Un gene è una sequenza ordinata di nucleotidi che codifica per una molecola di

RNA. Le cellule di un organismo pluricellulare posseggono tutte lo stesso materiale

genetico, ma sono molto differenti tra loro per struttura e funzione.
La specializzazione dei diversi tipi cellulari è dovuta alla modulazione dell'espressione dei
geni contenuti nel DNA: la cellula spegne alcuni geni e ne attiva altri (solo le proteine
necessarie alla sua funzione).
Tutto ciò è possibile grazie alla regolazione genica (meccanismi che modulano
l'espressione dei geni).
Non tutti i geni sono regolati:
● i geni regolati sono attivati o disattivati a seconda della necessità;
● i geni costitutivi (o housekeeping) espressi costantemente, codificano per proteine
essenziali alla sopravvivenza.

La duplicazione del DNA

Poiché ogni cellula tramanda il proprio materiale genetico alle cellule figlie, prima della
divisione cellulare è necessario duplicare il DNA. La duplicazione del DNA è detta
semiconservativa e produce due molecole di DNA identiche, ciascuna formata da un
filamento della molecola originale (parentale) e da un filamento di nuova sintesi.
Nella prima fase della duplicazione interviene l'enzima elicasi, che apre la doppia elica del
DNA creando la forcella di duplicazione. L’enzima primasi sintetizza un breve frammento di
RNA, detto primer, indispensabile per permettere alla DNA polimerasi di iniziare la sintesi
delle nuove catene polinucleotidiche.
I due filamenti che costituiscono una molecola di DNA sono antiparalleli, quindi su un
filamento (filamento guida, o veloce) la sintesi procede senza interruzioni; sull'altro filamento
(filamento discontinuo, o lento), invece, sono sintetizzati brevi frammenti di DNA,chiamati
frammenti di Okazaki.
Il primer deve essere sostituito: l'enzima RNasi H lo degrada e il vuoto lasciato è colmato
dalla DNA polimerasi. A questo punto interviene la DNA ligasi la quale, tramite la formazione
di un legame fosfodiestereo, salda lo scheletro zucchero-fosfato per ottenere un filamento
continuo.
Si verifica un solo errore ogni miliardo di nucleotidi. Questo è possibile grazie ai meccanismi
di "correzione di bozze" (proofreading) messi in atto dalla DNA polimerasi essa individua ed
elimina i propri errori mentre si muove lungo la catena nucleotidica.

B. La trascrizione
La trascrizione è il primo passo nella decodifica del DNA, durante la trascrizione, un gene è
utilizzato come stampo dall'enzima RNA polimerasi per la sintesi di una molecola di RNA.
L'RNA polimerasi riconosce e lega una sequenza specifica di DNA detta promotore, quindi si
sposta lungo il filamento stampo di DNA sintetizzando I'RNA in direzione 5'-3'. Quando
l'enzima giunge alla sequenza terminatore, che indica la fine della trascrizione, esso si
separa dal filamento stampo e libera la molecola di RNA .
Esistono vari tipi di RNA polimerasi:
• RNA polimerasi 1: localizzata nel nucleolo, sintetizza gli RNA ribosomiali (rRNA) che,
insieme ad alcune proteine, formano i ribosomi, sede della sintesi proteica.

• RNA polimerasi II: sintetizza gli RNA messaggeri (mRNA), che contengono l'informazione
per sintetizzare una catena polipeptidica e la trasportano dal nucleo al citoplasma.
• RNA polimerasi III: sintetizza gli RNA transfer (tRNA), che trasporta gli aminoacidi al
ribosoma e li dispongono in una sequenza ordinata in base all'informazione contenuta
nell'mRNA.
Le RNA polimerasi II e III, inoltre, sintetizzano anche RNA non codificanti, piccoli RNA
nucleari (snRNA), microRNA (miRNA).

C. La traduzione
Durante la traduzione, il messaggio portato dall' mRNA è decodificato seguendo il codice
genetico ed è tradotto in una sequenza di amminoacidi. Come sappiamo, il codice genetico
è costituito da 64 codoni, dove ogni codone è costituito da una sequenza di tre basi azotate.
Il codice genetico è detto degenerato o ridondante (più codoni codificano per uno stesso
amminoacido) e non ambiguo (ogni codone codifica per un solo amminoacido). Inoltre,
esistono quattro codoni speciali: un codone di inizio AUG e tre codoni di stop UAA, UAG e
UGA.
3 fasi.
● Inizio: l'estremità 5' dell'mRNA forma un complesso di inizio con la subunità minore
del ribosoma e il tRNA iniziatore, che trasporta la metionina, quando quest'ultimo
riconosce, con il suo anticodone, il codone di inizio, la subunità maggiore del
ribosoma si lega al complesso. A questo punto, il tRNA iniziatore si trova nel sito P,
mentre il secondo codone dell'mRNA è posizionato nel sito A [7a].
● Allungamento: un tRNA si posiziona nel sito A; la subunità ribosomiale maggiore
catalizza la rottura del legame tra il tRNA iniziatore e la metionina e la formazione del
legame peptidico tra la metionina e il secondo amminoacido.
● Terminazione: l'allungamento si interrompe in corrispondenza di un codone di stop
nel sito A, la catena polipeptidica viene rilasciata e tutti gli attori si separano

OPERONE
L'operone
Il termine "operone" indica un gruppo di geni adiacenti e controllati in modo coordinato (cioè
attivati o inattivati), aventi in comune il promotore e le sequenze regolatrici.

Un operone comprende i seguenti elementi:

● il promotore (P), cioè il sito dove all'inizio si lega la RNA polimerasi;Il promotore
contiene le sequenze consenso -35 e -10, così chiamate perché sono situate a 35 e
10 nucleotidi a monte del punto di inizio della trascrizione.L'RNA polimerasi dei
procarioti è costituita da un core e da una subunità detta fattore sigma. Il fattore
sigma riconosce le sequenze consenso e lega con forza il core dell'RNA polimerasi
al promotore, permettendo all'enzima di aprire la doppia elica di DNA e di iniziare la
trascrizione.
● l'operatore (O), una sequenza di nucleotidi posta dopo il promotore, al quale si lega
un repressore o un attivatore;
● due o più geni strutturali per la sintesi degli enzimi, e si trovano dopo l'operatore;
● un gene regolatore (I), che può trovarsi in qualsiasi punto del cromosoma batterico, il
quale codifica per una proteina, il repressore, che si lega all'operatore (in realtà non
appartiene propriamente allaoperone).
Un'altra strategia di regolazione dell'espressione genica prevede l'intervento di alcune
proteine regolatrici, le quali possono accendere (attivatori) o spegnere (repressori) i geni. Gli
attivatori legano il promotore e migliorano la sua affinità per L'RNA polimerasi, arrivando ad
aumentare la frequenza di inizio della trascrizione fino a mille volte. Al contrario, i repressori
inibiscono la trascrizione perché ostacolano il legame dell'RNA polimerasi al DNA.

