I diversi tipi cellulari adulti derivano da cellule immature

I TIPI
cellulari,
secondo
la loro
storia embrionale
(ontogenesi)
I TIPI
cellulari
e la loro
ontogenesis
(origine embrionale)

Tutte le cellule mature derivano da

cellule immature embrionali, che a
loro volta derivano dall ovocita
fecondato. Si possono tutte ricondurre
a tre grandi pedigree o lineage
cellulari :

Ectoderma linea blu

Endoderma linea gialla
Mesoderma linea rossa

nota

Gli esperimenti di clonazione

ci forniscono unimportante
informazione sulla potenzialit dell informazione genetica

Risultato : da un nucleo di UN tipo cellulare

possiamo ottenere un individuo completo, con
TUTTI i tipi cellulari, e non solo il tipo iniziale.
Dunque, ogni cellula possiede il programma e le
informazioni complete per definire TUTTI i tipi
cellulari, non solo il proprio.

nota : Si tratta di introdurre un nucleo preso

da una cellula matura di UN TIPO cellulare in
un ovocita fecondato, a cui precedentemente
abbiamo tolto in suo nucleo

In tutte le cellule il DNA viene tramandato completo, e quindi

ogni cellula possiede le codifiche per tutte le proteine e le
regolazioni necessarie per ogni via differenziativa.
Quindi la differenza tra un tipo cellulare e un altro NON nel
nel DNA, che viene replicato e ereditato con estrema fedelt

ma evidentemente nel corredo di mRNA, microRNA e proteine

che la cellula possiede.
Di circa 25.000 geni del nostro DNA, solo 3.000-4.000 mRNA
sono presenti in una cellula; di questi circa 2.000 sono diversi
tra (esempio) una cellula nervosa e una muscolare.

Corredi differenti di mRNA, microRNA

e proteine si acquisiscono regolando
LATTIVITA dei geni, che significa in
prima istanza la presenza/assenza del
mRNA, ma anche quanto e quando.

La domanda centrale, quindi,

come si regola lattivit genica ?

Specifici RNA possono essere rivelati, grazie al principio

dellappaiamento tra sequenze complementari
Mentre una sequenza definita di DNA presente
in tutte le cellule, una sequenza definita di un
mRNA presente solo nelle cellule in cui
quel gene attivo. Si dice che quel gene
ESPRESSO in quelle cellule. Es. le cellule
precursori del muscolo dellembrione di topo
esprimono il mRNA per miogenina.
Se un gene espresso sempre in tutte le cellule
si dice COSTITUTIVO, o anche house-keeping,
perch probabilmente ha funzioni essenziali.
Molti mRNA sono presenti solo in alcune cellule,
in alcuni momenti, in alcuni luoghi; si parla quindi
di territori di espressione

Gli
mRNA
e i miRNApossono
sono presenti
manieranelle
selettiva
in
Anche
i microRNA
essereinrivelati
cellule
Diverse cellule e tessuti di un organismo animale e vegetale

Alcuni miRNA con

diversi territori di
espressione in un
embrione di pesce

Solomon, Berg, Martin Biologia Capitolo 23

Espressione genica, mutazioni e malattie

Una mutazione genica modifica la sequenza del DNA
Tuttavia, leffetto della mutazione si manifesta a seconda :
- del tipo di mutazione (vedremo in seguito )
- dell espressione di quel gene, cio in quali cellule presente
l RNA messaggero di quel gene, cio in quali cellule il gene trascritto .
- . Perch in queste cellule si pu produrre una proteina anomala,
o si verifica lassenza della proteina.
p63 (ectoderma)
Laminina (ectoderma)
Collagene (mesoderma-connettivo)
Distrofina (mesoderma-muscolo)
APC (endoderma)
Fosforilasi (endoderma-fegato)

-------------

displasia ectodermica
epidermolisi bullosa
osteogenesi imperfetta
distrofia muscolare
adenocarcinomi del colon
glicogenosi

