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Trascrizione del DNA nei procarioti

La trascrizione il processo attraverso il quale viene sintetizzato RNA messaggero a partire dal DNA.
Nonostante ci siano alcune differenze tra procarioti ed eucarioti in entrambi la trascrizione pu essere
suddivisa in 3 fasi: inizio, allungamento e terminazione.
inizio: riconoscimento del promotore e apertura del DNA a formare la bolla di trascrizione
allungamento: l'RNA polimerasi sintetizza l'RNA utilizzando come stampo uno dei due filamenti di
DNA
terminazione: viene riconosciuto il terminatore e l'RNA polimerasi si arresta
Un tipico promotore di E.coli costituito da 3 componenti:
1. sequenza consenso TTGACA -35 (ricca in A-T)
2. sequenza consenso TATAAT -10 o pribnow box (ricca in A-T)
3. sito dinizio della trascrizione.
Alcuni promotori contengono lelemento UP ancora pi a ?monte? della sequenza -35, altri possono
mancare della sequenza -35 ma avere una sequenza -10 estesa, altri ancora a valle della sequenza -10
contengono un discriminatore che controlla il legame della RNA polimerasi.

LRNA polimerasi un enzima a forma di pinza o chela di granchio costituito da pi subunit, come la DNA
polimerasi sintetizza in direzione 5' 3' ma non necessita di primer. Nei procarioti c una sola RNA
polimerasi che presenta 5 subunit:
1. 2 sub : responsabili dellassemblaggio del complesso della trascrizione e partecipano al
riconoscimento del promotore nei promotori contenenti lelemento UP, contengono 2 domini con
funzioni diverse:
a. dominio C-terminale, che lega lelemento UP del promotore che, se presente,
responsabile dellinizio della trascrizione
b. dominio N-terminale, che interagisce con le altre subunit
2. : che contiene il sito catalitico e quindi responsabile dellattivit polimerasica
3. : che lega il DNA (NB Il canale dove passa il DNA formato dalle 2 subunit e )
4. : che stabilizza il complesso
Inoltre lRNA polimerasi lega una subunit che riconosce il promotore.


Come anche la DNA polimerasi la RNA polimerasi lega 2 ioni bivalenti Mg
+2
che neutralizzano le cariche
negative dei gruppi fosfato e stabilizzano il pirofosfato; precisamente un Mg
+2
strettamente legato
mentre laltro viene introdotto ad ogni ciclo con il nucleotide trifosfato. La reazione consiste nellattacco
dellOH in 3 della catena nascente di RNA sul P del fosfato del nucleotide trifosfato entrante con
formazione di un legame fosfodiestereo e rottura del legame fosfoanidridico e rilascio di pirofosfato.
Lenergia per la formazione del legame fornita proprio dalla rottura del legame fosfoanidridico che pu
essere considerato come una riserva di energia libera.

Assemblaggio delloloenzima (RNA pol + fattore
Tutto inizia dalla subunita che contatta la subunit , questo eterodimero lega il DNA in maniera
aspecifica e promuove l'assemblaggio delle restanti subunit, si legano quindi le subunit e '; la subunit
' partecipa al legame aspecifico della polimerasi con il DNA mentre la subunit responsabile
dellattivit catalitica vera e propria. Cos com (2) l'enzima non in grado di riconoscere il promotore
ma necessita del fattore , questo si lega alle altre subunit formando l'oloenzima completo il quale scorre
lungo il DNA e quando incontra il promotore vi si lega tramite il fattore .
Esistono pi fattori che regolano l'espressione genica:
70 espresso in condizioni normali (permette all'RNA polimerasi di legarsi ai geni house-keeping),
riconosce un promotore che contiene 2 sequenze consenso di 6 nucleotidi poste a -35 e a -10
rispetto al sito di inizio della trascrizione. La sequenza -35 riconosciuta dalla regione 4 del fattore
(NB Il fattore composto da 4 regioni 1, 2, 3 e 4) mentre la sequenza -10 o Pribnow box,
ricca in A e T, riconosciuta da 2 o anche 3 se estesa. Quando libero il fattore 70 lega il DNA
mediante il dominio N-terminale, quando si associa al complesso 2 formando loloenzima
completo la regione N-terminale viene spostata dal DNA

