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molecolare
dei geni
Denaturazione e rinaturazione di una molecola di
DNA
Si rompono i legami idrogeno
Maggiore e’ il contenuto
delle G C, maggiore e’ la
…
Tm
slow
Fast: DNA altamente ripetuto, presente in
numerose copie (trasposoni inattivi, copie
geniche inattive, ripetizione di sequenze
semplici, sequenze ripetute in tandem,
duplicazioni segmentali)
Intermediate: DNA mediamente ripetuto
Slow: DNA presente in sequenze uniche
Composizione del genoma umano
PCR
(Polymerase Chain Reaction o reazione a
catena della polimerasi)
1 2
La PCR permette
l’amplificazione di un
milione di volte o piu’ di
una sequenza specifica
di DNA che e’ gia’ nota o
di cui sono note delle
piccole sequenze
all’estremita’ del gene
La possibilita’ di conoscere i geni
deriva dalla capacita’di manipolarli:
DNA polimerasi
dNTP
Mg2+
Ibridazione
con sonda
di DNA
- PER INDIVIDUARE LA PRESENZA DEL GENE CHE SI STA
CERCANDO
La
mutazione
abolisce il
sito MstII
Ibridazioni in situ
Il sequenziamento del DNA (Sanger)
Determinazione della
sequenza nucleotidica
del DNA
il metodo di Sanger 2’-3’
DIDEOSSINUCLEOTIDI
DNA stampo
DNA polimerasi
dNTP
primer marcato
autoradiogramma
fondatori
fondatori
progenie
MICROINIEZIONE NEI PRONUCLEI
ANIMALI CHIMERICI e le CELLULE STAMINALI
EMBRIONALI
blastocisti
Cellule embrionali
PROPRIETA’ DELLE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI
(ES)
Eredita’ mendeliana
Progenie con
del transgene
cellule
germinali
portatrici del Cellule germinali
transgene aploidi
50% + 50% -
Come introdurre il transgene
nella cellula zigote o nelle
cellule staminali embrionali?
•INIEZIONE NEL PRONUCLEO DI PLASMIDI
INEFFICIENTE E COSTOSO
• ONCORETROVETTORI MoMLV
SILENZIAMENTO DEL VETTORE DURANTE LO SVILUPPO
• LENTIVETTORI
NON SOGGETTI A SILENZIAMENTO