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Il nucleo e la sua organizzazione!

I PORI NUCLEARI !

I PORI NUCLEARI ! L ʼ involucro nucleare è costituito da una doppia membrana. La membrana

Lʼinvolucro nucleare è costituito da una doppia membrana. La membrana esterna è in continuità con quella del RE. Le membrane sono permeabili solo a piccole molecole apolari. I pori nucleari regolano il passaggio selettivo di proteine e RNA.

Le piccole molecole e le proteine con massa inferiore a 20-40 kd attraversano il poro

Le piccole molecole e le proteine con massa inferiore a 20-40 kd attraversano il poro che ha un diametro di 9 nm per diffusione passiva (diffusione facilitata).

La maggior parte delle proteine e degli RNA passano per trasporto attivo.

Le proteine che entrano nel nucleo presentano segnali di localizzazione nucleare (NLS) per la

loro traslocazione (Lys-Arg e Lys-Lys-Lys-Lys)

per la loro traslocazione (Lys-Arg e Lys-Lys-Lys-Lys) Le proteine che escono dal nucleo presentano segnali di

Le proteine che escono dal nucleo presentano segnali di esportazione nucleare (NES) per la loro traslocazione nel citoplasma.

Lʼentrata delle molecole nel nucleo avviene mediante IMPORTINE, lʼuscita mediante ESPORTINE. !

l

mediante IMPORTINE, l ʼ uscita mediante ESPORTINE. ! l d e l l e macromolecole è

d e l l e

macromolecole è regolato da piccole proteine leganti il GTP (small GTP-binding protein) chiamate Ran.

I

m o v i m e n t o

Nel versante citoplasmatico Ran stimola lʼidrolisi del GTP (Ran GAP - proteina attivante la Ran)

Nel versante nucleare Ran scambia GDP con GTP ( Ran-GEF - fattore di scambio del GTP)

Ran-GDP deve essere riportato nel nucleo dove è riconvertito in Ran-GTP ! Ran-GTP deve essere

Ran-GDP deve essere riportato nel nucleo dove è riconvertito in Ran-GTP !

Ran-GTP deve

essere

alto

nel

nucleo

perché

promuove

al

dissociazione

proteina-

importina!

Le proteine che escono dal nucleo presentano segnali di esportazione nucleare ( NES) !

Le proteine che escono dal nucleo presentano segnali di esportazione nucleare ( NES) !

La lamina nucleare!

La lamina nucleare ! La lamina nucleare è costituita da filamenti intermedi formati da proteina lamine

La lamina nucleare è costituita da filamenti intermedi formati da proteina lamine. !

Progeria di Hutchinson-Gilford !

Progeria di Hutchinson-Gilford ! La distrofia muscolare EDMD2 è un ʼ altra patologia rara dovuta alla

La distrofia muscolare EDMD2 è unʼaltra patologia rara dovuta alla mutazione delle lamine nelle cellule muscolari !

La matrice nucleare!

La matrice nucleare !

Funzione del nucleo !

Funzione del nucleo !

DNA ed ereditarietà !

I geni contenuti nella molecola di DNA portano lʼinformazione per le proteine:!

1 GENE

!

di DNA portano l ʼ informazione per le proteine: ! 1 GENE ! 1 PROTEINA !

1 PROTEINA !

Questo messaggio deve essere trasmesso di generazione in generazione:! - il DNA rappresenta la molecola che trasmette lʼinformazione genica! (ereditarietà) ! - la serie completa di informazioni contenute nel DNA di un organismo si chiama GENOMA !

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Struttura del genoma !

Frazione altamente ripetitiva ! Almeno 10 5 copie IN TANDEM della stessa sequenza non codificante (DNA satellite, DNA minisatellite, DNA microsatellite). ! Rappresenta l’1-10% del DNA totale. ! Corti pezzi di DNA (qualche centinaia di nucleotidi):! DNA satellite (soprattutto a livello centromerico e molto variabile)! DNA minisatellite (molto variabile nelle popolazioni e variabile attraverso le generazioni) ! DNA microsatellite (utilizzate per confrontare l’evoluzione delle popolazioni) ! Frazione moderatamente ripetitiva ! Rappresenta il 20-80%del DNA totale. ! Sia sequenze codificanti che non codificanti! Codificanti: RNA ribosomiali e istoni ! Non codificanti: sequenze LINE (long interspersed elements) e SINE (short interspersed element) ! Frazione non ripetitiva ! Sequenze a copia singola codificanti proteine :! GENI ! Meno dellʼ1,5% del DNA !