Appaiamento e ibridazione : i reagenti

Si possono produrre acidi nucleici artificiali, con la sequenza desiderata (ESOGENI).
Questi si possono appaiare a corrispondenti sequenze complementari e antiparallele,
per es. gli mRNA in una cellula (ENDOGENI).
DNA polimerasi

DNA

DNA

32P 32P 32P

RNA polimerasi

DNA

sonda
radioattiva

RNA

sonda
radioattiva
32P 32P 32P

Trascrittasi inversa

RNA

DNA

sonda
radioattiva
32P 32P 32P

DNA

DNA

sonda
marcata
DIG DIG DIG

Appaiamento e ibridazione : la rivelazione

Rilevata mediante .
DNA

sonda
radioattiva

Radiografia

32P 32P 32P

DNA

sonda
marcata

Anticorpo anti-DIG

sonda
marcata

Avidina legata a una

molecola fluorescente
o chemioluminescente

sonda
fluorescente

Fluorescenza diretta

DIG DIG DIG

DNA
Biotina

Biotina

DNA

Cy3

Cy3

Le moderne tecnologie dei microArray per rivelare la

presenza di tutti gli mRNA in una cellula

Vengono depositate delle goccioline

su un vetrino, ognuna contenente una
sequenza diversa di RNA o DNA, in
una posizione ben precisa. Circa due
milioni in 2 cmq.
Ogni sequenza corrisponde a un tratto
noto di un RNA realmente esistente.

Preparando dei campioni di RNA da

cellule, posso far avvenire una
ibridazione sul vetrino. Si rileva il
segnale fluorescente in corrispondenza di ogni sequenza, e si valuta
il risultato (MOLTO COMPLESSO)

Il dogma
dogma centrale
ai controlli
suicontrollo
processi
Il
centraledella
dellabiologia,
biologiaESTESO
e i principali
punti di

Principali meccanismi di regolazione dell espressione genica

Controllo dellinizio della trascrizione

Controllo della maturazione

- Splicing alternativo
- Lunghezza del poli-A al 3

Controllo della localizzazione

- Pori nucleari e proteine di trasporto

Controllo negativo da parte dei microRNA

Controllo dalla stabilit (vita media) del RNA - Degradazione

Controllo della traduzione in proteina

- Fattori di Elongazione
- Chinasi S6

Per generare la variet dei TIPI cellulari, le

informazioni contenute nel DNA non si esprimono
contemporaneamente, e sono finemente regolate
Geni ad espressione costitutiva (housekeeping)
Geni ad espressione condizionale (inducibili, reprimibili)

Geni specializzati (presenti in tessuti specifici, che a loro volta

possono essere costitutivi o condizionali)

Organizzazione generale di un gruppo di geni procariotici (operone)

Pi geni (unit codificanti per una proteina) sono allineati sotto una sola
regione di controllo, chiamata promotore. Questo ha una logica in quanto le
proteine controllate IN SERIE fanno spesso parte della stessa via metabolica

Nel promotore, esiste una sequenza chiamata operatore che funziona come un
interruttore acceso/spento, e consente/impedisce lattacco della RNA polimerasi.

Il controllo sullinizio della trascrizione nei procarioti mediato

direttamente da attivatori e repressori proteici
In maniera analoga, un repressore pu essere eliminato (quindi DE-REPRIME, cio
attiva) in presenza di un intermedio metabolico o una molecola segnale. In assenza di
induttore il repressore occupa fisicamente il sito dove si legherebbe la RNA polimerasi.

Il controllo sullinizio della trascrizione nei procarioti mediato

direttamente da attivatori e repressori proteici
Questo un esempio di un repressore. La proteina repressore pu essere attivata (quindi
REPRIME) da un attivatore, in genere un intermedio metabolico o una molecola
segnale. Funziona occupando fisicamente il sito dove si legherebbe la RNA polimerasi

Il controllo sullinizio della trascrizione nei procarioti mediato

direttamente da attivatori e repressori proteici
Questo un esempio di un attivatore. La proteina attivatore per funzionare (quindi
ATTIVARE) necessita di un regolatore allosterico positivo, in genere un intermedio
metabolico o una molecola segnale

La regolazione delloperone lattosio, positiva e negativa assieme

Solo quando lattivatore CAP attivato e il repressore LacI disattivato la RNA

polimerasi pu agire e iniziare la trascrizione. Negli altri casi la trascrizione impedita.

