Acizii nucleici sunt policondensati de nucleotide Nucleotid: baza azotata pentoza - fosfat

Nucleaze: hidrolaze care scindeaza (prin contributia unei molecule de apa) o legatura fosfodiesterica. DNAze (specifice pentru legaturile fosfodiesterice ale dezoxiribonucleotidelor); RNAze specifice legaturilor fosfodiesterice dintre ribonucleotide Exonucleaze: scindeaza numai un nucleotid terminal (specifice 3 sau 5) Endonucleaze: scindeaza o legatura fosfodiesterica distantata cu cel putin 2 nucleotide de terminus.

http://www.hhmi.org http://www.dnai.org

Izolarea DNA din celule si analiza proprietatilor sale Extractia consta din: 1. Liza celulelor si a nucleelor (mecanica sau detergenti) 2. Precipitarea proteinelor (fenol sau alt precipitant) 3. Centrifugare 4. Precipitarea din supernatant cu alcool 5. Purificare prin centrifugare in gradient de clorura de cesiu (clasic) sau adsorbtia pe si elutia din rasini care retin numai acizii nucleici 6. Tratamentul cu RNAza (daca vrem sa izolam ADN) sau DNAza (daca vrem sa izolam ARN) Analiza : Fragmentare (enzime de restrictie) si electroforeza in gel de agaroza http://www.dnai.org

animatii F://animatii http://www.dnai.org/d/index.html Manipulations, Techniques, PCR, secventare Sinteza in vitro a DNA prin reactia PCR

Secventarea ADN prin tehnica terminarii lantului prin folosirea 2,4 di-dezoxi NTP (animatie) http://www.dnai.org/d/index.html

http://en.wikipedia.org http://en.wikipedia.org-DNA-Wkipedia http://en.wikipedia.org-DNA Fuorescent in situ hybridization Wkipedia

DNA polimeraze DNA polimeraze DNA dependente: Procariote: DNA polimeraza I (E. coli), procesivitate mica, 5 exonucleaza asociata, 3exonucleaza asociata DNA polimeraza II (E.coli) procesivitate mica DNA polimeraza III (E. coli) inalt procesiva, 3exonucleaza asociata DNA polimeraza IV (E.coli) procesivitate mica, poate face sinteza translezionala a dimerilor de timina DNA polimeraza V (E coli) procesivitate mica, fidelitate mica, face sinteza translezionala cu greseli Taq polimeraza (Termus aquaticus) procesivitate mica, 5polimeraza asociata Eucariote:

DNA polimeraza (cu centru catalytic suplimentar de ARN polimeraza (primaza); neprocesiva DNA polimeraza neprocesiva DNA polimeraza (mitocondrialla) DNA polimeraza inalt procesiva, centru catalytic 3exonucleazic DNA polimeraza inalt procesiva, centru catalytic 3 exonucleazic DNA polimeraza procesiva, poate face sinteza translezionala T-T fara eroare DNA polimeraza procesiva, face sinteza translezionala cu erori DNA polimeraze RNA dependente (revers-transcriptaze) Caractere comune: Toate adauga nucleotide (din nucleozid trifosfati) la extremitatea 3 a unui primer, conform unui model monocatenar) Toate au nevoie de un model (DNA in cele mai multe, ARN la revers-transcriptaze) Toate au nevoie de un primer (ADN sau ARN) complementar cu modelul Diferente: Functii enzimatice suplimentare (datorate unor centri catalitici diferiti de cel polimerazic) 5 exonucleazic 3 exonucleazic Fidelitate Procesivitate (datorata unei subunitati speciale numite factori de procesivitate), uneori folosita alternativ de una sau alta din polimeraze (de exemplu polimeraza eucariota delta si polimeraza eta folosesc acelasi factor de procesivitate PCNA, dar nu simultan. Capacitatea de a sesiza sau nu leziunile Capacitatea de a adauga (sau nu) un nucleotide suplimentar la catena sintetizata dupa terminarea modelului Molecule DNA in vivo Molecule circulare (in special la procariote) : cromozomi bacterieni (sute de mii de perechi de nucleotide), plasmide (mii de perechi de nucleotide)

