quando il batterio si divide,le copie del vettore si ripartiscono tra le cellule figlie :da ogni

singola cellula batterica si genera così una colonia di cellule identiche,o clone,ciascuna
contenente molte copie del gene introdotto nel vettore ricombinante.Si dice che a questo
punto il gene è stato clonato.

clonaggio genico :grazie al clonaggio genico è possibile generare diversi cloni di cellule
batteriche,ciascuno dei quali contiene milioni di copie del gene di interesse.

1 passaggio):isolamento di uno specifico frammento di dna che ci interessa clonare .Per

separare un frammento dalla molecola di dna che lo contiene ,per esempio un cromosoma,si
sfrutta l’azione di una particolare classe di enzimi:le endonucleasi di restrizione.Questi
enzimi fanno parte dei sistemi di difesa naturale dei batteri,che li producono per degradare il
dna dei virus che li infettano.le endonucleasi di restrizione sono enzimi che idrolizzano il
legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti all’interno di una doppia elica di dna.
-questi enzimi sono ideali per il clonaggio per la loro capacità di tagliare entrambi i filamenti
di una molecola di dna a doppia elica in corrispondenza di una specifica sequenza bersaglio.
uno degli enzimi più usati è ecori (il batterio di origine)->questi producono delle estremità
coesive ,che sono molto utili per il clonaggio .In natura esistono centinaia di
endonucleasi di restrizione diverse,ciascuna in grado di riconoscere una determinata
sequenza di nucleotidi di dna.

2)ottenuto il frammento di dna,è necessario inserirlo nel vettore plasmidico per ottenere il
dna ricombinante.(proviene da unione del gene di interesse + vettore plasmidico)
la natura ci viene incontro fornendo l’enzima necessario:la dna ligasi
la dna ligasi è in grado di ricostruire il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti
utilizzando l’atp come cofattore.
tutte le cellule viventi possiedono la dna ligasi->è essenziale per le reazioni di replicazione e
riparazione del dna .
a questo punto possiamo sfruttare gli enzimi di restrizione e la loro capacità di formare
estremità coesive.il vettore e il frammento genico da incorporare nel vettore di clonaggio
vengono tagliati entrambi con lo stesso enzima di restrizione,per esempio ecori e poi
mescolati.in questo modo le estremità coesive presenti sul frammento possono unirsi
spontaneamente alle estremità complementari presenti nel vettore formando legami a
idrogeno.

i vettori plasmidici
-vengono utilizzati per il clonaggio
-sono ottenuti da plasmidi batterici naturali tramite manipolazioni genetiche
-sono molecole di dna circolare a doppia elica lunghi alcune migliaia di nucleotidi.

tutti i vettori contengono alcuni elementi essenziali:

-un origine di replicazione per consentire la replicazione del plasmide ad ogni divisione
cellulare
-uno o più geni per la resistenza ad antibiotici,che agiscono come marcatori per selezionare
le cellule che hanno incorporato il vettore
-un sito multiplo di clonaggio o polylinker in cui sono presenti,una vicina all’altra,numerose
sequenze di riconoscimento per diversi enzimi di restrizione:questa è la regione,in
cui ,grazie a tagli di restrizione,viene inserito il frammento di dna da clonare.
quali sono i diversi modi per inserire vettori plasmidici all’interno delle cellule.?
-tecnica della trasformazione batterica )->che sfrutta la capacità dei batteri di inglobare
frammenti di dna se stimolati in modo opportuno,per esempio tramite il calore o campi
elettrici.
i plasmidi hanno una loro origine di replicazione,grazie alla quale possono duplicarsi
autonomamente all’interno del batterio.Per la loro duplicazione i plasmidi sfruttano l’apparato
replicativo delle cellule batteriche,in quanto non contengono geni per gli enzimi
replicativi,come la dna polimerasi.A partire da un’unica bolla replicativa,si generano due
forcelle di replicazione che procedono in senso opposto.Poichè il plasmide è
circolare ,quando le due forcelle si incontrano,la replicazione termina e genera due molecole
identiche del plasmide.i plasmidi possono passare facilmente da un batterio all’altro.per
esempio quando una cellula batterica muore o viene lisata,i plasmidi rilasciati sono assorbiti
da cellule batteriche adiacenti attraverso il processo di trasformazione batterica.)
-microiniezione ->non tutte le cellule acquistano facilmente come i batteri il dna esogeno,nel
caso delle cellule animali,per esempio il dna può essere iniettato direttamente al loro interno
mediante una procedura chiamata microiniezione.
-biolistica:permette di sparare il dna nelle cellule dopo averlo caricato su microproiettili di
materiali inerti come l’oro.

