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MANUALE PCR

Guida pratica per risolvere i problemi pi


comuni.

Maurizio Autunno & Giuseppe Bonapace


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Questo manuale stato pensato e redatto in costante


collaborazione con il dr. Giuseppe Bonapace .
Senza il suo aiuto fraterno, non avrebbe mai potuto vedere
la luce.

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Che cos' il sistema "PerfectLab"?


Un gruppo di ricercatori e responsabili commerciali si sono posti questa domanda:
come possiamo riuscire a rendere i processi di lavoro dei nostri colleghi piu' semplici, sicuri, rapidi e
riproducibili?
Come possiamo riuscire a rendere piu' piacevole il lavoro degli addetti al settore?
Siamo stati in tutto il mondo e abbiamo incontrato scienziati in centinaia di laboratori. Abbiamo studiato le loro
pratiche di lavoro e le loro preferenze nell'uso quotidiano dei prodotti e questo ci ha permesso di specializzarci.
Oggi possiamo affermare che riusciamo a produrre in maniera intelligente, soluzioni ottimizzate per poter ridurre
al minimo limpatto sui vostri campioni !
Quanto l'affidabilit dei tuoi risultati dipende dalla qualit' degli strumenti, consumabili e reagenti che usi ?
Quanto dal metodo? Quanto dagli errori di manualit' che puoi commettere?
Qualit, semplicit di utilizzo e riproducibilit', sono requisiti indispensabili in strumenti, consumabili e reagenti
utilizzati nel processo sperimentale.
I tuoi campioni sono preziosi perch rappresentano Tempo, Risorse e Lavoro.
Se la perfezione non esiste, PerfectLab garantisce solo strumenti, consumabili, reagenti e metodi che
permettono di ridurre al minimo gli errori di processo sperimentale, rendendo i risultati estremamente affidabili.
Se anche tu ti sei ritrovato in una situazione dove non sapevi se il fallimento del tuo esperimento fosse dovuto
ad applicazioni errate del protocollo applicato o al materiale o alla strumentazione che utilizzavi, Benvenuto in
PerfectLab Solutions for reliable results.

Noi siamo gli unici che non ti lasceranno solo nel tuo esperimento.
Maurizio Autunno e Giuseppe Bonapace

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SOMMARIO
Introduzione7
Quali sono i componenti di una reazione di PCR ?...............................10
Alcuni consigli utili per cominciare..13
Cinque consigli per un buon risultato...15
La prima PCR..18
Il controllo dellamplificato.21
Problemi tecnici e loro risoluzione..25

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MANUALE PRATICO PCR


Introduzione:
Il primo problema da risolvere, per chi opera nel campo della biologia
molecolare, quello relativo alla necessit di estrapolare da un contesto
genomico complesso il singolo gene di interesse o una sua parte specifica. I
genomi sono entit estremamente grandi. Per avere un idea di tale complessit
basti ricordare che un semplice batterio contiene 3 milioni di coppie di basi che
gli conferiscono la capacit di codificare 3000 proteine differenti e che tale
complessit aumenta enormemente spostandoci lungo la scala evolutiva fino ad
arrivare ai mammiferi e alluomo con oltre 3 miliardi di coppie di basi (Fig1). Per
affrontare e risolvere tale problema, sulla base delle conoscenze attuali sulla
struttura dei principali genomi vegetali e animali e per disporre di quantit di
materiale sufficientemente elevate per studi di diagnostica e/o caratterizzazione
genetica stata messa a punto la tecnica della Polymerase Chain Reaction
(PCR) o amplificazione a catena mediata da polimerasi.

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Fig 1

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Che cos la PCR ?


La PCR una reazione di polimerizzazione mediante la quale una specifica
sequenza di acido nucleico pu essere amplificata esponenzialmente in vitro. Lo
stesso tipo di reazione pu anche essere utilizzato per modificare il contenuto
informativo di una specifica sequenza o per aggiungere dello specifico
contenuto di informazione. Il requisito fondamentale per il successo della PCR
in termini di specificit del prodotto ottenuto che siano conosciute le sequenze
esterne che fiancheggiano la zona di interesse allo scopo di disegnare i primers
di innesco della reazione. Questo oggi possibile grazie allesistenza di banche
genomiche estremamente accurate nelle quali sono riportate e costantemente
aggiornate le sequenze complete di interi genomi ed alle quali si pu accedere
in rete allo scopo di acquisire le conoscenze necessarie per il disegno dei
primers di innesco.

