Duplicazione del DNA

Inizio
In questa prima tappa si ha la despiralizzazione del DNA per la rottura dei legami idrogeno.
La duplicazione non parte dall'inizio del cromosoma ma in punti ben definiti, ricchi di A e T - più
facili da separare perché tra queste basi ci sono solo due legami idrogeno -, detti punti di origine
della duplicazione, e rappresentano segnali di attacco di una proteina iniziatrice, che ha il
compito di tendere i due filamenti.
Di seguito intervengono altre proteine del complesso di duplicazione.
La DNA elicasi si lega alla proteina iniziatrice e forza l'apertura della doppia elica, grazie
all'energia fornita dall'ATP, rompendo i legami idrogeno tra le basi azotate.
Le proteine SSB stabilizzano i due filamenti impedendo che i filamenti si riassocino.
La topoisomerasi (DNA girasi nei Procarioti) impedisce il superavvolgimento del DNA.
L'azione combinata di queste proteine consente l'apertura di una bolla di replicazione nei
Procarioti - o più bolle contemporaneamente negli Eucarioti - formata da due forcelle di
replicazione a forma di Y.
Allungamento
L'allungamento consiste nell'aggiunta progressiva di nucleotidi trifosfati complementari a quelli
presenti nei due filamenti stampo di DNA, secondo le regole di appaiamento.
I nucleotidi formano legami fosfodiesterici tra il gruppo ossidrile all'estremità 3' del filamento
preesistente e il fosfato del nuovo nucleotide. L'energia è fornita dalla liberazione dei due
gruppi fosfato. La formazione dei nuovi filamenti avviene nelle due direzioni a partire
dall'origine della duplicazione.origine della duplicazione
L'appaiamento corretto è reso possibile da una categoria di enzimi chiamate DNA polimerasi,
che presentano due restrizioni:
-non possono far iniziare nuove catene, cioè quelle con una terminazione 5' libera, ma sono in
grado aggiungere nucleotidi solo ad altri nucleotidi già correttamente appaiati.
-possono aggiungere nucleotidi solo all'estremità 3', dove è presente il gruppo -OH. Di
conseguenza, l'allungamento del nuovo filamento può avvenire solo in direzione 5' → 3';
La prima condizione è superata grazie all'enzima primasi, che crea una corta catena di una
decina di nucleotidi di RNA funzionanti da innesco, o primer, e consentono alla DNA polimerasi
di iniziare l'aggiunta di nucleotidi. Alla fine della duplicazione l'innesco è sostituito da DNA da
una DNA polimerasi.
I due filamenti del DNA sono antiparalleli perciò uno, detto guida (o anticipato, o veloce), si
trova nella corretta direzione (5' → 3') e la DNA polimerasi può procedere in modo continuo
verso la forcella di replicazione, avendo bisogno di un solo innesco.
Nel filamento 3' → 5' (in ritardo o lento) la sintesi avviene a ritroso in pezzi detti frammenti di
Okazaki, ciascuno dei quali richiede un innesco. I frammenti sono poi uniti da una ligasi dopo
aver rimosso l'innesco e riempito la parte mancante, purché i monconi siano perfettamente
adiacenti.
Schematizziamo le varie tappe di replicazione.
1-Una proteina iniziatrice separa i due filamenti della doppia elica e altri enzimi aprono una
bolla di replicazione.
2-La primasi sintetizza un frammento di RNA che funziona da innesco (primer).
3-Una DNA polimerasi allunga la catena (filamento guida) in modo continuo sul filamento
stampo 3' e in frammenti di Okazaki nello stampo 5', partendo dalla terminazione 3'-OH
dell'RNA.
4-La DNA polimerasi nei Procarioti, o DNA polimerasi con altri enzimi ad attività esonucleasica
negli Eucarioti, rimuove il primer.
5-Una DNA polimerasi riempie il vuoto lasciato dall'RNA.
6-La ligasi unisce i frammenti.
Nei cromosomi degli Eucarioti, che sono lineari, la rimozione dell'innesco terminale del
filamento lento lascia un vuoto che non può essere sostituito da nuovo DNA in quanto manca
un'estremità 3' che la DNA polimerasi possa prolungare, perciò le estremità 5' del filamento
stampo non vengono duplicate. Rimane dunque un pezzettino di filamento di DNA singolo che
viene tagliato insieme a una piccola porzione di filamento doppio e questo provoca
l'accorciamento di circa 50-200 basi del filamento ritardato a ogni duplicazione. Le cellule, dopo
20 - 30 cicli di duplicazione muoiono.Per evitare questo problema, alcuni cromosomi sono
dotati di telomeri alle estremità, sequenze ripetute moltissime volte, che possono essere
perdute senza danno.Le cellule del midollo osseo e quelle germinali, invece, sono dotate di
telomerasi, un insieme di proteine ed RNA, in grado di aggiungere unità telomeriche.
 Correzione degli errori
Per quanto accurata sia la duplicazione, si possono presentare errori di appaiamento delle basi
oppure modifiche dovute a cause esterne durante la vita cellulare.Le cellule possiedono diverse
modalità per rimediare agli errori.

1. Correzione di bozze (proofreading)

Durante l'allungamento del filamento, la Dna polimerasi fa un controllo immediato della
correttezza degli appaiamenti e, in caso di errore, retrocede fino ad incontrare un
nucleotide appaiato correttamente, sostituisce subito il nucleotide errato con quello
giusto e poi procede con l'aggiunta di nuovi nucleotidi. Questa operazione è possibile in
quanto la DNA polimerasi, oltre ad avere la capacità di polimerizzazione, possiede
un'attività di esonucleasi in direzione 3' → 5'.
2. Riparazione di errato appaiamento.
Al termine della duplicazione, se è sfuggito un errore, un'altra DNA polimerasi, insieme
a diversi enzimi, rileva errori di appaiamento da anomalie chimiche o strutturali della
doppia elica.
Un secondo complesso di enzimi con attività di esonucleasi apre una bolla e rimuove il
nucleotide errato insieme a quelli adiacenti, dopo aver tagliato il DNA in un solo punto.
Una DNA polimerasi riempie gli spazi con i nuovi nucleotidi e, alla fine, la ligasi salda i
due monconi.
3. Escissione.
Un terzo processo di correzione si ha al di fuori della duplicazione, durante tutta la vita
della cellula. Alcuni enzimi riconoscono le parti modificate del DNA a causa di agenti
fisici, come i raggi UV, o chimici. Tipico è il caso dei dimeri di timina: le radiazioni
possono incollare due timine adiacenti, creando errori molto dannosi nella trascrizione.
Una endonucleasi taglia il DNA su entrambe le estremità della base errata, un
esonucleasi rimuove la parte tagliata, una DNA polimerasi aggiunge i nucleotidi mancati
e la ligasi salda le due parti.