ESPERIMENTI SUL DNA

Dopo la 2° guerra mondiale la chimica ha consentito di vedere un’enorme diversità di proteine e si chiese se
queste fossero depositarie dell’informazione.

Due esperimenti rispondono a questa domanda:

1. Esperimento di Griffith

Identificarono in due modi la sostanza che trasformava i batteri:

- Eliminando altre possibilità  quando i campioni trattati venivano analizzati, quelli trattati con
RNasi e proteasi (che distruggono RNA e preteine) erano ancora in grado di trasformare batteri
R in batteri S. L’attività si perdeva negli estratti trattati con DNasi (che distrugge il DNA)
- Facendo esperimenti positivi  isolarono il DNA virtualmente da un estratto che conteneva la
sostanza trasformante. Il DNA da solo era in grado di trasformare le cellule.
2. Gli esperimenti di Harshey e Chase hanno confermato che il materiale genetico è il DNA

Harshey e Chase si accinsero a determinare quale

parte del virus (DNA o proteine) entrava nella cellula
ospite per causare questo cambiamento genetico.
Un altro esperimento risale agli anni ’50  diffrazione dei raggi X

Wilkins scoprì un modo per produrre fibre altamente organizzate di DNA, adatte a studi di diffrazione a
raggi X. I suoi campioni vennero analizzati da Rosalind Franklin. I dati suggerivano che il DNA fosse un’elica
doppia con 10 nucleotidi ogni giro intero.

Il diametro 2 nm indicava che lo scheletro di zuccheri e gruppi fosfato di ogni filamento di DNA si trovava
nella parte esterna dell’elica.

Watson e crick

 le basi disposte interiormente ai due filamenti, con uno scheletro di zuccheri e fosfati nella parte
esterna
 I filamenti di DNA correvano in direzioni opposte (antiparalleli)
 IL DNA
Il DNA si trova nei cromosomi, che diventano visibili solo quando si addensano in preparazione alla
divisione cellulare.

Applicando l’analisi biochimica scoprirono che i cromosomi sono costituiti sia da DNA sia da proteine.

CARATTERISTICHE DEL MATERIALE GENETICO:

 Dà informazioni: consente di dare un fenotipo

 Viene trasmesso: deve potersi duplicare senza errori per molte generazioni per mantenere costanti
le proprie caratteristiche (fenotipo) di quella cellula e/o di quella specie e poter essere trasferito
alle cellule figlie.
 È un materiale chimico stabile: il DNA è una molecola che vive a lungo, viene trasmessa fedelmente
mantenendo così le informazioni in modo utile.
 Si evolve: deve avere la capacità di cambiare (avere mutazioni) e di mantenere stabilmente questi
cambiamenti.
questa capacità spiega la diversità tra specie ed evoluzione
GENOTIPO (DNA)  FENOTIPO (proteine)
↓ ↓
Composizione risultante dei geni,
allelica cioè le proteine

COMPOSIZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI

DNA= acido desossiribonucleico

RNA= acido ribonucleico

Sono formati da:

1- Acido fosforico
2- Zuccheri

3- Basi azotate  anelli planari eterociclici

PURINE: a due anelli
- Adenina
- Guanina

PIRIMIDINE: singolo anello

o Timina
o Citosina
o Uracile (al posto della timina nell’uracile)
NUCLEOTIDI

 PURINICI
o Deossiadenosina-5’-monofosfato (dAMP)
o Deossiguanina-5’-monofosfato (dGMP)
 PIRIMIDINICI
o Deossicitosina-5’-monofosfato (dCMP)
o Deossitimina-5’-monofosfato (dTMP)

LEGGI DI CHARGAFF

Per primo ha studiato la composizione chimica degli organismi viventi

- La composizione in basi del DNA varia da una specie all’altra

- Molecole di DNA isolate da tessuti diversi della stessa specie hanno la stessa composizione in
basi
- La composizione in basi di DNA di una certa specie non si modifica in base all’età, allo stato
nutritivo o alle variazioni ambientali.

numero di residui di A = numero di residui di T

numero di residui di G = numero di residui di C

somma residui purinici = somma residui pirimidinici

A+G = T+C

CARATTERISTICHE PRINCIPALI

Una molecola di acido deossiribonucleico (DNA) consta di due catene polinucleotidiche (catene o filamenti)
ciascuna composta da 4 tipi di subunità nucleotidiche, che stanno insieme grazie a legami a idrogeno che
uniscono le basi azotate delle subunità nucleotidiche.

