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Domande biochimica applicata: Istoni (interazione DNA-proteine), duplicazione DNA e ruolo telomerasi,

riparazione DNA, duplicazione frammenti di Okazaki, mutazioni, basi azotate e loro appaiamento (disegno
SEMPRE), differenze polimerasi I-III, funzione telomerasi, sintesi proteica, modificazioni post trascrizionali
mRNA, trascrizione RNA, sintesi tRNA, tRNA e ruolo aminoacil-tRna-sintasi, splicing, clonazione,
cromatografia d'assorbimento, elettroforesi, risposte SOS, oncogeni, traslocazioni e diagnosi con PCR,
operazione LAC e sintesi triptofano, applicazioni PCR, elisa, cromatografia, maldi, sequenziamento di Sanger,
tecniche di proteomica (cromatografia-elettroforesi)
1u1C8A1C 03/03/2013
CSSl8lLl uCMAnuL ul 8lCCPlMlCA ALlCA1A
- nucleoLldl e nucleosldl (sLruLLura e legame)
- curva dl denaLurazlone
- cosLlLuenLl dna ( genl,lnLronl)
- dna pollmerasl (Llpo1,2,3)
- cromaLografla,eleLLroforesl
- sLruLLura del cromosoma
- Lopolsomerasl ( classl,funzlone)
- lsLonl
- eplgeneLlca
- pcr
- Lelomerasl
- Lrascrlzlone 8nA
- operone LAC
- legame AA-adenlna
- 1-8nA slnLeLasl
- slnLesl proLelca
n.8. SoLLollneaLl gll argomenLl che chlede plu spesso





8lSCS1L:
1) lS1Cnl : Gli istoni sono proteine basiche che costituiscono la componente strutturale
della cromatina
[1][2]
. Risultano essere le pi abbondanti proteine della cromatina andando a costituirne
l'80-90% circa..Sono proteine basiche cariche positivamente, poich posseggono un gran numero
(circa il 20%
[1]
) di amminoacidi con catena laterale basica, in particolare lisina e arginina. Gli istoni
interagiscono con il DNA, che carico negativamente a causa dell'abbondanza di gruppi fosfato, per
formare strutture dette nucleosomi.Il ruolo fondamentale degli istoni quello di organizzare il DNA,
compattandolo in maniera ordinata, in modo tale da consentire alle cellule di conservarlo in un volume
ristretto come quello del nucleo
[12]
. Nell'uomo il fattore di compattazione del genoma pari a quasi
10000
[13]
volte



2)DUPLICAZIONE DNA :


3)TELOMERASI : La telomerasi una ribonucleoproteina, un enzima che aggiunge sequenze
ripetitive di DNA non codificante, TTAGGG" per tutti i vertebrati ed altri organismi, al terminale 3' dei
filamenti di DNA nelle regioni dei telomeri, che si trovano alle estremit dei cromosomi eucariotici,
riallungando cos i telomeri accorciati in modo da mantenere integri i cromosomi.
Si tratta di una vera e propria trascrittasi inversa (o DNA polimerasi RNA-dipendente, numero
EC 2.7.7.49
[1]
), dal momento che utilizza frammenti di RNA, propri, come stampo per l'elongazione dei
telomeri


