Cause endogene di malattia:

LE PATOLOGIE GENETICHE
 Le malattie genetiche si dividono…
…in base al tipo di trasmissione
• MALATTIE MENDELIANE: dovute ad alterazione in un singolo gene. Eredità
semplice (mendeliana):
a) Autosomiche Dominanti
b) Autosomiche Recessive
c) Dominanti legate all’X
d) Recessive legate all’X

• MALATTIE CON TRASMISSIONE NON-MENDELIANA O NON CLASSICA

• Espansioni di triplette (es. X fragile, Corea di Huntington)
• Mutazioni in geni mitocondriali (eredità matrilineare)
• Difetti da imprinting genomico: legata a processi epigenetici
• Complesse: dovute all’effetto combinato tra i geni e l’ambiente

…in base al numero di geni coinvolti

• Monogeniche
• Digeniche
• Poligeniche
• Multifattoriali (complesse)
 …in base alla sede della mutazione
• Mutazioni germinali o costitutive : insorgono nei gameti e possono essere
trasmesse alla prole. Tutte le cellule dell'individuo portatore contengono la
mutazione.

• Mutazioni somatiche: insorgono nelle cellule del corpo (somatiche), quindi

non possono essere trasmesse alla prole (assenti nei gameti), tipiche dei
tumori sporadici. Sono trasmesse per mitosi a cellule figlie (clone cellulare).

…in base al meccanismo molecolare d’insorgenza

• Espansioni da triplette
• Da imprinting
• Da non disgiunzione cromosomica
• Da crossing over ineguale
• ……
 …in base all’estensione
1) MALATTIE CROMOSOMICHE : coinvolti molti geni; dovute all’alterazione
del numero o della struttura dei cromosomi

2) MALATTIE GENICHE : che coinvolgono singoli geni e sono dovute a

mutazioni puntiformi, piccole delezioni, inserzioni o duplicazioni
intrageniche

3) PATOLOGIE DA MICRODELEZIONE e MICRODUPLICAZIONE: coinvolgono più

geni ma NON sono rilevabili al cariotipo convenzionale
Non esiste una classificazione omnicomprensiva

/microduplicazione

Mitocondriali
IMPATTO CLINICO DELLE MALATTIE GENETICHE

Anomalie
cromosomiche Malattie
multifattoriali

Malattie
monogeniche

nascita pubertà età adulta

 Mutazioni puntiformi
Alterazioni del DNA di una o poche basi indagabili a livello molecolare

• SOSTITUZIONI DI SINGOLE BASI:

o MUTAZIONI SILENTI e NEUTRALI
o MUTAZIONI MISSENSO: sostituzioni di un aa con un altro
o MUTAZIONI NONSENSE: sostituzione di un codone codificante un aa con un codone di
stop
• INSERZIONI E DELEZIONI in frame: senza slittamento del modulo di lettura
(perdita o inserimento di uno o più aa)
• SLITTAMENTI DEL MODULO DI LETTURA (frameshift) da
o Delezioni
o Inserzioni
15% di
o Di splicing tutte le mut DNA CODIFICANTE

• ALTRE MUTAZIONI NEL DNA NON CODIFICANTE

o Di splicing: diversi effetti a livello proteico
o Del promotore
o Di regioni UTR
Wild type DNA
SOSTITUZIONI DI
RNA
SINGOLE BASI
proteina

La sintesi di un polipeptide tronco è un’

evenienza rara.
L’instabilità del mRNA è l’evenienza più
comune. Se in un mRNA è presente un codone
di stop situato almeno 50 nt a monte della
giunzione di splicing più vicina, viene attivato
un meccanismo noto come degradazione
mediata da codoni nonsenso (NMD Non-
sense Mediated Decay) che determina la
rapida degradazione dell’mRNA per
proteggere la cellula dagli effetti nocivi della
proteina tronca.
Altre mutazioni : DNA NON CODIFICANTE

In genere non patogenetiche,

ma se….

(Sequenze canoniche di splicing)

Non sempre variazioni nel DNA sono patogenetiche. Delezioni dell’intero gene, mutazioni
frameshift e nonsenso quasi sicuramente distruggono la funzione genica, più difficile è
stabilire la patogenicità di mutazioni missenso.