Promotore e Operatore sono tratti di DNA, il cui funzionamento

dipende da proteine specifiche che leggono la sequenza

La trascrizione negli eucarioti differisce per due importanti

caratteristiche rispetto ai procarioti:
nota

- le RNA polimerasi necessitano di fattori generali di trascrizione

nota

- altri fattori di trascrizione specifici

possono legarsi a grande
distanza dal promotore che essi controllano

Nota: fattori generali sono quelli che costituiscono il macchinario

basale che inizia la trascrizione, e si legano vicino al sito di inizio.
Es. TFIID TFIIA, TFIIB
I fattori specifici sono molti, riconoscono sequenze diverse, anche lontane.
Es. Pax, Hox, Otx, myc, AP1, CREB, ecc ecc

Assemblaggio del complesso dinizio per la trascrizione di

un gene eucariote, il macchinario BASALE
La maggioranza dei geni eucarioti possiede
una sequenze TATA circa 30 nucleotidi a monte
del punto di inizio della trascrizione, detta TATA-box

Per iniziare la trascrizione, al DNA si legano

nellordine :
TATA-binding protein (TBP) che possiamo
considerarla parte del TFIID, riconosce la
sequenza TATA-box e si lega stabilmente.
TFIIA, TFIIB,
RNA polimerasi, con TFIIF, TFIIE, TFIIH

Questultima una chinasi, fosforila la RNA

polimerasi che pu partire la trascrizione

Modello a nastro della TATA-binding protein legata alla

sequenza TATA-box di un promotore eucariotico

Regione di controllo di un tipico gene eucariotico

Regolatori specifici

Fattori
generali

RNA polimerasi II

Regolatori
specifici

Sequenze
regolative

a monte .

. a valle del gene

Come possibile una regolazione a distanza ?

Numerosi fattori di trascrizione eucariotici possono agire a

distanza grazie al ripiegaento della doppia elica di DNA

Le proteine regolatrici si assemblano formare

dei complessi, direttamente sul DNA

Uno stesso fattore di trascrizione controlla linizio della trascrizione

di molti mRNA e microRNA, utilizzando altre proteine che cooperano.
A loro volta sono molteplici e si legano a altre sequenze del DNA

Il controllo trascrizionale si basa sullesistenza di :

1) Specifiche sequenze di DNA
Specifiche sequenze di DNA, generalmente lunghe meno di
20 nucleotidi, servono da sito di riconoscimento e legame per
specifiche proteine regolatrici

2) Proteine regolatrici che riconoscono e

legano tali sequenze
Le proteine regolatrici contengono motivi strutturali che
leggono specifiche sequenze di DNA

Legame di una proteina regolatrice al

solco maggiore del DNA

I diversi accoppiamenti di basi possono essere riconosciuti

dallesterno della doppia elica di DNA

Fattori di trascrizione specifici

leggono sequence specifiche
nel contesto della doppia elica

Principali motivi nota proteici presenti nei fattori di

trascrizione specifici, che riconoscono e legano una
sequenza di DNA:

- elica-giro-elica
- omeodominio
- a dito di zinco
- a cerniera di leucine
- elica-ansa-elica

(helix-turn-helix)
(homeodomain)
(zinc-finger)
(leucin-zipper)
(helix-loop-helix)

nota: per motivo, o dominio proteico, si intende un tratto di una proteina con
una conformazione 3D, una stereochimica e una funzione riconoscibile anche
separatamente dal resto della proteina. Domini molto simili sono presenti in
proteine diverse, della stessa classe. Il grado di similitudine di un dominio in
proteine diverse si indica come conservazione, o omologia di sequenza.