4)RIPARAZIONE DNA : La riparazione del DNA un processo che opera costantemente nelle cellule;
essa essenziale alla sopravvivenza in quanto protegge il genoma da danni e mutazioni nocive. Nelle
cellule umane, sia le normali attivit metaboliche che i fattori ambientali (quali i raggi UV) possono
causare danno al DNA, determinando almeno 500000 singole lesioni molecolari per cellula al giorno
[1]
.
Tali lesioni provocano danno strutturale alla molecola di DNA, e possono alterare in maniera
drammatica il modo in cui la cellula legge le informazioni contenute nei suoi geni. Di conseguenza, il
processo di riparazione del DNA deve lavorare in continuazione, per correggere qualsiasi danno nella
struttura del DNA.
Quando la cellula invecchia, tuttavia, la velocit di riparazione del DNA decresce fino a che non pu
tenere pi il passo con la creazione del danno al DNA. A quel punto la cellula va incontro ad uno dei tre
possibili destini:
1. Uno stato di dormienza irreversibile, detto senescenza.
2. Il suicidio della cellula chiamato apoptosi o morte cellulare programmata.
3. La carcinogenesi, ossia la formazione del cancro.
La maggior parte delle cellule del corpo diviene inizialmente senescente. Poi, dopo un danno
irreparabile al DNA, va incontro ad apoptosi. In tal caso, l'apoptosi rappresenta un meccanismo di
ultima istanza per prevenire la trasformazione carcinogenica di una cellula, pericolosa per l'organismo.
Quando le cellule divengono senescenti, le alterazioni nella biosintesi e nel turnover determinano una
minore efficienza nel loro funzionamento, causando inevitabilmente malattia. La capacit di riparazione
del DNA in una cellula vitale per l'integrit del suo genoma e quindi per il normale funzionamento della
cellula stessa e di tutto l'organismo. Molti geni, originariamente ritenuti capaci di influenzare la durata
della vita, si sono dimostrati coinvolti nella riparazione e nella protezione dal danno al DNA
[2]
.
Errori nella correzione delle lesioni in cellule che producono gameti danno origine ad una progenie
mutata e quindi possono influenzare la velocit di evoluzione.


5)DUPLICAZIONE FRAMMENTI OKAZAKI : Dal momento che la sintesi del DNA pu avvenire solo in
direzione 5'!3' e che l'origine di replicazione (rappresentato da una specifica sequenza di nucleotidi)
non si trova mai all'estremit 5' o 3' (motivo per cui si forma la cosiddetta bolla replicativa), solo uno dei
due filamenti appartenenti alla stessa corsia, detto filamento guida (o filamento leader, filamento
veloce o, in inglese, leading strand), pu essere sintetizzato in maniera continua, utilizzando un unico
innesco.
L'altro filamento, invece, chiamato filamento in ritardo (detto anche filamento lento o lagging strand in
inglese), deve essere sintetizzato in direzione opposta alleading (in direzione 3'- 5'), sotto forma di
piccoli frammenti discontinui, definiti appunto frammenti di Okazaki. Per tale motivo, in realt,
il filamento tardivo dunque composto da diversi filamenti, la cui sintesi inizia vicino alla forca
replicativa a partire da un innesco (in inglese primer) da parte dell'enzima DNA polimerasi III. Il primer
verr poi rimosso dall'enzima RNAsi H e sostituito con DNA da parte della DNA polimerasi I. Il
frammento viene poi legato al frammento successivo grazie alDNA ligasi tramite un legame
fosfodiesterico per creare una catena di DNA continua.
Questo modello di replicazione discontinuo fu postulato da Reiji Okazaki, il quale dimostr l'esistenza
dei frammenti di DNA, che da lui presero in seguito il nome.
Si noti che la replicazione del DNA bidirezionale, a opera di forchette di replicazione che operano in
entrambe le direzioni lungo il doppio filamento di DNA; pertanto un singolo filamento di DNA
contemporaneamente guida per la duplicazione in una direzione e in ritardo in direzione opposta; i
frammenti di Okazaki si formano sulle "met" percorse dalle forchette di replicazione in direzione 3'!5',
quindi su entrambi i filamenti della doppia elica del DNA.