POLIMORFISMI DI SINGOLI NUCLEOTIDI

( SNP, Single Nucleotide Polymorphisms )

Varianti della sequenza genomica presenti sia in sequenze codificanti che non-codificanti
Sono in genere polimorfismi biallelici
Sono presenti in numero elevato nel genoma umano (1/1000 bp; 3x106)
Sono utili marcatori genetici

Una variante per essere considerata uno SNP deve essere presente almeno
nell’1% della popolazione (in almeno 1 su 50 individui)

Un locus genetico si dice polimorfico se si osservano nella popolazione due o

più varianti alleliche, la più rara delle quali ha una frequenza >1%
Come si riconosce la patogenicità di una variazione?

• Frequenza: i polimorfismi hanno in genere una frequenza dell’1% nella popolazione

• Una mutazione missenso è più probabile sia patogena se cade in una parte importante
dal punto di vista funzionale della proteina

• Valutare quanto un aa è conservato nel corso dell’evoluzione. Se aa conservato nelle

varie specie (geni ortologhi) o tra i membri di una famiglia genica (geni paraloghi)

• È più probabile che sia patogena se la variazione cade in un gene patologico presente in
un paziente affetto de novo e non nei suoi genitori sani

La prova definitiva per stabilire se una mutazione alteri la funzionalità di una

proteina deriva da test funzionali in vitro o in vivo
 Proteine: effetti patologici delle mutazioni
Per la comprensione nel meccanismo patogenetico è importante
prima di tutto capire se la mutazione determina:

1. perdita della funzione. Il prodotto può presentare:

- parziale/tot riduzione (quantitativa, relato alla dose)
- riduzione o assenza di funzione (alterazione qualitativa)

Allele null o amorfo: allele che non dà prodotto.

In eterozigosi in genere è presente in un portatore sano di una malattia AR
poiché la maggior parte dei prodotti genici non è sensibile a variazioni
quantitative (es. enzimi).

Ipomorfo: allele che produce una ridotta quantità o attività del

prodotto.
(es. distrofia muscolare di Duchenne e Becker)

Antimorfo (dominante negativo): allele la cui attività o il cui prodotto

antagonizza l’attività del prodotto normale (es. collagene).
 Proteine: effetti patologici delle mutazioni

Per la comprensione nel meccanismo patogenetico è importante

prima di tutto capire se la mutazione determina:

2. acquisizione della funzione. Il prodotto proteico è:

- aumentato (quantitativa, relato alla dose)
- iperfunzionante (alterazione qualitativa)

Ipermorfo: allele che produce un aumentata quantità o attività del

prodotto.
È associato di regola ad un tratto genetico dominante (es. FGF3 acondroplasia)
perché la presenza del prodotto dell’allele normale non impedisce al prodotto
dell’allele mutato di comportarsi in maniera anomala

Neomorfo: allele con una nuova attività o prodotto (es. Bcr-Abl in CML).
 Esempio LOF: mutazioni nel gene CFTR

La Fibrosi Cistica (AR)

Definizione
Patologia sistemica che colpisce le ghiandole a secrezione mucosa ed
è caratterizzata da abnorme accumulo di muco vischioso (da cui
mucoviscidosi), con ostruzione e dilatazione dei dotti ghiandolari.

Epidemiologia:
1:2000-1:4000 alla nascita
1/25 della popolazione è costituita da eterozigoti, i portatori sani.

Causata da mutazioni loss of function nel gene CFTR (Cystic

FibrosisTransmembrane conductance Regulator), che codifica per il canale che
trasporta gli ioni del cloro (Cl-) attraverso la membrana apicale delle
cellule epiteliali esocrine.
Il canale del cloro è espresso nelle cellule epiteliali di diversi organi,
in particolare: polmoni, intestino, pancreas, dotti sudoripari,
epididimo.
 Esempio LOF: mutazioni nel gene CFTR

La proteina CFTR appartiene alla superfamiglia di proteine di

membrana ATP-binding cassette (ABC) transporters che utilizzano ATP
per traslocare differenti substrati attraverso la membrana cellulare.