Gli operoni si possono classificare in inducibili, se la presenza di un determinato stimolo

attiva l'espressione genica, e reprimibili, se invece lo stimolo la inibisce.

A. L'operone lac

L'operone lac di E. coli codifica per tre enzimi coinvolti nella digestione del lattosio. In
condizioni normali, E. coli utilizza il glucosio come principale fonte di carbonio, quindi la
trascrizione dell'operone è bloccata. L'operone è espresso solo quando si verificano due
condizioni: il lattosio è presente e il glucosio è assente.
In assenza di lattosio, il repressore è legato all'operatore e impedisce il legame dell'RNA
polimerasi al promotore. Il lattosio, se presente in grande quantità, è trasformato in
allolattosio, il quale funziona da induttore: lega il repressore e questo, con un cambio
conformazionale, si stacca dall'operatore. In tal modo, I'RNA polimerasi ha accesso al
promotore. Perché inizi la trascrizione, tuttavia, è necessario anche il legame dell'attivatore
CAP. Grazie a questo meccanismo di regolazione, la cellula batterica ottimizza le risorse
energetiche esprimendo i geni dell'operone solo quando sono necessari, cioè se il lattosio è
l'unica fonte di carbonio disponibile. Quando la concentrazione di lattosio diminuisce, il
repressore torna a spegnere l'operone.

B. L'operone trp

Un tipico esempio di operone reprimibile è l'operone trp, che possiede cinque geni coinvolti
nella sintesi dell'amminoacido triptofano in E. coli. Quando il triptofano è assente, il
repressore è inattivo e l'RNA polimerasi trascrive l'operone. Se la concentrazione del
triptofano è invece elevata, e quindi la sua biosintesi non è necessaria, l'amminoacido funge
da co-repressore. In questo sistema è la disponibilità del prodotto degli enzimi espressi
dell'operone (il triptofano) ad accendere o spegnere i geni.

C. regolazione traduzionale
L'espressione genica nei procarioti può essere regolata anche a livello traduzionale. Gli
mRNA batterici presentano all'estremità 5', prima del codone di inizio della traduzione
(AUG), una sequenza di sei nucleotidi chiamata sequenza di Shine-Dalgarno. Questa
determina l'efficienza di traduzione. I batteri, infatti, possono controllare la sintesi proteica
nascondendo la sequenza di Shine-Dalgarno o aumentando l'esposizione.

ESPRESSIONE GENICA EUCARIOTI

Il corpo umano contiene circa 200 tipi di cellule che esprimono proteine diverse .
La cellula di un follicolo pilifero produce cheratina. Un globulo rosso, invece, produce molta
emoglobina. Inoltre, ogni cellula è in grado di modulare la propria espressione genica in
risposta a segnali extracellulari.
Anche la crescita e lo sviluppo degli organismi pluricellulari sono coordinati dall'espressione
genica differenziale.
Inoltre la regolazione dell'espressione genica consente alle cellule di controllare la spesa
energetica producendo solo le proteine necessarie.
Le cellule eucariotiche possono, potenzialmente, esercitare un controllo sull'espressione
genica in tutte le tappe del percorso che porta dal DNA alle proteine. Di conseguenza, il
controllo può essere:

• pre-trascrizionale, se regola l'accesso al DNA mediante modificazioni del DNA o delle

proteine istoniche;

• trascrizionale, se controlla quando e quanto un gene è trascritto

• post-trascrizionale, se regola la maturazione, lo splicing alternativo e la degradazione

dell'mRNA,

• traduzionale e post-traduzionale, se stabilisce quali mRNA debbano essere tradotti e quali

proteine attivate, disattivate o degradate.

I meccanismi di controllo dell'espressione genica consentono una regolazione fine per

determinare la quantità e il tipo di proteina prodotta in un dato momento.
A. La regolazione pre-trascrizionale

Se misurassimo il DNA contenuto in una singola cellula umana, una volta disteso questo
raggiungerebbe i 3 metri di lunghezza; tuttavia, all'interno del nucleo occupa solamente
pochi micrometri grazie a un complesso sistema di avvolgimento del filamento di DNA
attorno a proteine istoniche, con cui forma la cromatina. Il nucleosoma, che rappresenta
l'unità base della cromatina, è formato da un segmento di DNA avvolto intorno a otto
proteine istoniche. Inoltre, le proteine istoniche interagiscono tra loro per creare un
avvolgimento (chiamato solenoide) che subisce ulteriori livelli di spiralizzazione, fino a
compattarsi nei cromosomi .

Lo stato di condensazione della cromatina costituisce una prima forma di regolazione

dell'espressione genica. La forma più aperta di cromatina, detta eucromatina, si osserva
durante la trascrizione; la forma più.compatta, l'eterocromatina, visibile durante la divisione
cellulare, determina l'inattivazione della trascrizione. Inoltre, le cellule possono segnalare il
DNA non necessario con gruppi metilici, una modificazione chiamata metilazione. Queste
modificazioni, che possono anche essere ereditabili, sono dette epigenetiche (dal greco epi-,
"dopo", nel senso di "oltre la genetica") perché variano l'espressione genica senza alterare
la sequenza nucleotidica. L'epigenetica negli ultimi anni ha riscosso molto interesse in
quanto modificazioni epigenetiche sono state associate allo sviluppo di tumori e altre
malattie (come il diabete mellito di tipo 2).
La cellula può regolare l'accesso a determinate porzioni del proprio DNA andando ad agire
sul grado di compattazione della cromatina; tale compattazione dipende da modificazioni
reversibili della porzione N terminale delle proteine istoniche: acetilazione, metilazione e
fosforilazione. L'insieme di queste modificazioni ha un significato specifico per la cellula:
rappresenta un codice istonico che stabilisce se il DNA debba essere trascritto o meno.

Metilazione del DNA

Un'importante modificazione epigenetica è l'aggiunta di un gruppo metile su una percentuale
variabile di citosine adiacenti alle guanine. Regioni ricche in citosine e guanine, dette isole
CpG, sono abbondanti nei promotori. Le isole CpG metilate legano dei repressori che
inibiscono il legame dell'RNA polimerasi al promotore e quindi bloccano la trascrizione del
gene

B. La regolazione trascrizionale
Le RNA polimerasi eucariotiche, a differenza di quelle procariotiche, non legano
direttamente il promotore di un gene ma hanno bisogno di proteine dette fattori di
trascrizione.