5)MUTAZIONI DNA : Per mutazione genetica si intende ogni modifica stabile ed ereditabile nella
sequenza nucleotidica di un genoma o pi generalmente di materiale genetico (sia DNA che RNA)
dovuta ad agenti esterni o al caso, ma non alla ricombinazione genetica.
[1]
Una mutazione modifica
quindi il genotipo di un individuo e pu eventualmente modificarne il fenotipo a seconda delle sue
caratteristiche e delle interazioni con l'ambiente.
Le mutazioni sono gli elementi di base grazie ai quali possono svolgersi i processi evolutivi. Le
mutazioni determinano infatti la cosiddetta variabilit genetica, ovvero la condizione per cui gli
organismi differiscono tra loro per uno o picaratteri. Su questa variabilit, tramite la ricombinazione
genetica, opera la selezione naturale, la quale promuove le mutazioni favorevoli a scapito di quelle
sfavorevoli o addirittura letali. Essendo una parte delle mutazioni non favorevoli, gli organismi hanno
sviluppato diversi meccanismi per la riparazione del DNA dai vari danni che pu subire, riducendo in
questo modo il tasso di mutazione.
Le mutazioni vengono distinte dai genetisti in base alla loro scala di azione: l'alterazione pu riguardare
un singolo gene, porzioni del genoma o l'intero corredo cromosomico.
Se le mutazioni avvengono in una cellula somatica queste, assieme ai relativi effetti, saranno presenti
in tutte le cellule da essa derivate per mitosi; alcune di queste mutazioni possono rendere le cellule
maligne e provocare il cancro,e sono responsabili di alcune malformazioni congenite. Se le mutazioni
sono presenti nelle cellule delle linee germinali o neigameti sono ereditate dalle generazioni successive
e possono eventualmente provocare malattie genetiche ereditarie.


6)BASI AZOTATE E APPAIAMENTO : In biochimica, per base azotata si intende una delle
cinque basi che compongono i nucleotidi del DNA e dell'RNA. Si distinguono in purine e pirimidine.
Purine: Adenina e Guanina
Pirimidine: Citosina, Timina e Uracile
Nel DNA si trovano entrambe le purine e, tra le pirimidine, citosina e timina. Nell'RNA la timina
sostituita dall'uracile. Nel DNA le basi si accoppiano a due a due con legami a idrogeno, mentre
nell'RNA, essendo questo una catena singola, non sono legate tra loro.
DNA: adenina-timina e citosina-guanina.
RNA: adenina-uracile e citosina-guanina.
Ogni tipo di base presente su un filamento forma un legame con la base posta sul filamento opposto.
Tale evento noto come appaiamento complementare. Le basi puriniche formano legami idrogeno con
le basi pirimidiniche: A pu legare solo T e G pu legare solo C. L'associazione di due basi viene
comunemente chiamata paio di basi ed l'unit di misura maggiormente utilizzata per definire la
lunghezza di una molecola di DNA. Dal momento che i legami idrogeno non sono covalenti, essi
possono esser rotti e riuniti in modo relativamente semplice, poich questi sono legami ad alta energia.
I due filamenti possono essere allontanati tra loro, come avviene per unacerniera, sia dalle
alte temperature che da un'azione meccanica (come avviene durante la replicazione del
DNA).
[32]
Conseguenza di questa complementarit che tutte le informazioni contenute nella doppia
elica possono essere duplicate a partire da entrambi i filamenti, evento fondamentale per una corretta
replicazione del DNA.
[19]

I due tipi di paia di basi formano un numero differente di legami idrogeno: A e T ne formano due, G e C
tre. Per tale motivo, la stabilit del legame GC decisamente maggiore di quello AT. Di conseguenza,
la stabilit complessiva di una molecola di DNA direttamente correlata alla frequenza di GC presenti
nella molecola stessa, nonch alla lunghezza dell'elica: una molecola di DNA dunque tanto pi stabile
quanto pi contiene GC ed lunga.
[33]
Un'altra conseguenza di tale evento il fatto che le regioni di
DNA che devono essere separate facilmente contengono un'elevata concentrazione di A e T, come
avviene ad esempio per il Pribnow box deipromotori batterici, la cui sequenza infatti TATAAT.
[34]

In laboratorio, la stabilit dell'interazione tra filamenti misurata attraverso la temperatura necessaria a
rompere tutti i legami idrogeno, chiamata temperatura di melting (o T
m
). Quando tutti i legami idrogeno
sono rotti, i singoli filamenti si separano e possono assumere strutture molto variegate.
[35]

