000 sotto la quale c'è la trascurabilità dell'effetto (penso rispetto la potenza cancerogena).
Manca la latenza, periodo di tempo necessario per lo sviluppo del k. Non si riesce ad inserire nel
modello matematico.
Manca un'espressione biologica perchè nelle cellule colpite ci sono cellule che si replicano e altre
che muoiono. Mancano questi due parametri biologici. Ci sono altri modelli che necessitano di tutti
i parametri che però devono essere validati.
Dal punto di vista quantitativo il problema è nato con il tricolometano: si è deciso di fare una stima
del rischio e la molecola come decaffeinante era accettabile (1/1.000.000 di k). Nella lacca per
capelli (dove era un propellente) erano sufficienti invece 5 minuti di applicazione per inalare una
quantità di triclorometano che portava il rischio individuale compreso tra 1/1000 e 1/10000. si bandì
l'uso di questa molecola nella lacca per capelli. Se uno era un parrucchiere il rischio era 10-100
volte superiore perchè l'esposizione era maggiore.
Ora si utilizza la CO2 per decaffeinare il caffè e quindi non si usano alogeni. Il gusto del caffè era
uguale. Negli anni 90 sono stati fatti studi di tossicocinetica sui k epatici e k mammari. Il glutatione
del fegato ci difende da molti tessuti tossici. Il triclorometano si coniuga con il glutatione e forma
una specie elettrofila e diventa lui il cavallo di troia. Una volta scoperto ciò il problema è stato
comparare il topo con le altre specie. Si è visto che il rischio di 4/10.000.000 delle 3 tazzine al
giorno va abbattuto di 100 volte diventando 4/1.000.000.000 e il rischio è molto minore in quarto
l'uomo è meno suscettibile al metabolismo di questo tipo considerando il metabolismo del
glutatione. L'uomo solitamente ha un metabolismo maggiormente protettivo rispetto gli animali ma
non è sempre così. Per esempio l'uomo è più sensibile alle radiazioni ionizzanti e i raggi X e γ
hanno effetto tramite l'acqua attraverso le quali produce le specie radicaliche dell'ossigeno. Noi
siamo i più suscettibili perchè abbiamo una maggiore concentrazione di acqua.
Qui ci interessa il valore più basso del limite di confidenza inferiore perchè stiamo ragionando in

80
maniera opposta a prima perchè vogliamo vedere qual è la dose minore che può dare un effetto
osservabile.
Si possono osservare delle unità di rischio che vanno moltiplicate per l'esposizione. Nella tabella
abbiamo alcune sostanze come radon, asbesto, benzene, radiazioni ionizzanti, diossine per esempio
e si può leggere in verticale per diminuzione progressiva del rischio (i lavoratori rischiano di più).

Grilli, venerdì 13 maggio 2011

Benzene ed IPA
Il benzene è stato scoperto nel 1825 dopo essere stato isolato dal petrolio. È un mutageno e
cancerogeno ed ha evidenza di categoria 1. È facilmente volatile e i dati sullo studio sulla sua
tossicità risalgono al 1929 ma a metà del 900 c'era già la convinzione della cancerogenità sull'uomo.
In seguito sono stati effettuati differenti esperimenti sugli animali che hanno dimostrato che non c'è
corrispondenza di bersaglio tra uomo ed animale. Nell'uomo il benzene causa la leucemia mieloide
cronica (bersaglio oncologico) preceduta da ipoplasia (o aplasia) del midollo osseo rosso che
rappresenta l'organo bersaglio. Negli animali si sono visti vari k ma non la leucemia. Il bersaglio
può dipendere da vari percorsi metabolici all'interno dell'organismo e quindi la non-corrispondenza
è motivata. La stima di rischio che si può fare nell'animale differisce di un fattore 2 da quello
umano, quindi c'è un'ottima concordanza tra la stima della potenza cancerogena nell'uomo e negli
animali. 8/1.000.000 sono i soggetti che si ammalano di k in soggetti che si espongono a 1
microgrammo di benzene per m3 di aria (USA). L'OMS parla di 6/1.000.000 morti per k in più che
per tutta la vita sono esposti a benzene. Poi è stata misurata l'esposizione: i lavoratori che lavorano e
producono il benzene ogni giorno assorbono 10.000 microgrammi di benzene (stima USA 1988, le
cose ora possono essere migliorate) mentre i fumatori attivi assorbono 1800 milligrammi di
benzene. L'esposizione in ambienti non confinati (ovvero nelle città dove è presente molto traffico
veicolare in quanto il benzene è presente nelle benzine e deriva anche dalla combustione incompleta
della benzina) comporta l'assorbimento di (vedi fotocopie), i fumatori passivi assorbono 50
microgrammi, gli autisti 40 microgrammi al giorno, i benzinai 10 microgrammi al giorno e quindi
hanno stimato l'esposizione. Hanno poi moltiplicato l'unità di rischio (k 1 = 8 x 10-6) per la quantità
di microgrammi al giorno, poi hanno stimato qual è l'entità della popolazione esposta. I fumatori
all'epoca (1988) erano 53 milioni su 240 milioni di statunitensi; l'esposizione in ambienti non
confinati riguardava la totalità degli statunitensi (240 milioni), i fumatori passivi erano 190 milioni
(240 – 53), i lavoratori esposti erano 250.000; il rischio individuale di queste persone era molto
maggiore della popolazione ma dal punto di vista della considerazione di tutte le esposizione la loro
propria esposizione viene diluita nella popolazione generale – ciò perchè facendo poi il prodotto
dell'unità di rischio moltiplicata per la singola esposizione moltiplicata per la dimensione del
campione e dividendo il tutto per 80 che rappresenta l'aspettativa di vita media di ogni persona,
otteniamo i casi di morti da benzene per k stimati negli USA per ogni anno. In totale sono circa
1000 e di questi la metà sono ascrivibili al fumo attivo di sigaretta, 350 all'esposizione in ambienti
aperti, i lavoratori sono 10 casi per anno. Quindi rispetto la popolazione il numero dei lavoratori che
si ammalano sono molto minori ma se consideriamo invece solo i lavoratori esposti allora il rischio
è chiaramente maggiore. I benzinai sono 5 casi per anno. Il problema del benzene quindi non è un
problema riferito solo all'ambiente lavorativo ma anche ad altri ambienti, come la strada o gli spazi
aperti.
Il benzene viene modificato all'interno del corpo in tanti modi ma in tutte queste trasformazioni
mantiene l'anello aromatico. Recentemente è stato definito che la spaccatura dell'anello forma una
dialdeide (OHC-CH...-CH-CHO) chiamata muconaldeide o mucondialdeide. Gli aldeidi hanno una
vita breve e può interagire con i siti nucleofili e quindi anche con il DNA. Il muconaldeide è il
mutageno cancerogeno terminale. La quota che non interagisce con un nucleofilo viene ossidato
ulteriormente ad acido mucolico (2CHO → 2COH) che è stabile e si può misurare nelle urine. Per
misurare quindi l'assorbimento non vado a ricercare il fenolo (che veniva ricercato in passato) ma
l'acido mucolico che è quello che ci da delle indicazioni rispetto la dose effice in prospettiva degli
effetti mutageni o cancerogeni.

81
Siamo partiti dal benzene per parlare degli IPA; ne abbiamo già parlato quando abbiamo affrontato
il discorso qualitativo mentre qui facciamo solo un discorso quantitativo, ovvero fare una stima del
rischio. Oltre al benzoapirene ve ne sono altri 8 (benzoantracene, ecc). Questi sono quelli che
ricerchiamo in aria e cerchiamo poi di convertirli in benzoapirene tramite dei fattori che sono pari a
1 per il benzoapirene e sono minori di 1 (dato che sono fattori di potenza) per le altre sostanze
elencate. Non verrà chiesta la lista delle 8 sostanze ma dobbiamo sapere che sono 8 idrocarburi
policiclici aromatici rappresentati da un solo composto che è il beanzoapirene e che tutti gli altri in
funzione della loro concentrazione misurata e moltiplicata per il fattore specifico di ciascuna
sostanza vengono trasformati in equivalenti del benzoapirene. Questi dati devo essere sommati e
otteniamo il benzoapirene equivalente e su questo facciamo la stima del rischio, ovvero quanti k ci
aspettiamo per una esposizione inalatoria (più efficace) o alimentare (maggiormente frequente). È
necessario rispettare la normativa e non fare sforamenti. Anche se rispettiamo la normativa
dobbiamo sapere che ogni anno muore 1 persona in più su 10.000 persone che ogni giorno per tutta
la vita hanno respirato benzoapirene equivalenti 1ng o 1 miliardesimo di g per m 3 di aria. Dobbiamo
tendere quindi al nanogrammo che è il valore minore rilevabile. Se parliamo di particolato, ovvero
le polveri sottili, cerchiamo di diminuire i PM10 da 40 microgrammi/m 3 aria a 20 per l'anno 2015
(normativa europea). Oggi siamo a 40 con tanti sforamenti. Non è facile ridurre questi valori. Il
contributo del traffico veicolare è molto basso in quanto ci sono anche le caldaie domestiche. Solo il
metano con la combustione non produce IPA. Il limite è di 1 ng/m3 di aria posta in Italia nel 1994.
Per quanto riguarda l'assorbimento mediamente in Italia si assorbono per via inalatoria il 6,5% del
totale e per via orale il 93,5% soprattutto tramite alimenti grassi (latte e derivati perchè gli IPA sono
solubili nel grasso e lì si concentrano). Anche tutto ciò che è affumicato, bruciato contiene IPA.
Tutto dipende da quanto ne viene mangiato.
L'unità di rischio è maggiore per la via inalatoria che rispetto a quello orale. Un eccesso di 1 morto
in più ogni milione di persone che per tutta la via assumono da 6 a 50 ng di benzoapirene al giorno.
Nell'intervallo da 6 a 50 prendo il più basso, 6, perchè voglio essere protettivo (non è chiaro perchè
prima aveva detto 1 ng e non 6).

Diossine e policlorobifenili
Sono composti clorurati e sono cancerogeni indiretti in quanto necessitano di un'attivazione
metabolica e, a differenza degli IPA, hanno un tempo di dimezzamento nell'ambiente molto elevato
(anni). La via principale non è quella inalatoria ma quella alimentare.
La struttura di base delle diossine è differente e la più nota e pericolosa di esse è la 2,3,7,8-
tetraclorodibenzo-p-diossina, ovvero la diossina che è legata a 4 Cl, la diossina di Seveso, la più
potente sia dal punto di vista tossico che cancerogeno. Le diossine sono tante (210) e non tutte sono
cancerogene e le dobbiamo misurare tutte. La potenza della diossina di Seveso è pari a 1 e poi ce ne
sono altre 17 che hanno una potenza tossica più bassa di quella della diossina di Seveso. Queste
vengono trasformate in benzoapirene equivalente tramite il fattore di potenza. Anche qui misuriamo
le concentrazioni delle 18 diossine, si moltiplicano questi per il fattore di potenza specifico; poi si
trasforma in diossina di Seveso equivalente (tramite sommatoria). L'unità di rischio cancerogena è
1 picogrammo di diossina di Seveso per Kg di peso corporeo al giorno dà un eccesso di rischio di
2/1.000.000. Questa è la stima cancerogena. Questi interferiscono sullo sviluppo della vita e quindi
è presente nei siti non l'unità di rischio ma la quantità assumibile giornalmente tollerabile ed è di
2 picogrammi per Kg di peso corporeo. Se moltiplichiamo questo per 60 (peso medio) abbiamo 120
picogrammi. La stima delle diossine presenti negli alimenti (stima anni 80-90), soprattutto alimenti
grassi, era 180-420 picrogrammi/persona/giorno. Il limite di 120 è stato applicato nel 2002. Oggi
siamo sui 100 picogrammi/persona/giorno di diossina equivalenti negli alimenti. C'è stata una
modificazione positiva e siamo in una condizione di sicurezza anche quando osserviamo la tossicità
per lo sviluppo. Si aspetta che gli effetti di interferenza endocrina siano minori rispetto il passato.
Le diossine erano presenti negli inceneritori vecchi; negli inceneritori di nuova generazione (terza)
si arriva con una camera aggiuntiva (camera di post combustione primaria) nella quale ad una
temperatura elevata viene distrutta la diossina.

