SPLICING ALTERNATIVO

Biologia molecolare
Ilaria Lampronti, Ph.D

Biologia molecolare, F. Amaldi et al., Casa Editrice Ambrosiana

Biologia molecolare, G. Capranico et al., EdiSES ed.
Le cellule possono cambiare l’espressione genica
•  In base a stimoli esterni (extracellulari)
•  L’espressione genica viene regolata lungo la via DNA-RNA-
Proteine (a diversi livelli), controllando:
1.  Quando e quanto spesso un gene è trascritto (controllo trascrizionale)
2.  Lo splicing (controllo delle modificazioni dell’RNA)
3.  Scegliendo quali mRNA maturi possono essere localizzati nel citosol
(controllo di trasporto e localizzazione dell’RNA)
4.  Scegliendo quali mRNA devono essere tradotti dai ribosomi (controllo
traduzionale)
5.  Destabilizzando selettivamente alcune molecole di mRNA (controllo
della degradazione dell’mRNA)
6.  Attivando, disattivando, degradando o compartimentando
selettivamente proteine specifiche dopo la sintesi (controllo
dell’attività delle proteine)
I sei passaggi del controllo dell’espressione genica
2. Controllo delle modificazioni dell’RNA
•  Mediante un processo particolare che prende il nome di
splicing alternativo
•  Il trascritto primario (RNA derivato dalla trascrizione-pre-RNA) viene
trasformato in mRNA mediante lo splicing “classico” sempre nel
nucleo
•  Spesso nella cellula viene effettuato anche lo splicing alternativo da
cui si possono ottenere più prodotti
•  Proteine regolatrici specifiche riconoscono i siti di splicing
•  Difetti dello splicing sono alla base di importanti patologie
•  Tumori
•  Malattie genetiche
Splicing
•  Maturazione post-trascrizionale degli mRNA
•  Le sequenze nucleotidiche degli mRNA maturi sono diverse da quelle
degli mRNA precursori trascritti (pre-mRNA)
•  I processi di maturazione avvengono nel nucleo (eucarioti o
mitocondri) dopo la trascrizione
•  Attività pressoché assenti nei procarioti

Dimostrarono per
primi la presenza
degli INTRONI:

A.  Philip Sharp,

Genetista e
biologo USA
B.  Richard Robert,
Biochimico UK
Differenze nella trascrizione di procarioti
ed eucarioti

Geni procariotici ed eucariotici
Geni discontinui e splicing
La sequenza di un gene può contenere tratti di sequenza interposti che
non compaiono poi nel trascritto maturo funzionale. Tali sequenze
interposte sono state chiamate introni, mentre i tratti di sequenza che,
unendosi, vanno a formare il trascritto maturo sono stati chiamati
esoni.
 Lo splicing: un evento unico!
•  Evento caratteristico degli eucarioti
•  DNA (introni + esoni)
•  Trascritto primario (pre-mRNA)
•  Trascritto secondario (mRNA maturo)

•  Nei procarioti la sequenza genica corrisponde all’mRNA

•  Negli eucarioti il pre-RNA corrisponde alla sequenza di DNA
•  L’mRNA maturo, dopo lo splicing, corrisponde alla sequenza genica
codificante (in cui sono stati escusi tutti gli introni)
•  Ogni pre-mRNA inizia e finisce con esoni
•  Se n è il # degli esoni, n-1 sarà il # degli introni (v. lezioni Prof. Spisani)
Un vecchio concetto superato
•  “Un gene, una proteina”
•  Oggi sappiamo che tale affermazione non è corretta
anche grazie alla scoperta dello splicing alternativo
•  Scoperto perché
•  I trascritti maturi avevano sequenza che non corrispondeva a
quella del DNA codificante
•  Le immagini ottenute al microscopio elettronico forniscono le prove
•  Grazie a questo meccanismo un solo gene può generare
diversi mRNA che codificano per diverse proteine
•  Oltre il 90% dei geni è soggetto a splicing alternativo
•  Fenomeno da cui deriva la complessità del trascrittoma e
del proteoma
Lo splicing alternativo
•  È il meccanismo attraverso il quale uno stesso pre-mRNA
può subire eventi di splicing differenti che portano alla
creazione di diversi mRNA alternativi, che a loro volta
possono codificare differenti proteine
•  Scoperto da David Baltimore
•  Esistono vari eventi che portano alla generazione di più
trascritti grazie a
•  Siti alternativi di inizio e terminazione
•  Diversi eventi
Possibili eventi che portano a splicing alternativo

