Summary

• La replicazione del DNA è il processo mediante il quale una cellula replica

ciascun doppio filamento di DNA, prima di dividersi per generare due
cellule figlie.
• Esploreremo quindi il meccanismo di base della replicazione, che è stato
compreso dopo che Watson & Crick definirono la struttura del DNA.
• Esamineremo quindi le diverse modalità di replicazione, i requisiti per la
replicazione e la direzione universale della sintesi del DNA.
• Impareremo quali sono le proteine coinvolte nel processo.
Alcuni numeri…
Una stima attuale delle cellule totali che compongono un
essere umano di riferimento* calcolata per una varietà di
organi e tipi di cellule corrisponde ad un numero intorno a 3.72
x 1013 [Bianconi et al, 2013; Sender et al, 2016].

Ma le cellule nascono e muoiono costantemente.

Dato questo continuo turnover, quante cellule nuove si
generano in una persona durante la sua vita?
Si è calcolato che il numero totale di divisioni cellulari nella vita
di un individuo è dell'ordine di 1016.

* L'uomo di riferimento: un giovane adulto di 30 anni, del peso

di 70 kg, alto 1.72 m e con una superficie corporea di 1.85 m2
[Irving, 2007].
Alcuni numeri…

Una quantità enorme di informazioni genetiche e un numero enorme di divisioni

cellulari sono quindi necessari per produrre un organismo adulto multicellulare:
anche un basso tasso di errore durante la copia del DNA sarebbe catastrofico!
Uno zigote umano (monocellulare) contiene 6.4 miliardi di coppie di basi di DNA.
Se assumessimo un solo errore per milione di coppie di basi sintetizzate, ci
sarebbero circa 6400 errori ogni volta che una cellula si divide - errori che si
verificherebbero per ognuna delle milioni di divisioni cellulari che si verificano
durante lo sviluppo di un corpo umano completo:
numero di potenziali errori di replicazione del DNA =
numero totale di divisioni nella vita * numero di errori teorici =
1016 * 6400 = 6.4 * 1019
Alcuni numeri…

L’unico cromosoma circolare di E. coli contiene circa 4.6 milioni di coppie di

basi. Ad una velocità di oltre 1000 nucleotidi al minuto, la replicazione
dell'intero cromosoma richiederebbe quasi 3 giorni.
Ma questi batteri sono sorprendentemente capaci di dividersi in soli 20
minuti: infatti, E. coli replica il suo DNA ad una velocità di 1000 nucleotidi al
secondo, con meno di un errore in un miliardo di nucleotidi.

Come può essere cosi straordinariamente

accurato un processo così rapido?
La duplicazione del DNA è semiconservativa

La natura complementare dei due filamenti

nucleotidici presenti nella molecola di DNA - scoperta
da Watson e Crick - suggeriva che, nel corso della
replicazione, ogni filamento potesse fungere da
stampo per la sintesi di un nuovo filamento.
Questo processo è chiamato duplicazione
semiconservativa, perchè ciascuna delle nuove
doppie eliche conserva uno solo dei due filamenti
nucleotidici originali (ovviamente non più appaiato
con quello che lo accompagnava nella molecola
originale); la molecola originale di DNA, al termine
della replicazione, risulta così conservata per metà in
ciascuna delle due molecole figlie.
Come funziona la replicazione?

Le singole unità di replicazione sono chiamate repliconi, ognuno dei quali

contiene una origine di replicazione.
La replicazione inizia all'origine e continua fino a quando l'intero replicone è
stata duplicato. I cromosomi batterici hanno un'unica origine di replicazione,
mentre i cromosomi degli eucarioti contengono molte origini di replicazione.
Duplicazione «Theta»

Un tipo comune di replicazione che avviene in cellule con DNA circolare, come E. coli
e altri batteri, è chiamata replicazione theta.
Il DNA a doppio filamento inizia ad aprirsi in corrispondenza dell'origine di
replicazione, rendendo disponibili due stampi a singolo filamento. Lo srotolamento
della doppia elica genera un loop, chiamato bolla di replicazione. Lo svolgimento
può essere ad entrambe le estremità della bolla, rendendola progressivamente più
grande. La replica del DNA su entrambi i filamenti del modello è simultanea con lo
svolgimento. Il punto di svolgimento in cui i due singoli filamenti nucleotidici si
separano l’uno dall’altro è chiamato forcella di replicazione.
Se ci sono due forcelle di replicazione, una ad ogni estremità della bolla di
replicazione, le forcelle procedono verso l'esterno in entrambe le direzioni in un
processo chiamato replicazione bidirezionale, in cui il DNA è simultaneamente
aperto e replicato fino a quando alla fine le due forcelle si incontrano.
Duplicazione lineare negli eucarioti

I grandi cromosomi lineari nelle cellule eucariotiche, invece, contengono una

quantità di DNA molto più grande rispetto ai procarioti, che non può essere
replicato rapidamente se si utilizza una singola origine.