82
I primi problemi sono quelli di tossicità dello sviluppo prima dei problemi
di cancerogenesi.
Assieme alle diossine dobbiamo considerare anche un'altra classe di
composti chiamati policlorobifenili (PCB). Sono 209 composti e ci sono 2
anelli esagonali ai quali si possono attaccare 5 atomi e ci possono essere da
1 a 10 sostituenti. I PCB sono suddivisi in due categorie:
• Simili alle diossine: che sono la maggiorparte;
• Non simili alle diossine: sono molto meno potenti delle diossine (di 6 ordini di grandezza,
un milione di volte in meno).
I PCB sono contaminanti ambientali come le diossine e gli IPA. Le diossine sono molto più affini al
recettore APO rispetto agli IPA (di circa 30.000 volte). Ciò spiega la maggiore potenza della
molecola.
Il PCB sono presenti nei cibi (parti grasse) a livelli di concentrazione pari a 8 ordini di grandezza in
più delle diossine. Dato che per calcolare il rischio devo fare una moltiplicazione il rischio più alto è
di circa due ordini di grandezza per il PCB che per le diossine.

Composti inorganici
Asbesto: l'OMS afferma che l'unità di rischio debba essere 500 fibre/m 3 di aria misurate al
microscopio ottico; in realtà il microscopio ottico dà solo la metà delle fibre (solitamente si usa il
microscopio a scansione) e quindi l'unità di rischio è di 1000 fibre/m3 di aria. Vi sono due unità di
rischio (uno per il polmone e l'altro per la pleura). C'è un intervallo da 1/1.000.000 ad 1/100.000 per
il k al polmone, di u ordine di grandezza maggiore per il k della pleura. Questi sono dati che
riguardano l'inalazione ogni giorno per tutta la vita di 1000 fibre di asbesto/m 3 di aria. Ogni giorno
inaliamo circa 30 m3 di aria, beviamo 2 litri d'acqua, mangiamo 400g al giorno di frutta e verdura
(pesticidi), 500g al giorno di carne – questi sono i valori medi.
Questi dati sono stati impiegati quando sono state fatte delle stime del rischio per le fibre di lana di
vetro, le sostitute dell'amianto. Mancando il potere della cancerogenicità delle fibre di vetro (unità
di rischio) per fare una stima è stato impiegato quello dell'asbesto, immaginando che fossero
identici. Le fibre erano impiegate come isolanti. Non è stato ottenuto un eccesso di rischio e il
rischio era di 1/1.000.000 utilizzando un unità di rischio probabilmente molto maggiore della realtà
e quindi il rischio era trascurabile.
Cloro: oggi si usa l'ossido di cloro per potabilizzare l'acqua. In passato era stato usato gas cloro e la
varechina. I composti clorurati hanno una possibile/probabile tossicità. I composti che si formano
per clorazione sono quelli del gruppo A (classificazione USA) e sono quattro molecole. Uno di
questi è il cloroformio. La concentrazione di microgrammi per litro di acqua a cui è associato il
rischio di 1/100.000 (vedi fotocopie per i valori) ovvero il massimo che noi accettiamo come rischio
per rendere l'acqua potabile. Nell'acqua ci sono residui di acidi organici (acidi urici) che per
reazione con il Cl formano quei 4 composti. L'insieme di quei 4 composti non deve superare i 30
microgrammi/litro di acqua potabile. Questo limite è rispettato. L'acqua di falda protetta ci aiuta
ad evitare che ci sia la contaminazione dell'acqua stessa. Se l'acqua contiene uno di questi
contaminanti significa che qualcuno sta contaminando l'ambiente.

Epidemiologia
Nel 1981 è stato fatto uno studio che ha cercato di valutare tutti i parametri che influenzano
l'andamento dei k.
Di tutte le morti per k negli USA del 1981 l'età media era di 35 anni con un intervallo da 10 a 70
anni. Ciò perchè ci sono k molto differenti. Noi abbiamo un intervallo che va da 25 a 50. Il fumo
attivo negli USA era a 30 anni con un intervallo da 20 a 45-50 anni e da noi la situazione è simile.
Negli USA la curva della mortalità al k si sta riducendo perchè sono meno i soggetti che fumano
(vedi fotocopie per percentuali).
Rispetto al passato si fanno più indagini diagnostiche ma si irradia di meno. I due fattori che
aumentano la possibilità di soffrire di k sono il fumo e la dieta. Non esiste una dieta ottimale ma

83
solo dei sani principi (percentuale dei lipidi e dei carboidrati, attività fisica, ecc).
In Svezia è stato fatto un altro studio. In Svezia le campagne antifumo sono state efficaci e c'è
minor abitudine al fumo e quindi meno k.

Fumo di sigaretta e tumori

I tumori associati causalmente al fumo di sigaretta sono 14, di cui il primo quello al polmone ed è
quello per cui il rischio relativo è il più alto. Inoltre ci sono tutti gli apparati delle vie aeree digestive
superiori come l'esofago, fegato, leucemia mieloide, la vescica (via aerea digestiva superiore?).
Ogni anno 40-45.000 persone muoiono per l'insieme di questi 14 k. Altrettanti morti ogni anno
muoiono per patologie non neoplastiche quali cardiovascolari (nei 2/3) e per 1/3 sono polmonari
non neoplastiche (croniche). Il totale è di 90.000 morti ogni anno → importante la prevenzione
primaria.
Un fumatore che decide di smettere, passati i primi 2-3 anni dove il rischio è maggiore, il rischio
tende ad avvicinarsi a quello di chi non ha mai fumato che sta salendo (perchè gli anni vanno
avanti). Queste due curve non si uniranno mai. Ciò significa che le sostanze presenti all'interno
della sigaretta hanno funzione di promozione del cancro e non sono quelle stesse sostanze le
cancerogene e mutagene; ciò lo possiamo affermare perchè se fossero prevalenti le azioni dei
mutageni le due linee non dovrebbero tendere ad unirsi.

Decalogo del cancro:

• Non fumare;
• Ridurre alcolici in quanto promotori (250 g al giorno);
• Aumento verdura e frutta fresca;
• Aumentare fibre perchè aumentano la velocità del transito intestinale di sostanze che
possono essere tossiche oppure di sostanze che diventano tossiche con l'azione della flora
batterica intestinale. Se si esagera si ha malassorbimento intestinale.
• Evitare il consumo di cibi grassi;
• Protezione dalle sostanze cancerogene;
• eseguire test di screening (pap-test dai 25 ai 65 anni ogni 3 anni, mammografia dopo
menopausa);
• Abitudini sessuali.

84
 Lezione prof Grilli, giovedì 19 maggio 2011

Riprendendo il discorso che abbiamo fatto l'ultima volta abbiamo detto che uno studio descrittivo
fotografa una situazione e non permette quindi di indagare una causa-effetto ma genera solamente
delle ipotesi che devono essere saggiate in un momento successivo da studi analitici; se queste
dovessero essere confermate ci daranno quindi delle associazioni di tipo causale.
Facciamo un esempio di studio descrittivo: per esempio possiamo descrivere i migranti giapponesi
che nella seconda metà del '900 si sono spostati nel west-USA comparare l'incidenza di patologie
neoplastiche nei gruppi che sono emigrati con quelli che sono rimasti in Giappone. Sappiamo infatti
che vi sono dei tumori che colpiscono con un'elevata incidenza i giapponesi ed uno di questi è il k
allo stomaco mentre nella popolazione americana l'incidenza non è così elevata. Viceversa invece
per quanto riguarda il k della mammella che colpisce più le americane che le giapponesi. Se
andiamo a vedere dopo 2 generazioni qual è l'andamento dell'incidenza del k si è visto che
l'incidenza del k della mammella si alza e diventa pari a quello della costa west mentre il k dello
stomaco si abbassa e diventa pari a quello della California. Ciò deve essere dovuto probabilmente a
caratteristiche ambientali (abitudini alimentari, sessuali, ecc – magari aggiungerei io non mangiare
il pesciaccio crudo).
Un altro esempio può essere l'incidenza dell'epatocarcinoma nei Bantu (razza dell'Africa nera) e in
coloro che sono stati deportati negli USA come schiavi. Si è visto che i Bantu tendenzialmente
soffrono maggiormente di epatocarcinoma (probabilmente a causa della presenza maggiore di virus
epatitici) ma nei soggetti che sono stati deportati come schiavi ciò non si verifica più. Dobbiamo
ricordare che è necessario attendere qualche generazione per poter fare dei confronti, non è
possibile farlo con chi si è appena traferito.

C'è quindi una ciclicità nei processi epidemiologici. Questi sono:

1. studi descrittivi – raccolta e analisi dei dati che una volta raccolti permettono di formulare
un →
2. modello di ipotesi; è necessario quindi applicare degli →
3. studi analitici per saggiare ipotesi, e una volta compiuti →
4. l'analisi suggerisce ulteriori studi descrittivi.

Quando si parla di studi di correlazione dobbiamo ricordare che questi ci danno i dati medi
cumulativi senza però indagare l'esposizione e quindi sono scarsamente indicativi.
Possiamo poi indagare l'effetto dell'età in relazione ai numeri di k per età. Un dato ormai abbastanza
certo è che dai 60 anni aumenta esponenzialmente l'incidenza dei k. Questo è uno studio descrittivo.
I K pediatrici sono pochi e la loro incidenza è bassa. Questa curva si applica alla maggiorparte dei
k.
Ci sono altri k che hanno un andamento differente, come il neuroblastoma, la leucemia linfatica
acuta e l'osteosarcoma che seguono 3 andamenti differenti. Con l'avanzare dell'età gli ultimi due
seguono l'andamento della curva precedente (k generali). L'osteosarcoma ha un picco qualche anno
dopo la conformazione completa dell'osso.
Un'altra eccezione è il k della mammella in quanto a circa 50 anni si manifesta un flesso di
pendenza (così come nel k dell'utero) e poi sale con esponenzialità più bassa (ricordiamoci però
che nei giapponesi non cresce ma rimane una linea parallela all'asse x) a causa della menopausa
(ovvero a causa della mancanza di estrogeni) in quanto manca il fattore che causa la proliferazione
del k. In principio era solo un'ipotesi che poi è stata dimostrata con studi analitici.

Metodologie analitiche
Queste possono essere di due tipi:
• Studio caso controllo
• Studio di coorte

85
L'Odd ratio (rapporto dei pronostici) dobbiamo in realtà trattarlo come rischio relativo. (2x2 tabella)
→ è uno studio caso controllo proprio perchè presenta l'OR.

x2 = (numero osservato – numero atteso)/?

Rischio relativo = per esempio uno studio che indaga il rischio relativo è quello che va a vedere nei
fumatori la relazione dose-morte. Si è visto negli anni che chi usa il filtro muore meno in quanto
arriva meno catrame nei polmoni e co esso quindi meno idrocarburi e robaccia varia. Ovviamente
però se uno che fuma le sigarette light ne fuma il doppio di uno che fuma quelle senza filtro allora il
gioco non vale più e il rischio è lo stesso. Lo studio caso controllo ci dice che il filtro qualcosa fa
nel ridurre il rischio relativo e che una relazione dose-risposta nel k del polmone.
Un altro studio ha indagato l'esposizione a pesticidi negli agricoltori e ha studiato l'incidenza di tre
patologie importanti (osteosarcoma, linfoma di Hodking e linfomi non Hodking) in relazione all'uso
di pesticidi. Si studia la free malattie studiate. Dobbiamo considerare però che c'è anche un
intervallo di confidenza: questo deve serguire completamente lo stesso andamento dell'OR per poter
affermare che il risultato ottenuto sia statisticamente significativo (ovvero i due intervalli devono
essere entrambi o < o > di 1 per poter dare la significatività statistica).
Anche il concetto di tail (coda) è importante. Dobbiamo infatti esplicitare se abbiamo un modello a
doppia coda o a coda singola, ovvero se guardiamo solo verso l'alto (se sappiamo che la sostanza
che studiamo ha un effetto avverso alla salute) oppure verso il basso (se sappiamo che la sostanza
ha un effetto protettivo per la salute). Se ovviamente non sappiamo qual è l'effetto sulla salute
dobbiamo applicare il modello a doppia coda. In questo caso c'è un eccesso di rischio e la
probabilità p=0.004 sta a significare che si sbaglia meno di 4 volte su 1000 nel dire che c'è un
affetto avverso del pesticida sulla salute. Dobbiamo però osservare che c'è solo qualche conferma
nel linfoma non Hodking per dosi molto elevate di pesticida.