Sito alternativo di inizio

Sito alternativo di terminazione

facoltativi

Possibili  even+  elementari  che  concorrono  alla  generazione  di  più  trascri7  a  par+re  da  uno  
stesso  gene.  Uno  stesso  gene  può  esprimere  numerosi  trascri1  dis3n3  a4raverso  l’u3lizzo  di  
si3  alterna3vi  di  inizio  (a)  e  terminazione  (b)  della  trascrizione  (AAUAAA  è  il  3pico  segnale  di  
poliadenilazione),  e  lo  splicing  alterna3vo  che  comprende  diversi  even3  elementari  (c-­‐g).  
Nell’istogramma sono indicate le
frequenze relative delle diverse
modalità di splicing alternativo in
varie specie animali
Esempio del gene Dscam in Drosofila

Lo splicing alternativo può determinare più di 38.000 trascritti

differenti! Grazie alla combinazione di diversi esoni mutuamente
esclusivi.
In rosso esoni costitutivi; in verde, viola, azzurro e giallo, gli
esoni con più siti di splicing alternativo (esoni 4, 6, 9, 17)
Regolazione dello splicing
•  Esistono siti di splicing a valle e a monte (in cis) che opportune
proteine regolatrici (in trans) riconoscono attraverso due meccanismi:
1.  Riconoscimento degli ESONI (uomo)
2.  Riconoscimento degli INTRONI (invertebrati, piante, funghi)

•  Alta specificità di riconoscimento dei siti di splicing, grazie alla presenza

di sequenze addizionali riconosciute da
•  Attivatori (enhancers)
•  Repressori (silencers)
•  Questi elementi regolatori sono classificati come

•  Enhancer esonici (ESE: Exonic Splicing Enhancers) o

•  Silencers esonici (ESS: Exonic Splicing Silencers)

•  Enhancer intronici (ISE: Intronic Splicing Enhancers) o

•  Silencers intronici (ISS: Intronic Splicing Silencers)
Regolazione dello splicing

La  regolazione  dello  splicing  comporta  l’interazione  tra  proteine  in  grado  di  legare  specifici  mo3vi  
presen3   nel   pre-­‐mRNA   sia   negli   esoni   (ESE,   ESS)   che   negli   introni   (ISE,   ISS).   All’azione   delle  
proteine   SR     (serina   S,   arginina   R)   che   legano   le   sequenze   enhancer   negli   esoni   (ESE)   e   negli  
introni   (ISE),   e   che   a1vano   lo   splicing   (frecce   rosse   e   verdi   a   punta),   si   oppongono   le   proteine  
hnRNP  (heterogeneus  nuclear  RiboNucleoProtein),  che  invece  riconoscono  le  sequenze  silencer  
negli  esoni  (ESS)  e  negli  introni  (ISS)  (frecce  viola  a  punta  pia4a).  Il  meccanismo  di  a1vazione  o  
repressione   normalmente   comporta   l’interazione   con   altre   componen3   dello   spliceosoma:   gli  
snRNP  (small  nuclear  RiboNucleoProtein)  
Meccanismi di regolazione

