BIOTECNOLOGIE E LA GENOMICA

Le biotecnologie sono tutte quelle tecniche utilizzate (fin dall’antichità) per produrre sostanze specifiche a
partire da organismi viventi o da loro derivati.
Inoltre, servono a migliorare piante ed animali o sviluppare microorganismi utili per usi specifici come
l’inquinamento ambientale che ci aiutano a smaltire alcuni tipi di sostanze come la plastica.
A metà del Novecento la biologia molecolare offre gli strumenti per lo sviluppo dell’ingegneria genetica
cioè la possibilità di poter modificare la molecola del DNA.
Questo ha permesso lo sviluppo di tutte quelle tecniche che hanno come scopo finale la modifica di
organismi viventi che possono portare delle migliorie in diversi campi.
Le tecniche che fanno parte dell’ingegneria genetica e quindi delle tecnologie che ci permettono di
modificare il DNA sono:
-Taglio del DNA con enzimi di restrizione il DNA viene tagliato e questo taglio ci permette di ottenere un
DNA ex-novo definito DNA ricombinante.
-Costruzione libreria genomica  avendo ottenuto il DNA ricombinante posso costruire le librerie
genomiche che sono delle librerie che raggruppano differenti genomi modificati
-Impiego di sonde di acido nucleico  i frammenti di DNA possono essere utilizzati per creare delle sonde
che ci permettono di individuare altre molecole di acido nucleico sfruttando la legge di accoppiamento delle
basi azotate.
-Formazione del cDNA
-PCR
-elettroforesi su gel
-souther blotting
-Sequenziamento del DNA
-DNA microarray
Molto spesso molte tecniche si compenetrano o rappresentano degli step di un protocollo più complesso per
arrivare al mio obiettivo.
Se io devo sequenziare il DNA devo seguire una serie di passaggi che precedono il sequenziamento vero e
proprio del DNA.
Qualsiasi sia l'utilizzo che io devo fare del mio DNA è necessario che il sequenziamento venga proceduto da
uno step di frammentazione tramite degli enzimi di restrizione.
È possibile che sia necessario separare i frammenti mediante un’elettroforesi sul gel.
Ancora se deve esserci un Identificazione di un frammento utilizzerò una sonda marcata che mi porterà
all’ibridazione del mio frammento.
Lo step di sequenziamento, solamente con la frammentazione, prevede la presenza di molte copie del
genoma che voglio sequenziare e, di conseguenza, devo procedere con il processo di amplificazione per
evitare che ci siano errori nel sequenziamento.

LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

La creazione di un DNA ricombinante, che è costituito da diversi frammenti provenienti da microrganismi,
cellule differenti, non è altro che la formazione di un ibrido che non esiste in natura.
Il primo step è agire con gli enzimi di restrizione, i quali si trovano in particolar modo nei batteri e che
hanno il compito di riconoscere specifiche sequenze del DNA ed effettuare dei tagli.
Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA a livello di specifiche sequenze chiamate siti di restrizione.
L’enzima di restrizione utilizzato nel tagliare le sequenze dei DNA deve essere il medesimo poiché, se così
non fosse, creerei delle estremità che non si potrebbero accoppiare poiché il taglio sarebbe diverso.
In questo modo posso garantire l’accoppiamento delle basi e la formazione della molecola di DNA
attraverso l’utilizzo delle DNA ligasi.
Le DNA ligasi cuciono i frammenti formando DNA ricombinante.
Come ben sappiamo, i plasmidi sono delle molecole di DNA extra-cromosomico, piccole e con la capacità
di autoreplicarsi indipendentemente dal DNA genomico batterico.
Queste molecole si possono manipolare facilmente proprio attraverso gli enzimi di restrizione.
Di conseguenza il plasmide batterico diventa uno dei due elementi del DNA ricombinante, viene tagliato con
un enzima di restrizione e, parallelamente, faccio avvenire la frammentazione del mio DNA estraneo.
A questo punto dovrò prendere il frammento che è di mio interesse per andare a generare una molecola di
DNA, che verrà ricostituita per l’azione delle DNA ligasi in corrispondenza delle due estremità, ottenendo
nuovamente una molecola circolare di DNA plasmidico batterico differente da quella d’origine.