Uno studio retrospettivo è solitamente caso-controllo. Partendo dall'esposizione in persone sane

faccio uno studio longitudinale o prospettico. Gli studi trasversali (cross sectional o studio di
prevalenza) sono quantitativi ma non ci danno associazione perchè non possiamo dire cosa causa la
malattia ma ci dà solo quanti sono i malati. Per esempio ci dice quanti sono i malati di un
determinato tipo di k ma non ci dicono da quanto tempo, per quale motivo, a quale stadio, ecc.
Uno studio fatto bene può essere quello di coorte: selezioniamo i casi esposti ad un fattore (ce in
questo momento sono quindi sani) e dobbiamo poi confrontarli (almeno per 15 anni) con l'incidenza
e la mortalità di tutta la popolazione nazionale. Quindi non si fa il braccio di destra mentre si quello
di sinistra.

Le tossine
Ci sono tossine prodotte dalle alghe che sono classificate in DST (intossicazione con diarrea acuta
→ molluschi) acido cadarico che a lungo termine da k pelle. Questo viene filtrato dalle spugne e se
non si rispettano i termine di decantazione questo rimane nella sostanza. Dato che dà una diarrea
acuta il medico pensa che la diarrea sia causata da batteri ma l'acido cadarico non è sensibile
all'antibiotico e neanche al calore (quindi anche se cuoci i molluschi, ciccia).
L'altra classe di tossine sono quelle paralizzanti (dipende dalle concentrazioni) a breve termine. La
paleotissina prodotta dalle alghe dà irritazione cutanea. Ha una tossicità simile a quello della
tossina botulinica e si forma perchè certe alghe si sviluppano con alta temperaura dell'acqua. Un
paio di anni fa quando era caldo d'estate questa era particolarmente presente nell'acqua del mar
ligure.

Replicazione cellulare
Se analizziamo una curva di crescita batterica (tropismo) la teoria dice che se tutte le cellule si
duplicano e nessuna viene persa arriviamo al numero di 10 13 cellule incompatibile con la vita dopo
42 replicazioni. Non sono però verificate le due condizioni, ovvero che un certo numero di cellule

86
non si riproduce e che una seconda parte muore per apoptosi. Quando abbiamo 10 9 cellule,esse
misurano 1 cm3 ed è di dimensioni palpabili (questa è la fase fase resecabile), mentre con 108
cellule ancora non siamo in grado di individuarla con PET, TAC e quant'altro (fase preclinica)
mentre con 1012 cellule abbiamo 1 kg di cellule tumorali.
Il tempo di raddoppiamento delle cellule può essere variabile in quanto solo una percentuale di
cellule si duplica e una parte delle cellule viene persa per apoptosi. Queste due percentuali possono
essere proporzionali per un certo periodo di tempo (solitamente all'inizio c'è proporzionalità tra la
componente che duplica e quella che viene persa e per questo si rimane in una condizione stabile)
anche se con il tempo se un k deve evolvere verso la malignità evolverà e queste perentuali
perderanno di proporzionalità.
Se prendiamo un k embrionale abbiamo una perdita cellulare del 93% e c'è una sensibilità a 25-30
Gray, ovvero il k è sensibile alle radiazioni. Tanto più dobbiamo alzaci con i Gray, tanto più il k non
è sensibile. (+++ sensibile a radio e chemio). Il simbolo + indica che il k è sensibile a radiazioni
gamma.
Le curve di crescita sono influenzate da vari fattori.
Le cellule tumorali (leucemia linfoide cronica) hanno una velocità di ciclo cellulare, in relazione a
quelle del midollo osseo sane, minore ma c'è un'insensibilità ai fattori di stop che dà il problema del
k. Quindi il problema non è in realtà la velocità di replicazione ma l'insensibilità agli stimoli
limitanti esterni.

In scala semi-log abbiamo delle rette per la curva esponenziale: se abbiamo una linea poco verticale
il k non è aggressivo mentre se è pendente il k è rapido nell'accrescimento e quindi più aggressivo e
più invasivo.

Nelle leucemia mieloide con scala semilog e si fa diagnosi quando le cellule k sono il 0.5 – 5%. Se
dopo la diagnosi non faccio niente dopo un po' di tempo la curva piega perchè manca la
proporzionalità di trofismo (1012 cellule → morte perchè incompatibilità con la vita).

Può accadere che la terapia sia efficace e ci può essere una remissione parziale oppure si arriva alla
guarigione. La chemioterapia A non ha avuto un efficacia terapeutica perchè non ho un guadagno di
anni e il pz muore ugualmente nello stesso momento. La chemioterapia B invece è efficace in
quanto ha portato alla guarigione del paziente.

Chemioprevenzione
Le sostanze chemiopreventive devono avere alcune caratteristiche:
• meccanismo d'azione conosciuto;
• tossicità nulla o comunque bassa (a seconda delle dosi)
• elevata efficacia contro siti multipli (possibilmente)
• basso costo
• facilmente somministrabile per via orale (unica via di somministrazione)
• benaccetto

L'anticancerogenesi si può fare in vari momenti della cancerogenesi.

Distinguiamo in 3 tipologie differenti la chemioprevenzione:
• Chemioprevenzione primaria: sulla popolazione che sta bene asintomatica
• Chemioprevenzione secondaria: su persone che sono a rischio (esempio forti fumatori)
• Chemioprevenzione terziaria: coincide sulla terapia (esempio retinoidi nei k testa-collo)
La maggior parte degli studi sono di chemioprevenzione secondaria, quindi su soggetti a rischio.
Questi studi durano 5 anni almeno con osservazione di almeno altri 10 anni per la convalida
nell'uomo. Sono impiegati gruppi a maggiore rischio perchè così si riduce il numero di soggetti da
includere nello studio e ho bisogno di meno tempo (perchè sono soggetti a rischio). I risultati di
questo studio non posso però trasferirlo alla popolazione generale sana ma solo ad altre persone che
87
hanno l'esposizione agli stessi fattori di rischio del mio gruppo di studio.

Le molecole chemiopreventive sono un migliaio ed alcune hanno vari bersagli mentre altre solo un
tipo. Ora ne citiamo alcuni:
• Retinoide deve essere somministrato di continuo perchè se sospendo la somministrazione il
k va avanti;
• Finastride è utile per la prostata;
• Licopene (presente nel pomodoro o nella pizza) è utile contro il k di prostata e mammella
• Beta carotene è un precursore della vit A; in realtà non è un antoiossidante ed è uno scarso
precursore di vit.A; ogni 6 molecole di Beta carotene ho una molecola di vit.A e se amento
la dose diminuisce la quota di beta carotene che si trasforma in vit.A.
• Calcio (Ca2+) va bene per il colon, villi epiteliali e strato germinativo del colon.
• N-acetilcisteina (NAC, la cisteina ha la coppia di elettroni libera per catturare gli elettrofili)
è un farmaco (fluimucil) ed è un espettorante; in questo caso (nella chemioprevenzione) si
usa in dosi basse.
• S-allilcisteina (sostituendo il principio attivo di cipolla ed aglio con composti solforati che
danno l'odore all'aglio). Si prende il diallilsolforato e si prende la parte allilica e si coniuga
con la cisteina e si ha la S-allilcisteina che ha un effetto antiossidante maggiore. In un
vegetale finlandese c'è questo composto già in naturale (prima di essere scoperto era
sintetizzato dall'uomo);
• NSAID (antinfiammatori non steroidei) sono i profeni (ibuprofene) ed è chemiopreventiva
per il colon.
• Aspirina non fa nulla, né protezione né rischio.
• SERM (modulatori selettivi della risposta agli estrogeni): il tamoxifene è un proestrogeno
per l'endometrio e un antiestrogeno per la mammella.
Il the ha degli antiossidanti che sono le catechine: queste sono presenti nel the in qualunque tipo.
Le catechine sono 4, una di queste è più potente e si chiama epigallocatechingallato (EGCG).
Questa è presente anche nel vino rosso e bianco. In il vino rosso contiene il RES che è un
antifungino che produce la vite naturalmente e dà dei buoni risultati dell'infarto miocardico (20% in
meno) di chi beve un bicchiere di vino rosso a pasto. Nell'animale si protegge il k del colon mentre
nell'uomo non si ha corrispondenza, ancora.

Tamoxifen
È una molecola in uso dagli anni 60, ed è stata impiegata per molti scopi. Venne scoperto per puro
caso mentre si cercava di sintetizzare un nuovo farmaco anticoncezionale ma aveva scarsi risultati.
Alla fine è stata impiegata come un ormono-terapia nei k della mammella sensibile all'estradiolo,
per limitare la recidiva locale, o la metastasi; il tamoxifen riduce del 50% la probabilità di recidiva
se somministrata a 20mg/die (tenendo conto dell'atà della donna, in quanto in una donna giovane la
produzione di estrogeni è maggiore che non in una donna più anziana). Ovviamente è impiegato
solo per k maligni in quanto è un mutageno. All'inizio degli anni 90 furono fatti 3 studi con 15000
persone negli USA, in Italia (con Veronesi) e in GB. Provarono a somministrare 40mg/die e
20mg/die di farmaco ma notarono che vi era un aumento di k uterini. Ciò si verificava in quanto la
molecola non era stata sottoposta a screening prima di essere impiegata (cosa che non dovrebbe mai
accadere). Negli USA lo studio ha evidenziato una riduzione del 50% del k della mammella mentre
negli studi inglese e italiano non c'è stato questo (e nessun altro) effetto. È usato nell'ormonoterapia.
Ora si cerca un farmaco antiestrogeno che funzioni per due bersagli, ovvero che funzioni sia nelle
cellule mammarie che nelle cellule uterine. Ciò perchè il Tamoxifen non funziona sulle cellule della
mucosa uterina. C'è un farmaco in sperimentazione del quale è nota la sola sigla in quanto c'è un
brevetto → ICI182780 – faslotex (nome comune)

Identificazione e sviluppo di agenti chemiopreventivi

Vi sono differenti tipi di studio:
88
 • Studi in vitro
• Studi in vivo
• Studi preclinici: studi di tossicità per lavorare in dosi atossiche per l'uomo
• Prove cliniche (Fase 2): Dose più alta che dà il minimo effetto tossico

Se si parla di un farmaco:
Fase 3: trovare un farmaco più efficace del migliore disponibile.

In una provincia cinese è stato fatto uno studio su 30000 persone trattate con beta carotene,
riboflavina, vitE. Si è visto che la vit E ha ridotto l'incidenza del k dell'esofago e dello stomaco
(10% dopo 10 anni, 20% doopo 20 anni e 30% dopo 30 anni). Può essere che quelle persone fossero
carenti di loro di vit.E? Ai posteri l'ardua sententia.