L’a7vità  dei  mo+vi  di  regolazione  dello  splicing  è  dipendente  dal  contesto.  
(A)   Lo   stesso   mo3vo   (1,   2)   può   fungere   sia   da   a1vatore   che   da   repressore   in   funzione   della   sua  
localizzazione   esonica   o   intronica.   (B)   Lo   stesso   mo3vo   (1),   anche   nella   stessa   localizzazione  
intronica,  può  avere  a1vità  differen3  in  diversi  geni  (mostra3  con  un  colore  diverso).  Nel  gene  
mostrato   nel   pannello   a   destra,   il   mo3vo   di   regolazione,   che   normalmente   agisce   come  
a1vatore,  non  è  in  grado  di  legare  il  suo  intera4ore  proteico.  Si  consideri  che  l’a1vità  dei  si3  di  
regolazione  dello  splicing  dipende  anche  dallo  stato  epigene3co  della  croma3na.  
Lo splicing alternativo tessuto-specifico
•  Uno stesso gene può generare mRNA diversi a seconda
dei tessuti in cui viene espresso
•  Soprattutto nel tessuto nervoso
•  Numerosi mRNA derivanti da splicing alternativo
•  Dovuto a espressioni tessuto-specifiche di fattori coinvolti nello
splicing
•  Il ruolo dello splicing alternativo si somma al più
conosciuto e classico controllo dell’espressione genica
(differenziamento e risposta a stimoli)
•  Esempio: gene della CALCITONINA (CT/CGRT)
 Il gene per la calcitonina
Il gene della calcitonina umana (CT/CGRT) rappresenta un interessante esempio di splicing alternativo
tessuto-specifico. Si manifesta un fenomeno di exon skipping, a carico di un esone (4) nel quale è
presente un sito di poliadenilazione che porta alla terminazione della trascrizione e alla produzione di una
forma tronca dell’mRNA. Il gene è espresso solo in due tessuti: da una parte, in un particolare gruppo di
neuroni e dall’altra a livello della tiroide. Nell’ipofisi è attivo il meccanismo di exon skipping e viene
espressa la forma più lunga dell’mRNA. A livello della tiroide, invece, l’esone permane e viene pertanto
espressa la forma più lunga dell’mRNA. L’mRNA espresso nei neuroni codifica per la proteina cgrt
(calcitoninegene-related sequence), un peptide con attività vasodilatatorie. Nelle cellule della tiroide, invece,
l’mRNA prodotto codifica per l’ormone calcitonina (CT), un peptide che regola la concentrazione del calcio
nel sangue.
Difetti dello splicing
•  Che sono coinvolti in malattie neoplastiche
•  Che sono coinvolti in malattie genetiche
•  Thalassemia
•  Fibrosi cistica
Difetti dello splicing
•  Mutazioni a carico di molti geni determinano difetti nel
meccanismo dello splicing
•  Splicing aberrante
•  Malattie ereditarie
•  Malattie neoplastiche
Le mutazioni che interessano lo splicing
•  Sequenze specifiche introniche legano i vari componenti
(fattori) dello spliceosoma
•  Mutazioni a carico di tali sequenze si chiamano mutazioni in cis
(più frequenti)
•  Mutazioni a carico dei fattori dello spliceosama si dicono mutazioni
in trans (molto meno frequenti)
•  Esempi:
•  Beta-talassemia
•  Fibrosi cistica
•  Tumori
La beta-talassemia
•  Malattia genetica autosomica recessiva
La beta-talassemia
(morbo di Cooley)
Gravità della malattia e livelli di Hb
•  Pazienti portatori (talassemia minor)
•  Pazienti β+ (talassemia intermedia)
•  Pazienti β0 (talassemia major)

Terapie convenzionali e sperimentali

•  TERAPIA CONVENZIONALE
•  Trasfusioni di sangue
•  Chelanti del ferro
•  TRAPIANTO DI MIDOLLO OSSEO
•  Donatore compatibile
•  TERAPIA GENICA
•  Vettore contenente gene corretto
•  RIATTIVAZIONE DI EMOGLOBINA FETALE
•  Utilizzo di induttori del differenziamento eritroide
Come si può fare diagnosi?

