La replicazione del DNA

Questo modello di replicazione del DNA è noto come modello

semiconservativo, poiché ogni doppia elica glia conserva una delle 2 eliche
parentali.
A questi tempi (1953) erano stati proposti altri 2 modelli per la replicazione del
DNA, il modello conservativo e il modello dispersivo.

L’esperimento di Meselson e Stahl

Nel 1958 Meselson e Stahl ottennero la prova sperimentale che il modello di

replicazione semiconservativo era quello esatto.

Le cellule erano fatte crescere in terreno contenente 15N (pesante) per

numerosi cicli di replicazione e poi trasferite in terreno contenente 14N
(leggero).
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In tempi successivi, per molti cicli di replicazione, venivano prelevati dei
campioni; il DNA veniva estratto e analizzato mediante centrifugazione in
gradiente di cloruro di cesio (CsCI) che formava un gradiente, con il materiale
più leggero in alto e il materiale più pesate in basso.

Dopo un ciclo di replicazione (una generazione) in terreno contenente 14N,

tutto il DNA aveva una densità esattamente intermedia fra quella del DNA 15N
e quella del DNA 14N.

Dopo due cicli di replicazione, metà del DNA era ancora di densità
intermedia mentre l'altra metà era della densità del DNA 14N (Figura 3.2).

Queste osservazioni e quelle ottenute dai successivi cicli di replicazione

erano perfettamente compatibili con il modello semiconservativo.

La DNA polimerasi 1

L’approccio di Kornberg fu biochimico; egli propose di identi care tutti gli

ingredienti necessari per la sintesi in vitro del DNA di E. coli.

La prima sintesi fu ottenuta con successo in una miscela di 4 precursori

desossiribonucleosidi 5’-trifosfati, e 1 lisato di cellule di E. coli.

Kornberg analizzò il lisato e isolò un enzima responsabile della sintesi di

DNA. Questo enzima oggi viene chiamato DNA polimerasi 1 (DNA pol1).

Con l’isolamento della DNA pol1 fu possibile ottenere informazioni più

dettagliate. I ricercatori trovarono che erano indispensabili cinque componenti
per avere sintesi di DNA in vitro. La sintesi di DNA, infatti, non avveniva in
assenza di uno qualsiasi seguenti elementi:

1. Tutti i 4 dNTP. Queste molecole sono i precursori dei blocchi nucleotidici

per la costruzione del DNA per la costruzione del DNA;
2. La DNA pol1;
3. Un frammento di DNA di E. coli che funga da stampo, cioè una molecola
utilizzata per produrre una molecola complementare di DNA nella
reazione;
4. Un frammento di DNA come innesco (primer);
5. Ioni magnesio (Mg2+), necessari per la funzionalità ottimale della DNA
polimerasi 1.

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Il ruolo delle DNA polimerasi
Tutte le DNA polimerasi dei procarioti e degli eucarioti catalizzano la
polimerizzazione di precursori nucleotidi (dNTP) in una catena di DNA.

La reazione ha 3 caratteristiche fondamentali:

1. La catena di DNA in allungamento fornisce un’estremità 2’-OH libera, a

cui può essere aggiunto un nuovo nucleotide (funziona cioè da innesco);

2. A ogni tappa dell’allungamento della nuova catena di DNA, la polimerasi

trova il precursore (dNTP) giusto che può formare una coppia di basi.
Il processo non avviene con una precisione al 100% ma la probabilità di
errore è molto bassa (grazie a un meccanismo di correzione di bozze);

3. La direzione della sintesi della nuova catena di DNA è solo da 5’-3’.

Dal punto di vista funzionale Pol1 e DNA Pol3 sono polimerasi necessarie per
la replicazione (anche se ne esistono altre 3)

Pol1 e Pol3 sintetizzare il nuovo lamento di DNA nella direzione 5’-3’.

Entrambi gli enzimi hanno anche attività esonucleasica da 3’ a 5’; in altri

termini, essi possono rimuovere nucleotidi dall'estremità tre apostrofo della
catena di DNA. Questa attività enzimatica è utilizzata nel meccanismo di
correzione di bozze (proofreading).