89
 Prof. Grilli, venerdì 20 maggio 2011

Radioterapia
La radioterapia è una metodica di somministrazione di radiazioni ionizzanti.
Le dosi di erogazione in radioterapia sono distanziate nel tempo; è possibile arrivare alla
somministrazione di una quantità di radiazioni che può essere anche pari a 60 sievert (che se
somministrate in un'unica dose porterebbe il paziente a morte nel giro di tre giorni) mentre dato che
la somministrazione è dilatata in 3 mesi non si ha l'exitus.
L'obiettivo della radioterapia è di evitare di mandare in circolo le cellule tumorali; il campo di
applicazione del raggio stesso viene localizzato a priori e quindi i danni saranno dove le radiazioni
passano e non si avranno quindi danni sistemici. A differenza di questa la chemioterapia invece una
tipologia di somministrazione sistemica e i danni saranno quindi sistemici.
I fattori che influenzano l'efficacia della radioterapia sono:
• Fase del ciclo replicativo cellulare nella quale sono colpite le cellule (agisce maggiormente
nella fase S e in fase M) quindi si potrebbe ipotizzare l'efficacia di un farmaco che blocca le
cellule in queste due fasi combinato con la radioterapia;
• LET (Linear energy trasfert) della radiazione, ovvero l'energia che viene trasferita con la
radiazione stessa; questa è maggiore negli acceleratori lineari ed è possibile quindi in questi
casi ridurre la dose;
• tensione di ossigeno: è necessario avere una elevata tensione di ossigeno perchè in questo
modo maggiore sarà la produzione di ROS (radicali dell'ossigeno, a partire dal perossido di
ossigeno fino ad arrivare all'ossigeno singoletto) che propagano l'effetto della radioterapia
(in particolare dei raggi gamma). La radioterapia avrà la capacità di provocare necrosi
vascolare. Dove la pressione di ossigeno è bassa si può aumentare tale pressione tramite la
camera iperbarica per massimizzare l'effetto della radioterpia oncologica. Non è una
metodica popolare irradiare in camera iperbarica in quanto la camera iperbarica stessa è
paricolosa.
• Sostanze radiosensibilizzanti: sono state ricercate differenti sostanze ma nessuna ha dato
risultati positivi quindi niente.
• Radioprottettori: come i radiosensibilizzanti.
• Protrazione e frazionamento dell'irradiazione
• Ipertermia: in alcuni tipi di tumori (epitelio cutaneo per esempio) se aumenta la
temperatura c'è una risposta maggiore ma no è possibile l'applicazione per tutti i tipi di
tumore.
L'efficacia biologica relativa della radioterapia si misura con la sua capacità di uccidere le cellule
tumorali. In una scala semilogaritmica possiamo mettere a confronto l'efficacia delle low-LET (che
hanno una spalla) mentre le HIGH-LET definiscono una linea più retta; di conseguenza sarà
necessaria una dose minore di high-LET rispetto una low-LET in termini di energia per ottenere il
medesimo risultato. Queste due curve definiscono il fattore RBE che è un fattore medio di 2,45
volte dell'high let rispetto le low let, ovvero le dosi dell'high-let possono essere circa 2,45 volte
inferiori del low-let.
Il LET è l'energia rilasciata dalla radiazione per unità di lunghezza. Per quanto riguarda i tessuti
biologici si può parlare di dose equivalente e di dose efficace. Qui l'unità di misura è il Sievert (Sv).
La dose equivalente viene calcolata moltiplicando la dose assorbita per un fattore di peso che
dipende dal tipo di radiazione. La dose efficace rappresenta la sommatoria delle dosi equivalenti;
sommatoria moltiplicata per un fattore di ponderazione tissutale, ovvero per pesi relativi ai vari
organi e tessuti; questi ultimi pesi tengono conto della diversa sensibilità alle radiazioni degli organi
e dei tessuti irradiati.

Frazionamento della dose in radioterapia

Il frazionamento della dose è giustificata dalla regola delle “4R”:
• riparazione dei danni subletali o potenzialmente letali, più pronta ed efficace per le cellule
90
 sane, meno per quelle tumorali;
• ripopolazione da parte delle cellule normali che sopravvivono alla radiazione o provengono
dalla zona circostante;
• reclutamento in fase di maggiore sensibilità delle cellule neoplastiche già proliferanti o in
attività riproduttiva di quelle inizialmente a riposo;
• riossigenazione della componente ipossica meno radiosensibile del k per riavvicinamento
delle celle k ancora vitali al letto vascolare.

Indice terapeutico
È un rapporto definibile in vari modi: può essere definito come la dose di tolleranza tessuti
sani/dose letale per il tumore.
Ovviamente l'indice terapeutico dipende dalla radiosensibilità propria del k, dal volume e da altri
fattori.
I k che possono rispondere alla radioterapia in maniera efficace sono essenzialmente:
• neoplasia maligne del sistema emolinfopoietico (leucemie linfoidi mieloma)
• malattia di Hodgkin;
• semioma e disgermioma;
• cacinoma delle vie aeree digestive superiori
• sacroma di Ewing;
Sei linfociti scendono sotto i 2000/mm 3 di sangue si interrompono tutte le terapie in quanto c'è il
rischio di morte del soggetto per infezioni opportuniste.

In seguito alla radioterapia possono esserci differenti evoluzioni della clinica:

• Remissione completa (CR) della malattia: non corrisponde a guarigione ma è la regressione
completa di tutti i segni e sintomi di neoplasia, compresa la calcificazione di tutte le
metastasi osteolitiche per la durata minima di un mese;
• remissione parziale (PR): maggiore o uguale al 50% nella somma del prodotto dei due
diametri perpendicolari principali di tutte le lesioni misurabili compresa la ricalcificazione
parziale delle metastasi osteolitiche (no varuazioni osteoaddensanti) er la duata minima di
un mese;
• stazionarietà (NC): regressione inferiore al 50% nella somma del prodotto dei due diametri
perpendicolari principali di tutte le lesioni misurabili e nessuna variazione delle metastasi
ossee.
• Progressione (P): aumento maggiore o uguale al 25%. potra a resistenza alla terapia e le k
sono più facilmete riparabili. quando si parla di cellule tumorali più suscettibili alle
radiazioni ionizzanti delle normali ci sono delle eccezioni e una cellula k può essere più
veloce nella riparazione dei danni al DNA → cambio strategia terapeutica.

Chemioterapia classica
La chemioterapia classica comincia dal 1945 con delle mostarde azotate. In seguito sono stati
impiegati altri farmaci quali ciclofosfamide, adriamicina (fine anni 60), actinomicina D (tuttora in
uso una sua variante, la epirubicina che non ha l'ffetto tossico che aveva l'actinomicina D, ovvero
che l'1% dei soggetti andava incontro al decesso per infarto miocardico), epirubicina (metà anni 80,
è una micina modificata efficace come antitumorale ma ha perso l'effetto cardiotossico), molecole al
platino (costoso, cisplatino e sono alchelanti particolari). In totale sono 25 molecole ottenute in 50
anni, quindi sono poche. Uno studio USA di anni fa ha screenato molte molecole (circa 7000) per
capire se ve ne fossero alcune chemioterapiche ma non ha avuto nessun risultato positivo; inoltre ha
screenato degli studi dove si studiavano tumori che venivano trapiantati in topi e che quindi non
erano realistiche in quanto erano tumori estremamente maligni.

Classificazione dei chemioterapici:

91
 • Alchilanti (sono quelli che abbiamo visto nell'introduzione e che abbiamo chiamato
mostarde azotate e ciclofosfamide); questi alchilano tutto ciò che trovano (melecole,
proteine in fase S ed M (anche se in realtà non sono fase-specifici) e cedono gruppi alchilici
e bloccano la replicazione cellulare facendo una serie di addotti di base errate e il danno da
loro creato porta allo stop mitotico. Per esempio questi farmaci sono il citofosfamide, il cis-
platino; questi due hanno un meccanismo di azione differente che ne permette l'uso
combinato.
• Antimetaboliti (che possono bloccare la sintesi del DNA da lontano (blocco della
tetrafolico reduttasi) → per esempio uno di questi farmaci è il metotrexato (che porta al
blocco della sintesi di purine e pirimidine a meno che nella cellula tumorale non si sia
sviluppata una via di salvataggio metabolica alternativa – questa è una via di azione che
parte da lontano) oppure l'azione etabolica parte da vicino come nel caso del 5-fluoruracile
che porta al posto del metile porta al legame nelle timidilato sintetasi e impedisce il distacco
e mette fuori gioco vicino alla timidina) agiscono in fase S, sintesi del DNA, impedendo la
sintesi di DNA.
• Alchiloidi delle Vinca (soccia che nome!!) che sono per esempio la Vincristina, usata per
tumori cerebrali (astrocitomi, gliomi ecc) e sono molecole che hanno la capacità di passare
la barriera ematoencefalica e sono inibitori di fase M e inibiscono la formazione del fuso
mitotico. Anche le epipodofilotossine agiscono sul fuso: le tenioposide disturbano la
formazione del fusomentre etoposide direttamente (all'inizio questi farmaci erano impiegati
come antielminti ma avevano degli scarsi risultati);
• Antibiotici antitumorali: il più potente è l'adriomicina, la daunomicina (cardiotossico) e la
epiadriomicina (non cardiotossica).

Esisterebbe in realtà anche una quinta classe rappresentata dei farmaci per l'ormonoterapia. Ci
sono anche dei farmaci quali i glucocorticoidi che sono impiegati nella terapia delle leucemie c'è
una combinazione di farmaci chiamata NOPP (dove un P è il prednisone che viene impiegato per
ridurre gli effetti dell'infiammazione). Tra le molecole alchilanti il Ciclofosfamide è da ricordare.

Effetti tossici della chemioterapia

La chemioterapia ha degli effetti tossici immediati, precoci e tardivi.
• Immediati: istolesività (necrosi tissutale, flebite), sensibilizzazione (febbre eruzioni cutanee)
e effetti lesivi sul SNC (nausea vomito);
• Precoci: Emolinfopoiesi (leucopenia, linfopenia, anemia), mucose (mucositi), cute
(alopecia), SNP (tremori stipsi);
• Tardivi: ciclofosfamide induce k della vescica e in generale questi farmaci hanno un potere
cancerogeno più o meno importante

Classificaizone cinetica degli agenti antiproliferativi

Classe II fase specifici:
Classe III ciclo-specifici (antibiotici) → fluoruracile

Fluorouracile: agisce in fase S ma anche in fase G1. In dose normale prevale la fase S mentre a dose
maggiore (che richiede anche un supporto al pz perchè non muoia come la somministrazione di
emazie concentrate) entra in gioco anche in G1.
Viene mostrata ora una tabella con numero totale di pazienti richiesti per evidenziare o escludere un
miglioramento della terapia. p1 e p2 sono le percentuali di efficacia dei farmaci è in numeri sono
molto variabili a seconda dell'effetto della terapia standard e quella innovativa.
La chemioterapia è nata inizialmente come monochemioterpia ma poi è cresciuta come
combinazioni di più farmaci diventando una polichemioterapia. I vantaggi sono:
• impedire o ritardare i fenomeni di resistenza cellulare, ovvero la progressione maligna della
neoplasia;

92
 • Aumentare la distruzione di cellule neoplastiche.
Quali classi di farmaci si combina? Solitamente si utilizzano farmaci appartenenti a quattro
differenti classi che agiscono quindi con meccanismi differenti (non avrebbe senso usare 4 farmaci
della stessa classe poiché hanno la medesima modalità di funzione).
Il k nasce come monoclonale ma evolve ad una eterogenità.
La resistenza può essere ad una terapia (singolo farmaco) per difettoso trasporto del farmaco
all'interno del k, un difettoso metabolismo del farmaco, inattivazione del farmaco da parte della
cellula tumorale che diventa resistente, utilizzo di vie di salvataggio da parte della cellula.
Un esempio di inefficacia della terapia è quando è presente la gliporoteina p170 che ha come
funzione quella di espellere veleni al di fuori della cellula stessa ma in realtà espelle anche una gran
quantità di chemioterapici quali gli AB antitumorali per esempio ma non rigetta un alchilante. Ciò
significa che sé è espressa questa glicoproteina (ed è espressa se la cellula esprime MDR1) si deve
pensare ad una strategia terapeutica non basata su quella tipologia di farmaci.