L’esperimento di Cohen e Boyer

Nel 1973 Cohen e Boyer combinano due sequenze diverse di DNA per produrre una nuova molecola di
DNA ricombinante.
Partirono dall’ipotesi che è possibile produrre laboratorio cromosomi ricombinanti biologicamente
funzionali.
I due ricercatori presero in considerazioni i plasmidi degli E. Coli, i quali presentano un gene per la
resistenza all’antibiotico canamicina e alla tetraciclina, e per dimostrare che questi due plasmidi si potevano
unire e si poteva creare il DNA ricombinante, hanno fatto in modo che i due plasmidi venissero tagliati da
un enzima di restrizione, metterli insieme ed esponendo i due frammenti alla DNA ligasi, permettere ai due
frammenti di unirsi.
Il nuovo plasmide contiene entrambi i geni per la resistenza ai due antibiotici.
Una volta formato il plasmide con il DNA ricombinante si reinserisce nell’E. Coli.
Parallelamente a questo esperimento hanno mantenuto i due plasmidi con i differenti geni per la resistenza
agli antibiotici, hanno messo in coltura i ceppi batterici d’origine e hanno messo anche il batterio con il
ceppo con la doppia resistenza ad entrambi gli antibiotici.
Come sappiamo i batteri necessitano per proliferare dei medium di cultura che possono essere o dei brodi o
delle piastre, ed insieme alle sostanze nutritive presenti nella piastra o nel brodo che fanno sì che il batterio
si accresca e riproduca, è anche presente la miscela di antibiotici.
Quello che ci dobbiamo aspettare è che se la trasformazione del batterio con il DNA ricombinanti ha una
validità, gli unici batteri che rimarranno presenti nella piastra sono questi poiché posseggono entrambi i
ceppi di difesa per entrambi gli antibiotici.
I batteri “puri” ossia i batteri che sono resistenti per uno o per l’altro antibiotico, subiranno uno stop nella
loro crescita e replicazione e, probabilmente, andranno incontro a morte.
Di conseguenza abbiamo dimostrato che due frammenti di DNA contenenti due diversi geni possono essere
congiunti per ottenere una molecola di DNA ricombinante e questa molecola è funzionale.
Quindi i batteri, da questo momento, sono diventati dei bioreattori in grado di riprodurre qualsiasi tipo di
sostanza che potesse essere stratta ed impiegata per qualsiasi scopo.
Ovviamente si sfrutta il batterio, e non la cellula eucariotica, poiché ha la possibilità di riprodursi in maniera
esponenziale in brevi periodi di tempo.
Attraverso la possibilità di utilizzare la replicazione esponenziale dei batteri, non faccio altro che creare dei
Cloni o gruppi di batteri che hanno un determinato patrimonio genetico, soprattutto plasmidico, e ho così la
possibilità di andare a costruire le librerie genomiche. (METODO DEL CLONAGGIO)

Gli enzimi di restrizione possono essere utilizzati, oltre nel clonaggio, per analizzare il DNA genomico
mediante la tecnica del Southern Blot (analogo del western blot che si riferiva ad una separazione su gel
delle proteine, mentre il Southern blot si riferisce a separazione su gel di acidi nucleici, in particolare del
DNA).
Il campione viene digerito con uno più enzimi di restrizione per generare frammenti di DNA di diverse
dimensioni che vengono poi separati mediante elettroforesi su gel, dove le diverse lunghezze dei frammenti
creano una sorta di mappa del DNA, che può essere utilizzata in diagnostica per analizzare mutazioni sui
geni specifici presenti in un individuo virgola di una famiglia o di una popolazione (RFLP).
Quindi questo è lo studio della lunghezza dei polimorfismi ottenuti tramite gli enzimi di restrizione.
Gli enzimi di restrizione possono essere utilizzati anche per distinguere alleli diversi di uno stesso gene (non
definibili come mutazioni), quindi, per analizzare i cambiamenti di una singola base nel DNA, ossia un
polimorfismo di un singolo nucleotide (SNP).
 Ciò è possibile solo se il SNP modifica il sito di restrizione presente nell’allele.
Con questa strategia, l’enzima di restrizione può essere utilizzato per analizzare il genotipo in un campione
di DNA, al posto del sequenziamento genico, che sarebbe peraltro molto più costoso.
Gli enzimi di restrizione sono quindi utilizzati per il DNA fingerprinting come nelle analisi di paternità.