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Struttura del genoma ed evoluzione!

La maggior parte del DNA contiene quindi DNA intergenico. ! Allʼinterno dei geni inoltre vi sono sequenze non codificanti (introni). ! Tutte queste sequenze non codificanti tendono a cambiare durante lʼevoluzione. ! Le sequenze codificanti invece sono CONSERVATE durante lʼevoluzione in quanto importanti!

invece sono CONSERVATE durante l ʼ evoluzione in quanto importanti ! Nel genoma umano scoperti circa

Nel genoma umano scoperti circa 30000 geni. !

Stabilità del genoma !

Duplicazione dell’intero genoma (poliploidia) ! Tutti i cromosomi vengono duplicati (anfibio Xenopus laevis) ! Avviene raramente. !

Duplicazione di singole sequenze di DNA ! Si verifica molto facilmente. Il gene duplicato spesso va incontro a mutazioni e genera geni solo parzialmente differenti che producono isoforme proteiche ( alfa e beta tubulina nei microtubuli) !

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!Sequenze mobili nel DNA ! Alcune sequenze di DNA sono in grado di muoversi da un punto all’altro del genoma

attraverso il fenomeno della trasposizione.!

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Trasposizione!

La trasposizione coinvolge elementi genici mobili del DNA o trasposoni. ! Inizialmente evidenziati nei batteri, si è poi scoperto che il 45% del genoma umano è costituito da elementi mobili (circa 300000 elementi). !

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A volte durante l’evoluzione hanno perso la capacità di muoversi, altre volte derivano da virus integrati e mantengono la capacità di dare Trasposizione.!

Gli elementi mobili o trasposoni codificano il macchinario per il loro spostamento (enzima trasposasi).! La Trasposizione può provocare mutagenesi. !

Gli elementi trasponibili sono stati inseriti durante l’evoluzione in modo casuale e stanno nel genoma sino a quando non conferiscono un danno all’individuo che li porta, vengono quindi detti “deposito dei rottami genetici “ (DNA spazzatura). !

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Altre volte vengono utilizzati per l’evoluzione di nuovi geni o porzioni regolatorie. !

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Per la scoperta dei trasposoni Barbara McClintocK ottenne il Nobel nel 1983 a 81 anni, dopo 35 anni dalla sua scoperta iniziale. !

Trasposoni!

Taglia -incolla! Copia -incolla!
Taglia -incolla!
Copia -incolla!

Trasposizione mediante un intermedio a RNA ! ( retrotrasposoni) !

mediante un intermedio a RNA ! ( retrotrasposoni) ! Esempi: ! - elementi LINE ( L1)

Esempi: !

- elementi LINE ( L1) (long interspersed element) !

- elementi SINE (Alu) (short interspersed element) nell’uomo !

Conservazione di geni!

Variabilità genetica all’interno delle popolazioni umane!

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I polimorfismi genetici sono geni siti all’interno del genoma che variano tra i diversi individui almeno nell’1% della popolazione. ! ( Es. gruppi sanguigni) !

! Nella maggior parte di casi sono polimorfismi del singolo gene (SNP “snip”) ovvero variazioni
!
Nella maggior parte di casi sono polimorfismi del singolo gene (SNP “snip”)
ovvero variazioni in un solo nucleotide con due forme alternative (es. A o G)!
!
Ogni individuo umano presenta circa 3 milioni di differenze in singoli
nucleotidi, quindi gli individui umani hanno un genome uguale al 99,9%. !
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Le variabilità strutturali ! Duplicazioni, delezioni, inserzioni, inversioni. ! Molto spesso coinvolte in patologie genetiche. !

Il DNA è la sede dellʼinformazione genica !

Il DNA è la sede dell ʼ informazione genica !
Nel nucleo è contenuta l ʼ informazione genica. ! ! I principali eventi che coinvolgono

Nel nucleo è contenuta lʼinformazione genica. !