La stabilizzazione della doppia elica, in ogni caso, non dovuta ai soli legami idrogeno, ma anche
ad interazioni idrofobiche e di pi stacking.
[36]



7)DIFFERENZE POLIMERASI 1,2,3 : La DNA Polimerasi I non l'enzima principale della replicazione,
il cui ruolo spetta alla DNA polimerasi III (nota per questo anche come replicasi). Svolge invece:
una funzione di riparazione dei danni del DNA, riempendo brevi regioni a singolo filamento;
un ruolo accessorio durante la replicazione, consistente nel sostituire i ribonucleotidi (RNA) con
deossiribonucleotidi (DNA), sul filamento lagging, una volta che l'RNasi H e una esonucleasi hanno
rimosso gli inneschi dei frammenti di Okazaki.



La DNA polimerasi II non risulta essenziale per la replicazione del DNA. La sua azione indotta
da danni al DNA. Ha attivit polimerasica 5'!3'. La DNA polimerasi II capace di riempire i gap
(buchi) di DNA, che hanno quindi una singola elica, senza bisogno di un primer a RNA; svolge
quindi una funzione di "gap filling", ovvero riempie zone della molecola di DNA non complete.
Queste zone non devono superare le 100 coppie di basi. Ha alta fedelt di scrittura, ovvero
commette pochi errori, ma per questo ha bassa processivit, e non pu quindi essere utilizzata
nella normale sintesi. La sintesi di questa polimerasi indotta durante la fase stazionaria di
crescita della cellula. una fase in cui possono capitare errori di sintesi di DNA, fra cui piccoli
gaps, buchi, che bloccano la DNA polimerasi III, la quale svolge la stragrande maggioranza
della sintesi con la sua elevata processivit. In queste circostanze la DNA polimerasi II risolve il
problema riniziando la sintesi nel buco. La DNA Polimerasi II differisce dalla DNA Polimerasi I in
quanto non ha attivit esonucleasica 5'->3' (esclusiva della Polimerasi I).
Assemblaggio[modifica | modifica sorgente]
La premessa necessaria all'assemblaggio della DNA pol III l'apertura della forca di
replicazione tramite un'elicasi, a cui, tramite un connettore, si lega il clamp loader (complesso !). A
questo punto avvengono una serie di passaggi in rapida successione:
Inizialmente il clamp loader, dopo aver legato un anello ", idrolizza una molecola di ATP e carica
l'anello su un complesso DNA stampo-primer (questo costituir il filamento leading);
Legando il DNA, l'anello " modifica la conformazione del clamp loader, che acquisisce un'elevata
affinit per il nucleo polimerasico. In questo modo il vero corecatalitico della polimerasi si lega al
DNA: lo scopo dell'anello " proprio "legare" il complesso al filamento;
Il dimero # svolge la sua funzione di "dimerizzazione" e lega il secondo nucleo polimerasico,
associato ad un altro anello ".
Ciascuno dei due complessi dell'oloenzima sintetizzer ora, rispettivamente, uno dei nuovi filamenti di
DNA, a una velocit di circa 1000 nucleotidi al secondo. Analizziamo ora in dettaglio il complesso
meccanismo per la replicazione del filamento lagging
Replicazione del filamento lagging
Mentre una volta che viene ancorato all'enzima il filamento leading non perde pi affinit con
il core catalitico (se non dopo pi di 500000 basi, facendone una delle polimerasi a pi alta affinit per
la catena nucleotidica, proprio grazie allo sliding clamp), la sintesi del filamento lagging richiede una
serie di passaggi ciclici, durante i quali verranno continuamente attaccati e rilasciati nuovi anelli " dal
filamento. Questo perch essendo la polimerizzazione obbligatoriamente in direzione 5'-3', per riuscire
a sintetizzare continuativamente in direzione opposta la polimerasi costretta a creare una serie
di loop consecutivi con il filamento. Il primo passo il caricamento di un anello " sul clamp loader (ad
assemblaggio completato), che, con idrolisi di ATP viene aperto dalla subunit $ e caricato sul DNA.