Cromosomi la eucariote : DNA linear cu extremitatile celor doua catene sudate. DNA cromosomal este impachetat cu proteine, sub forma de cromatina

Topoizomeraze: Enzime care catalizeaza trecerea unui topoizomer: de exemplu DNA superhelicat, adica avind un n linking number-diferit de cel de echilibru in DNA relaxat, cu n linking number- apropiat de cel de echilibru Topoizomeraze I (fac rupturi monocatenare temporare si sudare dupa relaxare) Topoizomeraze II (fac rupturi bicatenare si resudare dupa relaxare sau superhelicare dependenta de ATP)

Fidelitatea replicarii DNA Probabilitatea de a introduce un nucleotid gresit este in jur de 10-9. Ea este atit de mare in ciuda faptului ca: - erorile datorate numai formelor tautomere ale bazelor ar avea frecventa de ordinul 10-5 -agitatia termica ar duce la ruperea legaturilor N- glicozidice la un numar de aprox. 10-4 10-5 situri abazice. In timpul replicarii, acele situri ar putea fi complementate cu orice nucleotid, corect sau gresit. -factori fizici (radiatia UV, radiatiile ionizante, chimicale ca acidul nitros si derivatii sai, agentii alkilanti, hirocarburile policiclice (din fum, gudroane, etc) pot modifica un numar variabil de baze azotate. In acest caz, in cursul replicarii, aceste baze modificate ar putea duce la complementarea gresita pe catenele noi sintetizate. Aceste efecte sunt contracarate de: Functia editoare (3-exonucleazica) a DNA polimerazelor (mai ales in cazul erorilor produse de formele tautomerice minore a bazelor azotate (care dureaza foarte putin in timp Procese de reparare a leziunilor

Leziunile DNA si repararea lor 1. Oxidari (raze UV, derivati ai acidului nitros) Dezaminare

2.Alkilari (metil metan sulfonat, gaz mustar si alti agenti alkilanti)

3. Legaturi covalente nenaturale intre baze azotate (raze UV)

4. Rupturi monocatenare (UV, procese ale metabolismului DNA) 5. Rupturi bicatenare (radiatii ionizante, rupturi in timpul replicarii, etc)

Raspuns la leziunile DNA Raspuns Oprirea ciclului celular (prin mecanismele de check-point al integritatii genomului Repararea ADN 1. Repararea neinperecherii de baze (MMR) Repararea ADN 2. Repararea prin excizie de baze (BER) Repararea ADN 3. Repararea prin excizie de nucleotide (NER) Repararea DNA 4. Repararea rupturilor bicatenare Apoptoza Mutatii, eventual transmisibile la descendenti Ce se intimpla in lipsa raspunsului (boli genetice care predispun la cancer) Ataxia-telangiectazia Cancer de colon non-polipozic familial

Xeroderma pigmentosum, diferite variante Sindromul Bloom, sindromul Werner, sindromul Nijmegen Sindromul Li Fraumeni, cancere variate Boli genetice diverse

Repararea prin folosirea altui duplex ca model (repararea prin recombinare)

Acizii ribonucleici (ARN, RNA): lanturi de ribonucleotide

Existenta functiei alcoolice la 2 face ca ARN sa fie diferit de AND in urmatoarele privinte: 1. Legaturile fosfodiesterice la AND sunt mult mai stabile decit cele de la ARN (labilizate de vecinatatea functiei hidroxil la 2) 2. ARN are proprietati catalitice, datorita aceleiasi functii hidroxil de la pozitia 2 a ribozei. ARN poate cataliza reactii de transesterificare si transpeptidare

Majoritatea moleculelor de ARN sunt monocatenare; exista si ARN bicatenar

Specii de ARN in vivo ARN monocatenar Nuclear hnRNA (heterogen)== RNA nucleolar snRNA

Citoplasmatic mRNA (mesager) rRNA (ribosomal) tRNA (transfer)