 Due catene avvolte in senso destrorso

 Gli scheletri zucchero-fosfato sono all’esterno della doppia elica e le basi sono orientate verso l’asse
centrale
 Ogni nucleotide è composto da uno zucchero fosfato unito a una base da un legame covalente.
 Le due estremità della catena si distinguono facilmente, perché una presenta il fosfato 5’ (-OPO3),
l’altra l’ossidrile 3’ (-OH).

 Per indicare la polarità del DNA si chiamano le estremità: terminale 3’ e terminale 5’.
 Questi due filamenti sono complementari e antiparalleli.
 Coppia di basi: una coppia purina-pirimidina.
  Questo appaiamento di basi complementari permette di compattare le coppie di basi
all’interno della doppia elica.
 Tra T e A si formano 2 legami a idrogeno
 Tra G e C si formano 3 legami a idrogeno

CURIOSITA’

 Una coppia di basi occupa 0,34 nm

 Un giro dell’elica completo occupa 3,4 nm
 10 basi per ogni giro d’elica
 Zucchero-fosfato non sono ugualmente spaziati formano due solchi: maggiore o minore
 DNA lungo dai 3 ai 4 miliardi di coppie di basi
 Circa 30 mila geni
 1,5% codifica proteine
 3,5% regioni estremamente conservate
 Circa il 50% degli elementi sono ripetuti (per conservare le copie originali)

LA STRUTTURA DEI CROMOSOMI EUCARIOTICI

Le molecole di DNA sono organizzate in cromosomi.

Il DNA nucleare si distribuisce in una serie di cromosomi diversi. Il DNA umano comprende circa 3,2 x 10 9
coppie di nucleotidi distribuite in 23 o 24 tipi di cromosomi.
CROMOSOMA = una molecola di DNA associata a proteine che ripiegano e compattano il filamento di DNA.
CROMATINA = complesso DNA-proteine.
CROMOSOMI OMOLOGHI = i cromosomi materno e paterno di ogni coppia.
CROMOSOMI SESSUALI = cromosoma X e cromosoma Y.
CARIOTIPO UMANO = immagine ordinata del corredo completo dei 46 cromosomi.
GENE = segmento di DNA che contiene le istruzioni per sintetizzare una certa proteina o una molecola di
RNA.
GENOMA = insieme delle informazioni genetiche contenute in tutti i cromosomi.
DNA SPAZZATURA = quantità enorme di DNA inframezzato, la cui utilità non è stata ancora dimostrata. È
quella parte di DNA che non viene utilizzata nella trascrizione. Più il genoma è grande e più l’organismo è
complesso, ma non è sempre vero.
CROMOSOMI INTERFASICI = una matassa morbida di DNA filamentoso che si forma nel nucleo,
nell’interfase, dove i cromosomi sono distesi.
CROMOSOMI MITOTICI = cromosomi molto compatti ad alta condensazione. Questo accade quando il DNA
si spiralizza perché il centromero provvede a suddividere ogni cromosoma duplicato durante la fase M.
CROMATIDI = cromosoma contenente due cellule figlie identiche, dopo una replicazione.
CROMOSOMI SINGOLI = un cromatidio una volta che è separato dal suo cromatidio fratello.
NUCLEOSOMA = il DNA si avvolge due volte a molecole di proteine
DNA LINKER = parte che congiunge un nucleosoma con l’altro.
Le proteine che si legano al DNA formando i cromosomi si suddividono in due classi:
- Proteine cromosomiche non istoniche
- Istoni: proteine basiche responsabili del primo livello di organizzazione della cromatina
(nucleosoma).
una singola particella nucleosomica consta di un complesso di 8 molecole
istoniche (istoni H2A, H2B, H3 e H4, due per tipo) e un tratto di DNA a
doppio filamento lungo 147 nucleotidi, che si avvolge intorno all’
ottamero istonico.
I quattro istoni sono a carica positiva e per questo si legano saldamente
all’ossatura zucchero-fosfato del DNA.
L’istone H1 induce i cromosomi a raggrupparsi in un insieme ripetitivo
ordinato.
La particella nucleosomica si ottiene dalla cromatina digerendola con una
nucleasi, un enzima che degrada il DNA, in modo da degradare il DNA
esposto, ma non il DNA avvolto intorno al
nucleosoma. Dissociando poi il nucleosoma si
riesce a determinare la lunghezza del tratto che
prima si trovava avvolto: con le sue 147 coppie
di basi, il DNA fa quasi 2 giri intorno al corpo
centrale istonico.
Le code di tutti gli istoni del nucleo centrale
sono soggette a vari tipi di modificazioni
covalenti. esse attraggono proteine differenti in
determinati segmenti di cromatina; alcune promuovono la condensazione
della cromatina e facilitano l’accesso al DNA. I complessi utilizzano
l’energia derivante dall’idrolisi dell’ATP per distendere il DNA
nucleosomico e farlo scivolare lungo l’ottamero di istoni, esponendo il
DNA ad altre proteine che legano il DNA.