8)FUNZIONE TELOMERASI : I telomeri sono le parti finali dei cromosomieucariotici, sono formati da
sequenze oligomeriche ripetute. La necessit di queste strutture terminali palese se si considera che
tutte le DNA polimerasi conosciute duplicano le catene diDNA dall'estremit 3' e che tutte richiedono
un primer a RNA o (solo per certe DNA-polimerasi eucariotiche) a DNA. Quando la forcella di
replicazione si avvicina all'estremit del cromosoma lineare, la sintesi del filamento guida continua
regolarmente sino alla fine della catena stampo del DNA; la doppia elica figlia rilasciata dopo essere
stata duplicata interamente.
La catena stampo per il filamento lento, invece, copiata in modo discontinuo. Quando l'ultimo innesco
a RNA rimosso, non c' nessun innesco a monte cui una DNA polimerasi possa legarsi per riempire il
vuoto derivante dalla rimozione di tale primer. A causa di ci, il filamento di DNA che si formato come
filamento tardivo sarebbe accorciato ad ogni divisione cellulare. La telomerasi evita questo progressivo
accorciamento del filamento tardivo agendo come unatrascrittasi inversa. Al suo interno contiene infatti
un RNA stampo (3'-AAUCCCAAU-5') che serve per prolungare la catena stampo di DNA (parentale).
Un ulteriore estensione dell'estremit 3' della catena stampo di DNA fornisce il modello necessario per
la DNA polimerasi % per completare la sintesi del filamento in ritardo (lagging) a partire da ulteriori
primers. Questo meccanismo lascia comunque a livello del telomero un filamento sporgente
all'estremit 3'. Nei cromosomi dei mammiferi, la fine a singolo filamento serve per formare un loop,
producendo una struttura a tripla elica simile al D-loop mitocondriale, che stabilizzata da legami con
proteine telomero-specifiche. Queste proteine nell'uomo sono denominate complesso Shelterin.

9)SINTESI PROTEICA : La sintesi proteica (detta
anche traduzione, proteosintesi, proteogenesi, protidogenesi, proteinogenesi,
o proteoneogenesi) il processo biochimico attraverso il quale l'informazione genetica contenuta
nel mRNA (RNA messaggero), viene convertita inproteine che svolgono nella cellula un'ampia gamma
di funzioni. La sintesi proteica inizia da un filamento di mRNA, prodotto a partire da
un gene sul DNA attraverso il processo di trascrizione. Questo filamento usato come stampo per la
produzione di una specificaproteina. Quando si parla di sintesi proteica del tessuto
muscolare scheletrico, liscio o cardiaco, viene chiamata nello specificomiogenesi.
10)TOPOISOMERASI : Le topoisomerasi sono una categoria di enzimi appartenenti alla classe
delle isomerasi che regolano il metabolismo del DNA, scoperti da James Wang e Martin Gellert. In
particolare, le topoisomerasi determinano un aumento o una diminuzione del grado
di superavvolgimento. Tali enzimi svolgono un ruolo fondamentale nell'impacchettamento e nella
replicazione del DNA. Pi in dettaglio, essi sono in grado di introdurre una rottura del singolo o del
doppio filamento di DNA in modo temporaneo.
Classificazione[modifica | modifica sorgente]
Esistono due classi di topoisomerasi.
Le topoisomerasi I (o DNA topoisomerasi propriamente dette, numero EC 5.99.1.2
[1]
) rompono
transitoriamente una sola delle catene del DNA, la ruotano attorno a quella integra e infine
riuniscono le estremit interrotte, modificando il numero di legame "Lk" con incrementi positivi di 1.
Dal momento che il DNA superavvolto in senso destrogiro, un incremento positivo di Lk porta in
effetti ad un rilassamento della doppia elica, un processo termodinamicamente favorevole. Il
cambiamento del numero di legame topologico di un'unit per volta.
Le topoisomerasi II (DNA topoisomerasi idrolizzanti ATP, numero EC 5.99.1.3
[1]
), invece, rompono
entrambe le catene di DNA e modificano Lk con incremento negativo di 2; dal momento che
introduce un ulteriore stress topologico nella doppia elica, questa reazione necessita di energia,
prodotta attraverso l'idrolisi di una molecola di ATP. Esse permettono di cambiare il numero di
legami topologici di due unit per volta.
Funzione
L'acido desossiribonucleico (DNA) una molecola troppo complessa ed enormemente lunga per
essere contenuta facilmente all'interno di un contenitore biologico come una cellula (nel caso dei
procarioti) o un nucleo (negli eucarioti). La lunghezza del DNA del cromosoma di Escherichia Coli, ad
esempio, di 1,7 mm, laddove la lunghezza di una tipica cellula dello stesso batterio di soli 2 m: pi
di 800 volte pi piccola del proprio DNA. Per raggiungere un grado di compattezza tale da poter
impacchettare il DNA, salvaguardando l'accesso rapido all'informazione codificata al suo interno, le
cellule possiedono l'apparato delle topoisomerasi, la cui funzione appunto quella di introdurre
superavvolgimenti nella superelica di DNA. La topologia introduce una particolare grandezza,
chiamata numero di legameLk per quantificare il grado di superavvolgimento: Lk aumenta con
superavvolgimenti positivi (levogiri) e diminuisce con superavvolgimenti negativi (destrogiri). Due
molecole di DNA che differiscono tra loro soltanto per una variazione del numero di legame, sono
definite topoisomeri.