•  Diagnosi di I livello
•  RBC, Hb, MCV (Emocromo)
•  Diagnosi di II livello
•  Analisi dei livelli di Hb prodotti
•  Diagnosi di III livello
•  Analisi genetiche (individuare la precisa mutazione)

Mutazioni che portano a

splicing aberrante
Geni globinici
Le mutazioni
•  Più di 200 alterazioni del gene beta globinico causano
beta-talassemia
•  MUTAZIONI
•  Alterazioni puntiformi sul promotore (inibizione della trascrizione)
•  Alterazioni puntiformi in zone introniche (molte a carico delle
sequenze di riconoscimento dello splicing)
•  Delezioni (più rare)
•  Tipologia del fenotipo risultante
•  β+ (emoglobina difettosa o scarsa)
•  β0 (assenza di emoglobina adulta)
Mutazioni che influenzano lo splicing
•  Mutazioni a livello delle sequenze altamente
conservate (GT e AG) sui siti di splicing in 5’ e in 3’
•  Mancato riconoscimento da parte di snRNP U1 (5’) e U2AF35 (3’)
•  Impossibilità di tradurre una proteina normale e funzionale
•  Generazione di fenotipo β0 (forma grave)
•  Formazione di mRNA aberranti
•  Ritenzione di un introne (intron retention)
•  Eliminazione di un esone (exon skipping)
•  Mutazioni che generano nuovi siti di splicing
•  G A nell’introne 1
•  80% di probabilità: si forma mRNA con esone 2 più lungo (mancata
sintesi di Hb)
•  20% di probabilità: viene effettuato lo splicing classico
•  Generazione di fenotipo β+ (forma attenuata)
Difetti dello splicing nella β-talassemia

Intron retention esone 2 più lungo

Exon skipping
La fibrosi cistica
•  Malattia genetica autosomica recessiva
•  Già descritta in precedenti lezioni (v. il TF NF-kB)
Le mutazioni
•  Più di 2000 alterazioni del gene CFTR causano CF
•  MUTAZIONI
•  Alterazioni nella sequenza codificante (la maggior parte)
•  Alterazioni in zone introniche e splicing aberrante (circa il 13%)
•  Proteina non funzionale (exon skipping)

DELEZIONE

Exon skipping
Malattie tumorali
•  Cos’è il cancro?
•  Splicing aberrante e correlazione con i tumori
•  Tumore del colon
•  Retinite pigmentosa
Cos’è il cancro?
•  Statistiche: il cancro colpisce una persona su tre!
•  Definizione: il cancro è costituito da una famiglia di
malattie caratterizzate da crescita cellulare incontrollata e
sregolata e dall’invasione e dalla diffusione di cellule
cancerose dal sito d’origine (sito primario) ad altri distretti
dell’organismo.
•  Famiglia di malattie: più di 100 tipologie conosciute
•  Classificazione:
•  CARCINOMI
•  SARCOMI
•  ADENOCARCINOMI
•  Cause: luce UV, fumo da sigaretta, esposizione ad agenti
chimici, ecc.
Il tessuto di origine determina le
caratteristiche che distinguono il cancro

•  CARCINOMI
•  Circa 85%, cellule epiteliali
•  SARCOMI
•  Meno frequenti, cellule mesodermiche (tessuto connettivo,
cartilagine, osso, muscolo)
•  ADENOCARCINOMI
•  Meno frequenti, tessuto ghiandolare (mammella, prostata,
pancreas)
Le 6 caratteristiche del cancro
Tumore BENIGNO e MALIGNO

•  Il tumore benigno non è evidenza di cancro

•  Il tumore benigno non metastatizza

•  Il tumore benigno può comunque essere pericoloso per la

vita a causa della posizione
Cancro = malattia genetica
•  La maggior parte degli agenti cancerogeni provocano
alterazioni della sequenza di DNA o mutazioni (mutageni)
•  Mutazioni puntiformi
•  Delezioni
•  Traslocazioni
•  L’accumulo di mutazioni è alla base della carcinogenesi
•  La vita media che si allunga spiega l’aumento dei casi di tumore
•  Quasi tutte le mutazioni causa di cancro avvengono in
cellule somatiche (mutazioni somatiche)
•  Tumore non trasmissibile alle generazioni successive
•  Solo alterazioni del DNA dello sperma e delle cellule uovo
(mutazioni germinali) sono trasmesse alla progenie
Mutazioni somatiche