ETEROCROMATINA = la forma più densa della cromatina

EUCROMATINA = il resto della cromatina.

Le modificazioni specifiche per l’eterocromatina che riproducono le stesse modificazioni sugli istoni
circostanti. Così l’eterocromatina può espandersi fino a quando incontra la sequenza di DNA che funge da
barriera bloccando la sua propagazione nelle regioni di eucromatina.
 LA REPLICAZIONE DEL DNA
Meselson e Stahl hanno preso dei batteri e metà li hanno fatti crescere in terreno con azoto pesante e metà
in terreno con azoto leggero.

Hanno visto che ultracentrifugando:

- Azoto normale  si posizionava normalmente

- Azoto pesante  si posizionava più in basso

Se l’azoto pesante veniva portato in azoto normale si generavano cellule che si posizionavano a metà (tra le
molecole si azoto semplice e quelle di azoto pesante).

Il DNA che si posizionava a metà lo hanno denaturato con la temperatura, facendo aprire i legami a
idrogeno e hanno notato che un filamento era composto da atomi di azoto normale, l’altro da atomi di
azoto pesante.

Questa è stata una dimostrazione formale del fatto che la replicazione è un meccanismo semiconservativo,
cosa che Watson e Crick avevano già ipotizzato.

LE FASI DELLA REPLICAZIONE:

1. La doppia elica del DNA viene aperta per separare i due filamenti stampo in
una regione precisa: ori (origine della replicazione) a cui si lega il complesso
pre-replicazione.
2. Nei procarioti la replicazione procede in entrambe le direzioni lungo il
cromosoma circolare, formando due forcelle di replicazione.
Negli eucarioti il DNA è più lungo e non è circolare.
3. La DNA elicasi utilizza l’energia ottenuta dall’idrolisi dell’ATP per svolgere e
separare i due filamenti
4. Le single-strand binding proteins (SSB) sono proteine leganti il singolo
filamenti che impediscono ai filamenti riassociarsi in una doppia elica.
5. Il primer è un piccolo filamento che dà inizio alla replicazione. Esso è
sintetizzato dalla primasi.
6. La DNA polimerasi aggiunge i nucleotidi all’estremità 3’ del primer e continua
fino a quando la replicazione è completata.
Le DNA polimerasi sono molto grandi e sono a forma di una mano destra
aperta.
Ci sono due filamenti che crescono in maniera diversa durante la
replicazione:
 FILAMENTO VELOCE: orientato in modo che possa crescere con
continuità alla sua estremità 3’ man mano che la forcella si apre.
 FILAMENTO RITARDATO: è orientato in modo che, mentre la forcella si apre, la sua
estremità 3’ si allontani sempre di più da questa, così che si forma una regione non
replicata.
Si formano così i frammenti di Okazaki. Ogni frammento richiede un suo proprio primer.
7. Man mano che i nuovi nucleotidi si appaiano con il DNA stampo, vengono uniti covalentemente
attraverso legami fosfodiestere, a formare un polimero con sequenza di basi complementare alle
basi nel filamento stampo.
 8. Quando la replicazione è completata la DNA polimerasi viene degradata e viene aggiunto nuovo
DNA al suo posto. La DNA ligasi unisce insieme i frammenti e rende continuo il filamento ritardato.
9. I telomeri sono le sequenze ripetute alla fine di ogni cromosoma. Quando un primer terminale di
RNA viene rimosso, all’estremità del cromosoma nessun DNA può essere aggiunto per rimpiazzarlo
perché non c’è alcuna estremità 3’ da allungare.
I nucleotidi terminali vengono rimossi e il cromosoma si accorcia.
Nelle cellule staminali l’enzima telomerasi utilizza uno stampo di RNA per estendere il telomero.
La telomerasi si sposta verso la nuova estremità terminale e la DNA polimerasi riempe lo spazio
vuoto.

Se un nucleotide prende conformazione sbagliata c’è attività di correzione

LA DNA POLIMERASI

La DNA polimerasi utilizza nucleotidi trifosfato (ATP, GTP,…) per catalizzare la formazione di un legame
fosfodiesterico tra il gruppo 3’OH del deossiribosio dell’ultimo nucleotide ed il fosfato in 5’ del nucleotide
da aggiungere.

L’energia di legame è data dalla liberazione di due fosfati (pirofosfato) dal nucleotide trifosfato utilizzato.

Fa viaggiare molto velocemente la duplicazione e in un’unica direzione (5’  3’)

È una sorta di mano che aggrappa la molecola, aggiunge un nucleotide e consente la formazione del legame
con la perdita e l’aggiunta dei fosfati.

LA REPLICAZIONE NECESSITA DI:

 Topoisomerasi (1-2): eliminano i superavvolgimenti

 Proteine: stimolano le DNA polimerasi
 Proteine iniziatrici: stimolano le polimerasi
 Primasi
 Elicasi
 DNA polimerasi
 Proteine: che stabilizzano il DNAss e lo proteggono dalla degradazione (a monte e a valle della
forcella)
 Ligasi

CURIOSITA’

- Da 500 a 1000 nucleotidi aggiunti al secondo

- DNA totale= 3-4 x 109 bp
- Replicazione = 40 minuti
- Fedeltà = 1 errore ogni 107 – 108 nucleotidi
 - Riparazione post replicativa = 1 errore ogni 10 9 nucleotidi.

LA TRASCRIZIONE DEL DNA

Un mutagene è qualcosa che danneggia il DNA, causando mutazioni: alterazioni ereditabili nella sequenza
del DNA.

Durante la trascrizione l’informazione nella sequenza di DNA (il gene) è copiata in una sequenza
complementare di RNA.

TIPI DI RNA:

1. RNA messaggero: quando un gene è espresso, uno dei due filamenti di DNA del gene è trascritto in
mRNA. Nelle cellule eucariotiche, l’mRNA viaggia dal nucleo al citoplasma, dove viene tradotto in
un polipeptide
RNA primario e secondario (maturo)
Nei procarioti l’mRNA può trasportare l’informazione trascritta da più geni; negli eucarioti da un
solo gene.
2. RNA ribosomiale: il ribosoma è una fabbrica per la sintesi di proteine, composta di proteine
multiple e diversi rRNA.
3. RNA transer: lega lo specifico amminoacido e riconosce una sequenza specifica di nucleotidi
nell’mRNA.
4. MicroRNA: regola l’espressione genica.

