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ON OFF

Dalla fecondazione allembrione

Come si presenta il DNA?


Una molecola di DNA cromosomico (2mt) e due milioni di volte piulunga del diametro di un nucleo (10mm)
DNA a doppia elica

Nucleosomi

Il DNA cromosomico si ripiega in modo appropriato per essere contenuto un un nucleo

fibra di cromatina di 30nm con nucleosomi compattati sezione di un cromosoma in forma estesa

Il DNA cromosomico ripiegato prende il nome di: cromatina


sezione di un cromosoma condensato

La cromatina degli eucarioti e organizzata in diversi livelli di ripiegamento che costituiscono diverse strutture: nucleo soma fibra da 30nm ansa di cromatina

cromosoma mitotico RISULTATO: IL DNA E STATO COMPATTATO IN UN CROMOSOMA CHE E 10.000 VOLTE PIU CORTO DELLA SUA LUNGHEZZA ESTESA

Gli istoni e la struttura dei nucleosomi


Un nucleosoma e formato da un filamento di DNA, avvolto attorno ad un nucleo proteico centrale costituito da 8 istoni Gli istoni sono proteine basiche altamente conservate tra diverse specie Esistono cinque tipi di istoni: H1, H2A, H2B, H3, H4

Lo stato di condensazione della cromatina influenza la trascrizione dei geni


Le regioni di cromatina altamente condensate prendono il nome di ETEROCROMATINA e NON sono trascrizionalmente attive

zona trascrizionale attiva

Le regioni di cromatina meno condensate prendono il nome di EUCROMATINA e sono trascrizionalmente attive
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Come si attiva il DNA?


GENOMA
DNA informazione informazione immagazzinata immagazzinata

cromatina

informazione organizzata

EPIGENOMI: gli interruttori dei geni


EUCROMATINA ETEROCROMATINA

cromatina aperta accessibile all apparato trascrizionale

Cromatina ristretta trascrizionalmente non attiva

La formazione degli epigenomi si basa sulla modificazione chimica di istoni e DNA


repressione genica

ETEROCROMATINA

modificazion i degli istoni

metilazione del DNA

EUCROMATINA attivazione genica

I nostri interruttori
Il gene PAX6
: codifica per la sintesi di una proteina o fattore di trascrizione che attiva lo sviluppo degli occhi e di altri organi sensoriali, cos come di alcuni tessuti nervosi ed epidermici

Il gene LFB3 : codifica per la sintesi di una proteina regolatrice coinvolta nella
espressione di diversi geni specifici del fegato .

Come abbiamo studiato il differenziamento


Riconoscimento e isolamento di embrioni di Zebrafish a 20 e 28 h dal concepimento. Estrazione della cromatina con metodo FAIRE seq per isolare le sequenze trascrizionalmente attive. Individuazione delle sequenze geniche PAX6 (responsabile dellattivazione dei geni dellocchio) e LFB3 (responsabile dellattivazione dei geni del fegato). Amplificazione dei campioni con PCR e successiva elettroforesi mirata a riconoscere la presenza delle zone attive e la loro intensit trascrizionale.

Come abbiamo studiato il differenziamento


Dissezione di Zebrafish adulto ed asportazione di fegato e cervello (gangli ottici) Estrazione della cromatina con metodo FAIRE seq per isolare le sequenze trascrizionalmente attive. Individuazione delle sequenze geniche PAX6 (responsabile dellattivazione dei geni dellocchio) e LFB3 (responsabile dellatttivazione dei geni del fegato).

Amplificazione dei campioni con PCR e elettroforesi mirata a riconoscere la presenza delle zone attive e la loro intensit trascrizionale.

Come abbiamo studiato il differenziamento


Confronto fra i risultati dellelettroforesi dei campioni dellembrione e delladulto. Riconoscimento dellattivit trascrizionale delle sequenze PAX6 e LFB3 sia nellembrione che nelladulto

Elaborazione grafica computerizzata dei dati ottenuti

Laboratorio 1
Dissezione di Zebrafish adulto ed estrazione di tessuto nervoso gonadi e tessuto epatico

Osservazione e riconoscimento degli organi al microscopio ottico

Trattamento dei tessuti prelevati con formaldeide per legare stabilmente i nucleosomi al DNA

Congelamento dei campioni

Laboratorio 1: metodo FAIRE - seq


Trattamento delle cellule con formaldeide.

La Metodica FAIRE-seq
Isolamento della cromatina

Si formano legami stabili tra i nucleosomi e il DNA (cross-link).

Sequenziamento High Throughput del DNA purificato dalla frazione acquosa (privo di nucleosomi) Rottura del DNA per sonicazione Estrazione con fenolo-cloroformio

Laboratorio 2
Omogeinizzazione dei tessuti, rottura delle cellule, e rilascio dei nuclei

Estrazione e frammentazione della cromatina

Estrazione del DNA trascrizionale con fenolo-cloroformio

Laboratorio 3

Osservazione al microcopio ottico degli embrioni di Zebrafish

Selezione degli embrioni allo stadio di 20 e 28 h dal concepimento

Trattamento dei tessuti embrionali con metodo FAIRE per lestrazione del DNA trascrizionalmente attivo

Laboratorio 4

Elettroforesi dei campioni amplificati mediante PCR contenenti le sequenze PAX6 e LFB3

Osservazione dei gel e riconoscimento dei risultati

Laboratorio 5

Quantizzazione delle bande del DNA Calcolo della media delle misurazioni Elaborazione grafica computerizzata dei risultati

Conclusioni

Nellembrione stata rilevata unattivit trascrizionale del DNA del fegato e del cervello pi blanda allo stadio di 20h e pi intensa a quello di 28h

Nelladulto stata osservata unattivit del DNA ancora maggiore, come prevedibile in uno stadio di sviluppo ormai completo