•  Non trasmissibile all future generazioni

•  Determinato da agenti esogeni: contatto con sostanze
chimiche pericolose o con radiazioni ionizzanti
•  Possono determinare cancro o altre malattie
 Mutazioni germinali
•  Dovute a fattori endogeni ed esogeni:
•  Fattori endogeni: errori durante la replicazione (1) o danno
ossidativo (2).
1.  Più frequenti nelle cellule spermatiche (maggior numero di divisioni
cellulari nell’arco della vita dell’uomo) che negli oociti. Queste
mutazioni puntiformi includono delezioni di singole basi, inserzioni,
duplicazioni e cambio degli aminoacidi.
2.  Radicali liberi dell’ossigeno possono determinare mutazioni del DNA:
trasformano la Guanina in 8-oxoguanine che viene scambiata per una
Timina dalla DNA polimerasi che commette dunque un errore.
•  Fattori esogeni: esposizione a sostanze chimiche pericolose o
radiazioni ionizzanti

-Crow JF (October 2000). "The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation". Nature
Reviews Genetics. 1 (1): 40–7.
-Wong WS, Solomon BD, Bodian DL, Kothiyal P, Eley G, Huddleston KC, Baker R, Thach DC, Iyer RK, Vockley
JG, Niederhuber JE (2016). ”New observations on maternal age effect on germline de novo mutations” Nature
Communications. 7: 10486.
Crescita, apoptosi, differenziamento
•  Fattori che regolano il numero totale di cellule in un
individuo
•  La proliferazione cellulare
•  L’apoptosi
•  Il differenziamento terminale
•  Le mutazioni del DNA che alterano queste funzioni
influenzano l’equilibrio del numero di cellule
•  Crescita non regolata
•  Insorgenza di tumori
Oncogeni e geni soppressori dei tumori
•  Protoncogeni: geni normali che possono essere attivati
con una mutazione e divenire oncogenici (presenti in tutte
le cellule)
•  Oncogeni: gene che produce la rispettiva proteina in
modo più abbondante o più attiva per agire in maniera
dominante per dare inizio alla formazione di un tumore
•  Geni soppressori (oncosoppressori): codificano per
proteine che sono coinvolte nell’inibizione della crescita e
della formazione dei tumori
•  I principali oncosoppressori sono:
•  p53
•  RB
•  APC
Fattori che influenzano la carcinogenesi
•  Ambiente
•  Posto di lavoro
•  Posti di svago usuali
•  UVB
•  Vita riproduttiva
•  Donne senza figli
•  Età prima gravidanza
•  Inizio e termine menorrea
•  Contraccezione
•  Promisciutà sessuale
•  Dieta
•  Dieta mediterranea (riduzione del rischio)
•  Fumo
•  Polmoni, pancreas, fegato, vescica, reni, bocca, stomaco
•  Altro
•  Fisiologia personale
•  Altre malattie
Frequenza annuale di morti (USA)
•  Pazienti maschi normalizzati sull’età (1930-2002)
Principali terapie
•  Chirurgia
•  Rimozione massa tumorale (sito primario)
•  Problema: metastasi (siti secondari)
•  Chemioterapia e radioterapia
•  Per colpire anche le cellule metastatiche
•  EFFETTI citostatici e citotossici
•  Goal: danneggiare il DNA in cellule con alta proliferazione per
indurre APOPTOSI
•  Effetti collaterali noti su cellule non tumorali (alopecia, ulcere,
anemia) a causa del basso INDICE TERAPEUTICO
•  Nuovi farmaci biologici
•  Per diminuire effetti collaterali
•  Aumentando la selettività
Indice terapeutico
•  Differenza tra dose massima
tollerata (MTD) e dose minima
efficace