I fattori trascrizionali possono essere ancorati al promotore oppure a una sequenza

regolatrice esterna al promotore chiamata enhancer (amplificatore). Le sequenze enhancer
possono trovarsi in prossimità del gene, o addirittura al suo interno, ma più spesso si
trovano a migliaia di paia di basi di distanza.
Il primo fattore di trascrizione, detto TFIID lega la TATA box. Il legame di TFILD provoca una
distorsione del DNA che attira altri fattori di trascri zione, comprese alcune proteine
associate a un enhancer. Al termine di questo processo, l'RNA polimerasi si unisce al
complesso posizionandosi in prossimità dell'inizio del gene insieme a un elevato numero di
fattori che aumentano l'efficienza di trascrizione. Quando l'RNA polimerasi ha preso il suo
posto, la trascrizione può avere inizio.
Esistono sequenze che hanno un effetto opposto a quello degli enhancer, chiamate
silencer (silenziatori): queste arrestano la trascrizione in seguito al legame con particolari
repressori proteici.
Per capire l'importanza dei fattori di trascrizione e delle sequenze enhancer nel la
regolazione genica, prendiamo come esempio la capacità di digerire il lattosio da parte
dell'essere umano. I lattanti producono l'enzima lattasi, che permette di scindere il lattosio in
glucosio e galattosio, i due monosaccaridi che lo compongono. Durante la crescita, il gene
per la lattasi si inattiva; senza l'enzima, il lattosio non può essere digerito e si manifestano
quindi i sintomi dell'intolleranza a questo zucchero. Alcuni individui, tuttavia, riescono a
digerire il lattosio anche da adulti, perché una mutazione nella sequenza enhancer
promuove la trascrizione del gene che codifica per la lattasi.

Alcuni fattori trascrizionali, come Myc, regolano la crescita e il ciclo cellulare perché
controllano l'espressione di geni coinvolti in questi processi. Un'alterazione dell'espressione
di Myc è spesso associata allo sviluppo di tumori umani.

C. La regolazione post-trascrizionale

Negli eucarioti, I'RNA messaggero è prodotto sotto forma di una molecola precursore (pre
mRNA), la quale deve essere sottoposta a diverse modificazioni prima di poter essere
esportata dal nucleo e tradotta a livello dei ribosomi. La maturazione del messaggero
prevede l'aggiunta di un cappuccio, di una coda di poli(A) e lo splicing.

La prima modificazione a cui va incontro il pre-mRNA avviene già durante la trascrizione: è

l'aggiunta di una guanosina metilata all'estremità 5'. Questo nucleotide prende il nome di
cappuccio ed è indispensabile per l'esportazione dell'mRNA dal nucleo e per il suo legame
con il ribosoma. Quando l'RNA polimerasi termina la trascrizione, l'enzima poli(A) polimerasi
aggiunge una alla volta circa duecento adenine all'estremità 3' del trascritto, formando la
coda di poli(A). La lunghezza della coda determina l'emivita dell'mRNA, cioè il tempo
necessario affinché il 50% del trascritto sia degradato, Il pre-mRNA è costituito da sequenze
alternate di introni ed esoni, ma l'informazione genetica codificante è contenuta solo negli
esoni. Prima di lasciare il nucleo, gli introni devono essere rimossi mentre gli esoni devono
essere uniti in sequenza per formare il trascritto maturo. Questo processo di taglia e cuci è
chiamato splicing ed è catalizzato dalle snRNPS ("snurps"), complessi di RNA e proteine
con funzione catalitica. Esistono diversi tipi di snRNP, ma tutti legano il pre mRNA in
allungamento in zone specifiche, chiamate giunzioni di splicing, poste al confine tra introni
ed esoni. Queste sequenze sono altamente conservate nei diversi geni eucariotici e si
legano all'RNA delle snRNP grazie alla complementarietà di sequenza. Due snRNP a
monte e a valle di un introne formano lo spliceosoma, un grande complesso ribonucleico
ATP-dipendente che

Gli mRNA non opportunamente modificati sono trattenuti nel nucleo e degradati.

Splicing alternativo

Modificando la combinazione degli esoni che compongono I'mRNA maturo, da uno stesso
gene si possono ottenere proteine diverse. Lo splicing alternativo è il principale responsabile
della discrepanza osservata, all'indomani del sequenziamento del genoma umano, tra il
numero di geni (circa 23 000) e il numero di proteine (tra 100 000 e 150 000).
Lo splicing alternativo è possibile grazie ad alcune proteine che possono coprire delle
giunzioni di splicing e dirigere lo spliceosoma verso un'altra giunzione.

RNA interference
La RNA interference è un meccanismo mediante il quale alcuni frammenti di RNA sono in
grado di interferire (e spegnere) l'espressione genica.
L'RNAi è anche un meccanismo di difesa cellulare da materiale genetico esogeno. Infatti,
molti elementi trasponibili e virus, che tratteremo successivamente, producono RNA a
doppio filamento che sono riconosciuti da RISC e innescano i meccanismi di RNAi.
Il silenziamento genico mediato da RNA è oggi ampiamente usato nel campo delle
biotecnologie mediche per lo studio e la cura di numerose patologie.

Sebbene non tutti i dettagli del processo stesso siano ancora chiari, sembra che il cosiddetto
macchinario dell'RNAi, una volta individuata una molecola di RNA a doppio filamento
(dsRNA), sia in grado di avviare il meccanismo della RNAi.
-Attraverso un enzima (chiamato Dicer), la sequenza di dsRNA è tagliata in frammenti di
lunghezza minore (19-21 paia di basi).
-Il breve frammento di dsRNA si associa ad un complesso enzimatico denominato RISC.
-L'RNA a doppio filamento viene aperto, probabilmente da una elicasi: solo il filamento di
RNA antisenso rimane associato a RISC, mentre il filamento senso viene degradato.
-La RISC è ora attiva: è in grado di scansionare molti mRNA presenti nel citosol fino a
trovarne uno complementare al frammento di RNA antisenso associato al complesso stesso.
Se l'appaiamento tra siRNA e mRNA è perfetto (o quasi perfetto), una componente della
RISC (detta argonaute protein o Argo) è in grado di operare un taglio sull'mRNA. I due f
rammenti di mRNA risultanti vengono così rapidamente degradati dalle RNAsi della cellula
stessa. Se l'appaiamento, invece, non è perfetto, si pensa che la RISC sia comunque in
grado di inibire la traduzione del gene.

La regolazione traduzionale e post-traduzionale

Gli mRNA maturi sono tradotti nel citoplasma a livello dei ribosomi. La traduzione inizia
generalmente dal primo codone AUG a valle del cappuccio.
La traduzione ha inizio solo se entrambe le estremità sono intatte.

Un ulteriore meccanismo di regolazione traduzionale riguarda la coda di poli(A), alla

lunghezza della quale, come sappiamo, è legata la stabilità del trascritto. Nel citoplasma, la
coda dell'mRNA maturo è progressivamente accorciata, fino a determinare la degradazione
del messaggero. In alcuni casi, però, la coda di specifici messaggeri é allungata per
stimolare la traduzione e garantire una maggiore produzione di determinate proteine. Infine,
la cellula può agire direttamente sulla proteina mediante modificazioni covalenti che portano
alla conformazione biologicamente attiva della proteina. Le modificazioni post-traduzionali
sono le seguenti.
● Modificazioni dell'estremità N-terminale o C-terminale: per esempio è eliminata la
metionina iniziale.
● Modificazione di singoli amminoacidi: fosforilazione o metilazione.
● Aggiunta di catene laterali glucidiche o lipidiche.
● Taglio proteolitico di precursori inattivi: per essere attivata, la proteina deve
essere tagliata in uno o più punti; alcuni esempi sono l'insulina, ottenuta dal taglio
della proinsulina, e la fibrina, prodotta a partire dal fibrinogeno durante la
coagulazione del sangue.
● Ubiquitinazione: più monomeri di ubiquitina (una piccola proteina composta da soli
76 amminoacidi) sono aggiunti alla proteina da degradare. L'ubiquItina si comporta
come una "etichetta" che permette il riconoscimento della proteina da parte di un
grande complesso proteico che si trova nel citoplasma delle cellule eucariotiche: il
proteasoma

VIRUS
I virus sono entità biologiche non viventi che si comportano come endoparassiti obbligati.
Non si nutrono, non sono attivi sotto il profilo metabolico e non sono in grado di riprodursi
autonomamente.