! I principali eventi che coinvolgono il contenuto del nucleo sono:! ! 1) la replicazione
!
I principali eventi che coinvolgono il contenuto del nucleo sono:!
!
1) la replicazione del DNA !
2) la trascrizione del DNA nel formare l’RNA !
3) la maturazione degli RNA !
3) l’assemblamento dei ribosomi!
!

Dal DNA alle proteine attraverso lʼRNA !

Dal DNA alle proteine attraverso l ʼ RNA !

DNA e CROMATINA ! Ciascuna cellula umana contiene 2 metri di DNA ed il nucleo presenta un diametro di 6 µ m. ! Nonostante lʼelevato numero di nucleotidi, le molecole di DNA occupano poco spazio perché sono compattate a vari livelli. ! Il DNA per compattarsi si avvolge su proteine specializzate:! - proteine istoniche! Lʼinsieme del DNA e delle proteine istoniche e non istoniche costituisce la CROMATINA. ! La condensazione consente la concentrazione in uno spazio ridotto. !

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Il DNA è più decondensato nellʼinterfase e si condensa nella mitosi in cromosomi. ! Il maggior grado di compattamento della cromatina è nel CROMOSOMA metafasico. !

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DNA, cromatina, cromosoma!

DNA, cromatina, cromosoma !

La doppia elica del DNA !

Il DNA è strutturato in una doppia elica destrorsa (scoperta da Watson e Crick nel 1953). ! Lʼelica presenta un solco principale (maggiore) e un solco secondario (minore). ! Ciascun giro dellʼelica è composto da 10 coppie circa di nucleotidi (3,4 nm) Tra due nucleotidi la distanza è di 0.34 nm !

giro dell ʼ elica è composto da 10 coppie circa di nucleotidi (3,4 nm) Tra due

Doppio filamento:!

-

Complementare!

-

Antiparallelo!

Nucleotidi!

Legame fosfodiesterico !

Doppio filamento: ! - Complementare ! - Antiparallelo ! Nucleotidi ! Legame fosfodiesterico !

Complementarietà!

La complementarietà avviene fra le BASI. !

A

!

G

T !

C !

Complementarietà ! La complementarietà avviene fra le BASI. ! A ! G T ! C !

Purine! Pirimidine!

Complementarietà ! La complementarietà avviene fra le BASI. ! A ! G T ! C !

Antiparallelismo !

Direzione 5ʼ

Direzione 5 ʼ 3 ʼ !

3ʼ !

5ʼ !
5ʼ !

Direzione 3ʼ

-ossidrile!

-gruppo fosfato !

Struttura del nucleosoma!

- DNA !

- Istoni : H2A !

! H2B !

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H3

!

H4

!

- Istone H1 !

Struttura del nucleosoma ! - DNA ! - Istoni : H2A ! ! H2B ! !
Struttura del nucleosoma ! - DNA ! - Istoni : H2A ! ! H2B ! !

Nucleosoma !

Nucleosoma ! Il core istonico è costituito da 8 istoni : !   - 2 istoni

Il core istonico è costituito da 8 istoni: !

 

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2 istoni H2A !

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2 istoni H2B !

-

2 istoni H3 !

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2 istoni H4 !

Lʼ istone H1 posiziona il DNA !

Tra due istoni vi è il DNA linker di 54 bp ! Attorno al core istonico vi sono due giri di DNA lunghi 146 bp. !

2 nm DNA ! 11 nm ( DNA + istoni) ! ! (fibra cromatinica) !

2 nm DNA !

11 nm ( DNA + istoni) !

! (fibra cromatinica) !

30 nm

Domini ad ansa! 300 nm (solenoide) !

Eterocromatina ! 700 nm! (supersolenoide) !

1400 nm ! (cromosoma! metafasico) !

Domini ad ansa ! 300 nm (solenoide) !

Domini ad ansa ! 300 nm (solenoide) !

Eterocromatina ed eucromatina !

Durante la vita cellulare il DNA può presentare diversi gradi di condensazione. !

! Nel corso dellʼinterfase (ciclo cellulare) la cromatina presenta zone meno condensate (eucromatina) o più
!
Nel corso dellʼinterfase (ciclo cellulare) la cromatina presenta zone
meno condensate (eucromatina) o più condensate
(eterocromatina). !
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Le zone eucromatiche sono attive nella trascrizione (espressione
genica). !
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Eterocromatina costitutiva !