Struttura dei principali motivi proteici

elica-giro-elica

dito di zinco

omeodominio

cerniera di leucine

Il motivo elica-giro-elica costituito da due -eliche unite

da una corta catena di amminoacidi

Una delle due -eliche si inserisce nel solco maggiore della doppia elica

Lomeodominio un tratto di 60 a.a. con tre -eliche, due

delle quali compongono un motivo elica-giro-elica,

Lelica 3 contatta in DNA inserendosi nel solco maggiore. L omeodominio

presente in numerosi (140) FT importanti per lo sviluppo embrionale

Motivo di legame al DNA a dito di zinco

Il motivo ricorrente sono due istidine e due cisteine, opportunamete spaziate, a

coordinare un atomo di zinco. Spesso questi FT hanno pi di 1 dito di zinco

Il motivo a cerniera di leucine costituito da due eliche che interagiscono tra loro

Due -eliche interagiscono mediante R di

leucine, opportunamente spaziate e
orientate in modo da trovarsi al centro.
Questo dominio tipico di fattori di
nota
trascrizione che agiscono come DIMERI.

Nota: molte proteine agiscono formando dei complessi temporanei

di due (DIMERI), tre (TRIMERI), quattro (TETRAMERI) proteine.
Se sono proteine diverse, si parla di ETERO-DIMERI, se la stessa
proteina si parla di OMO-DIMERI

Il motivo Helix-Loop-Helix costituito da due

corte-eliche unite da una regione ad ansa

Come si pu individuare una sequenza riconosciuta da un FT

Un tratto di DNA che si presume contenga questa sequenza viene fuso con
un gene reporter che produce una proteina facilmente misurabile. Facendo
delle DELEZIONI progressive di questo tratto di DNA, assieme al FT di
mio interesse, posso vedere quando la trascrizione cambia bruscamente.

Come agiscono i fattori di trascrizione

considerando la struttura impaccata del DNA ?

Organizzazione base della cromatina : i nucleosomi

Ottamero costituito da 2 molecole
di istone H2a, H2b, H3, H4.

Istone H1

Organizzazione base della cromatina : i nucleosomi

Fibra di cromatina
condensata di 30 nm
Cromatina
decondensata
e organizzazione in
nucleosomi

Regolazione dellespressione genica a livello cromatinico

Eucromatina, DNA meno condensato

Pi attiva

Eterocromatina, DNA fortemente condensato

Meno attiva

La etero-cromatina del cromosoma X

Situazione particolare : in tutte le cellule
femminili ci sono 2 cromosomi X, mentre
in tutte le cellule maschili un X e un Y.
Il cromosoma X grande e contiene molti
geni importanti per le cellule, mentre Y
porta solo i caratteri per l inversione del
sesso (da femminile a maschile)
Nelle cellule femminili uno dei due X
viene sistematicamente inattivato.

Eterocromatina facoltativa.
In definitiva, sia le cellula maschili che le
cellule femminili sono aploidi per X

Disassemblamento dei nucleosomi dal

promotore durante linizio della trascrizione

Disassemblamento dei nucleosomi dal promotore

Nel disassemblamento dei nucleosomi

intervengono ancora altre proteine, le
quali gestiscono lorganizzazione della
cromatina.

Gli istoni poco impaccati non sono un grave ostacolo alla trascrizione di
un gene in quanto possono essere rimossi o scivolare, liberando le sequenze
che servono

Invece il grado di impaccamento della cromatina pu ostacolare laccesso dei

fattori di trascrizione e della RNA polimerasi, un macchinario ingombrante

Lo stato di condensazione della

cromatina controlla lespressione genica

Il compattamento dei nucleosomi dinamico e viene

modificato da due principali sistemi regolatori

1
Modificazione
degli istoni

2
Rimodellamento
della cromatina

Gli istoni nel nucleosoma contengono code aminoterminali flessibili che

sporgono dalla loro porzione globulare, ricche in lisine
(aa con carica positiva)
In virt della carica positiva, le lisine interagiscono con i gruppi fosfato
del DNA -> COMPATTAMENTO
Le lisine possono essere reversibilmente acetilate e de-acetilate da enzimi
specifici (HAT, HDAC)
L acetilazione neutralizza la carica positiva riducendo linterazione con
il DNA e rende meno possibile la compattazione dei nucleosomi

Modificazione degli istoni

1 Modificazione degli istoni

OPERAZIONE

ENZIMA

- acetilazione
- metilazione
- fosforilazione

acetilasi
metilasi
chinasi

- deacetilazione de-acetilasi
- demetilazione de-metilasi
- defosforilazione fosfatasi

Un codice combinatorio di
modificazioni istoniche .