È composta da:
- 2 domini transmembrana ad alfa
elica
- 2 regioni globulari NBD
(Nucleotide Binding Domain) che
legano una molecola di ATP ciascuna
- 1 regione regolatrice (R) unica di
CFTR (non presente negli altri ABC
transporters) che contiene numerosi
siti di fosforilazione per PKA e PKC
Chen J-H, et al; 2006
 Esempio LOF: mutazioni nel gene CFTR
Azione svolte dal CFTR:
- Regolazione del passaggio degli ioni Cloro
- Regolazione negativa dei canali del Sodio (canali epiteliali del sodio ENaC, che sono
responsabili della captazione di sodio dalle secrezioni luminali, rendendole ipotoniche).

Funzioni del CFTR sono tessuto specifiche VIE AEREE

CFTR : secrezione Cl-
inbizione ENac

1. aumento di ioni Cl- intracellulari

2. aumento di attività dell’attività di EnaC e conseguente marcato incremento della
captazione di Na dal lume attraverso le membrane apicali.
Entrambe le modificazioni ioniche determinano il riassorbimento passivo di H20 e
formazione di liquido di superficie iperdenso e viscoso Disidratazione delle secrezioni

COMPROMISSIONE DELLA PRIMA LINEA DI DIFESA DEL SISTEMA RESPIRATORIO

CONTRO I PATOGENI
Esempio LOF: mutazioni nel gene CFTR

Nei pazienti affetti da FC le mutazioni

nel gene determinano un cambiamento
delle proprietà delle secrezioni che
soprattutto a livello dell'apparato
respiratorio e dell'apparato digerente
(pancreas e fegato) sono molto più
dense e viscose del normale, e difficili
da eliminare:

- polmoni, seni paranasali

- pancreas, fegato, intestino
- apparato riproduttivo
-ghiandole sudoripare

Danni funzionali da ristagno:

- Ostruzione
- Infezione
Esempio LOF: mutazioni nel gene CFTR
Sono state identificate almeno 2000 varianti di CFTR

Castellani C et al; 2008.

 Classificazione delle mutazioni

Alleli amorfi (null) Alleli ipomorfi

ΔF508del: allele null Boyle MP et al; 2013.

 Classificazione delle mutazioni

- Classe I: mancata sintesi proteica e assenza completa della proteina

Mutazioni di STOP: mutazioni frame-shift o non sense, CFTR non è sintetizzato
(7% pazienti CF)
- Classe II: alterazioni del ripiegamento, elaborazione e trasporto
Elaborazione difettosa della proteina dal RE al Golgi (degradata prima di
raggiungere la membrana cellulare) (85% pz CF)
- Classe III: alterata regolazione
Mancata attivazione del CFTR per mancato legame con ATP, CFTR presente ma
non funzionante (3% pz CF)
- Classe IV: ridotta conduttanza
Mutazioni a carico dominio transmembrana; proteina a funzione ridotta;
solitamente fenotipo più lieve
- Classe V: riduzione quantitativa del trascritto (per mutazioni del promotore
solitamente fenotipo più lieve)
- Classe VI: turnover di superficie accelerato (diminuita emivita proteica in
membrana)
 Classificazione delle mutazioni

La più comune è ΔF508 → delezione

in frame di 3 nt della Phe 508
Costituisce il:
- 95% mutazioni danesi
- 70-80% USA
- 40-50% Europa del Nord (52% in
Italia)

Allele null: in vitro attività di trasporto,

ma in realtà degradata prima di
raggiungere la membrana a causa di
anomala conformazione- ripiegamento
Correlazione genotipo-fenotipo
 Correlazione genotipo-fenotipo
L’eterogeneità allelica spiega in parte i differenti fenotipi
1) il genotipo è un buon predittore della funzionalità pancreatica:
• Alleli null: associati ad insufficienza pancreatica
• Alleli ipomorfi (con attività parziale della proteina): sufficienza pancreatica