librerie genomiche:sono collezioni di cloni batterici ciascuno contenente un diverso framento

di dna .
con questo sistema si può creare una serie di cloni,che nel loro insieme,racchiudono tutto il
genoma di un organismo da cui poi estrarre il frammento di dna che interessa.Nelle
genoteche i frammenti genici contengono sia le sequenze codificanti (esoni )sia le seguenze
non codificanti(introni)
spesso il modo più conveniente per isolare e clonare un gene eucariotico consiste nel partire
dal corrispondente mrna perché tutti gli introni sono già stati rimossi durante lo
splicing.Tuttavia non è possibile clonare direttamente una molecola di rna all’interno del
vettora a dna.Per farla è prima necessario convertire il filamento singolo dell’mrna nella sua
copia a dna,chiamata cdna.Questi frammenti sono poi usati per creare una libreria cdna che
contiene quindi solo i geni espressi dalla cellula.Per generare la molecola di cdna si utilizza
l’enzima trascrittasi inversa dei retrovirus,che è in grado di utilizzare un RNA a singolo
filamento per generare una copia a dna a doppia elica .

libreria a cdna-rispetto a quella genomica richiede alcuni passaggi aggiuntivi per convertire
gli mrna in cdna .
è una genoteca che contiene tutti i geni espressi da una determinata cellula.
1)il primo passo è l’isolamento degli mrna cellulari.Per fare questo le cellule vengono
lisate,cioè frammentate con l’uso di appositi tamponi.
2)gli mrna purificati sono convertiti in cdna dalla trascrittasi inversa.
3)con la dna ligasi,alle estremità di ciascun cdna sono saldati dei corti oligonucleotidi con la
sequenza di riconoscimento per un enzima di restrizione.In questo modo tagliando i cdna,e
un opportuno vettore con lo stesso enzima,si formeranno estremità coesive identiche ,adatte
per il clonaggio.
4)l’ultimo passaggio consiste nel trasformare una cellula ospite con la miscela dei vettori
ottenuti,ciascuno contenente un diverso cdna.

la reazione a catena della polimerasi o pcr

immaginiamo di voler isolare nuovamente in forma pura un cdna già inserito all’interno di un
clone della libreria a cdna.In passato questa fase comportava una serie molto lunga e
complessa di passaggi.oggi il compito è facilitato dalla tecnica della reazione a catena della
polimerasi o pcr

la pcr sfrutta due fenomeni :la tendenza di due filamenti di dna con sequenza
complementare ad appaiarsi spontaneamente e la capacità dell’enzima dna polimerasi
di copiare un filamento di dna stampo.

il dna stampo di una reazione di pcr può essere di qualunque tipo:da un corto
filamento di dna a un intero genoma.
il dna stampo sarà il vettore di clonaggio contenente il cdna,che stiamo cercando
nella libreria.prima di procedere alla pcr,questo vettore deve essere estratto e
purificato lisando le cellule batteriche che lo contengono.una volta estratto il dna
stampo viene inserito nella miscela di reazione della pcr,in cui è presente una coppia
di oligonucleotidi di dna,detti primer,ciascuno complementare all’inizio e alla fine
della sequenza da amplificare:i primer forniscono l’innesco per la reazione di
polimerizzazione.

dato che le sequenze dei vettori di clonaggio sono note,è oggi possibile usare per la pcr
coppie di primer universali che sono complementari alle sequenze a monte e a valle del
polinker di uno specifico vettore,questi primer universali possono essere usati anche per
amplificare tramite pcr qualsiasi frammento di dna clonato,senza bisogno di conoscerne la
sequenza.
la pcr avviene attraverso la ripetizione ciclica di una sequenza standard di reazioni.ogni ciclo
di reazione della pcr comprende 3 fasi:
-denaturazione:si alza la temperatura fino a 90 gradi ,per rompere i legami ad idrogeno che
uniscono i filamenti complementari del dna contenenti la regione da amplificare
-ibridazione:la temperatura viene abbassata fino a 50 gradi per consentire l’appaiamento dei
primer a dna stampo ,(all’estremità della regione bersaglio)
-allungamento :la dna polimerasi sintetizza la prima copia della porzione della dna stampo
compresa tra i due primer.La reazione avviene a temperature intorno ai 60 gradi per
garantire la specificità della reazione:a queste temperature solo i primer appaiati alle
sequenze perfettamente complementari rimarranno legati al dna stampo.

terminata la fase di allungamento il campione viene riportato a 90 gradi e si ha una

nuova denaturazione ,in cui tutte le molecole di dna a doppio filamento si aprono:si
comincia così un nuovo ciclo di reazione
partendo da una singola copia di una sequenza di dna stampo,dopo un primo ciclo di
replicazione si otterranno due copie .
la pcr permette di disporre di una quantità di dna sufficiente per condurre le analisi chimiche
e le manipolazioni genetiche.