VIRUS

Trascrivono da RNA a RNA, creando un filamento di RNA complementare al loro genoma. Questo filamento
“opposto” viene quindi usato per fare copie multiple del genoma virale attraverso la trascrizione.

Il virus HIV, invece, dopo aver infettato la cellula ospite, fa una copia del suo genoma, che viene incorporata
nel genoma dell’ospite. Il virus utilizza i processi di trascrizione dell’ospite per produrre copie del proprio
RNA. Questo RNA può essere sia tradotto per produrre proteine virali, sia incorporato come genoma nelle
nuove particelle virali.

La sintesi di DNA a partire da RNA si chiama trascrizione inversa e questi virus sono chiamati retrovirus.

FASI DELLA TRASCRIZIONE:

1) INIZIO
La RNA polimerasi si lega a una sequenza di DNA chiamata promotore.
I geni eucariotici hanno ognuno un proprio promotore, nei procarioti e nei virus parecchi geni
condividono lo stesso promotore.
I promotori indicano alla RNA polimerasi la direzione e qual è il filamento corretto da usare da
stampo.
Parte di ogni promotore è il sito di inizio
Altre proteine aiutano a direzionare la polimerasi verso il promotore: fattori sigma e fattori di
trascrizione.
Le TATAbox sono componenti chiave di molti promotori e si lega all’RNA polimerasi II, solo negli
eucarioti.
2) ALLUNGAMENTO
La RNA polimerasi svolge il DNA circa 10 basi alla volta e legge il filamento stampo in direzione 3’ 
5’.
 La RNA polimerasi usa i (ribo)nucleosidi trifosfato (NTP) come substrati, rimuovendo due fosfati da
ogni substrato (defosforilazione) e utilizzando l’energia rilasciata per la reazione di
polimerizzazione.
A differenza del DNA, l’RNA polimerasi non necessita di un primer per far partire questo processo.
3) TERMINAZIONE
Sequenze particolari specificano la terminazione.
Nei batteri ci sono due meccanismi:
o Il trascritto neoformato forma un’ansa che causa il distacco del trascritto dal DNA stampo e
dalla RNA polimerasi.
o Una proteina coadiuvante si lega a sequenze specifiche sul trascritto e determina il distacco
dell’RNA dal DNA stampo.

EVENTI POST-TRASCRIZIONALI

Introni = sequenze del DNA che vengono trascritte e poi eliminate dal pre-mRNA nel nucleo.

Esoni = sequenze espresse lasciate nell’mRNA che raggiunge il ribosoma.

Gli introni interrompono, ma non rimescolano, la sequenza del DNA di un gene.

I trascritti primari dei geni eucariotici vengono modificati prima che lascino il nucleo. Entrambe le estremità
pre-mRNA vegono modificate e gli introni sono rimossi.

- Un cap (cappuccio) in 5’ viene aggiunto all’estremità 5’ del pre-mRNA. Il cappuccio al 5’ è una

molecola chimicamente modificata di guanosina trifosfato (GTP). Questa facilita il legame del
mRNA al ribosoma per la trascrizione, e protegge l’mRNA dalla digestione da parte delle
ribonucleasi che degradano gli RNA.
- Una coda di poli A viene aggiunta all’estremità 3’ del pre-mRNA alla fine della trascrizione.
Negli eucarioti (AAUAA) vicino all’estremità 3’ del pre-mRNA.
Questa sequenza agisce come segnale per un enzima che taglia il pre-mRNA.
Questa coda può facilitare la fuoriuscita dell’mRNA maturo dal nucleo ed è importante per la
stabilità dell’mRNA.
- Lo splicing
o Quando il pre-mRNA è trascritto, piccole ribonucleoproteine nucleari (snRNP) si legano
all’estremità di ogni introne.
o Ad ogni giunzione tra esoni ed esoni si trovano le sequenze consenso.
o Per mezzo dii ATP alcune proteine vengono aggiunte a formare un grosso complesso di RNA
e proteine chiamato spliceosoma. Il complesso taglia il pre-mRNA alle giunzioni tra esoni e
introni, rilascia gli introni, e unisce le estremità degli esoni per produrre l’mRNA maturo.
- Dopo che la maturazione è completata nel nucleo, l’mRNA maturo esce nel citoplasma attraverso i
pori nucleari. Nel nucleo il “complesso di legame del cappuccio” si lega al cap in 5’ dell’mRNA
processato. Questo complesso viene riconosciuto da un recettore del poro nucleare e attraversa il
poro.
- La trascrizione e gli eventi post-trascrizionali producono un mRNA pronto per essere tradotto in una
sequenza di amminoacidi di un polipeptide.