Quadro classico FC (quadro polmonare, pancreatico):

omozigoti o eterozigoti composti per alleli null
Quadro più mild (non compromessa funzione pancreatica )
omozigoti o eterozigoti composti con almeno 1 allele ipomorfo

2) il genotipo non è un buon predittore della severità della malattia polmonare e di altre
funzioni: Probabile ruolo di altri geni MODIFICATORI

Due varianti in TGFB1 sono associate a

malattia polmonare più grave

Le malattie
mendeliane
(semplici) non sono
poi così semplici!!
Nelle mutazioni loss of function l’effetto fenotipico dipende
dalla attività residua del prodotto genico

Molte sostituzioni di amminoacidi hanno poco o nessun effetto, mentre

alcune mutazioni aboliscono totalmente la funzione

Una mutazione può essere presente in una o entrambe le copie di un

gene (generalmente recessive)

Quando entrambi gli omologhi sono colpiti, possono essere influenzati in

maniera disuguale - le persone con condizioni autosomiche recessive sono
spesso eterozigoti composti, con due differenti mutazioni

Se entrambe le mutazioni causano la perdita di funzione, ma in misura diversa,

l'allele meno grave detterà il livello di funzione residuale

L'effetto fenotipico dipende dal livello di prodotto del gene residuo

CARATTERISTICHE DI ALCUNE MUTAZIONI LOSS OF FUNCTION
1) Aploinsufficienza – effetto dose

• Le mutazioni con perdita di funzione di geni non sensibili al dosaggio sono

recessive
• Alcune proteine sono invece sensibili al dosaggio: diminuzioni al di sotto
del 100% di attività del prodotto genico non vengono tollerate.

L'aploinsufficienza è una situazione in cui la presenza di un solo allele

funzionante di un determinato gene non è sufficiente per il normale
funzionamento delle cellule di un organismo.

Le mutazioni con perdita di funzione che danno

aploinsufficienza hanno un fenotipo dominante
trasmissione familiare dominante
CARATTERISTICHE DI ALCUNE MUTAZIONI LOSS OF FUNCTION
2) Effetto dominante negativo
Fenomeno per cui un polipeptide mutante non solo perde la sua funzione,
ma è in grado di interferire con l’attività del prodotto proteico
codificato dall’ allele normale nell’eterozigote (allele antimorfo)

Le mutazioni con perdita di funzione che danno effetto

dominante negativo hanno un fenotipo dominante

Tale fenomeno si instaura quando le proteine mutate fanno parte di

complessi multimerici in cui si ha un’associazione fisica tra proteine
mutate e non (es collagene).

Le mutazioni con perdita

di funzione che danno
effetto dominante
negativo hanno fenotipo
più grave rispetto alla sola
perdita di funzione
MALATTIE DA ESPANSIONE DI TRIPLETTE NUCLEOTIDICHE

Mutazioni dinamiche

3% del genoma: Microsatelliti,

anche noti come Short Tandem
Repeats (STRs), sono sequenze
ripetute di 1-6 bp di DNA.

POLIMORFICI

La presenza di sequenze ripetute

all’interno di un gene non è di per
sé un evento patologico, ma lo
diventa nel caso il numero di copie
superi una certa soglia
MALATTIE DA ESPANSIONE DI TRIPLETTE NUCLEOTIDICHE

Le triplette sono instabili e tendono ad espandersi: mutazione

dinamica, al contrario di quanto avviene per le malattie genetiche
classiche in cui la mutazione rimane stabile.

Si ha un’espansione quando,
durante la replicazione del
DNA, il DNA strand di
neosintesi si stacca in
modo inappropriato dal
templato. Quando si
riassocia con il templato, il
nuovo strand potrebbe
ripiegarsi per scivolamento
all’indietro e riappaiarsi
con un repeat fuori
registro.
MALATTIE DA ESPANSIONE DI TRIPLETTE NUCLEOTIDICHE

Sembra che all’aumentare del numero di ripetizioni

aumenti l’instabilità dell’allele
L’elevata frequenza di mutazione da espansione
suggerisce che dopo la soglia di 50 repeats, la
macchina replicativa non sia più in grado di
duplicare fedelmente la sequenza corretta: da qui
l’alta variabilità dei repeats
MALATTIA DI HUNTINGTON
Meccanismo patogenetico