Trasportano informazioni sotto forma di acidi nucleici: DNA o RNA, a singolo o a doppio
filamento. Poiché non sono in grado di riprodursi in maniera indipendente, per replicarsi
sfruttano la macchina di duplicazione della cellula ospite, che si trasforma in una vera e
propria "fabbrica di virus". I virus hanno piccole dimensioni (circa 80 nm di diametro) e una
struttura semplice, che consta di materiale genetico circondato da un rivestimento proteico,
detto capside [24]; in alcuni casi, è presente anche un involucro di natura lipidica che ha
origine dalla membrana della cellula ospite. La singola particella virale matura, costituita da
acido nucleico e rivestimento proteico, è chiamata virione.
Tutti i virus presentano un processo di infezione articolato in cinque fasi .
● Il virus si ancora alla superficie della cellula ospite grazie alle proteine del capside
che riconoscono dei recettori di membrana.
● Il materiale genetico del virus penetra all'interno dell'ospite.
 ● Il virus sfrutta l'apparato metabolico della cellula ospite per sintetizzare le
componenti virali.
● Le nuove particelle virali sono assemblate all'interno della cellula ospite.
● I virioni abbandonano l'ospite: sono pronti a infettare nuove cellule.

Come vedremo più avanti, una volta infettata la cellula ospite un virus può presentare due
diversi cicli vitali: può provocare la lisi della cellula nell'immediato e liberare molti virioni (ciclo
litico) oppure può mantenere il proprio genoma latente all'interno del genoma dell'ospite
(ciclo lisogeno).

Invece, in base al tipo di ospite possiamo distinguere i virus capaci di infettare i batteri, detti
batteriofagi o semplicemente fagi, dai virus eucariotici.
A. I batteriofagi

Alcuni batteriofagi, detti virulenti, possono riprodursi esclusivamente tramite il ciclo litico.
Il ciclo litico consta di due fasi: precoce e tardiva. Nella fase precoce, il genoma fagico è
riconosciuto dall'RNA polimerasi procariotica; l'espressione dei geni virali porta alla sintesi di
proteine che bloccano la trascrizione dei geni della cellula ospite, stimolano la duplicazione
del genoma virale e degradano il genoma procariotico.
Nella fase tardiva sono trascritti i geni che codificano per le proteine del capside e per gli
enzimi che lisano la cellula ospite, portando alla liberazione dei virioni. I virus che alternano
il ciclo litico al ciclo lisogeno sono invece detti temperati. Nel ciclo lisogeno il materiale
genetico virale è integrato nel cromosoma batterico e si duplica insieme a esso. In questa
forma il fago prende il nome di profago, mentre il batterio che lo ospita è detto lisogeno. Le
proteine virali prodotte sono poche e servono per lo più a innescare un eventuale passaggio
al ciclo litico

B. I virus eucariotici

In base al tipo di materiale genetico presente, distinguiamo i virus eucariotici in virus

a DNA e virus a RNA. Possono essere provvisti di involucro lipidico oppure "nudi", cioè privi
di involucro; entrambe queste tipologie possono penetrare nella cellula per endocitosi.
L'involucro lipídico, inoltre, aiuta il virus a entrare nella cellula anche per fusione con la
membrana cellulare.

A causa della semplicità della loro struttura, i virus mutano continuamente: accumulano
mutazioni che consentono loro di produrre nuove proteine del capside, così che sfuggono al
sistema immunitario degli ospiti. Questo è vero soprattutto per i virus a RNA.

Virus a DNA
I virus a DNA hanno un comportamento simile ai batteriofagi: possono compiere un ciclo
litico, come il virus dell'epatite, o un ciclo lisogeno, come gli herpesvirus. Questi ultimi
causano malattie come il fuoco di Sant'Antonio, la mononucleosi e Herpes labiale e genitale.
Fattori di stress fisico o emotivo sono il segnale che consente il passaggio al ciclo litico e la
manifestazione della malattia. Questo tipo di virus non viene debellato completamente e
l'organismo, una volta infettato, può presentare la sintomatologia più volte nel corso della
vita.
Virus A RNA
Esaminiamo di seguito il ciclo riproduttivo di un virus a RNA a singolo filamento prendendo
come esempio il virus dell'influenza. Il virus dell'influenza entra nella cellula ospite per
endocitosi; in seguito, il suo involucro si fonde con la membrana della vescicola endocitica e
così il virione è liberato all'interno della cellula. L'RNA virale funziona da stampo per la
sintesi di filamenti complementari grazie a una RNA polimerasi RNA-dipendente contenuta
all'interno del virione. I filamenti neosintetizzati si comportano come mRNA per la produzione
di proteine virali e fungono da stampo per la sintesi di nuovo genoma virale. Altri virus a
RNA hanno un ciclo riproduttivo più complesso, è questo il caso del virus
dell'immunodeficienza umana (human immunodeficiency virus, HIV), che appartiene alla
classe dei retrovirus, virus a RNA che si riproducono mediante una molecola di DNA (29).
L'HIV entra nella cellula ospite per fusione e, insieme al proprio genoma, rilascia anche
l'enzima trascrittasi inversa. Questo enzima è una DNA polimerasi RNA-dipendente che usa
I'RNA a singolo filamento come stampo per produrre un filamento di DNA; in seguito,
aggiunge il secondo filamento di DNA complementare. Il DNA a doppio filamento così
prodotto si integra nel genoma della cellula ospite, diventando un provirus che può restare
latente per anni.

Epidemiologia
branca della scienza che studia la diffusione delle malattie. Un virus può essere descritto in
base a:
● La patogenicità rappresenta la capacità di un virus di creare danni all'organismo; nei
casi più estremi causa la morte.
● La letalità di un virus si ottiene contando il numero di morti sul totale degli infetti, in
un dato intervallo di tempo.
● La mortalità consiste nel numero di morti sul totale della popolazione espo sta
all'infezione.
● L'infettività è la capacità del virus di diffondersi da un soggetto a un altro; può essere
espressa per mezzo dell'indice Ro, che indica il numero di persone contagiate da
ciascuna persona infetta. Questo dipende anche dalle caratteristiche della
popolazione e dalle condizioni igieniche e climatiche.