La replicazione eucariotica procede ad una velocità che va da 500 a 5000

nucleotidi al minuto per ogni forcella di replicazione (considerevolmente più
lenta della replicazione batterica). Pertanto, la sintesi del DNA a partire da
una singola origine richiederebbe 7 giorni per replicare un cromosoma
umano medio costituito da circa 100 milioni di coppie di basi di DNA.
Duplicazione lineare negli eucarioti

Invece, la replicazione dei cromosomi eucariotici

avviene in realtà nel giro di pochi minuti o ore, non di
giorni.
Questo tasso è possibile perché la replicazione di
ciascun cromosoma inizia da migliaia di origini di
replicazione simultaneamente: i repliconi tipici degli
eucarioti sono lunghi da 20.000 a 300.000 paia di
basi.
11
Requisiti della duplicazione

Durante la duplicazione sono necessari tre elementi principali:

1. le materie prime (= substrati) da assemblare in un nuovo filamento
nucleotidico,
3. uno stampo costituito da DNA a filamento singolo ( = uno dei due
filamenti di un cromosoma),
2. enzimi e altre proteine che "leggono" lo stampo e "assemblano" i
substrati in una nuova molecola di DNA (la sintesi del DNA non avviene
spontaneamente).
I monomeri

Le materie prime da cui vengono

sintetizzate le nuove molecole di DNA
sono i deossiribonucleosidi trifosfati
(dNTPs), ciascuno composto da uno
zucchero deossiriboso e da una base
azotata (un nucleoside) collegata a
tre gruppi di fosfati.
Lo stampo

Nella sintesi del DNA, i nucleotidi

sono aggiunti al gruppo 3′-OH del
filamento crescente.

Il gruppo 3′-OH dell'ultimo

nucleotide del filamento si lega al
gruppo 5′-fosfato di un nuovo
dNTP in ingresso. Due gruppi
fosfato sono liberati dal dNTP in
arrivo, e si crea un legame
fosfodiestere tra i due nucleotidi.
Direzione della replicazione
• La DNA polimerasi, l'enzima che sintetizza il DNA, può solo aggiungere nucleotidi alla
estremità 3′ del filamento in crescita (non al terminale 5′), e quindi i nuovi filamenti di
DNA si allungano sempre nella stessa direzione 5′→3′.
• Poiché i due stampi di DNA a singolo filamento sono antiparalleli e l'allungamento del
filamento è sempre 5′→3′, se la sintesi su un modello procede, ad esempio, da destra a
sinistra, allora la sintesi sull'altro modello deve procedere nella direzione opposta, da
sinistra a destra.
La sintesi del DNA è continua su
un filamento di DNA e
discontinua sull'altro
Mentre il DNA si apre, il filamento dello
stampo esposto nella direzione 3′→5′
permette al nuovo filamento di essere
sintetizzato continuamente, nella
direzione 5′→3′.
Questo nuovo filamento, che va
incontro ad una replica continua, è
chiamato filamento guida.
La sintesi del DNA è continua su
un filamento di DNA e
discontinua sull'altro
L'altro filamento stampo è esposto invece nella direzione 5′→3′.
In tal caso, dopo che un breve tratto di DNA è stato srotolato, la
sintesi deve procedere con la direzione 5′→3′, che è opposta a
quella dello svolgimento.
A quel punto, più DNA è stato srotolato, fornendo un nuovo
template alla fine 5′ del nuovo filamento. La sintesi del DNA deve
ricominciare dalla forchetta di replicazione e procedere nella
direzione opposta a quella del movimento della forcella, fino a
quando non incontra il segmento di DNA precedentemente
sintetizzato.
Questo processo si ripete per molte volte, e così la sintesi di
questo filamento avviene per una successione di scatti brevi e
discontinui. Il nuovo filamento appena costituito, che va incontro
a replicazione discontinua, è chiamato filamento in ritardo.
La sintesi del DNA è continua su
un filamento di DNA e
discontinua sull'altro
I brevi segmenti di DNA prodotti dalla replicazione
discontinua del filamento in ritardo sono chiamati
frammenti di Okazaki, dal nome di Reiji Okazaki,
che li ha scoperti.
Nelle cellule batteriche, ogni frammento di Okazaki
ha una lunghezza che varia da 1000 a 2000
nucleotidi circa; nelle cellule eucariotiche, sono
lunghi da 100 a 200 nucleotidi.
I frammenti di Okazaki sul filamento in ritardo sono
collegati tra loro dall'enzima DNA ligasi per creare
una nuova molecola di DNA continua.
Duplicazione del DNA nei batteri

La replica si svolge in quattro fasi:

1. iniziazione,
2. svolgimento,
3. allungamento,
4. terminazione.

Anche se molti aspetti della replicazione nelle cellule eucariotiche sono simili
a quelli delle cellule procariotiche, ci sono alcune importanti differenze.
 DNA pol.