Ormonoterapia
Un esempio l'abbiamo già fatto quando abbiamo parlato del Tamoxifen. Anche qui la storia è lunga.
Inizialmente sono state asportate le ovaie per diminuire gli estrogeni nel k mammario. Poi è stata
intrapresa la terapia additiva di androgeni che causava irsutismo nelle donne. In seguito è stata
effettuata una orchiectomia nel k prostatico (un farmaco impiegato in questo senso è il finasteride
che blocca 5 alfa reduttasi, chemoterapica in fieri e anche clinica), nel 1941 sono stati somministrati
estrogeni nel k prostatico (che causavano quidi femminilizzazione del maschio). Nel 1945 è stata
effettuata una surrenectomia nel k prostatico per rimozione dei precursori degli estrogeni. In seguito
sono stati somministrati pregestinici nel k uterino. Negli anno 60 alti dose progestinici per effetto
antiestrogeno, poi antiestrogeni veri nel 1964, nel 1969 surrenectomia chimica, nel 1971 terapia
additiva con progestinico (antiandrogeno) nel k prostatico. Come vediamo si tratta sempre di due
modalità, o ormonale additiva o ormonale riduttiva.
Nessuna terapia ormonale può però dare risultati terapeutici stabili e portare a guarigione un
soggetto, viene impiegata per un controllo del k.

Tipi di endocrinoterapia (vedi fotocopie):

• Ablativa
• Additiva
• Competitiva
• Inibente

Il k della tiroide beneficia di approcci con terapia ormonale in entrambi i sessi. Si usano
radioisotopi di iodio che viene captato principalmente nella tiroide e in questo organo si esplica
l'effetto ionizzante dello I131. Un'altra modalità è la somministrazione di T3 o T4 per il feed back
negativo sull'asse ipotalamo-ipofasario-ghiandola periferica.

Tumore della mammella

La strategia terapeutica nel tumore della mammella segue un processo a blocchi a seconda,
innanzitutto, se la donna sia in età premenopausale o postmenopausale:
• Premenopausale: ci sono due strategie a seconda che il recettore per gli estrogeni sia:
• Positivo: viene fatta l'ovarectomia per ridurre la quota di estrogeno. Poi si usa
Tamoxifen, poi si in seconda linea si possono usare i progestinici o
l'aminoglutetimide (il farmaco per la surrenectomia chimica). Se progredisce si
intraprende la via seguente, ovvero viene trattato come se non fossero presenti i
recettori per gli estrogeni;
• Negativo: Dato che non ci sono gli estrogeni si usa la polichemioterapia (poi farmaci
non cross resistenti e poi farmaci sperimentali se il k dovesse progredire);
• Postmenopausale: come nel caso precedente, in relazione alla presenza o meno dei recettori
93
 degli estrogeni:
• Recettore estrogeni positivo: Tamoxifen, poi proestinici o l'aminoglutetimide
(surrenectomia chimica). Se progredisce si intraprende la via dei recettori negativi
degli estrogeni;
• Negativo: Dato che non ci sono gli estrogeni si usa la polichemioterapia (poi farmaci
non cross resistenti e poi farmaci sperimentali).

Quindi in sostanza lo stato premenopausale comporta le scelta della chirurgia ed è quindi il

momento in cui viene diagnosticato il k che fa la differenza.
Se andiamo a fare due conti sappiamo che l'ormonoterapia è efficace nel 75-80% nelle pz che
presentano il recettore per gli estrogeni mentre solo nel 10% nelle pz che non lo presentano.
Nel 7-10% dei casi la resistenza all'ormonoterapia può essere correlato allo presenza di ERB2 per
l'epidermical grow factor. In questi casi si impiega un anticorpo specifico.

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 Lezione di giovedì 26 maggio 2011 – Prof. Grilli, Prof.ssa Nanni

Terapia Genica
La terapia genica è una delle possibilità terapeutiche in medicina. Questa terapia ha delle
caratteristiche peculiari: è una terapia locale (questo può essere anche un limite per la terapia stessa
in quei casi nei quali vi sono metastasi in quanto viene riconosciuto come target solo un k tessuto-
specifico) ma può essere anche sistemica (in questo caso funziona peggio). Inoltre è possibile
applicare la terapia genica in due differenti modalità, ovvero la modalità ablativa attraverso la
quale possiamo inserire una copia sana del genoma al posto di quella non funzionante; questa
metodica funziona peggio della modalità sostitutiva attraverso la quale è possibile sostituire una
parte del genoma.
I sistemi di trasduzione virale ad alta efficienza (così come vengono chiamati in ambito biologico)
in realtà in ambito clinico sono poco efficienti. Abbiamo a disposizione dei farmaci che possono
uccidere il 99,9% delle cellule tumorali ma questa percentuale attualmente non è neanche
lontanamente raggiungibile con la terapia genica in generale. Questo si verifica in quanto poche
cellule in vivo (circa 50%) riescono ad “assumere” la modifica genetica.
Ora cerchiamo di capire un po' meglio come funziona la terapia genica. Uno dei tipi virali più usati
sono i retrovirus (virus che inseriscono il loro genoma nel genoma della cellula ospite – in
particolare viene impiegato il virus MMV, virus della leucemia di Moroni - sui quali possiamo
caricare dei geni della lunghezza massima di 10 Kb – lunghezza insufficiente per malattie
mendeliane. Questi geni si integrano nel genoma umano). Sono stati molto usati anche gli
adenovirus (per esempio rinovirus, virus del raffreddore) che non si integrano e quindi dobbiamo
pensare a somministrazioni multiple. Somministrare più volte l'adenovirus vuol dire però indurre
una risposta immunitaria nel soggetto.
Oltre ai retrovirus tradizionali sono impiegati virus basati sull'HIV (questo è un caso
particolarmente interessante di trasformazione di un agente patogeno in un agente terapeutico).
La terapia genica viene impiegata, secondo le sperimentazioni cliniche approvate, prevalentemente
nei trial clinici contro il cancro (70% - anche se la terapia genica nasce per le malattie mendeliane –
questo perchè i pazienti con cancro sono numericamente maggiori di quelli con malattie mendeliane
e i fondi disponibili per questa patologia sono maggiori), il 10% nelle malattie mendeliane (perchè
sono patologie rare e molto eterogenee) il 7% nelle infezioni e il 13% in altre patologie.

Terapia genica nelle malattie mendeliane

Le patologie in cui la terapia genica ha funzionato bene sono le SCID (“deficienze combinate gravi
dei linfociti B e T”). Di questa malattia esistono principalmente due forme: la prima è chiamata
ADA-SCID ed è causata da un'alterazione di una adenosina-daeminasi la cui alterazione comporta
una modificazione della biosintesi dei nucleotidi dei linfociti B e T; questi vengono prodotti ma si
intossicano a causa dell'accumulo del precursore dei nucleotidi. La secondo forma è più frequente
ed è causata da un'alterazione sul cromosoma X sulla sub-unità γ-common (controllare il nome
della sub-unità) e per questa motivazione viene chiamata X-SCID. Essa comporta un'alterazione
dell'IL2 (che in questo caso funziona come un oncogene).
Di fatto l'alterazione dei linfociti B e T in questi soggetti ne comporta l'immunodeficienza. Erano
bambini che avevano una gravidanza normale ma che una volta nati dovevano essere tenuti al riparo
da tutti gli antigeni e per questo erano costretti a vivere all'interno di bolle di plastica con aria
filtrata.
Già negli anni '70 si scopre che questo enzima (adenosina deaminasi) più essere somministrato
come farmaco (anche se con bassa efficienza) nell'ADA-SCID → in questo caso assume la funzione
di terapia convenzionale (termine con il quale individuiamo tutti i tipi di terapia non genica). Per
la X-SCID attualmente non c'è terapia farmacologica.
Per quanto riguarda la terapia genica ora illustreremo in breve come viene eseguita: viene prelevato
il Midollo Osseo del bambino, vengono isolate cellule staminali emopoietiche e trasdotte con un
vettore retrovirale che ha la copia corretta del gene, si verifica poi che sia stato accettato dalla

95
cellula la copia corretta del gene e la cellula viene poi reimpiantata nel midollo. Nei bambini con
ADA-SCID si assiste che a seguito della somministrazione della terapia genica i linfociti T e B
aumentano la propria concentrazione ematica e tornano verso la normalità. I bambini hanno una
quindi una risposta immunitaria che prima della somministrazione della terapia genica non era
presente.
Anche nella X-SCID si ha una risposta della terapia genica. Il problema in questo caso è legato alla
mutagenesi inserzionale (che si verifica quando un retrovirus si inserisce vicino ad un oncogene e
lo attiva – uno dei casi più frequenti è quello che coinvolge HTLV1) e questi bambini hanno
sviluppato una leucemia. Nel trial sull'ADA-SCID non si è verificata la mutagenesi inserzionale.
La ricerca ad oggi si cerca di allontanare dai retrovirus per non avere il problema della mutagenesi
inserzionale, puntando maggiormente sugli adenovirus i quali non hanno questo problema ma, come
abbiamo visto, ne hanno altri (immunità).
Ovviamente la terapia genica ha una sua tossicità e anche degli effetti indesiderati. Questi sono:
• Effetti di mutagensei inserzionale
• Tossicità epatica (soprattutto con gli adenovirus)
• Infiammazione
• Risposta immunitaria contro gli adenovirus che usiamo come vettori

Terapia genica nella terapia oncologica

Possiamo dividere il 70% (rappresentato dalla terapia oncologica stessa) a seconda del tipo di
approccio:
• 46% cercare di fare dei vaccini per stimolare la risposta vs tumori;
• 15% approccio antiproliferativo (è l'approccio più lineare) → si cerca quali sono le
mutazioni nei tumori (es p53) e si cerca di sostituire la forma inattiva con quella attiva.
• 7% approccio suicida: è basata su farmaci (terapia genica e interazione con farmaci) basata
sull'inserimento nella cellula k di un gene che definisce sensibilità ad un farmaco verso il
quale l'organismo non è sensibile. Un esempio è il ganciclovir (farmaco antiretrovirale usato
vs HIV) che deve essere attivato per essere funzionante (viene somministrato quindi in
forma inattiva); il corpo umano non ha gli enzimi per attivarlo ma l'HIV possiede gli enzimi
giusti per attivarlo. Per una cellula tumorale questo farmaco è inutile ma se prendo l'enzima
che attiva il Ganciclovir e lo inserisco nella cellula k questa si suicida (suicidio metabolico)
con la successiva somministrazione di Ganciclovir in quanto diventa sensibile al farmaco.
• Chemioprotezione: rappresenta il 2% del totale ed ha l'obiettivo di proteggere le cellule
normali. Gli antiblastici che sono alla base della terapia convenzionale uccidono tutte le
cellule in rapida differenziazione. Qui si pensa di inserire nelle cellule normali un gene di
resistenza ai farmaci. Se ho un farmaco tossico per le cellule emopoietiche posso mettere
questo gene e usare il farmaco a dosaggi superiori e non avere quell'effetto collaterale.

I risultati della terapia genica non sono stati particolarmente interessanti in nessuno di questi
approcci.
Nei pazienti con NSCLC (carcinoma del polmone con alterazione di p53) si è cercato di inserire un
vettore virale che trasduceva una copia normale di p53. La risposta veniva classificata come:
• completa: 2/9
• parziale: 1/9
• stabile: 2/9
• progressione: 2/9
• altro: 2/9
Per questi pazienti non c'era nessuna terapia eppure in 2/9 ha curato la massa tumorale. Purtroppo
tutti i pazienti (9/9) sono morti per metastasi tumorale non polmonare → uno dei limiti di questa
terapia è il fatto che la terapia genica è locale e non sistemica.

96
Nei k frontali cerebrali (in un particolare tipo) ci sono metastasi solo intracraniche e sono tumori
particolarmente aggressivi (5% dei pz sopravvive) e difficilmente operabili in quanto non tutte le
sedi sono resecabili. È stato impiantato un retrovirus (per rendere il k sensibile ad un farmaco) dopo
una resezione parziale del k che ha dato sensibilità alla massa k ma non in maniera globale in
quanto nei punti nei quali non si è fatta la somministrazione il k è cresciuto in quanto non sensibile
al farmaco. Questo è un esempio di terapia locale.
Ora si sta studiando un virus oncolitico; cerchiamo di fabbricare un virus che si replica
selettivamente uccidendo le cellule tumorali. Vi sono molte strategie: per esempio modificare i
recettori virali per cui i virus infettino selettivamente il k del pz. In questo modo si potrebbe fare la
terapia sistemica del k.
L'altro approccio usato per la diffusione sistemica è stato l'approccio immunologico. Si cerca di
inserire geni nel sistema immunitario per fare in sostanza dei vaccini.
La terapia genica quindi da molti problemi che si cerca di superare. Per le malattie mendeliane c'è
stato successo con le cellule staminali emopoietiche, parzialmente per la fibrosi cistica perchè è
difficile avere espressione fissa di geni. I problemi sono spesso gravi (sviluppo di neoplasie
iatrogene).
L'approccio immunologico è il migliore per i k.