ELEMENTI GENETICI MOBILI

sono in grado di spostarsi all’interno del genoma di una cellula o tra cellule diverse:

Plasmidi (procarioti):
sono piccoli anelli di DNA presenti in una o più copie nel citoplasma della cellula
procariotica, caratterizzati da un'origine di duplicazione indipendente e da poche dozzine di
geni. Possono essere trasferiti con facilità da una cellula all'altra attraverso la coniugazione.
Si distinguono in:
● plasmidi metabolici, che conferiscono particolari caratteristiche metaboliche alla
cellula ospite;
● plasmidi R (di resistenza), che conferiscono resistenza agli antibiotici attraverso la
sintesi di proteine in grado di metabolizzarli e inattivarli;
● plasmidi F (di fertilità), che rendono possibile la coniugazione.

Trasposoni (procarioti e eucarioti):

frammento di Dna mobile in grado di spostarsi lungo il genoma. Possiedono geni che
codificano proteine per la trasposizione. Sono presenti in diverse copie all’interno dello
stesso genoma e questo permette processi di ricombinazione omologa tra regioni lontane tra
loro. Esistono:
trasposoni a Dna: presenti nelle cellule eucariotiche e procariotiche. contengono un gene
che codifica per l'enzima trasposasi, il quale agisce sulle estremità del trasposone e
consente la trasposizione. Questa può avvenire in due modi:
● nella trasposizione conservativa il trasposone è scisso dalla sua posizione originale
ed è inserito in un nuovo sito del genoma
● nella trasposizione replicativa il trasposone si duplica e la copia è inserita in un
nuovo punto del genoma

retrotrasposoni: presenti solo negli eucarioti sono dei frammenti di DNA capaci di
trascriversi autonomamente in un intermedio ad RNA e replicarsi in diverse posizioni
all’interno del genoma

TRASFERIMENTO GENICO VERTICALE E ORIZZONTALE

Verticale: processo per il quale tutti gli organismi trasmettono il loro DNA da una
generazione all'altra attraverso la riproduzione

Orizzontale: avviene nei batteri e archei che possono velocizzare il processo evolutivo
permettendo di ricevere DNA da una cellula non progenitore. Può avvenire secondo 3
modalità:
trasformazione: consiste nella ricombinazione tra il genoma di un batterio e un frammento
di DNA libero assorbito dall'ambiente esterno. Quando il DNA esogeno, detto DNA
trasformante, penetra all'interno di un nuovo batterio, definito competente, esso scambia
materiale genetico con il cromosoma batterico in un processo simile alla ricombinazione
eucariotica. I biologi sfruttano la trasformazione per creare nuovi tipi di batteri geneticamente
modificati.

trasduzione:un virus trasferisce il DNA della cellula ospitante a un nuovo batterio. Può
accadere che durante la fase di assemblaggio alcune particelle virali inseriscano all'interno
del capside un frammento del DNA della cellula ospite che è stato degradato. Il virus
risultante inietta in un batterio questo DNA, che si può integrare nel genoma dell'ospite per
ricombinazione. Questo tipo di processo è casuale ed è chiamato trasduzione generalizzata,
per distinguerlo dalla trasduzione specializzata che coinvolge invece i profagi. Quando un
profago si stacca dal cromosoma della cellula ospite per completare il ciclo litico, può portare
con sé un pezzo di DNA batterico contiguo al proprio genoma. In questo caso, sequenza del
frammento dipende dal punto specifico (locus) in cui il profago si inserisce a livello del
cromosoma ospite.

coniugazione:processo mediante il quale un batterio può trasferire direttamente del

materiale genetico a un altro batterio. Un singolo filamento di DNA passa tra i due batteri
attraverso un'appendice chiamata pilo sessuale, che permette la formazione di un ponte
citoplasmatico tra le due cellule. L'altro filamento rimane nella cellula donatrice e serve da
stampo per la ricostituzione dell'intera molecola di acido nucleico. A coniugazione avvenuta,
il pilo si stacca e le due cellule si separano. In alcuni casi, il filamento di DNA proveniente
dalla cellula donatrice si appaia con sequenze simili sul genoma ricevente; in questo modo
può avvenire una ricombinazione fra tratti omologhi di DNA. In altri casi, il DNA trasmesso
per coniugazione rimane sotto forma di plasmide indipendente all'interno del citoplasma. La
coniugazione è un processo che caratterizza solo i batteri in cui si trova il plasmide F, che
contiene i geni coinvolti nella costruzione del pilo sessuale e del ponte citoplasmatico al suo
interno.

DNA RICOMBINANTE
molecola di DNA ottenuta dall’unione di materiale genetico proveniente da due o più
organismi.
Per ottenerne una molecola la prima cosa è sintetizzare o isolare la sequenza di DNA
contenente il gene di interesse, bisogna tagliare il DNA genomico scindendo il legame
fosfodiestereo che unisce due nucleotidi adiacenti.Gli enzimi di restrizione catalizzano
questa reazione, e sono capaci di tagliare il DNA a livello di sequenze specifiche note come
siti di restrizione (sequenze palindromiche di lunghezza variabile): ciò significa che le
sequenze su ciascun filamento di DNA sono identiche se lette nella stessa direzione
Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi (ossia enzimi idrolitici in grado di scindere un
legame interno a un filamento di acido nucleico) utilizzate dai batteri per difendersi dalle
infezioni virali, perché degradano il genoma fagico al suo ingresso nella cellula. Il taglio
sfalsato genera due estremità a singolo filamento complementari tra loro dette estremità
coesive più utilizzare per ottenere il DNA ricombinante. Gli enzimi di restrizione che tagliano
al centro della sequenza palindromica con un taglio netto producono estremità piatte, poco
usate per creare DNA ricombinante.

I vettori di clonaggio
molecola di Dna autoreplicante che trasporta il gene nella cellula da modificare. Esistono
diversi tipi di vettori: vettori plasmidici e quelli virali derivano da plasmidi e virus presenti
in natura, i cosmidi, sono vettori ibridi ottenuti fondendo parti di plasmidi e di genoma
fagico, cromosomi artificiali di lievito, batterio e mammifero (per inserti di grandi dimensioni).
Caratteristiche comuni:
● un'origine di duplicazione indipendente, in modo tale che la duplicazione del
vettore nella cellula proceda in autonomia rispetto al cromosoma dell'ospite;
● uno o più geni per la resistenza ad antibiotici
● un sito di clonaggio multiplo (noto come polylinker), cioè una sequenza
nucleotidica contenente siti di restrizione unici per molti enzimi di restrizione, in modo
che ciascun enzima tagli il plasmide in un solo punto;
● un gene reporter codificante per una proteina che consente di selezionare le cellule
che contengono il vettore ricombinante o di monitorare l'espressione di una
particolare proteina.
inattivazione inserzionale: il gene reporter codifica per un enzima che scinde un substrato
cromogeno (ossia una molecola che, una volta tagliata dall'enzima, genera una sostanza
colorata). All'interno della sequenza del gene c'è il polylinker: se il DNA esogeno si inserisce
nel plasmide, interrompe la sequenza del gene e l'enzima non è prodotto; di conseguenza, il
substrato cromogeno non è scisso. Questa tecnica consente di selezionare facilmente le
cellule ricombinanti

Il vettore di espressione consente anche la trascrizione dell'inserto permettendo di studiare

l’attività di un gene. Sono dotati di alcune particolari strutture (per esempio, un promotore e
una sequenza enhancer) che rendono possibile l'espressione genica dell'inserto. In questo
caso, il gene reporter codifica per una proteina facilmente identificabile come la luciferasi,
enzima che catalizza una reazione di bioluminescenza.