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Quali sono i componenti di una reazione di PCR?


Dna Genomico, plasmidico, fagico (100-200 ng)
Primers di innesco (02-05 M)
dNTP (150-250 M)
Tampone di reazione (50mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5mM MgCl2 )
Dna polimerasi (Taq, Pfu, 5U/100 l reazione)
Additivi (DMSO, glicerolo, Formamide BSA)

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Come funziona la reazione di PCR?


Fondamentalmente si tratta di una reazione in tre fasi che vengono ripetute
ciclicamente, dove un ruolo fondamentale giocato dalla temperatura di
reazione e dal tempo di esposizione. In ogni ciclo la prima fase detta di
denaturazione,lo scopo quello di ottenere la completa separazione dei due
filamenti che rappresentano il target per i primers di innesco. Tale scopo viene
ottenuto mediante una esposizione della miscela di reazione ad un passaggio di
denaturazione iniziale la cui durata va da 5 a 10 minuti. La seconda fase, che
per alcuni versi quella pi delicata, quella detta di annealing nella quale
mediante un repentino abbassamento della temperatura fino a valori che
dipendono dal templato e dai primers

si facilita linterazione tra le zone

bersaglio e gli inneschi. La terza fase quella di attivazione della polimerasi


mediante esposizione della miscela di reazione alla temperatura di 68 o 72C
che quella ottimale per lazione della DNA polimerasi che utilizza i gruppi OH
liberi sui due primers come punto di partenza per ricopiare i filamenti su cui si
sono posizionati. Come si pu osservare (Fig 2) alla fine del primo ciclo avremo
filamenti figli che superano il limite della zona di interesse. A partire dal secondo
ciclo ognuno dei filamenti nuovi ottenuti nel primo ciclo funge da stampo, ed
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avendo una estremit definita dal primer del primo ciclo a seguito
dellinterazione con laltro primer, produce il primo prodotto specifico limitato alla
zona di interesse. Dal terzo ciclo in poi si assiste alla crescita esponenziale dei
prodotti specifici che alla fine della reazione ( dopo un numero standard di 30,35
cicli) saranno il prodotto prevalente.

Fig2

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Alcuni consigli utili per cominciare


Sfatiamo prima di tutto alcune leggende metropolitane.
A) La maggior parte dei manuali ufficiali di biologia molecolare raccomanda
caldamente di lavorare in ambienti separati e dedicati rispettivamente
allestrazione del DNA, allesecuzione della reazione e al controllo del
prodotto finale allo scopo di evitare fastidiose contaminazioni da DNA
estraneo proveniente da precedenti manipolazioni. In definitiva questo
verrebbe a significare che solo chi dispone di spazi sufficienti potrebbe
eseguire una PCR in ragionevoli condizioni di sicurezza. In realt il
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problema delle contaminazioni pu facilmente essere tenuto sotto controllo


con qualche piccolo accorgimento:
Usare un set di pipette dedicato e non destinato ad altri usi
Usare puntali sterili non necessariamente autoclavati. In alternativa vanno
bene anche puntali non sterili e mantenuti sotto UV per almeno 24 ore
Procedere ad unaccurata pulizia delle pipette e del posto di lavoro con
NAOH 0,5M prima di eseguire la reazione
B) Occorre utilizzare tubi di reazione sterili o autoclavati :
Ricordiamo che i tubi per PCR in commercio sono gia sterili (PCR Clean)
e che se correttamente manipolati e conservati non necessitano di
trattamenti aggiuntivi
C) Occorre utilizzare solo acqua sterile BM grade:
Comuni fialette di acqua bidistillata sterile per iniezione vanno altrettanto
bene e sono meno costose.

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