Sindromi Paraneoplastiche
Rientrano nelle interazioni sistemiche.
Con “sindromi paraneoplastiche” indichiamo l'insieme di sintomi che si osservano nel 10-15% dei
pazienti con tumore e che non possono spiegarsi direttamente con la sola crescita locale o
metastatica del tumore. A volte le sindromi paraneoplastiche sono precoci rispetto la diagnosi di k.
Possono essere sindromi che si manifestano a vari livelli con sindromi:
• endocrinologiche
• neurologiche
• ematologiche/immunitarie
• renali
• cutanee
• gastrointestinali

Sono dovute a due cause principali:

• sostanze prodotte dalle cellule tumorali (es ormoni, fattori di crescita o melecole
ectopiche – ovvero molecole che quella cellula solitamente non produce)
• reazioni immunitarie verso molecole del tumore condivise da altre cellule normali (il
sistema immunitario reagisce contro gli antigeni)

Sindromi endocrine
Si può manifestare con secrezione ectopica di ACTH, ormone adrenocorticotropo nel carcinoma
polmonare a piccole cellule e non. Può esserci anche secrezione di PTH ormone paratiroideo nel ca
polmone a cellule squamose e cancro della vescica.

Sindromi ematologiche
Queste sindromi possono essere:
• Anemia causata da risposta immune verso antigeni comuni al tumore e agli eritrociti.
(causata anche da perdita di sangue, minore introduzione di molecole essenziali, ridotta
eritropoietina)
• Eritrocitosi dovuta a eritropoietina secreta dal tumore o in risposta ad altre molecole secrete
dal tumore che aumentano attività di eritropoietina. Presente in alcuni pazienti affetti da ca
renale, epatocarcinoma, emangioblastoma: eritropoietina secreta dalle cellule del tumore
• Leucocitosi causate da produzione di CSF e VEGF da parte delle cellule tumorali. Attività

97
 di cellule di derivazione mieloide soppressorie della risposta immunitaria (MDSC)
Possono esserci anche dei disordini coagulativi e tromboembolici in pazienti con tumore al
polmone, pancreas, stomaco, colon. In questi pazienti sono presenti nel siero alti livelli di fattori
della coagulazione.
Il tumore a volte viene indicato come ferita che non guarisce. Nella ferita infatti c'è un danno
vascolare → ipossia→coagulazione e angiogenesi → guarigione
Nel tumore invece si ha inizalmente vascolarizzazione insufficiente → ipossia cronica→ fattori
procoagulanti (Tissue Factor, Inibitore dell’attivatore del plasminogeno – PAI-I) e fattori
proangiogenici (VEGF, angiogenina, angiopoietina 2). Nelle zone con maggiore ipossia vi possono
essere maggiori mutazioni.
Inoltre sono prodotti fattori procoagulanti, proangiogenici prodotti da cellule tumorali, da piastrine,
monociti, cellule muscolari lisce, cellule endoteliali.
Un altro aspetto di interazione sistematica è quello della cachessia. Questo è caratterizzato da
perdita di peso, perdita delle masse muscolari (che è l'aspetto più importante) e deplezione delle
riserve lipidiche (oltre ad anoressia astenia). La perdita delle masse muscolari è l'aspetto più
importante perchè è quello che alla fine causa la morte del paziente (che avviene per insufficienza
respiratoria).
La sindrome è presente in circa metà dei pazienti con tumore (è presente anche in altre patologie:
infezioni, AIDS....) ed è più frequente in pazienti con tumore al polmone (60%) e tratto
gastrointestinale (80%). Questa sindrome è correlata con una minore sopravvivenza.
Cosa determina la cachessia?
Vi sono due tipi di mediatori:
1. citochine prodotte da cellule del tumore o da cellule dell’ospite quali TNFα, IL-6, IL-1,
IFN-γ;
2. prodotti catabolici prodotti dal tumore come LMF (lipid-mobilizing factor) e PIF
(proteolysis-inducing factor). Vi è quindi un aumento del catabolismo lipidico ed un
aumento del catabolismo proteico.
Questi mediatori possono essere rilevati nel siero o nelle urine dei pazienti.
La supplementazione alimentare e la manipolazione farmacologica dell’appetito non ripristinano le
masse muscolari. È necessario quindi l'inibizione di citochine e la somministrazione di inibitori di
induttori di catabolismo.

Modelli per lo studio di geni implicati nei tumori

È importante conoscerli perchè dobbiamo sapere ce ci sono degli aspetti in comune tra l'animale e
l'uomo. Le informazioni sulla funzione dei geni implicati nelle neoplasie possono venire da studi su:
• topi transgenici nei quali sono stati inseriti oncogèni;
• topi knock out nei quali sono stati inattivati geni oncosoppressori (in questi animali si è visto
cosa succedeva se veniva inattivato un oncosoppressore);
• in modelli animali di cancerogenesi virale
• Lieviti
• Caenorhabditis elegans
• Drosophila melanogaster

I modelli di tumori in roditori (ratti ma soprattutto topi) sono quelli più studiati per studi di
eziologia, prevenzione e terapia. Questo perchè i roditori sono più piccoli e conosciamo anche
molto bene l'aspetto genetico e inoltre perchè ci sono incroci tra sorella e fratello multipli che hanno
determinato l'uguaglianza genetica di esemplari della stessa progenie. Questo è un grosso
vantaggio. Quando andiamo a fare il confronto con l'uomo dobbiamo tenere presente che gli
individui umani non hanno lo stesso corredo; per questo motivo lo studio deve essere fatto su più
ceppi di topi. I modelli sono stati impiegati per lo studio di induzione di tumori (induzione chimica,
induzione fisica, induzione virale), per i tumori trapiantabili e linee cellulari non umane e tumori
trapiantabili e linee cellulari umane.

98
I modelli genetici sono utili per valutare apporto componenti genetiche e non per valutare:
1. varianti naturali: topi o ratti ad alta o bassa incidenza spontanea di tumori
2. acquisizione di funzione: materiale genico introdotto in topi o ratti con animali transgenici o
trasduzione in vivo;
3. perdita di funzione: intervento che danneggia il normale patrimonio genico con knock-out
genico o mutagenesi di cellule germinali.

Vantaggi e svantaggi dei topi transgenici

Vantaggi
• vi sono tumori poco immunogenici che insorgono in topi immunocompetenti
• tumori spontanei
• molti tumori sono istologicamente simili a quelli umani
• si può seguire tutta la storia naturale
• processo metastatico simile a quello umano
• ampio range di tumori
• i tumori sono biologicamente diversi
• i topi possono essere usati per studi di terapia, chemioprevenzione e screening di
cancerogeni

Svantaggi
− utilizzo di animali
− ottenimento laborioso (devono essere eterozigoti)
− i tumori possono svilupparsi troppo precocemente o tardivamente per sperimentazioni
− sono necessari ceppi inbred per immunoterapia.
− Tutti gli aspetti tumore-ospite non può essere ottenuto in vitro così come il processo di
metastatizzazione → per queste serve la sperimentazione animale.

Topi transgenici per l’oncogene HER-2/neu

È uno delle tipologie di topi più studiati. Il gene neu è amplificato o over-espresso in una parte dei
carcinomi della mammella umani e la sua espressione è correlata con cattiva prognosi.
Il proto-oncogene neu (HER-2 nell'uomo) codifica una proteina transmembrana che fa parte della
famiglia dei recettori di Epidermal Growth Factor. È lo sesso che nell'uomo è attivato per
amplificazione genica.
Topi transgenici per neu: il transgene è sotto promotore del MMTV che fa esprimere il transgene
preferenzialmente nei tessuti nei quali MMTV viene espresso in grandi quantità, cioè mammelle e
ghiandole salivari (regolazione ormonale)
Dati sperimentali di due linee di topi transgenici
1) MMTV/ proto-oncogene neu: in questo caso l'insorgenza è più tardiva
2) MMTV/ neu attivato (mutato): in questo caso c'è un'insorgenza precoce.
Lo stesso oncogene attivato in modalità differenti può portare ad espressioni cliniche differenti e
questi studi animali hanno evidenziato ciò.

→ la prof chiede spesso i meccanismi di attivazione degli oncogeni all'esame

La grande importanza del background genico è messa in evidenza da incroci di un determinato

ceppo transgenico con altri ceppi: possono venire modificate drasticamente incidenza e
caratteristiche tumorali.
Transgene neu sotto promotore di MMTV induce tumore mammario nel:
• 100% dei topi FVB con latenza mediana di 44 ws, ovvero in tutti i topi e molto rapidamente;
• 16% dei topi BALB/c con latenza mediana di 113 settimane cioè lo stesso gene in questo
ceppo mi induce raramente il k.

99
Tumori del colon
Mutazioni nel gene APC (adenomatous polyposis coli) sono responsabili nell’uomo della FAP
(familial polyposis syndrome) e rappresentano un evento precoce nello sviluppo del carcinoma
sporadico del colon (come è stato illustrato precedentemente).
Numerosi modelli murini sono basati sull’alterazione di questo gene per riprodurre la patologia
umana.

Min = Multiple intestinal neoplasia

Topi APCMin si sono originati per mutazione casuale indotta da etilnitrosourea e successiva
selezione.
La mutazione al codone 850 del gene APC determina un fenotipo che assomiglia alla FAP umana.
La mutazione in omozigosi è letale in utero, in eterozigosi determina lo sviluppo di numerosi
(diverse decine) adenomi (polipi) nel piccolo intestino.
La mutazione determina difetti mitotici nelle cellule delle cripte del piccolo intestino. C'è anche un
accumulo di beta catenina.

Topi con p53

• Topi p53 -/- sviluppano linfomi e sarcomi a 3 mesi
• Topi p53 +/- sviluppano tumori a oltre 12 mesi
• Topi p53 +/- e transgenici per neu sviluppano tumori mammari e tumori salivari nella
femmina e tumori salivari e rabdomiosarcomi pelvici nel maschio a 3-4 mesi
Combinazione di lesioni (rabdomiosarcomi) per alta penetranza solo in associazione con un altro
istotipo embrionale
HGF + INK4/ARF -/- → Rabdomiosarcoma in tronco e arti
HER-2/neu + p53-/- → Rabdomiosarcoma pelvico
Fos -/- + p53-/- → Rabdomiosarcoma orbite
Kras + p53-/- → Rabdomiosarcoma Arti inferiori