10) EPIGENETICA : L'epigenetica (dal greco !"#, ep = "sopra" e $!%%!&'()*, gennetiks = "relativo
all'eredit familiare") si riferisce ai cambiamenti che influenzano il fenotipo senza alterare il genotipo,
essendo una branca dellagenetica che studia tutte le modificazioni ereditabili che variano l&espressione
genica pur non alterando la sequenza del DNA, e quindi i fenomeni ereditari in cui il fenotipo
determinato non tanto dal genotipo ereditato in s, quanto dalla sovrapposizione al genotipo stesso di
"un'impronta" che ne influenza il comportamento funzionale. Un segnale epigenetico un qualsiasi
cambiamento ereditabile che non altera la sequenza nucleotidica di un gene, ma altera la sua attivit.
lo studio delle modifiche fenotipiche ereditabili nell'espressione del gene, dal livello cellula (fenotipo
cellulare) agli effetti sull'intero organismo (fenotipo, in senso stretto), causato da meccanismi diversi dai
cambiamenti nella sequenza genomica, ovvero lo studio di meccanismi molecolari mediante i quali
l'ambiente altera il grado di attivit dei geni senza tuttavia modificare l'informazione contenuta, ossia
senza modificare le sequenze di DNA
[1]
. stata definita da Arthur Riggs e colleghi come "lo studio dei
cambiamenti mitotici e meiotici ereditabili che non possono essere spiegati tramite modifiche della
sequenza di DNA".
[2]

Queste mutazioni, dette epimutazioni, durano per il resto della vita della cellula e possono trasmettersi
a generazioni successive delle cellule attraverso le divisioni cellulari, senza tuttavia che le
corrispondenti sequenze di DNA siano mutate;
[3]
sono quindi fattori non-genomici che provocano una
diversa espressione dei geni dell'organismo
[4]
. Su fenomeni epigenetici si basa la maggior parte dei
processi di differenziamento cellulare.
Tra i possibili meccanismi che possono provocare effetti epigenetici si annoverano
modificazioni del DNA = addizione covalente di gruppi a sequenze specifiche
(metilazione della citosina) da parte delle metiltrasferasi
modificazione delle proteine = addizione covalente di gruppi a specifiche proteine
della cromatina (modificazioni post-traduzionali degli istoni).Queste modificazioni includono
acetilazione, metilazione,ubiquitinazione, fosforilazione,sumoilazione
inattivazione del Cromosoma X
Silenziamento genico
Questi processi alterano l'accessibilit fisica alle regioni del genoma, sulle quali si
legano proteine e enzimi deputati all'espressione genica e quindi alterano l'espressione del gene.