Come abbiamo visto per le proteine,

anche per il DNA si può seguire un
iter:
- Come prima cosa bisogna
estrarre e purificare il DNA
dalle cellule.
- Si prosegue con la digestione
del DNA con gli enzimi di
restrizione per poi avere una
separazione dei frammenti del
DNA in elettroforesi di
agarosio. Il processo di
separazione lungo questo gel,
dall’alto verso dove la
corrente è a polo negativo,
verso il basso, che presenta il polo positivo ed il DNA essendo carico negativamente si sposta verso
il basso.
La separazione, oltre ad essere in funzione della carica, è anche in funzione delle dimensioni dei frammenti
(i frammenti più piccoli arriveranno verso la fine)
- Già a questo punto è possibile visualizzare, tramite dei coloranti, l’acido nucleico sul gel, oppure si può
continuare trasferendo i frammenti del DNA su un Blot, ossia su una membrana, procedendo con la
visualizzazione del frammento.
- In alternativa, se sono interessata ad una parte di DNA è possibile procedere con l’ibridazione con una sonda
marcata specifica per il mio gene d’interesse.
- Procedo con il lavaggio della membrana per eliminare la sonda in eccesso e passo all’esposizione su lastra
auto radiografica.

Variabilità genetica
In generale la diversità genetica offre alle specie maggiore capacità di adattamento e di sopravvivenza in
casi di particolari eventi o cambiamenti ambientali.
La varietà genetica è dovuta principalmente alle mutazioni e ai processi di ricombinazione cromosomica.
Le alterazioni che interessano le regioni codificanti del gene portano alla formazione di nuovi alleli ossia
forme alternative di uno stesso gene che sono trasmesse alle generazioni successive solo quando interessano
le cellule della linea germinale quindi ovociti e spermatozoi.
attraverso queste alterazioni sia quella che si definisce variabilità allelica punto
l’allele è la variante di un gene, ossia la forma alternativa di un gene.
Un allele selvatico è l’allele più diffuso nella popolazione in un organismo diploide, in cui è presente una
copia di ciascun cromosoma, il genotipo è dunque costituito da due alleli per un determinato gene.

Il POLIMORFISMO A SINGOLO NUCLEOTIDE costituisce il 90 % di tutte le variazioni genetiche.

I polimorfismi a singolo nucleotide si possono presentare non solo all'interno di una sequenza codificante,
ma anche all'interno di una regione intronica o in una regione Inter genica.
Questa alterazione riguarda una base della sequenza della molecola del DNA.
 La differenza tra polimorfismo a singolo nucleotide e mutazione puntiforme sta nell’incidenza con cui si
presentano: la variazione di un unico nucleotide presente nella popolazione in una percentuale >1% è
definito Polimorfismo a singolo nucleotide; sei la frequenza di una variazione genica è inferiore all' 1% si
parla di mutazione che produce inoltre un’alterazione funzionale del gene.
Possiamo dire che ci sono circa 10 milioni di variazioni geniche noti nel genoma.
L’alterazione della sequenza produce un’alterazione della proteina; solitamente gli SNPs vanno a variare la
performance della proteina, ma la proteina continua a funzionare.