Dna ligasi
è un enzima in grado di unire le estremità coesive complementari attraverso un legame
covalente. Catalizza la formazione di un legame fosfodiestereo tra due nucleotidi adiacenti in
presenza di ATP come cofattore.Non è selettivo nella scelta dell’estremità da unire perciò
dopo la reazione alcuni vettori avranno inserito il frammento (vettori ricombinanti) mentre
altri si richiudono senza inserto (vettori vuoti)

Clonaggio molecolare
tecnica che attraverso l’inserimento del DNA ricombinante in una cellula ospite consente di
ottenere tante copie di una regione di DNA o di un gene all’interno dell’organismo ospite. è
composto da 4 passaggi:
1 Selezionare e isolare il DNA di interesse contenente un gene o una porzione di genoma
(l'inserto).
2 Scegliere un vettore di clonaggio in base alle esigenze sperimentali.
3 Digerire sia l'inserto sia il vettore con lo stesso enzima di restrizione e ligare con la DNA
ligasi per ottenere una molecola di DNA ricombinante.
4 Trasferire il vettore ricombinante all'interno di una cellula ospite. Se la cellula ospite è un
batterio si dice trasformazione, se è una cellula eucariotica trasfezione (si realizza tramite
elettroporazione, lipofezione e nelle cellule vegetali con il metodo biobalistico)

Per rendere il processo di trasferimento più efficace bisogna sfruttare il gene reporter e la
resistenza all’antibiotico per selezionare le cellule con i vettori ricombinanti. Le cellule con il
dna di interesse poi si dividono generando cloni, cellule geneticamente identiche che
contengono il vettore ricombinante.

Librerie di DNA o GENOTECHE

dove vengono conservate le informazioni del dna e sono costituite da colonie di cellule
batteriche. Possono essere:
genomiche: collezione di cloni rappresentativa dell'intero genoma di un organismo. Per
costruirla, il genoma viene estratto dalle cellule e è tagliato con enzimi di restrizione; in
questo modo si ottiene una miscela di frammenti di DNA che sono poi inseriti in opportuni
vettori di clonaggio. L'intera raccolta di cloni ricombinanti rappresenta la libreria, impiegata
principalmente per individuare un gene di un genoma non sequenziato o per amplificare un
gene per studiarne la sequenza e la regolazione dell'espressione genica.

di cDNA: Una collezione di cloni che rappresenta l'insieme degli mRNA di una cellula o di
un tessuto. Per ottenere il cDNA sono necessari i seguenti passaggi:
1. I'RNA è estratto dal campione di interesse;
2. si aggiunge un primer di poli(T), cioè una sequenza di timidine che si appaia alla
coda di poli(A) degli mRNA;
3. l'enzima trascrittasi inversa produce una copia di DNA per ciascuna molecola di
mRNA;
4. l'enzima RNasi H degrada I'mRNA, lasciando solo alcuni frammenti;
5. la DNA polimerasi sintetizza l'altro filamento di DNA, utilizzando i frammenti di RNA
come primer.
Le librerie genomiche contengono tutte le sequenze di DNA del genoma di un organismo,
mentre la libreria di cDNA contiene soltanto quelle regioni di genoma trascritte in mRNA, che
in un organismo pluricellulare sono specifiche per tipo di tessuto.

L’identificazione di un gene
Per identificare il clone con la sequenza di interesse bisogna effettuare lo screening della
genoteca, che può avvenire per:
ibridazione con una sonda di acidi nucleici: si basa sulla capacità del Dna a singolo
filamento di legare una sequenza complementare e richiede la preparazione di una sonda,
molecola di acido nucleico a singolo filamento complementare alla sequenza di interesse
che si può ottenere conoscendo parte della sequenza di interesse o partendo dalla proteina
e risalendo alla sequenza nucleotidica. Questo processo avviene in 5 fasi:
1. Le cellule trasformate che costituiscono la genoteca prima sono diluite e poi sono
fatte crescere in piastre Petri su un terreno solido, in modo che le colonie siano ben
separate tra loro. Dal momento che ogni colonia origina dalla divisione di una singola
cellula, ciascuna rappresenta un solo clone della genoteca.
2. Sulla piastra Petri è premuta delicatamente una membrana di nitrocellulosa; alcune
cellule di ogni colonia vi rimangono appiccicate e la loro disposizione rispecchia
quella delle colonie sulla piastra.
3. La membrana di nitrocellulosa è trattata in modo da rompere le cellule batteriche ed
esporre il DNA.
4. A questo punto, è aggiunta la sonda che ibrida, cioè lega, le sequenze
complementari. La sonda è marcata con l'isotopo radioattivo del fosforo, il quale
emette particelle beta che impressionano una lastra autoradiografica.
5. Il confronto tra il segnale della lastra e la piastra Petri di origine consentirà di risalire
al clone positivo, che contiene cioè il frammento di DNA di interesse.

PCR (reazione a catena della polimerasi): consente di ottenere milioni di copie di una
sequenza specifica di DNA. Bisogna inserire in una provetta: lo stampo di Dna che si vuole
analizzare, una coppia di primer di DNA con una sequenza complementare alle estremità
della regione di DNA, desossiribonucleotidi trifosfato, una Dna polimerasi termostabile e il
suo buffer. La reazione avviene in un termociclatore che consente di ripetere ciclicamente le
tre fasi:
1. denaturazione della doppia elica del Dna (separazione in filamenti singoli)
2. appaiamento dei primer alle sequenze del dna
3. allungamento, reazione catalizzata dalla Dna polimerasi che inserisce i
desossiribonucleotidi creando una copia della porzione di Dna compresa tra i due
primer. Avviene a 72° perchè a questa temperatura rimangono legati solo i primer
che hanno una perfetta complementarietà tra le basi.

è stata sviluppata la Real Time PCR che permette di quantificare il Dna amplificato, avviene
come la Pcr tradizionale ma nella miscela di reazione va aggiunta una molecola che emette
fluorescenza se eccitata da un raggio luminoso e la cui lettura avviene durante la fase di
allungamento grazie a un sistema ottico.
La PCR ha diversi utilizzi: la diagnostica la utilizza per l’identificazione di patogeni o
mutazioni genetiche che causano patologie,la medicina forense per creare l’impronta genica
di un soggetto e identificarlo, può essere anche utilizzata come metodo di screening di una
libreria di DNA=> I cloni della genoteca diluita sono trasferiti in una piastra multipozzetto, in
modo che ogni pozzetto contenga un solo clone; poi le cellule sono lisate per liberare il
vettore ricombinante che rappresenta lo stampo per la reazione di amplificazione. Essendo i
primer complementari a parte della sequenza che si sta cercando, l'amplificazione avverrà
solamente nel pozzetto contenente il DNA di interesse. I prodotti della reazione sono poi
caricati su un gel di agarosio per la corsa elettroforetica. La visualizzazione dei frammenti
amplificati permette di individuare il clone positivo, cioè quello che contiene la sequenza di
interesse compresa tra i due primer utilizzati.