11)PCR : La reazione a catena della polimerasi (in inglese: Polymerase Chain Reaction),
comunemente nota con la sigla PCR, una tecnica di biologia molecolare che consente la
moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le
sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. L'amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro
molto rapidamente la quantit di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni.
La PCR ricostruisce in vitro uno specifico passaggio della duplicazione cellulare: la ricostituzione
(sintesi) di un segmento di DNA "completo" (a doppia elica) a partire da un filamento a singola elica. Il
filamento mancante viene ricostruito a partire da una serie di nucleotidi (i "mattoni" elementari che
costituiscono gli acidi nucleici) che vengono disposti nella corretta sequenza, complementare a quella
del DNA interessato.
Questo processo viene svolto in natura da enzimi chiamati DNA-polimerasi, che sono in grado di
sintetizzare progressivamente un nuovo filamento di DNA nelle seguenti condizioni:
devono essere disponibili i nucleotidi da polimerizzare, sotto forma di desossiribonucleosidi trifosfati
(dNTP);
il DNA deve essere denaturato, ovvero le due eliche che compongono i filamenti devono essere gi
separate;
il segmento da ricostruire pu essere soltanto prolungato, ovvero non possibile sintetizzare un
nuovo filamento a partire da zero;
devono inoltre essere rispettate opportune condizioni di temperatura, pH, ecc.
possibile quindi ricostruire le condizioni che portano alla formazione dei nuovi segmenti di DNA,
ponendo in soluzione:
una quantit, anche minima, del segmento di DNA che si desidera riprodurre;
una quantit opportuna di nucleotidi liberi per costituire i nuovi filamenti;
opportuni "inneschi", detti primer, costituiti da brevi sequenze di DNA (oligonucleotidi)
complementari agli estremi 3& dei due filamenti del segmento da riprodurre;
una DNA polimerasi termo-resistente (non necessario che provenga dallo stesso organismo di cui
si deve replicare il DNA);
un Buffer che serve a mantenere il pH stabile (tampone) e necessario per costituire l'ambiente
adatto alla reazione;
altri elementi di supporto (ad es. ioni magnesio) indispensabili per il corretto funzionamento della
DNA polimerasi;
acqua per portare a volume la soluzione.
Per avviare la reazione della polimerasi (fase di prolungamento del filamento a partire dal primer 5&)
prima necessario provvedere alla separazione dei filamenti del DNA (fase di denaturazione), quindi alla
creazione del legame tra i primer e le regioni loro complementari dei filamenti di DNA denaturati (fase
di annealing). Questo processo risulta per incompatibile con la DNA polimerasi umana, che viene
distrutta alle temperature necessarie alla denaturazione (96-99 C).
Per ovviare a questo inconveniente si fa ricorso alle polimerasi appartenenti a organismi termofili che
non sono inattivate dalle alte temperature, ad esempio la Taq polimerasi proveniente dal batterio
termofilo Thermus aquaticus. Ci consente di realizzare pi cicli di PCR in sequenza, in ciascuno dei
quali viene duplicato anche il DNA sintetizzato nelle fasi precedenti, ottenendo una reazione a
catena che consente una moltiplicazione estremamente rapida del materiale genetico di interesse.

12)TRNA : L'RNA transfer (o RNA di trasporto), abbreviato in tRNA, una piccola catena di RNA (di
74-93 nucleotidi) che trasferisce un amminoacido specifico di una catena polipeptidica in crescita al
sito ribosomiale della sintesi proteica durante latraduzione. Il tRNA ha un sito di attacco per
l'amminoacido ed una regione con tre basi (nucleotidi), chiamata anticodone, che riconosce il
corrispondente codone a tre basi dell'mRNA attraverso l'appaiamento di basi complementari.
[1]
Ogni
tipo di molecola di tRNA pu legarsi ad un solo tipo di amminoacido, ma essendo presenti nel DNA tipi
diversi di codoni che specificano uno stesso amminoacido, molti tipi di tRNA con anticodoni differenti
possono portare lo stesso amminoacido.
Il tRNA ha una struttura primaria (l'ordine dei nucleotidi da 5' a 3'), una struttura secondaria (chiamata
comunementestruttura a trifoglio), ed una struttura terziaria (tutti i tRNA hanno una simile struttura 3D a
forma di L che permette loro di entrare nei siti P ed A dei ribosomi