La eterocromatina del cromosoma X

Reazione dei cromosomi di una

cellula femminile con un anticorpo che riconosce Istone-H4
acetilato (in verde fluorescente).
Notare che un cromosoma X
(freccia bianca) NON si colora, in
quanto NON acetilato e inattivo.

Come gli attivatori della trascrizione possono reclutare le

acetilasi degli istoni (HAT), i repressori possono reclutare le
deacetilasi degli istoni (HDAC)

2 Il complesso del rimodellamento della cromatina

Invece che modificare gli istoni,

questo complesso pu far scivolare,
eliminare, aggiungere e in pratica
RIORGANIZZARE gli istoni dei
nucleosomi. Con le conseguenze
evidenti di favorire o sfavorire
lassemblaggio dellapparato di inizio
della trascrizione.

Regolazione dellespressione genica a livello cromatinico

Uno schema
generalizzato

Modificazione diretta del DNA : metilazione della citosina

demetilasi

DNA metil-transferasi

L aggiunta di Metile alla citosina avviene in prossimit di un gene che

deve essere silenziato, cio spento in maniera pi permanente.
Vengono metilate un certo numero di citosine in regioni del DNA con una
sequenza ricca di CG, dette CpG island. Un gene con CpG island
vicine, verosimilmente pu essere silenziato mediante metilazione

Solomon, Berg, Martin Biologia Capitolo 23

Principali meccanismi di regolazione dell espressione genica

Controllo dellinizio della trascrizione

- Splicing alternativo

Controllo della maturazione - Lunghezza del poli-A al 3

Controllo dell esportazione

- e della localizzazione

Controllo della traduzione in proteina

- Fattori di Elongazione
- Chinasi S6

Controllo negativo da parte dei microRNA

Controllo dalla stabilit (vita media) del RNA

- Degradazione

Gli enzimi necessari al processamento - maturazione del

mRNA messaggero sono associati alla RNA polimerasi

Lo splicing alternativo genera pi versioni di mRNA maturo

a partire da un unico trascritto primario

Gli RNA e le proteine sono continuamente degradate e eliminate

RNA e proteine sono molecole labili.

Per gli RNA esistono enzimi RNAsi molto
efficienti. Per le proteine esiste il complesso
del proteosoma. In entrambe i casi il livello
di un mRNA o proteina nella cellula il
risultato dellequilibrio tra la sua produzione
e la sua degradazione.
Eliminare molecole CON ALTO
CONTENUTO di INFORMAZIONE ha il
significato di ri-azzerare il sistema e
consentire alla cellula di modificare il suo
corredo di mRNA e proteine, maturando o
rispondendo a variazioni ambientali.

Alcuni mRNA sono localizzati in modo asimmetrico e

polarizzato nel citoplasma di una cellula

Alcune proteine sono quindi prodotte a un polo della cellula e mancano nellaltro.
Quando la cellula si divide, le cellule figlie NON sono esattamente uguali : queste
differenze si manifestano nellembrione in via di sviluppo come definizione di
territori distinti, che a loro volta diventeranno tessuti diversi

Con pochi fattori di trascrizione si pu generare una molteplicit

di tipi cellulari, come effetto di un codice di COMBINAZIONI

Come organizzare una memoria dellespressione genica

Per non perdere la regolazione acquisita a seguito
della replicazione del DNA, la cellula utilizza vari
metodi. Per esempio lauto-regolazione

Come organizzare una memoria dellespressione genica

Un altro modo e l utilizzo di proteine con legame multiplo COOPERATIVO,
dove la presenza di una sola molecola favorisce laggiunta delle altre.

Anatomia di un gene e del suo mRNA