ELETTROFORESI SU GEL
L'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle
elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato
mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Le particelle si spostano verso il catodo se
hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa.
L'elettroforesi su gel di agarosio è utilizzata per analizzare e separare acidi nucleici.
Sfrutta le cariche presenti nelle molecole di DNA o RNA (caricate negativamente) per farle
migrare, in un campo elettrico, attraverso un gel di agarosio. Il gel funge da setaccio,
essendo costituito da una rete di pori, i quali consentono di separare le molecole in base alla
loro grandezza: quelle più piccole attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più
grandi quindi si avrà una separazione in funzione della velocità. Fattori che fanno variare la
velocità di migrazione sono:

-Peso molecolare
-Concentrazione di agarosio
-Conformazione DNA
-Voltaggio applicato
-Intercalanti
-Tampone di elettroforesi

L'agarosio è un polisaccaride lineare e neutro.

Per consentire la visualizzazione degli acidi nucleici migrati si possono utilizzare diversi tipi
di coloranti; quello più usato in assoluto è l’etidio bromuro che si inserisce (intercala) tra le
basi dell'acido nucleico a doppio filamento, ed emette luce fluorescente quando irradiata con
luce ultravioletta (300 nm).
Con il termine elettroforesi proteica si indica una tecnica di laboratorio che utilizza la
carica elettrica e la massa molecolare delle proteine per misurarne la qualità e la quantità e
consente di separare le proteine in: albumina, alfa 1 globuline, alfa 2 globuline, beta
globuline e gamma globuline (utile a diagnosticare il mieloma multiplo e la sclerosi multipla).
Il fingerprinting del DNA (o impronta digitale del DNA) è una tecnica che
permette l’identificazione individuale a livello molecolare, analizzando le caratteristiche
uniche del DNA di un individuo.
L’applicazione del fingerprinting del DNA sta rivoluzionando la medicina forense, i
test di paternità, l’identificazione di vittime di disastri
La tecnica del DNA fingerprinting si basa sull’analisi di due tipi di sequenze altamente
variabili presenti nel genoma umano, le VNTR e le STR.
Combinando le informazioni che derivano dall’analisi di più loci VNTR o STR si ottiene un
profilo distintivo di una persona, cioè il suo DNA fingerprint
SEQUENZIAMENTO DI SANGER
è una tecnica di sequenziamento enzimatica che permette di stabilire la sequenza di
nucleotidi di un frammento di DNA. Per effettuarlo servono 4 reazioni con 4 terminatori
(deossiribonucleotide trifosfato) diversi. Quando la reazione di amplificazione ha inizio, la
DNA polimerasi comincia ad aggiungere ai primer i nucleotidi complementari a quelli dello
stampo; quando la polimerasi inserisce un terminatore al posto di un dNTP, l'allungamento
del filamento si interrompe, l'enzima si distacca e può iniziare nuovamente la reazione.
Quindi all'interno di ogni provetta si viene a formare una miscela di copie dello stesso
frammento di DNA, tutte di lunghezza differente. Le miscele sono separate con
un'elettroforesi su gel di poliacrilammide e i frammenti sono visualizzati mediante rilevazione
del segnale radioattivo. La sequenza di DNA sintetizzato si legge seguendo l'ordine dei
terminatori dal frammento più piccolo a quello più grande

SEQUENZIATORI MODERNI
Seguono il funzionamento di Sanger ma con l’aiuto della Pcr e altre tecniche:
● l'accoppiamento con fluorofori: Il DNA estratto da un campione biologico è
tagliato con enzimi di restrizione e alle estremità dei frammenti così generati sono
legate delle "etichette", cioè delle sequenze complementari ai primer utilizzati nella
successiva reazione di PCR. Grazie all'utilizzo di quattro terminatori, ciascuno
associato a un fluoroforo (ossia una molecola che, se stimolata, emette luce
fluorescente) di colore diverso, non è necessario allestire quattro reazioni differenti.
● elettroforesi capillare: I prodotti sono separati grazie a elettroforesi capillare,
tecnica in cui i frammenti marcati con un fluoroforo emettono un segnale di
fluorescenza che è letto dallo strumento. Poiché ogni nucleotide terminatore è
associato a un colore, il risultato è una sequenza di picchi di quattro colori per
ciascun frammento di DNA detta cromatogramma
● shotgun sequencing: Il cromatogramma è analizzato e allineato mediante analisi
computerizzata per ottenere la sequenza del DNA di partenza. I frammenti originati
dalla digestione iniziale sono infatti parzialmente sovrapposti e specifici software
sono in grado di unirli nella giusta sequenza sfruttando le estremità sovrapposte

SCIENZE OMICHE
Le scienze omiche rappresentano una neonascente classe di Discipline legate alla biologia
molecolare e alla genetica.
La ragione della nascita delle scienze omiche è di opportunità, con più rami è possibile
suddividere il vasto mondo della genetica e della biologia molecolare in più moduli.

Scienze omiche
Le scienze omiche non sono ambiti e discipline statiche, ma si evolvono parallelamente
all'evoluzione della ricerca. Alcuni "pilastri" delle scienze omiche, tuttavia, servono da
riferimento per gli altri insiemi. Questi pilastri rappresentano l'evoluzione dello studio dal
DNA verso la proteina.

Genomica
La genomica è la scienza omica che studia il genoma, il codice genetico che racchiude, in
modo ordinato e lineare, tutte le informazioni necessarie per la sintesi delle proteine e, in
maniera più semplice, per lo sviluppo dell'individuo.
Trascrittomica
La trascrittomica è la scienza omica che studia il trascrittoma, che è il trascritto che deriva
dal genoma.

Proteomica
La proteomica è la scienza omica che studia il proteoma, in altre parole la funzione e il
metabolismo delle proteine. La proteomica, per questa ragione, fa largo uso delle nozioni di
biochimica.

Lipidomica
La LIPIDOMICA è uno strumento della medicina molecolare che studia la condizione clinica
di un individuo sulla base della composizione a livello molecolare di alcuni suoi importanti
distretti. La lipidomica ha una interessante applicazione per il monitoraggio dello stato
metabolico nutrizionale. Le informazioni ottenibili dall’esame lipidomico dipendono dal
compartimento di osservazione.