ANALISI DELLA VARIABILITÀ GENETICA MEDIANTE Southern blot: RFLP

La RFLP è una tecnica che si basa sull’analisi della differenza nella lunghezza di sequenza riguardanti
regioni omologhe di DNA, che può essere analizzata dopo la digestione del DNA in questione con specifici
enzimi di restrizione.
RFLP rappresenta una sorta di marcatore molecolare: il pattern di bande per ciascun determinato gene è
caratteristico quando si usa uno o una combinazione di enzimi di restrizione.
Il frammento di restrizione per l’analisi della regione polimorfica (RFLP) possono produrre pattern
differenti quando nel campione lo stesso gene presenta due alleli differenti per il sito polimorfico, cioè
quando lo SNP è in eterozigosi.
Profili RFLP sono utilizzati nella mappatura del genoma e l’analisi di variazioni genetiche, come la
genotipizzazione, le analisi forensi, i test di paternità etc.

immaginiamo di avere un gene delimitato in

uno spazio ben preciso.
In questo frammento sono stati individuati tre
siti di restrizione, il che vuol dire che se io
metto la molecola di questo gene a contatto con
l’enzima di restrizione, dopo la
frammentazione l’enzimi produrrà due
frammenti 1 e 2.
I due frammenti sono di differente lunghezza
tra di loro.
Immaginiamo di proseguire con il nostro
metodo e facciamo questa miscela frammentata nel nostro gel.
Questo rappresenta la mia prima LAIN, linea.
Alla fine dell’analisi se metto in evidenza il mio gel e voglio andare a vedere dove sono localizzati i
frammenti, mi accorgo che i frammenti che si sono generati sono DUE, quindi ci sono tre siti di restrizione,
e che i frammenti hanno due dimensioni differenti in quanto il primo si blocca prima poiché più grande, ed il
secondo arriva più in basso proprio perché è più piccolo.
Se sullo stesso gene intervengono delle mutazioni la mappa di restrizione andrà a cambiare.
a) Ipotizziamo che il frammento ha subito una mutazione importante che è l’inserzione nel frammento più
corto (si è inserito in quella porzione un frammento in più).
Immaginiamo che stiamo trattando o un soggetto differente del caso precedente, o stiamo prendendo in
esame l’altro allele dello stesso soggetto di prima.
Se io ripeto tutto quello che ho fatto prima, mi aspetto di osservare nella mappa di restrizione rispetto, a
quella normale, due frammenti differenti in quanto il frammento 1 è uguale, quindi si andrà a fermare sullo
stesso livello, mentre il frammento 2, a causa dell’inserzione, sarà più grande rispetto al frammento 2 di
prima, e di conseguenza, si andrà a fermare prima.
QUINDI PER QUEL GENE ESISTE UN ALTRO ALLELE E QUEL GENE HA SUBITO
UN’ALTERAZIONE.
c. Stessa cosa varrà se l’inserzione avviene nel frammento più lungo, il numero 1.
Il frammento piccolo si troverà sullo stesso livello del normale, mentre il frammento 1 mutato andrà a
posizionarsi al di sopra rispetto alla posizione dell’1 normale.
d. Se al posto di avere un’inserzione ho una
delezione nella mappa andrò a notare che ci
sarà una modifica nel frammento 1 che,
avendo perso un pezzetto, ha un peso
molecolare più basso rispetto all’1 normale,
e di conseguenza, si andrà a posizionare più
in basso.
Nel frammento due, non avviene nessuna
mutazione.
b) Se notiamo la mappa in b notiamo che ho
ottenuto UN SOLO SEGNALE con un peso
molecolare maggiore rispetto ad 1.
Questo frammento che si ottiene è una mutazione puntiforme non confrontabile con nessun altro caso
evidenziato.
La mutazione ricade nel sito di restrizione, di conseguenza il DNA in presenza dell’enzima che dovrebbe
tagliare, l’enzima non riconosce il sito e non lo taglia.
Questo vuol dire che mancando la zona di taglio, i frammenti che otterrò è UNO.
Questo è molto più grande degli altri.