•  Esempio:
•  ASPIRINA IT alto
•  ANTITUMORALI classici IT basso
Genomica e proteomica del cancro
•  Completamento del progetto GENOMA umano
•  Conoscenza dei dettagli del genoma
•  Riconoscimanto di distinzioni tra cellule normali e cellule cancerose
•  Progettazione di farmaci mirati
•  Chemioterapici con bersaglio preciso (in combinazione con vettori)
•  Piccole molecole (RNA antisenso, siRNA, microRNA) come nuove
classi di biofarmaci
•  Studio del PROTEOMA umano
•  Ampliamento della conoscenza dell’espressione proteica
differenziata
•  Riconoscimento di distinzioni tra cellule normali e cellule cancerose
•  Scoperta di nuovi biomarcatori tumorali
•  Progettazione di farmaci mirati
•  Per esempio anticorpi diretti contro prodotti genici specifici (Ab coniugati
con antitumorali o radiofarmaci)
APOPTOSI: morte cellulare programmata
•  APOPTOSI: “Suicidio cellulare”
•  Modalità intrinseca di morte cellulare
•  Avviata da segnali specifici (extracellulari ed intracellulari)
•  Processo accurato e preciso
•  Poche tracce residue (formazione dei corpi apoptotici) della cellula
eliminata per fagocitosi (macrofagi)
•  NECROSI: “morte accidentale”
•  In condizioni patologiche
•  Riversamento del contenuto cellulare nello spazio circostante e
insorgenza di infiammazione (rigonfiamento cellulare)
•  AUTOFAGIA: “auto-digestione”
•  In caso di carenza di nutrienti
•  Azione di Lisosomi ed enzimi litici in essi contenuti
Tumori duvuti a splicing aberrante
•  Esempi
•  Tumore del colon
•  Retinite pigmentosa
•  Mutazioni negli elementi caratteristici della regolazione
dello SPLICING
•  Conseguente generazione di mRNA aberranti
•  Ingenere disattivazione di geni ONCOSOPPRESSORI
•  Inattivazione di sistemi di protezione
•  Trasformazione tumorale
Funzione degli oncosoppressori
•  p53
•  TF che induce blocco
del ciclo e apoptosi
cellulare (coinvolto in
molti tumori)
•  RB
•  Controllo trascrizione
geni coinvolti nel ciclo
cellulare (es.
retinoblastoma)
•  APC
•  Lega e regola l’attività
della beta-catenina
(es. tumore al colon)
Attivatori a monte ed effetti a valle della p53
Lauren Pecorino, Biologia molecolare del cancro, Zanichelli
 Retinoblastoma
•  Neoplasia rara dell’infanzia
•  Forma familiare ereditabile (40%)
•  Entrambi gli occhi colpiti
•  Forma sporadica (60%)
•  Solo un occhio
•  Mutazioni differenti
•  Delezioni, frameshift, nonsenso,
missenso
•  Mutazioni di splicing (esoni e
introni)
•  Ipotesi dei due colpi di Knudson Forme ereditaria e sporadica di retinoblastoma
•  Sono necessarie 2 mutazioni L. Pecorino, Biologia molecolare del cancro, Zanichelli
separate per inattivare le due
copie dell’allele Rb e inattivare la
proteina RB
Tumore del colon
•  Gene oncosoppressore APC
•  Regola l’attività della β-catenina:
•  Due alterazioni che alterano lo splicing:
•  Mutazione a livello del sito di splicing al 5’ dell’INTRONE 4 (exon
skipping dello stesso esone 4)
•  Sostituzione della sequanza AG del sito di splicing al 3’ (un
nucleotide più a valle: accorciamento dell’ESONE 8 e frame shift
conseguente)
•  In entrambi i casi, traduzione di proteine non funzionali