Qui la DNA polimerasi non riesce a trovare

nessun 3'OH libero nella forchetta di
replicazione

Qui la primasi ha sintetizzato un breve primer ad

RNA, fornendo così un gruppo 3′-OH libero.
primase

3’OH
 Ora, la DNA polimerasi può attaccare nuovi
nucleotidi del DNA a quel 3' OH libero e
iniziare il processo di replicazione.

DNA pol.
DNA polimerasi

Nonostante le loro differenze, tutte le DNA polimerasi hanno molte caratteristiche comuni:
1. sintetizzano qualsiasi sequenza complementare al filamento dello stampo;
2. sintetizzano nella direzione 5′→3′ aggiungendo nucleotidi ad un gruppo 3′-OH libero;
3. utilizzano dNTPs come monomeri per sintetizzare il nuovo DNA;
4. richiedono un primer per iniziare la sintesi;
5. catalizzano la formazione di un legame fosfodiestere unendo il gruppo 5′-fosfato del
nucleotide in ingresso al gruppo 3′-OH dell’ultimo nucleotide presente sul filamento in
crescita, liberando due gruppi fosfato;
6. producono filamenti di nuova sintesi che sono complementari e antiparalleli ai
filamenti stampo;
7. sono associati con un certo numero di altre proteine.
DNA ligasi

La DNA polimerasi I sostituisce i nucleotidi del

primer dell'RNA con i nucleotidi del DNA; dopo
che l'ultimo nucleotide dell'RNA è stato sostituito
con i nucleotidi del DNA, un piccolo gap deve
essere saldato.
Il gruppo 3′-OH dell'ultimo nucleotide aggiunto
dalla DNA polimerasi I non è infatti collegato al
gruppo 5′-fosfato del primo nucleotide aggiunto
dalla DNA polimerasi III.
Questo gap è «sigillato» dall'enzima DNA ligasi.
In sintesi…

Ogni forcella di duplicazione attiva richiede l’intervento di…

 una elicasi per srotolare il DNA,
 una serie di proteine ssbp per proteggere i singoli filamenti nucleotidici e
prevenire la formazione di strutture secondarie,
 la topoisomerasi per rimuovere la deformazione torsionale in
corrispondenza alla forcella di replicazione,
 la primasi per sintetizzare i primer che rendano disponibile un gruppo 3′-
OH all'inizio di ogni frammento di DNA nascente, ed infine
 la DNA polimerasi per sintetizzare il filamento guida e quello in ritardo.
Duplicazione del DNA negli eucarioti

La replicazione nelle cellule eucariotiche presenta diverse difficoltà

aggiuntive:
1. la dimensione molto più grande dei genomi eucariotici richiede che la
replicazione sia iniziata a più origini.
2. i cromosomi eucariotici sono lineari, mentre i cromosomi procariotici
sono circolari
3. il modello di DNA è associato a proteine istoniche nei nucleosomi.
DNA Polimerasi eucariotiche

Alcune differenze significative nei processi di replicazione batterica ed

eucariotica sono nel numero e nelle funzioni delle DNA polimerasi.
Le cellule eucariotiche contengono un certo numero differente di DNA
polimerasi con ruoli nella replicazione, ricombinazione e riparazione del
DNA.
Replicazione alle estremità dei cromosomi

Una differenza fondamentale tra la replicazione eucariotica e quella batterica

deriva dal fatto che i cromosomi eucariotici sono lineari e quindi hanno delle
estremità.
Come già detto, il gruppo 3′-OH necessario per la replicazione da DNA
polimerasi è fornito all'inizio della replicazione dai primer di RNA che
vengono sintetizzati dalla primasi. Questa soluzione è temporanea perché,
alla fine, i primer devono essere rimossi e sostituiti da nucleotidi del DNA.
Replicazione alle estremità dei cromosomi

Quando il primer alla fine del

cromosoma è stato rimosso, non può
essere sostituito da DNA nucleotidi, e
ciò crea un gap alla fine del
cromosoma… il rischio è che il
cromosoma possa diventare
progressivamente più corto ad ogni
ciclo di replicazione …
Replicazione alle estremità dei cromosomi

Le estremità dei cromosomi (telomeri) possiedono diverse caratteristiche

uniche, una delle quali è la presenza di molte copie di una breve sequenza
ripetuta.
L'estremità sporgente del telomero può essere estesa dalla telomerasi, un
enzima composto da una proteina e da una componente di RNA (è pertanto
una ribonucleoproteina). La parte ad RNA dell'enzima contiene da 15 a 22
nucleotidi che sono complementari alla sequenza ripetuta che si trova sul
DNA telomerico.
Questa sequenza si accoppia con l'estremità sporgente di 3′ del DNA e
fornisce un modello per la sintesi di ulteriori copie di DNA telomerico
ripetuto. Di solito, da 14 a 16 nucleotidi sono aggiunti al terminale 3′
dell’estremità sporgente.
https://www.youtube.com/watch?v=TNKWgcFPHqw