andiamo a vedere cosa accade quando si vanno a paragonare le mappe di restrizione sul genoma totale di
due individui, uno sano e uno malato a causa di una malattia ereditaria correlata al suo genoma.
Anche qua avremo il gene in duplice copia e, immaginiamo, di avere degli alleli normali e avere anche il
gene che in corrispondenza del sito di
restrizione è mutato per una mutazione
puntiforme.
Quando andremo a fare un’analisi RFLP,
ossia del pattern delle bande, e se
utilizziamo delle sonde oltre a confrontare
tutte le bande che vengono fuori dalla
frammentazione e dalla separazione, si può
mettere in evidenza la presenza o l’assenza
del gene wild type.
Quindi dall’analisi del pattern di
restrizione posso andare a diagnosticare
delle malattie ereditarie associate a degli
alleli.
La stessa cosa potrebbe essere condotta nell’ analisi della variabilità genetica mediante Southern blotting e
RFLP nella diagnosi di malattie ereditarie all’interno di una stessa famiglia.
Questo ci permette di effettuare una GENOTIPIZZAZIONE: conoscere il genotipo, ossia gli alleli che il
soggetto esprime per un determinato gene.
Come ben sappiamo il genotipo può essere omozigote dominante, omozigote recessivo, eterozigote.
Molto spesso le malattie ereditarie si manifestano in caso di omozigosi recessiva.
Se andiamo a vedere nell’AA due alleli wild type, con tre siti di restrizione, mi darà nella mappa due
frammenti, uno più grande ed uno più piccolo.
Nel genotipo aa si andrà ad evidenziare un solo frammento, poiché è stato soggetto a mutazione.
Nel genotipo Aa, dove abbiamo un allele wild type e uno mutato, nella mappa di restrizione andrò ad
evidenziare i due segnali normali, ed il singolo segnale che corrisponde all’allele mutato. Di conseguenza
avrò tre bande.
Quando si va a studiare l’ereditarietà di una malattia si va a considerare il genotipo dei genitori.
Se i genitori sono eterozigoti, nella loro mappa di restrizione si trovano tre bande.
I figli saranno: AA con due frammenti, Aa con tre frammenti e aa con un frammento.
 Un altro modo di utilizzare la mappa dei
frammenti di restrizione è nei metodi per
la rilevazione dei test di paternità, o il
riconoscimento di DNA nelle scene di un
crimine.

PCR
La reazione a catena della polimerasi (in inglese: Polymerase Chain Reaction), comunemente nota con la
sigla PCR, è una tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di
frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali.
L'amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale
genetico necessaria per le successive applicazioni.
Questa tecnica viene impiegata in una procedura molto più ampia.
La PCR è un processo ciclico; ci sono dei Cicli ripetuti di:
1. Denaturazione al calore
2. Primers (oligonucleotidi viola)
3. Polimerizzazione con polimerasi Taq (resistente al calore)
Le principali applicazioni della PCR sono:
-Identificazione di agenti patogeni nell’uomo, negli animali o negli alimenti come batteri e virus;
-Identificazione di organismi geneticamente modificati (OGM)
-Analisi del DNA in medicina legale come test di paternità;
-Diagnosi prenatale di malattie genetiche come l'anemia falciforme, la distrofia di Duchenne, la talassemia;
-La diagnosi di malattie tumorali come i linfomi,
-Il clonaggio e il sequenziamento di prodotto PCR.

I principali tipi di PCR sono:

 RT-PCR: serve a valutare l'espressione di un gene trami dell'amplificazione dell’RNA Messaggero da esso
trascritto.
 PCR competitiva: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o RNA attraverso l'amplificazione in
contemporanea con un DNA standard, aggiunto in quantità nota alla miscela di reazione.
Il campione standard si amplifica con la stessa coppia di inneschi del DNA di interesse.
 NESTED PCR: serve ad ottenere una maggiore specificità del prodotto di amplificazione utilizzando in
successione due coppie di inneschi: la prima più esterna mentre la seconda più interna rispetto al segmento
DDNA di interesse punto.
 Multiplex PCR: consente di amplificare contemporaneamente diversi segmenti dello stesso gene di interesse
utilizzando coppie di inneschi differenti come la distrofia Duchenne
 PCR Real Time: consente sia di monitorare in tempo reale l'andamento della reazione di PCR utilizzando
sostanze fluorescenti e sia di misurare la quantità assoluta di molecola di partenza.
RT-PCR: REVERSE TRANSCRIPTASE- POLYMERASE CHAIN REACTION
La tecnica della RT-PCR è una variante della tecnica della reazione a catena della polimerasi PCR.
Questa tecnica consiste nella sintesi di una molecola di DNA doppio filamento a partire da uno stampo di
RNA.
La molecola di DNA sintetizzata mediante il processo di retro-trascrizione è definita cDNA.
Mediante l'impiego della RT-PCR è possibile convertire in DNA un intero trascrittoma (un insieme di tutto
il trascritto di una cellula) di uno specifico tessuto di un individuo in una specifica fase del suo sviluppo.
Per tale motivo, la RT-PCR è una tecnica che viene sfruttata il laboratorio per studiare l'espressione genica,
perché consente di sottoporre ad ulteriore analisi il cDNA sintetizzato.
Il prodotto della retro-trascrizione dell'RNA, anche detta reazione first-strand, può essere amplificato
mediante PCR classica, oppure essere quantificato mediante real-time PCR.
Per retro-trascrizione si intende la trascrizione su templato di mRNA nel cDNA complementare.
L’uso degli enzimi retro-trascrittasi risale a quando furono scoperti i meccanismi molecolari con cui i virus a
RNA si replicavano all’interno delle cellule infettate.
Si parte dall’RNA e arrivo al DNA, ed è quindi come se la trascrizione andasse al contrario.
Il cDNA che io ottengo è complementare al filamento di mRNA.
Il cDNA ci serve per fare studi di espressione: attraverso la conversione stiamo analizzando il pool di
mRNA che si trovano all’interno di una cellula.
Si parte da un RNA estratto nella sua totalità dalla cellula e questo viene convertito in cDNA il quale è più
stabile e si può conservare per un periodo di tempo maggiore.
Il cDNA che si utilizza per la PCR è a singolo filamento e risulta essere complementare al trascritto di
mRNA con un senso inverso che è 5’3’

Misura del livello di espressione (trascrizione) di un gene: RT-PCR

Per misurare il livello di mRNA trascritto da un determinato gene e quindi avere indicazioni sul suo livello
di espressione (es. tessuto, organo, batteri, cellule di coltura, etc.) è necessario:
-estrarre l’RNA totale dal campione biologico che si vuole esaminare.
- trasformare il pool di RNA (che conterrà anche l’mRNA trascritto dal gene d’interesse) in cDNA tramite la
reazione di trascrizione inversa.
-evidenziare il cDNA di interesse tramite la reazione di PCR utilizzando una coppia di primers specifici.

Nella cellula di un tessuto sono presenti tutti i geni del genoma, ma solo quelli caratteristici di un tessuto
sono attivi.
Il profilo di espressione genica o “pattern di espressione” è l'insieme dei geni attivati in un tessuto.
Se consideriamo due cellule normali appartenenti a tessuti diversi possiamo evidenziare che sebbene
contengano RNA messaggiare proteine comuni, che rappresentano i geni costituitivi, ciascuna di queste
cellule a un RNA Messaggero e delle proteine peculiari, caratteristiche di quel tessuto.
Inoltre, è possibile misurare le differenze tra un tessuto normale ed un tessuto tumorale dello stesso tipo,
analizzandone l’espressione genica.
Mentre cellule normali di uno stesso tessuto presentano un identico profilo di espressione, quando insorge
un tumore tale profilo varia.
Le alterazioni dell’espressione genica possono causare variazioni nella produzione delle proteine o nella loro
reciproca interazione.
Le proteine fondamentali potrebbero non essere più disponibili, altre essere prodotte in eccesso.
Le cellule tumorali derivano quindi da una combinazione di più variazioni a livello genico e proteico.