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Non subisce modificazioni strutturali ed è sempre silente. ! Ne fanno parte la zona centromerica e telomerica dei cromosomi. !

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Eterocromatina facoltativa !

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È una zona di cromatina che può essere attivata e disattivata nel corso della vita cellulare:!

- geni dello sviluppo !

- cromosoma x !

Il cromosoma X inattivo è chiamato Corpo di Barr!

Il cromosoma X inattivo è chiamato Corpo di Barr !

Cromosoma metafasico !

Centromero 2 Cromatidi
Centromero
2 Cromatidi

Telomeri

Cromosoma

1 µ m

Telomero ! Metacentrico ! Braccio P ! Submetacentrico ! Centromero ! Braccio Q ! Acrocentrico
Telomero !
Metacentrico !
Braccio P !
Submetacentrico !
Centromero !
Braccio Q !
Acrocentrico !
Telomero !
Cromatidio !
Telocentrico !
fratello !

Il numero dei cromosomi è tipico per ogni specie. !

Specie umana: 46 cromosomi!

I 46 cromosomi costituiti da 23 coppie che presentano le stesse caratteristiche morfologiche (cromosomi omologhi). !

Questo tipo di genoma è detto Diploide ( 2n) !

le stesse caratteristiche morfologiche (cromosomi omologhi). ! Questo tipo di genoma è detto Diploide ( 2n)
le stesse caratteristiche morfologiche (cromosomi omologhi). ! Questo tipo di genoma è detto Diploide ( 2n)

CARIOTIPO UMANO !

22 coppie di autosomi (cariotipo diploide) ! 1 coppia di cromosomi sessuali ( x e y) !

CARIOTIPO UMANO ! 22 coppie di autosomi (cariotipo diploide) ! 1 coppia di cromosomi sessuali (

Colorazione Giemsa del cariotipo: Bandeggio G!

Bande!

Interbande!

Colorazione Giemsa del cariotipo: Bandeggio G ! Bande ! Interbande !

Struttura di ordine superiore della cromatina (1984) !

Struttura di ordine superiore della cromatina (1984) ! I cromosomi nel nucleo si distribuiscono in domini

I cromosomi nel nucleo si distribuiscono in domini funzionali discreti che comporta una differente espressione genica. ! I singoli cromosomi occupano territori distinti che coincidono con zone eucromatiche o eterocromatiche e che regolano se devono o non devono essere trascritti. ! La maggior parte di geni trascritti si trova nella zona adiacente al dominio intercromosomico, canale dove vengono rilasciati gli RNA, i geni eterocromatici tendono ad addensarsi al di sotto della lamina nucleare. !

Sub-compartimenti allʼinterno del nucleo !

La maggior parte dei processi nucleari è confinata in regioni distinte del nucleo. ! Si può parlare di una sub-organizzazione del nucleo dove avvengono distinte funzioni (replicazione del DNA, splicing dellʼmRNA dove si trovano le snRNP) !

Tra le diverse strutture distinte si possono notare:! - i nucleoli (sintesi dellʼRNA ribosomiale e assemblamento dei ribosomi) ! - i corpi PLM (da 5 a 20 per nucleo ) rappresentano siti di accumulo di fattori di trascrizione e proteine ( es. istone deacetilasi) che regolano la condensazione della cromatina ! - i corpi di Kajal o coiled bodiessi ritiene abbiamo la funzione di assemblare le RNP (ribonucleoparticelle) deputate allo splicing !

Il nucleolo !

Porzione non delimitata da membrana dove si trovato i geni che codificano per gli RNA ribosomiali e dove avviene la trascrizione degli rRNA e lʼassemblaggio dei ribosomi. !

! ! Presenta tre regioni :! - zona fibrillare al centro ! - componente fibrillare densa! - componente granulare!

fibrillare densa ! -   componente granulare ! Al termine della divisione cellulare i nucleoli si

Al termine della divisione cellulare i nucleoli si associano alle zone del DNA dove sono presenti i geni per gli RNA ribosomiali. ! Queste zone del DNA sono chiamate regioni organizzatrici del nucleolo. !

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