13)SPLICING : In biologia molecolare e in genetica, splicing (dall'inglese: montaggio) una modifica
del nascente pre-mRNA che avviene insieme o dopo la trascrizione, nella quale gli introni sono rimossi
e gli esoni vengono uniti. La cosa necessaria per il tipico RNA messaggero prima che possa essere
usato per produrre una corretta proteina tramite la traduzione o sintesi proteica.
Inizialmente, il sito di splicing 5' viene riconosciuto dalla snRNP U1. Una delle subunit di U2AF si lega
al segmento polipirimidinico, mentre l'altra si lega al sito di splicing 3'. la prima subunit interagisce con
BBP e aiuta questa proteina a legarsi al punto di ramificazione. Questo arrangiamento di proteine e
RNA chiamato complesso precoce E. A questo punto, la snRNP U2 si lega al punto di ramificazione,
con l'aiuto di U2AF, e spiazza BBP. Questo arrangiamento chiamato complesso A. L'appaiamento di
basi tra l'snRNA U2 e il punto di ramificazione tale che il residuo A del punto di ramificazione venga
spinto fuori dal segmento risultante a doppia elica di RNA e formi una protuberanza a singolo
nucleotide. Questa A diventa cos non accoppiata e disponibile per la reazione con il sito di splicing 5'.
La fase successiva il riarrangiamento del complesso A per l'avvicinamento di tutti e tre i siti di splicing.
Questo avviene in una serie di fasi: le snRNP U4 e U6, assieme alla snRNP U5, si uniscono al
complesso. Queste tre snRNP assieme sono dette tripla snRNP U4\U6*U5, in cui le snRNP U4 e U6
sono tenute assieme dall'accoppiamento complementare delle basi dei loro corrispettivi snRNA, mentre
la snRNP U5 legata in maniera pi lassa attraverso interazioni proteina-proteina. Con l'ingresso della
tripla snRNP U4\U6*U5 il complesso A diventa complesso B. Nel passaggio successivo, U1 lascia il
complesso e U6 lo rimpiazza al sito di splicing 5'. Questo richiede che l'appaiamento tra l'snRNP U1 e il
pre-mRNA venga rotto per permettere all'RNA U6 di riappaiarsi nella stessa regione. Questi passaggi
completano l'assemblaggio. Il riarrangiamento successivo innesca la catalisi ed avviene nel modo che
segue: U4 viene rilasciato dal complesso permettendo ad U6 di interagire con U2. Questo
arrangiamento, chiamato complesso C, produce il sito attivo. Cio il riarrangiamento avvicina all'interno
dello spliceosoma quei componenti che assieme formano il sito attivo. Questo stesso riarrangiamento
assicura che l'RNA substrato sia posizionato correttamente. Il fatto che la formazione del sito attivo sia
successiva al completamento dell'assemblaggio dello spliceosoma rende il sito attivo disponibile solo
nei siti di splicing corretto. La formazione del sito attivo mette in prossimit il sito di splicing 5' del pre-
mRNA e il punto di ramificazione, facilitando la prima reazione di transesterificazione. La seconda
reazione, tra i siti di splicing 5' e 3', supportata dalla snRNP U5, che aiuta ad avvicinare i due esoni. Il
passaggio finale implica il rilascio dell'mRNA e delle snRNP. Queste sono prima legate al cappio
formatosi, ma vengono rilasciate in seguito alla rapida degradazione di questo frammento di RNA.

14)CURVA DI DENATURAZIONE :