Malattia autosomica
autenticamente dominante:
fenotipo eterozigoti = omozigoti

ESPANSIONE CAG
NELLA REGIONE
CODIFICANTE DEL GENE
HTT (IT15) sul cromosoma 4

Come conseguenza, la gravità e la precocità dei sintomi (che sono

direttamente proporzionali al numero di triplette nell'allele
patologico) tendono ad aumentare nelle generazioni successive
(Fenomeno "dell'anticipazione" genica o Paradosso di Shermann),
al contrario di quanto avviene per le malattie genetiche classiche in
cui in genere un fenotipo patologico ben definito che si trasmette
invariato di generazione in generazione.
 MALATTIA DI HUNTINGTON

Fisiopatologia

ESPANSIONE CAG
NELLA REGIONE SINTESI PROTEINA Nuova proprietà:
CODIFICANTE DEL ANOMALA con TOSSICITA’ DELLA
GENE poliglutamine PROTEINA ANOMALA
IT15 sul cromosoma 4
Aggregazione per
(HUNTINGTINA,
formare precipitati
proteina HTT a funzione
non nota)
Non esiste una classificazione omnicomprensiva

/microduplicazione

Mitocondriali
 MALATTIE GENOMICHE

Definizione coniata da Lupski (Trends Genet, 1998) per descrivere

un gruppo di malattie genetiche umane caratterizzate da:
• perdita o acquisto di una specifica regione cromosomica, causata
da riarrangiamenti del genoma (solitamente sono rappresentati da
duplicazioni o delezioni, alcune volte da inversioni; i
riarrangiamenti coinvolgono segmenti di DNA di dimensioni
variabili da poche Kb a parecchie Mb)
• che risulta in una completa perdita o acquisizione di geni
dosaggio-sensibili
• che si associa tipicamente ad una sindrome genetica (presenta
clinicamente con anomalie congenite e disabilità neurologiche e
della funzione cognitiva)
 MALATTIE GENOMICHE
Molti di questi riarrangiamenti sono ricorrenti, ossia coinvolgono sempre le stesse
regioni genomiche con gli stessi punti di rottura.
Da cosa dipende tale instabilità?

L’instabilità è dovuta alla presenza

di motivi di sequenza denominati
duplicazioni segmentali (DS) o LCR
(ripetizioni a basso numero di
copie)
 DUPLICAZIONI SEGMENTALI

Nuova classe di DNA ripetuto identificato nel genoma umano, costituito da

grossi segmenti genomici con elevata omologia di sequenza.

E’ costituito da grosse e quasi identiche copie di DNA genomico la cui

lunghezza varia da 10 a 400 Kb, con una identità di sequenza che varia dal
90% al 100%.

L’analisi del genoma sequenziato, ha permesso di confermare che il 5% del

genoma umano è duplicato.

Sono separate solitamente da sequenze uniche con lunghezza >1Mb.

La distribuzione di questi segmenti tra i cromosomi umani non è uniforme.

Le duplicazioni segmentali intracromosomiche, sono tipicamente riscontrate

in un singolo cromosoma o in una singola banda cromosomica.

La classe intercromosomica è duplicata su cromosomi non omologhi e sono

localizzate a livello delle regioni subtelomeriche e pericentromeriche.
L’alto grado di omologia, l’estensione, l’orientamento e la distanza reciproca tra due o
più DS fa si che queste sequenze siano terreno fertile per eventi di ricombinazione
omologa non allelica (NAHR).
 MALATTIE GENOMICHE

Depending on the size of the genomic segment involved (i.e. the

distance between LCRs), and the number of potential dosage-
sensitive genes mapping within the rearranged segment,
deletions and/or duplications can result in any of the following:
• A mendelian disease (can segregate as autosomal recessive,
autosomal dominant, X-linked or even Y-linked traits)
• A contiguous gene syndrome
• A chromosomal disorder
 CONTIGUOUS GENE SYNDROMES

Contiguous gene syndromes result from DNA rearrangements (deletion/duplication)

that encompass several adjacent genes on a segment of the genome. The genome
segments involved in several of these conditions have been shown to be flanked by LCRs
and the rearrangements mediated by NAHR.