32 espresso quando i batteri sono esposti al calore e permette la trascrizione dei geni che
codificano per le heat-shock proteins permettendo ai batteri di sopravvivere a temperature pi
elevate (fa s che l'RNA polimerasi leghi i geni heat-shock).
alcuni promotori contengono anche 1 o + elementi a monte detti elementi UP che vengono legati
direttamente dalla subunit della RNA polimerasi mediante il dominio carbossiterminale. Infatti il
dominio carbossiterminale della subunit legato al resto dellRNA polimerasi tramite una
struttura proteica detta giunto flessibile che permette di raggiungere lelemento UP anche se non
si trova immediatamente vicino alla regione -35.
Inizialmente loloenzima (RNA pol + fattore ) si lega a qualsiasi sequenza di DNA in modo reversibile e
scorre lungo il DNA fino a incontrare il promotore formando il cosiddetto complesso chiuso in cui il DNA a
doppia elica. Quando loloenzima incontra e lega il promotore si ha il passaggio dal complesso chiuso al
complesso aperto in cui delle variazioni conformazionali nell'enzima provocano l'apertura della doppia
elica del DNA.
A questo punto la RNA polimerasi pu iniziare a sintetizzare lRNA utilizzando uno dei filamenti di DNA
come stampo. Inizialmente si pu avere una fase abortiva in cui altri lRNA polimerasi si muove avanti e
indietro (modello transiente) o si muove tipo bruco (modello a bruco) sintetizzando corti filamenti di 9-12
nucleotidi senza per procedere oltre e quindi rilasciandoli.
Dopodich alcuni cambiamenti conformazionali nella subunit permettono allRNA polimerasi di scorrere
lungo il DNA e iniziare quindi la fase di allungamento in cui i nucleotidi vengono aggiunti allestremit 3
della catena nascente di RNA formando un ibrido DNA-RNA nella regione srotolata. In questa fase pu
sempre succedere che la RNA pol rallenti o si blocchi.

Inoltre, per correggere leventuale inserzione di un nucleotide sbagliato, lRNA polimerasi ha 2 meccanismi
di correzione di bozze o proofreading:
editing pirofosforolitico: meccanismo che in grado di eliminare il nucleotide sbagliato perch
lappaiamento non corretto fa s che lRNA polimerasi rallenta molto e prevale la reazione inversa
cio il nucleotide rilega il pirofosfato riformando il nucleotide trifosfato e viene quindi rilasciato.
editing idrolitico: in questo caso il fattore Gre fa invertire la direzione della sintesi, perci lRNA
polimerasi torna indietro di uno o pi nucleotidi provocando il distacco della catena contenente
errori e poi lRNA polimerasi riprende lallungamento da dove stato tagliato lultimo tratto che
conteneva errori.
Durante lallungamento sono molto importanti come nella replicazione le topoisomerasi perch secondo
lipotesi dei domini gemelli man mano che si sposta in avanti la RNA polimerasi genera davanti a s dei
superavvolgimenti positivi e si lascia alle spalle dei superavvolgimenti negativi (per ogni giro delica
percorso si genera un superavvolgimento +1 anteriormente allenzima e un superavvolgimento -1
posteriormente), poich si pu avere uneccessiva compattazione che provoca il blocco della trascrizione
sono importanti la DNA girasi (una topoisomerasi tipo 2 che introduce avvolgimenti negativi) e la
topoisomerasi I (che rimuove i superavvolgimenti negativi) per correggere la struttura.
Infine nella fase di terminazione quando lRNA polimerasi incontra un terminatore si ha il distacco
dellenzima e la fine della trascrizione. Ovviamente si devono anche separare lRNA messaggero dal DNA e
questo pu avvenire in 2 modi:
i terminatori intrinseci sono caratterizzati da una sequenza
palindromica ricca in C e G ~20 bp seguita da una sequenza ricca in A
e T ~8 bp, lRNA polimerasi trascrive queste sequenze in mRNA e,
poich quelle ricche in G-C sono simmetriche, lmRNA si ripiega a
forcina per cui lRNA polimerasi non pu avanzare ulteriormente, si
stacca e viene rilasciato lRNA. NB la sequenza ricca in A-U nellibrido
RNA-DNA favorisce la dissociazione dellRNA (minori legami Idrogeno
e interazione di stacking) e il distacco dellenzima
i terminatori Rho-dipendenti, invece, codificano per una sequenza di
RNA ad alta affinit per la proteina esamerica rho; la proteina rho
unelicasi che lega l'mRNA in zone ricche di C dette RUT (RHO
UTilization) e separa librido RNA-DNA.

NB Lenzima completo o oloenzima ha una composizione 2, il nucleo enzimatico o core ha una
composizione 2. Il nucleo enzimatico grazie alla subunit pu legare il DNA in maniera non specifica
sul sito di legame debole, in questo caso per il DNA resta a doppia elica.