ARN regulatori Pre miRNA (monocatenar, nuclear), siRNA sau miRNA/miRNA (bicatenar, citoplasmatic)

Sinteza ARN Se face prin transferul unuia din cele 4 nucleotide componente: Adenilic, Guanilic, Citidilic, Uridilic de la ATP, GTP, CTP sau UTP la hidroxilul 3- a unui nucleotid (sau polinucleotid) anterior. Extremitatea 5 a unui ARN nou sintetizat este intotdeauna un nucleozid trifosfat. N1TP + N2TP -- N1TP N2P + PPi Reatia este catalizata de RNA polimeraze RNA polimeraze : ADN dependente

ARN dependente sau ARN replicaze (caz particular, in special la celulele vegetale) rezultind intr-un ARN bicatenar care poate fi fragmentat in RNAi (scurte molecule de ARN bicatenar de catre complexul Dicer existent in toate celulele eucariote)

Dolan : http://www.dnai.org/d/index.html http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

http://en.wikipedia.org `

Reglarea expresiei genice

Prin ritmul transcriptiei

Author Permission See

(Reusing this image) belo

w.

Text explicativ la aceasta imagine se poate gasi pe wikipedia/RNA http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm Codul genetic Alfabetul de 4 litere al DNA trebuie sa codifice 20 de aminoacizi. Aceasta se poate face doar prin grupare

Daca fiecare nucleotide ar codifica un aminoacid cele 4 nucleotide ar putea codifica 4 nucleotide Daca un grup de doua nucleotide (din 4) ar codifica un aminoacid atunci toate combinatiile de 2 nucleotide ar putea codifica 42 = 16 aminoacizi Daca un grup de trei nucleotide (din 4) ar codifica un aminoacid atunci toate combinatiile de 3 nucleotide ar putea codifica 43 = 64 aminoacizi Mai mult decit sufficient pentru cei 20 aminoacizi + citeva semne de punctuatie Un triplet de nucleotide este unitatea de cod = codon Codonii sunt juxtapusi sau suprapusi? Exista semne de punctuatie care sa separe codonii? Care sunt codonii pentru fiecare aminoacid? http://www.dnai.org/d/index.html

Moleculele si structurile supermoleculare care iau parte la biosinteza lanturilor polipeptidice (procesul de translatie a mesajului genetic) 1. ARN mesager (mesajul)

2. Conjugatul aa-tRNA (decodorul)

Reactia aminoacil tRNA sintetazei

3. Ribosomul (masina decodoare)

Sinteza lanturilor polipeptidice (translatia informatiei genetice) Etape: 1. Initiere Subunitatea mica se asociaza cu mRNA si cu tRNAmet initiator plasat in situl P impreuna cu codonul initiator de pe mRNA. Apoi asociaza si subunitatea mare 2. Alungire Se intimpla in cicluri; fiecare ciclu rezultind in adaugarea unui nou aminoacid la aminoacidul initiator (ciclu 1) sau a unui lant polipeptidic cu n aminoacizi (ciclul n) 3. Terminare Se intimpla cind in situl A al ribosomului apare un codon stop nerecunoscut de nici un anticodon ci de un factor proteic de terminare.

Lantul polipeptidic se desface de ultimul tRNA si subunitatile ribosomului disociaza 1. Initiere

Efectele mutatiilor punctuale din DNA asupra proteinelor codificate

Mutatii punctuale: 1. Substitutii (un nucleotid inlocuit prin alt nucleotid) Efecte posibile: a. Nici un effect b. Inlocuirea unui aminoacid cu alt aminoacid (mutatie missense sens gresit) c. Scurtarea prematura a lantului (mutatie nonsens, datorita transformarii unui codon sens (codifica aminoacid) in codon stop) 2. Insertii/deletii (mutatii cu alterarea cadrului de lectura) Efecte: a. Alterarea completa a secventei de aminoacizi inspre extremitatea C, pornind de la locul mutant; b. Lant polipeptidic mai scurt sau mai lung, ca effect al schimbarii cadrului de citire

Soarta lanturilor peptidice dupa sinteza lor