Istotipo alveolare (è un tipo particolare dato da trsmutazione – essenziale il discorso di

combinazione)
Pax3FKHR + INK4/ARF -/-
Pax3FKHR + p53-/-

100
 Appendice Prof. Grilli
Classificazione degli studi clinici

1) Classificazione generale:
• Osservazionali
• Analitici od eziologici: servono ad analizzare associazioni tra fattori di rischio
(determinanti) o fattori protettivi e la patologia in studio. Si suddividono in:
• Studi di coorte
• prospettico
• retrospettivo
• Studi caso-controllo
• Studi caso controllo nidificati
• Studi trasversali (studi di prevalenza)
• Analitici
• Descrittivi
• Studi di correlazione geografica o temporale
• Descrittivi
• Serie di casi (descrizione di uno o più casi di una determinata malattia,
effettuata in particolare per le sue peculiarità o per la novità)
• Studi ecologici (descrizione delle caratteristiche di tutta la popolazione
rispetto ad una determinata qualità o malattia, a partire dai registri di
popolazione esistenti)
• Distribuzione spaziale
• Andamento temporale
• Sperimentali (studi di intervento che valutano gli effetti di un nuovo trattamento su di un
gruppo di soggetti o in una comunità)
• Trial sul campo
• Trial di interventi di comunità
• Trial controllati randomizzati (sperimentazioni cliniche)
2) A seconda del fattore "tempo":
• Studio longitudinale: è uno studio che si realizza con dati ottenuti nel susseguirsi del tempo
e può essere retrospettivo o prospettico
• Studio longitudinale retrospettivo: è uno studio longitudinale effettuato con dati del
passato.
• Studio longitudinale prospettico: è uno studio longitudinale all'inizio del quale si
raccolgono i dati riferiti al momento corrente, per poi seguirne l'evoluzione nel
tempo.
• Studio trasversale: è uno studio che si realizza con dati ottenuti in un momento preciso
(letteralmente si "taglia trasversalmente").
3) A seconda del tipo di tipo di risultato che si ottiene con lo studio:
• studio osservazionale (in cui il ricercatore non interviene, ma si limita ad osservare
la realtà)
• Studio analitico. A seconda che il ricercatore intervenga o meno, si suddividono
come segue:
• studi con gruppo di paragone
• studio di coorte
• studio caso-controllo
• studi di intervento. L'investigatore inserisce variabili nello studio
intervenendo nello sviluppo dello stesso.
101
Il National Institutes of Health (NIH) suddivide i trial in 5 differenti tipi:
• Trial Preventivi: hanno lo scopo di individuare il miglior modo per prevenire la malattia in
persone che non hanno mai avuto questa malattia (prevenzione primaria). Questo approccio
può includere farmaci, vaccini, vitamine, minerali o cambiamenti dello stile di vita.
• Trial di Screening: studiano le metodiche di prevenzione secondaria (diagnosi precoce di
una malattia in soggetti a rischio che non manifestano sintomi).
• Trial Diagnostici: condotti per trovare migliori test o procedure per diagnosticare una
particolare malattia o condizione.
• Trial Terapeutici: testano trattamenti sperimentali, nuove combinazioni di farmaci e nuovi
approcci di terapia chirurgica o radiante.
• Trial sulla Qualità della Vita (o Supportive Care Trials): esplorano il modo di migliorare il
confort e la qualità della vita per individui con una malattia cronica.
• Trial ad uso Compassionevole: forniscono terapie sperimentali, prima che abbiano
raggiunto l'approvazione finale dell' FDA. Sono diretti a pazienti per i quali altre terapie
sono risultate fallimentari. Normalmente deve essere concessa l'approvazione dell'FDA, caso
per caso.

Studi osservazionali
A) Uno studio osservazionale, in inglese observational study, tende a dimostrare i possibili effetti
di vari fattori (di rischio o protettivi) su un gruppo di persone, osservando gli eventi che si
verificano senza alcun intervento da parte dello sperimentatore. Ciò è in contrasto con gli studi
sperimentali, nei quali lo sperimentatore introduce nello studio un nuovo fattore (ad esempio un
farmaco) per studiarne l'effetto sulla popolazione osservata. In uno studio osservazionale i
ricercatori osservano i soggetti ed effettuano misurazioni, e non intervengono attivamente
nell'esperimento. Questo è anche chiamato, in inglese, natural experiment. Un esempio potrebbe
essere il Nurses' Health Study. Uno studio osservazionale longitudinale è uno studio di ricerca
osservazionale che effettua ripetute osservazioni dello stesso oggetto in un lungo periodo di tempo,
solitamente decenni. In medicina è usato per scoprire fattori di rischio per particolari malattie. Fra
gli studi osservazionali longitudinali si distinguono:
1. Studi di coorte
2. Studi caso-controllo

Studio di coorte
Uno studio di coorte, o cohort study o panel study, studia una coorte, ovvero un gruppo che
sperimenta un dato evento, in un periodo di tempo selezionato, e lo studia ad intervalli di tempo.
Permette quindi di rilevare i possibili fattori di rischio di una popolazione, ed il suo follow-up.
Esso consiste nel confronto della diversa incidenza di un determinato fenomeno (ad esempio una
malattia professionale), fra il gruppo esposto al fattore di rischio, ed il gruppo non esposto.
È considerato uno dei metodi osservazionali più utili ed idonei, assieme a quelli "caso-controllo",
per indagare un rapporto causa/effetto.
Una coorte è un gruppo di persone che mostrano una caratteristica comune od esperienza in un
periodo di tempo (ad esempio anno di nascita, interruzione della scuola, perdita del lavoro, essere
esposti ad un farmaco o vaccino...). Il gruppo di comparazione potrebbe essere la popolazione
generale dal quale il gruppo di coorte è "ritagliato", oppure potrebbe essere un'altra coorte di
persone che abbiano solo una piccola o nessuna esposizione alla sostanza in investigazione. Quindi
una popolazione a rischio per la patologia (o evento) è seguita nel tempo per osservare l'eventuale

102
insorgenza della patologia (o evento). Per ogni paziente è nota l'informazione sullo stato di
esposizione in tutto il periodo di follow up. Un paziente potrebbe essere stato esposto ad un farmaco
in un determinato momento durante il follow up, ma non in un altro istante di tempo. Dal momento
che è nota l'esposizione della popolazione durante il follow up, è possibile calcolare il tasso
d'incidenza. In molti studi di coorte che coinvolgono l'esposizione al farmaco, coorti d'interesse a
confronto sono selezionate sulla base dell'uso del farmaco e seguite nel tempo. Gli studi di coorte
sono utili quando c'è la necessità di conoscere il tasso d'incidenza di eventi avversi.
In pratica si procede così:
Incidenza malattia = nuovi casi di malattia nella popolazione esposta/( nuovi casi di malattia nella
popolazione esposta+popolazione a rischio nel periodo)

Comunque, può essere difficile reclutare un numero sufficiente di pazienti che sono stati esposti ad
un farmaco d'interesse (come un farmaco orfano) o studiare degli eventi molto rari. Come negli
studi caso controllo, negli studi di coorte l'identificazione dei pazienti può provenire da grossi
database automatizzati o dai dati raccolti manualmente e specificatamente per lo studio. Inoltre, gli
studi di coorte possono essere usati per esaminare i problemi della sicurezza in popolazioni speciali
(gli anziani, i bambini, pazienti con condizioni co-morbose, donne incinte) attraverso un sopra
campionamento di questi pazienti o stratificando la coorte se esiste un numero sufficiente di
pazienti.
Rappresenta lo studio analitico più potente per valutare i fattori di rischio.
Lo studio di coorte ha lo svantaggio di essere di lunga durata, difficile, costoso. Non è adatto per le
malattie rare.

Studio di coorte prospettico

Si effettua seguendo nel tempo una popolazione selezionata (coorte), per osservare l'incidenza di un
particolare evento. Il più famoso studio per coorte prospettico è il Framingham study.
studio di coorte retrospettivo
Sono studi condotti sulla base di documentazione raccolta in passato e, quindi, già esistente prima
della decisione di iniziare lo studio; si tratta quindi di una ricerca d'archivio. In pratica si tratta di
osservazioni su persone delle quali è a conoscenza l’esposizione nel passato, seguite per un certo
tempo osservando il numero di eventi.

Studio caso-controllo
Uno Studio caso-controllo è utilizzato per identificare i fattori che possono contribuire ad una
condizione medica.
Si confronta un gruppo di soggetti con una certa malattia con un gruppo simile ma privo della
malattia e si valuta se ci sono state esposizioni o fattori di rischio.
Si risale quindi dall’esito (ovvero la malattia) alla esposizione, valutando se c’è una differente
incidenza di una determinata caratteristica (eziologia) fra casi e controlli.
Questi studi sono relativamente poco costosi ed usati frequentemente per studi epidemiologici,
anche in virtù della possibilità di essere svolti da un solo o pochi ricercatori. Si tratta di studi
retrospettivi, in quanto l'esposizione non può non precedere l’esito. Riguardano più l'eziologia che
gli esiti. Questo tipo di studio può correlare solo l'associazione, ma non la causalità. Mancano quasi
sempre dati obiettivi sull’esposizione dal momento che è riferita ad eventi del passato. Tra i limiti è
necessario ricordare le molte distorsioni possibili:
nella scelta dei casi, nella scelta dei controlli, mancanza frequente di dati obiettivi sulla esposizione,
atteggiamenti diversi degli osservatori nell’interpretazione dei dati.
Il più grande trionfo di questo tipo di studi è stata la dimostrazione del legame tra tabacco e tumore
al polmone, da parte di Sir Richard Doll ed altri dopo di lui. Doll fu abile a mostrare una
associazione statisticamente significativa tra i 2 in un grande studio-controllo. Gli oppositori,
normalmente sostenuti dall'industria del tabacco, sostennero (giustamente) che questo tipo di studio

103
non potesse sostenere il rapporto di causa effetto, ma che solo l'eventuale risultato di uno studio di
coorte avrebbe potuto confermare questo rapporto. Attualmente è ormai accettato che il fumo di
tabacco sia la causa di circa l'87% di tutta la mortalità negli USA per tumore ai polmoni.
Gli studi caso controllo sono particolarmente utili quando il fine è indagare se vi è un'associazione
tra un farmaco (o farmaci) ed uno specifico evento avverso raro, come pure i fattori di rischio per
gli eventi avversi. I fattori di rischio possono includere condizioni quali disfunzione renale ed
epatica, questi possono modificare la relazione tra l'esposizione al farmaco e l'evento avverso. In
condizioni specifiche uno studio caso-controllo può fornire il tasso d’incidenza assoluto dell'evento.
Se vengono individuati tutti i casi di interesse (o una frazione ben definita di essi) nell'area di
raccolta ed è nota la frazione dei controlli proveniente dalla popolazione d'origine, si può calcolare
un tasso d'incidenza.

casi malati controlli non malati

esposti a b
non esposti c d
totali a+c b+d

Un tipo particolare di case-control è il nested case-control study. Esso è un misto del case-control
e dello studio di coorte. Offre una importante riduzione nel costo e nella fatica di raccolta dei dati e
di analisi rispetto all'approccio full cohort, con relativamente minore perdita in efficienza statistica.
Rispetto agli studi caso-controllo il NCC riduce il recall bias e l'ambiguità temporale.
Lo svantaggio di studi caso-controlli nidificati è che le persone non malate da quelle selezionate dai
controlli non possono essere pienamente rappresentative della coorte originale, a causa di morte o
l'incapacità di follow-up dei casi.
Studio osservazionale trasversale o cross sectional (o di prevalenza)
Uno studio osservazionale trasversale o cross-sectional (o di prevalenza) si basa sull'osservazione
di un fenomeno o di un evento clinico in un determinato periodo di tempo. Viene usato per studiare
la prevalenza istantanea di una malattia oppure per misurare l’associazione tra il fattore di rischio di
malattia/condizione e la malattia/condizione.
I risultati, ovvero la prevalenza di una malattia, possono quindi variare tra 0 e 1 (oppure tra 0% e
100).
prevalenza malattia = N° di eventi sanitari osservati nel periodo / ( N° di eventi sanitari osservati
nel periodo + persone a rischio nello stesso periodo)

Negli studi di questo tipo non si fa altro che prendere dei campioni di popolazione e rilevare la
prevalenza di una determinata malattia.
Questi studi offrono risultati immediati e sono economicamente poco rilevanti in quanto non
richiedono l'impiego di mezzi, tempo e personale per lunghi periodi.
D'altro canto, però, essi non consentono di calcolare misure d'incidenza (da non confondere con la
prevalenza) né tantomeno di associare con sicurezza un fattore di rischio ad una malattia, in quanto
non permettono di verificare con certezza con quale fattore di rischio un "ammalato" sia entrato in
contatto.
Sono utili per:
• Descrivere il carico di una malattia al "tempo 0".
• Descrivere la distribuzione di una “variabile”.
• Analizzare l'associazione fra una malattia ed un fattore causale.

104
 • Sono poco costosi e di breve durata.