ANTIBIOTICI
sono molecole complesse prodotte da batteri o funghi che eliminano batteri patogeni per
l’essere umano. Sono detti metaboliti secondari perché non sono essenziali alla
sopravvivenza della cellula che li sintetizza. Il primo antibiotico scoperto è la penicillina.
Antibiotico resistenza: è un problema di sanità pubblica e consiste nella capacità di un
batterio di resistere all'azione di uno o più farmaci antibiotici e quindi di sopravvivere e
moltiplicarsi anche in loro presenza. i batteri diventano resistenti per effetto di un processo
evolutivo dovuto a mutamenti casuali.

BIOFARMACI
molecole biologicamente attive con proprietà terapeutiche prodotte da organismi transgenici.

Alcuni biofarmaci sono detti endofarmaci, perché mimano la funzione di molecole

endogene come gli ormoni. Il primo biofarmaco prodotto fu l’insulina, ormone che regola i
livelli di glucosio ed utilizzato per la cura del diabete. Inizialmente veniva estratto dal
pancreas dei suoni e bovini ma adesso viene codificata dal gene umano. I biofarmaci
possono essere prodotti anche da animali transgenici come l’antitrombina-alfa, un agente
anticoagulante che viene prodotto da capre transgeniche (inserito sotto il controllo di un
promotore attivo nelle ghiandole mammarie, così che la proteina sia secreta nel latte e sia
facilmente purificabile).

Vaccini ricombinanti
si utilizza un microrganismo innocuo per produrre l'antigene che caratterizza un determinato
patogeno e che è in grado di attivare la risposta immunitaria. Contengono solo l'antigene
quindi non causano i sintomi della malattia, cosa che invece può avvenire con i vaccini vivi
attenuati.

Vaccini vegetali
Le piante transgeniche sono impiegate anche come bioreattori per la produzione di proteine
virali o batteriche con proprietà immunogene (vaccino contro HIV prodotto nelle piante di
tabacco).
Immunoglobuline
sono glicoproteine prodotte dai linfociti B maturi (plasmacellule) che riconoscono e legano
un determinato antigene. In un organismo, differenti cloni di linfociti B producono anticorpi
che riconoscono diverse porzioni (dette determinanti antigenici) di uno stesso antigene.

Gli anticorpi policlonali sono miscele di anticorpi in grado di riconoscere diverse molecole
con affinità variabile si possono ottenere iniettando in un animale un antigene, rappresentato
da cellule batteriche (vive o morte), tossine o altre molecole in grado di attivare la risposta
immunitaria; dopo l'immunizzazione si preleva il siero dell'animale e si purifica la miscela
anticorpale.

anticorpi monoclonali: anticorpi con elevata selettività e specificità prodotti dai cloni di una
sola plasmacellula. La tecnica di produzione di tali anticorpi prevede l'utilizzo di un ibridoma,
ossia una cellula ottenuta dalla fusione di una plasmacellula con una cellula di mieloma.
Passaggi:
1 l'immunizzazione di un animale contro un antigene di interesse
2 Le plasmacellule dell'animale sono estratte dalla milza e fuse con le cellule di mieloma
(linfociti immortalizzati) difettive per la sintesi di nucleotidi
3 Le cellule sono fatte crescere per quattordici giorni su un terreno di coltura selettivo,
carente di nucleotidi; in questo terreno non possono sopravvivere né le cellule di mieloma,
perché non sono in grado di sintetizzare i nucleotidi, né le plasmacellule, perché hanno un
ciclo vitale inferiore alle due settimane. Al contrario, gli ibridomi sopravvivono, perché hanno
acquisito l'immortalità della cellula di mieloma e i geni per la sintesi dei nucleotidi dalla
plasmacellula.
4 La miscela di ibridomi è diluita in modo che ogni clone sia isolato e gli anticorpi che si
estraggono dal terreno di coltura siano prodotti da un solo tipo di ibridoma. Infine, si
seleziona il clone che produce una buona quantità di anticorpo con un'elevata specificità per
l'antigene di interesse.

La diagnosi di molte malattie infettive o tumorali avviene mediante test immunologici che
utilizzano anticorpi monoclonali. Questi sono molto sensibili e riescono a rivelare la presenza
di virus o batteri nelle fasi di insorgenza della patologia.
Immunoterapia: vengono infuse per via endovenosa alte concentrazioni di
immunoglobuline in modo da aumentare il numero di anticorpi che possono riconoscere e
inattivare una molecola che causa la patologia, oppure possono essere coniugati a un
farmaco e veicolarlo dove è necessario

TERAPIA GENICA
Trattamento basato sulla sostituzione del gene mutato che causa la malattia con un gene
normale. Utilizzata anche per individuare un gene che causa una patologia sfruttando
l'RNAi, è possibile, mediante virus ingegnerizzati, veicolare all'interno delle cellule i siRNA
diretti contro l'mRNA di un gene associato allo sviluppo di un tumore, bloccando la
traduzione. Le difficoltà incontrate inizialmente nell'uso della terapia genica erano:
● riuscire a infettare solo le cellule bersaglio;
● riuscire a introdurre il DNA esogeno in un punto specifico del genoma per evitare
mutazioni dannose per la salute dell'individuo;
● conservare il gene sano per evitare il ritorno della malattia
● evitare la risposta immunitaria del paziente contro i vettori virali
Alcune problematiche sono state superate: si utilizzano come vettori i retrovirus attenuati,
cioè virus vivi in grado di entrare nelle cellule e integrare il proprio genoma in quello
dell'ospite senza causare la malattia. Per evitare la risposta immunitaria è stata sviluppata
una terapia ex vivo: alcune cellule del midollo del paziente sono prelevate, modificate in vitro
e poi infuse nuovamente nel soggetto. Attualmente la terapia genica è utilizzata per curare
alcune malattie del sistema nervoso come la leucodistrofia metacromatica, cecità congenite
e anche alcune forme di tumori del sangue. Contro i tumori è stata sviluppata la terapia
genica CAR-T che utilizza linfociti T del paziente isolati, ingegnerizzati e reinfusi in modo da
attivare il sistema immunitario solo contro le cellule tumorali.

CRISPR/CAS9
sistema che permette di modificare il genoma del paziente senza creare mutazioni. è
composto da: la nucleasi Cas9, enzima in grado di tagliare il DNA; RNA guida sintetico.
L'RNA guida lega la sequenza del gene da modificare, grazie alla complementarietà delle
basi azotate. A questo punto, l'endonucleasi Cas9, giunta sul sito bersaglio grazie all'RNA
guida (a cui è ancorata) taglia entrambi i filamenti di un DNA in un punto.Il taglio
dell'endonucleasi attiva quindi il sistema di riparazione omologa del DNA detto HDR che
introduce la sequenza desiderata attraverso la ricombinazione omologa . In questo modo, il
sistema CRISPR/Cas9 può effettuare modificazioni mirate nella sequenza di DNA per
inattivare o ripristinare la funzionalità di un gene. Tale tecnologia può essere applicata per
modificare il genoma di animali, piante e anche dell'uomo per la cura di specifiche patologie
(fibrosi cistica, beta talassemia, diversi tipi di cancro e malattie autoimmuni). Vanno ancora
testati gli effetti a lungo termine e i possibili errori di taglio.