IL CODICE GENETICO

CODONE= specifica un particolare amminoacido.

Ogni codone è complementare a una tripletta di basi corrispondente nella molecola di DNA da cui è stato
trascritto.

Tutte le possibili combinazioni delle 4 basi danno 64 (4 3).

AUG = codone di inizio

UAA, UAG, UGA = codoni di stop

IL CODICE GENETICO E’ RIDONDANTE MA NON AMBIGUO

C’è più di un codone che codifica per più amminoacidi, ma c’è un solo amminoacido che codifica per un
codone.

Es: leucina  6 codoni

Metionina e triptofano  1 codone

LA TRADUZIONE DEL DNA

I tRNA hanno diverse funzioni:

- Lega con uno specifico amminoacido (è carico)

- Si lega all’mRNA per mezzo di legami a idrogeno. A circa metà della catena polinucleotidica del
tRNA c’è una tripletta di basi chiamata anticodone, che è il complementare del codone nell’mRNA
- Interagisce con i ribosomi. Il ribosoma ha diversi siti sulla sua superficie e il legame che si forma con
l’RNA transfert non è covalente.

Ogni codone di mRNA si lega solo a un tipo di tRNA, che porta un amminoacido specifico.

Il legame è ottenuto da una famiglia di enzimi: amminoacil-tRNA sintetasi.

La reazione avviene tramite ATP, e forma un legame ad alta energia tra l’amminoacido e il tRNA

IL RIBOSOMA:

 Negli eucarioti la subunità maggiore è costituita da 3 diverse molecole di RNA ribosomiale.

o Il sito A (amminoaciclico)  l’anticodone carico si lega al codone dell’mRNA, allineando
l’amminoacido corretto.
o Il sito P (peptidilico)  il tRNA aggiunge il suo amminoacido alla catena polipeptidica
o Il sito E (exit)  si trova il tRNA che ha già lasciato il suo amminoacido.
 I ribosomi dei procarioti sono più piccoli

Se tra le basi i legami a idrogeno non si sono formati correttamente, ciò significa che il tRNA è quello
sbagliato, e viene quindi espulso dal ribosoma.

LE FASI DELLA TRADUZIONE:

1. INIZIO
a. La subunità piccola del ribosoma si lega alla sua sequenza di riconoscimento sull’mRNA.
b. IL
c. Formazione di un complesso di inizio, che consiste nel tRNA carico e nella subunità minore
del ribosoma.
d. Nei procarioti l’rRNA si lea a un sito complementare di legame del ribosoma che si trova
sull’mRNA. Questa sequenza è meno di dieci basi a monte del codone di inizio.
 e. Negli eucarioti la subunità ribosomiale minore lega il cappuccio in 5’ dell’mRNA e poi si
muove lungo l’mRNA finchè non raggiunge il codone d’inizio.
f. AUG = codone di inizio
g. L’anticodone UAG di un RNA transfer carico di metionina lega il codone di inizio per
completare il complesso di inizio.
In molti casi la metionina iniziale viene rimossa dopo la traduzione.
2. ALLUNGAMENTO
 La subunità maggiore catalizza due reazioni (possiede attività peptidil transferasica):
o Rompe il legame fra tRNA e il suo amminoacido nel sito P
o Catalizza la formazione del legame peptidico tra questo amminoacido e quello
attaccato al tRNA che si trova nel sito A.
3. TERMINAZIONE