SINDROMI DA GENI CONTIGUI= SINDROMI DA MICRODELEZIONI E MICRODUPLICAZIONI

 CNVs (copy number variations)

•CNV è un frammento di DNA di almeno 1Kb, per il quale

viene vista una variazione del numero di copie in base al
confronto di uno o più DNA di riferimento (sia in
acquisizione che in perdita).

•CNVs possono essere dei polimorfismi (in più dell’1% della

popolazione; Redon R. et al. 2006:) e non avere effetto
fenotipico.

•Possono influenzare il dosaggio genico, permettere di

individuare loci di suscettibilità associati a patologie
 CNVs sono le alterazioni più frequenti a cui è più difficile associare
un significato eventualmente patogenetico.

L’esperienza di vari laboratori ha permesso di creare delle banche

dati con cui confrontarsi:

http://projects.tcag.ca/variation 1)Varianti polimorfiche su pazienti controllo sani

2) Varianti associate a condizione patologica:

Non esiste una classificazione omnicomprensiva

/microduplicazione

Mitocondriali
MALATTIE COMPLESSE - EREDITA’ MULTIFATTORIALE
- Some cancers - Schizophrenia
- Type 1 diabetes - Cleft lip/palate
- Type 2 diabetes - Hypertension
- Alzheimer disease - Rheumatoid arthritis
- Inflammatory bowel disease - Asthma

• malattie genetiche umane più frequenti

• tipicamente malattie dell’età ADULTA
• l’evento morboso è caratterizzato dall’interazione tra molteplici varianti
genetiche e molteplici varianti ambientali.

FATTORI DI RISCHIO O DI SUSCETTIBILITA’

Genetic
Variants

Trait
Trait

Non-genetic
factors
MALATTIE COMPLESSE - EREDITA’ MULTIFATTORIALE
MALATTIE COMPLESSE - EREDITA’ MULTIFATTORIALE

• Diseases of Simple Genetic Architecture

– Can tell how trait is passed in a family: follows a recognizable
pattern
– One gene per family
– Often called Mendelian disease
– Usually quite rare in population
– “Causative” gene

• Diseases of Complex Genetic Architecture

– No clear pattern of inheritance
– Moderate to strong evidence of being inherited
– Common in population: cancer, heart disease, dementia etc.
– Involves many genes or genes and environment
– “Susceptibility” genes
 Modello di Falconer: spiega la ricorrenza familiare delle
malattie complesse

• I fattori di suscettibilità
sono molteplici e sia di
natura genetica che
ambientale (asse X)

• Sono distribuiti nella

popolazione generale
secondo una gaussiana
n. fattori di suscettibilità
1) contributo genetico: varianti a loci multipli

Genetic
Variants
gene 3

environment environment

Physical trait
(disease)

gene 1 gene 2
environment

L'aumentata suscettibilità dipende da loci multipli:

effetti additivi, moltiplicativi, protettivi
2) contributo genetico: varianti a bassa penetranza

Genetic
Variants

Rare!

Comuni!

Ogni locus contribuisce con un debole aumento del rischio di sviluppare

la malattie (- ?? -)
MALATTIE COMPLESSE - EREDITA’ MULTIFATTORIALE
MALATTIE COMPLESSE - EREDITA’ MULTIFATTORIALE
Il metodo attualmente più utilizzato, efficace e semplice da
condurre è lo studio di associazione caso‐controllo.
Per questo tipo di analisi si selezionano due gruppi di individui, uno di soggetti affetti
dalla malattia di interesse, i cosiddetti casi, ed uno di individui sani, i cosiddetti
controlli, e si ricerca se una specifica variante genica che è più frequente tra i casi
rispetto ai controlli.

Disease Normal

5/20 Variant is not important 5/20

MALATTIE COMPLESSE - EREDITA’ MULTIFATTORIALE

Disease Normal

10/20 5/20

variant may be important