Questi studi forniscono indicazione sulla “prevalenza” e non sulla “incidenza”. La prevalenza è
infatti il rapporto tra il numero dei casi con una determinata malattia, in quel momento, ed il
numero di componenti della popolazione in esame. Gli studi trasversali possono essere pensati
come una istantanea di una malattia in una popolazione in un particolare momento. Questo tipo di
studio può essere utilizzato per misurare la prevalenza di condizioni acute o croniche nella
popolazione. Tuttavia, visto che l'esposizione e lo stato di malattia sono misurati nello stesso
momento, non è quasi mai possibile distinguere se l'esposizione precede o segue la malattia. Quindi
il principale inconveniente consiste nel fatto che la relazione temporale tra l’esposizione e l’esito
non può essere direttamente identificata. Lo studio trasversale può essere:
A21) Studio trasversale descrittivo
ricerca la prevalenza di una malattia nel tempo.

Lo studio trasversale congela un momento specifico nel tempo, mira a trovare lo stesso tipo di
rapporti che possono essere visualizzati con il "figure in movimento" dello studio di coorte, ma a
costi molto minori.
Studio trasversale analitico
In uno studio trasversale uno specifico gruppo è osservato per vedere se una sostanza od
attività, come il fumo, è correlata agli eventi da investigare, per esempio il cancro polmonare.
Se un più grande numero di fumatori hanno il tumore al polmone, rispetto a coloro che non
fumano, ciò supporta l'ipotesi che il tumore polmonare sia correlato con il fumo.

L'analisi trasversale (in generale) studia la relazione tra differenti variabili ad un determinato
momento.
Studi di correlazione geografica o temporale
Quasi sempre sono studi di mortalità per una certa malattia in due o più territori dove la mortalità è
messa in rapporto con la diversa esposizione/distribuzione di uno o più fattori di rischio.
I limiti sono lo scarso controllo della qualità dei dati, basandosi su statistiche correnti dove i dati
sono rilevati “per altri scopi da altri osservatori”. Presenza di fattori confondenti e distorsioni.
Studi sperimentali
Sono utilizzati prevalentemente per valutare l'efficacia o gli eventi avversi di nuove terapie.
Studio controllato randomizzato (clinical trial)
Attualmente, alcuni studi clinici in fase II e la maggior parte di quelli in fase III sono progettati
come randomizzati, doppio cieco, e controllati con placebo.
• Randomizzati: ogni soggetto dello studio è assegnato in modo casuale (random) a ricevere
uno fra i trattamenti in studio oppure il placebo.
• Cieco: I soggetti dell'esperimento non sanno quale trattamento ricevano.
• Doppio cieco. Se lo studio è in doppio cieco, neanche i ricercatori sanno quale trattamento è
somministrato a ciascun soggetto.
Lo scopo di questo "accecamento" è evitare, da un lato, che il soggetto che riceve la terapia sia
influenzato più o meno positivamente dalla consapevolezza di stare ricevendo una determinata cura;
dall'altro, garantire l'imparzialità dello sperimentatore nel valutare gli effetti della terapia. Una
forma di doppio cieco chiamato "double-dummy", permette sicurezze aggiuntive contro errori od
effetti placebo. In questo tipo di studi, a tutti i pazienti sono somministrati sia placebo che dosi
attive in tempi differenti ed alternati dello studio.

105
 • Controllati con placebo. L'uso del placebo permette, laddove sia possibile, di eliminare le
differenze nell'efficacia della terapia fra i diversi gruppi in studio dovute a fattori psicologici
(effetto placebo).
Da notare che negli ultimi dieci anni circa è diventata una pratica comune, condurre "active
comparator study" (chiamati anche "active control study"). In altre parole, quando un trattamento
esistente è chiaramente migliore che non fare niente per il soggetto (ovvero somministrargli il
"placebo"), il trattamento alternativo dovrebbe essere lo standard della cura.
Approfondimento su studi clinici randomizzati

Studi preclinici
Gli studi preclinici utilizzano test in vitro ed esperimenti su (animali)in vivo, utilizzando ampie dosi
del farmaco per ottenere informazioni preliminari su efficacia, tossicità e farmacocinetica. Tali test
permettono alle case farmaceutiche di decidere se un farmaco candidato ha merito scientifico per un
ulteriore sviluppo come en:investigational new drug.
Alcune volte la ricerca è fatta senza scopi medici e, solo accidentalmente, contribuisce alla ricerca
medica, vedi ad esempio la ricerca dellapenicillina.
Fase 0
La Fase 0 è stata introtta recentemente, ad indicare la prima fase clinica che precede la tradizionale
fase I,, in accordo con le linee Guida U.S.A della FDA sulla ricersa di nuovi farmaci [24] I trials in
Fase = 0 sono anche conosciuti come studi su umani con microdosi e sono progettati per accelerare
lo sviluppo di farmaci promettenti o traccianti per stabilire in tempi rapidi se il farmaco agisca sui
soggetti umani come si ritiene in base agli studi preclinici. Tipici esempi di studi in fase 0 sono la
somministrazione di singole dosi subterapeutiche del farmaco sotto studio ad un piccolo numero di
soggetti (da 10 a 15) per ottenere dati preliminari sulla farmacocinetica dell'agente (come il farmaco
agisce all'interno del corpi umano).
Gli studi in fase 0 non forniscono dati su sicurezza ed efficacia, essendo, per definizione ad una
dose troppo bassa per poter fornire qualunque effetto terapeutico. Le compagnie farmaceutiche
portano avanti studi in fase 0 in modo da classificare i farmaci candidati, per decidere chi ha i
migliori parametri farmacocinetici e chi può proseguire per ulteriori sviluppo e sperimentazione.
Ciò permette di decidere di proseguire o no, basandosi su modelli umani pertinenti invece di che
farlo su dati talvolta inconsistenti tratti da animali.
Alcuni autori si sono interrogati se la fase 0 dei trials sia utile, accettabile eticamente, fattibile e se
accelerino il processo di sviluppo dei farmaci o facciano risparmiare denaro, e se ci sia spazio di
miglioramento.
Fase I (sicurezza del farmaco)
I trials in fase I, sono la prima fase dei test su soggetti umani. Tentano di rispondere alla
domanda: quanto farmaco può essere somministrato senza causare effetti avversi gravi?
Normalmente viene selezionato un piccolo gruppo di volontari sani (circa 20-80 persone), vi sono
comunque alcune circostanze in cui sono utilizzati pazienti reali, come pazienti in fase terminale o
persone che non hanno altre opzioni teraputiche. Queste eccezione avvengono spesso nei trial con
pazienti oncologici o con AIDS. (vedi sotto). Questa fase include trials designati per misurare la
sicurezza (farmacoviglianza), tollerabilità (farmacocinetica) e la farmacodinamica di un farmaco.
Sono spesso condotti su pazienti ricoverati, dove i soggetti possono essere osservati da uno staff a
tempo pieno.
Misurano farmacocinetica e metabolismo del farmaco, il suo meccanismo di azione e la sua
farmacodinamica. Il soggetto che riceve il farmaco è normalmente tenuto in osservazione per un
tempo multiplo di parecchie emivite del farmaco. I trial in fase I normalmente includono il dose-

106
ranging, normalmente chamato studio dose escalation, cosicché si possa trovare la dose appropriata
per uso terapeutico. Il dosaggio testato è normalmente una frazione della dose che causa danno nella
sperimentazione su animali.

Fase II (effetto del trattamento iniziale)

Una volta che è stata confermata la sicurezza dello studio dal trial in Fase I, vengono effettuati trials
in Fase II su gruppi più grandi (20-300). Essi sono progettati per valutare come funziona il farmaco,
e per continuare la valutazione sulla sicurezza effettuata in fase I, su un gruppo più ampio di
volontari e pazienti. Quando fallisce il processo di sviluppo per un nuovo farmaco, ciò avviene
normalmente durante i trials in fase II, nel momento in cui si scopre che non funziona come
pensato, oppure che ha effetti tossici.
I trials in fase II sono, a volte, divisi in Fase IIa e fase IIb.
• La fase IIa è progettata specificatamente per valutare la quantità di farmaco necessaria.
• La fase IIb è progettata specificatamente per studi di efficacia (valutare come il farmaco
lavora alla dose prescritta).
Alcuni trials combinano Fase I e Fase II e testano sia l'efficacia che la tossicità.
Alcuni trials in fase II sono progettati come studio caso/controllo, ove alcuni pazienti ricevono il
farmaco/dispositivo, ed altri ricevono placebo/trattamento standard. I trials randomizzati in fase II
hanno molti meno pazienti che i trials randomizzati in fase III.
Fase III (valutazione generale)
Quando un farmaco è considerato ragionevolmente efficace e sicuro, viene somministrato a un
numero alto di soggetti. Gli studi in fase III sono trial multicentrici randomizzati e controllati,
effettuati su un grande gruppo di pazienti (300-3000 o più, a seconda della malattia o della
condizione medica investigata), e sono considerati effettuare la valutazione definitiva, sulla
efficacia del farmaco versus il "gold standard" corrente. In virtù della loro grandezza e durata, i
trials in fase III sono i più costosi, duraturi e difficili per quando concerne progettazione e decorso,
soprattutto nel caso di malattie croniche.
È una pratica comune che particolari trials in fase III continuino, mentre lo studio è in attesa di
regolamentazione al livello appropriato di regolamentazione. Questo permette ai pazienti di
continuare a ricevere la possibilità di ricevere farmaci salvavita, fino a che il farmaco non abbia
ottenuto l'approvazione alla vendita. Altre ragioni per effettuare trials a questo livello includono i
tentativi dello sponsor di una espansione della prescrizione, ovvero mostrare che il farmaco lavora
per tipi addizionali di pazienti e malattie oltre l'uso originale per il quale il farmaco è stato
approvato per la vendita, per ottenere dati addizionali sulla sicurezza, o per sostenere le richieste di
commercializzazione del farmaco. Studi in questa fase sono categorizzate da alcune compagnie
come studi in "fase III B"
Anche se non sempre viene richiesto, è consuetudine ottenere almeno due trials in fase III con
successo, a dimostrere la efficaciae la sicurezza de farmaco, per ottenere l'approvazione dalle
appropriate agenzie regolatorie (FDA (USA), TGA (Australia), EMEA (European Union), etc.) che
è sottoposta a revisione da parte delle autorità regolatorie appropriate nelle differenti nazioni. Esse
sottoporranno a revisione il documento ed auspicabilmente sosterranno l'approvazione per
l'immissione in commercio.
La maggior parte dei farmaci che hanno effettuato la fase III dei trials possono essere immessi sul
mercato sotto le norme della FDA con raccomandazioni particolari e linee guida., ma in caso di ogni
evento avverso riportato ovunque, il farmaco necessita di essere richiamato immediatamente dal
mercato. Mentre la maggior parte delle compagnie farmaceutiche si trattengono da questa pratica,

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non è anormale vedere molti farmaci essere sottoposti a clinical trials di fase III mentre sono
commercializzati.
Fase IV
I trials in fase IV sono anche chiamati come trials di sorveglianza Post-Marketing. Essi
coinvolgono la sorveglianza sulla sicurezzafarmacovigilanza e supporto tecnico in corso per un
farmaco dopo che ha ricevuto il permesso di essre venduto. Gli studi in fase IV possono essere
richiesti dalla autorità regolatoria o possono essere sottoposti dalla compagnia farmaceutiche per
ragioni di competitività (trovare un nuovo mercato per la molecola) od altre ragioni (per esempio il
farmaco potrebbe non essere stato prestato sull'interazione con altre molecoleod in certi gruppi di
popolazione, come ad esempio donne gravide, che difficilmente si sottoporrebbero da sole al test).
La sorveglianza sulla sicurezza è progettata per trovare ogni evento avverso raro od a lungo tempo,
su una più grande popolazione di pazienti ed un periodo più lungo di quello possibile durante le fasi
I-III. Effetti pericolosi scoperti nella Fase IV possono esitare in un ritiro dal commercio del farmaco
o la restrizione dello stesso in certi casi, recenti esempi sono la cerivastatina (i cui nomi
commerciali sono Baycol e Lipobay), troglitazone (Rezulin) e rofecoxib (Vioxx).

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