Inizio della replicazione

L’inizio della replicazione avviene in un punto speci co, corrispondente a una

sequenza di DNA che viene indicata come origine di replicazione. Questi
punti di origine sono circa 20-80 (replicazione + veloce) distanziati tra loro, in
questi punti la doppia elica viene denaturata.

Il segmento di DNA denaturato localmente è denominato bolla di replicazione

. I segmenti delle singole eliche srotolate su cui vengono sintetizzate le nuove
eliche vengono chiamati lamento stampo (o madre).

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 Quando una molecola di DNA si srotola per esporre i lamenti stampo si
forma una struttura a forma di Y, chiamata forca di replicazione.

Perché la replicazione abbia inizio, una proteina iniziatrice deve legare

l’origine di replicazione o indurre la denaturazione locale della regione ricca
in AT.

Il processo di separazione di una molecola di DNA a doppio lamento in due

lamenti singoli è chiamato denaturazione del DNA o melting del DNA.
Le DNA elicasi sono reclutate e caricate sul DNA mediante proteine (DNA
helicase loader).

Le elicasi cominciano a srotolare il DNA in entrambe le direzioni a partire

dall’origine di replicazione, rompendo il legame a idrogeno fra le basi.

Successivamente, ogni DNA elicasi recluta l'enzima DNA primasi che

sintetizza un corto lamento di RNA primer (o innesco; circa 5-10 nucleotidi),
al quale possono essere aggiunti dalla DNA polimerasi i nuovi nucleotidi.
Il primer serve come substrato per l'azione della DNA polimerasi.

Replicazione semidiscontinua del DNA

La forca replicativa viene generata quando le elicasi srotolano il DNA per

dare origine a due singoli lamenti che funzionano da stampo .

Proteine SSB (Single Strand Binding) si legano a ognuno dei singoli lamenti
di DNA, stabilizzandoli ed evitando che essi formino di nuovo DNA a doppio
lamento mediante l’appaiamento delle coppie di basi.

La DNA primasi che si trova alla forca di replicazione sintetizza un’altro

primer di RNA, nella parte alta del lamento stampo. Ogni primer di RNA
viene allungano dalla DNA polimerasi 3.

Le polimerasi spostano le proteine SSB quando si muovono lungo il lamento

stampo. I nuovi DNA sintetizzati sono complementari al lamento stampo.

La DNA girasi allenta la tensione prodotta nel DNA (superavvolgimento), nella

parte anteriore della forca replicativa.

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 Il nuovo lamento sintetizzato nella stessa direzione della forca replicativa è
l’elica guida (leading strand).
Mentre il nuovo lamento sintetizzato nella direzione opposta al movimento
della forca di replicazione è detto elica in ritardo (lagging strand).

Dal momento che, tuttavia, la sintesi del DNA avviene nella direzione 5’—3’,
la sintesi del lamento in ritardo può procedere solo no a un certo punto. Per
poter continuare la sintesi del DNA sul lamento stampo, è necessario un
nuovo inizio di sintesi del DNA; un primer di RNA.

La DNA polimerasi 3 aggiunge DNA al primer di RNA.

L’elica leading viene sintetizzata in modo continuo, mentre il lamento lagging

è sintetizzato segmento dopo segmento , vale a dire in maniera discontinua.
Per questo motivo, si dice che la replicazione del DNA nel suo insieme
procede con modalità semidiscontinua.

I frammenti del lamento lagging fabbricati in modo semidiscontinui sono

chiamati frammenti di Okazaki, dai loro scopritori, Rejii e Tuneko Okazaki e
colleghi.

Ogni frammento di Okazaki riparte con un nuovo primer di RNA. In ne, i

frammenti di Okazaki sono legati insieme per costituire un lamento
continuo. La loro saldatura richiede l’attività di due enzimi, DNA polimerasi 1
e DNA ligasi.

Le proteine chiave sono strettamente associate in modo da formare un

macchinario chiamato replisoma a livello della forca replicativa.

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 Modello della "macchina replicativa" (replisoma), il complesso delle proteine
chiave
della replicazione, con il DNA a livello della forca replicativa.

Riepilogo replicazione e delle molecole coinvolte

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