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CENNI SU ALCUNE TECNICHE UTILI PER LA


PURIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI
PROTEINE DI INTERESSE FARMACOLOGICO
ABBREVIAZIONI ................................................................................................................................................ 2
OBIETTIVI GENERALI ..................................................................................................................................... 2
INTRODUZIONE ALLE PROTEINE ................................................................................................................ 3
PREMESSA ............................................................................................................................................................ 3
Funzioni biologiche ....................................................................................................................................... 3
STRUTTURA ......................................................................................................................................................... 3
METODI GENERALI PER IL DOSAGGIO................................................................................................................... 3
PURIFICAZIONE DI PROTEINE...................................................................................................................... 4
DEFINIZIONE DELLA STRATEGIA............................................................................................................... 4
ESTRAZIONE ........................................................................................................................................................ 6
PURIFICAZIONE PRELIMINARE ............................................................................................................................. 7
PURIFICAZIONE CROMATOGRAFICA ........................................................................................................ 9
Premessa ........................................................................................................................................................ 9
Tecniche cromatografiche............................................................................................................................ 11
CARATTERIZZAZIONE CHIMICO-FISICA DI PROTEINE .................................................................... 13
ELETTROFORESI ................................................................................................................................................. 13

Elettroforesi analitica su gel di poliacrilamide (PAGE).............................................................................. 13


Tecniche di rivelazione ................................................................................................................................ 15
PREPARAZIONE DI ANTICORPI .................................................................................................................. 16
ANTICORPI POLICLONALI .......................................................................................................................... 16
ANTICORPI MONOCLONALI....................................................................................................................... 16
Specificit..................................................................................................................................................... 16
Reattivit crociata (cross-reactivity) ........................................................................................................... 16
SAGGI IMMUNOLOGICI ................................................................................................................................ 17
IMMUNO-BLOTTING ........................................................................................................................................... 17
LECTIN BLOTTING ............................................................................................................................................. 18
SAGGI RADIOIMMUNOLOGICI (RIA) .................................................................................................................. 18

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ABBREVIAZIONI
SDS
PAGE
Con A

dodecil solfato di sodio


elettroforesi analitica su gel di poliacrilamide
concanavalina A

OBIETTIVI GENERALI
1.

Caratterizzazione biologica (preliminare) e strutturale (peso molecolare, numero di subunit,


composizione aminoacidica, sequenziazione N-terminale).
2.
Preparazione di anticorpi policlonali e monoclonali.
3.
Messa a punto di saggi immunologici (RIA, ELISA, etc.) per il dosaggio della sostanza nei
diversi tessuti.
clonazione del gene al fine di produrre quantit sufficienti per una migliore caratterizzazione
biologica ed eventuali impieghi.

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INTRODUZIONE ALLE PROTEINE

PREMESSA
Funzioni biologiche
1. enzimatica
2. di trasporto (emoglobina, albumina, alfa1-glicoproteina acida, etc)
3. strutturale (collagene)
4. motoria (actina)
5. protezione immunitaria (immunoglobuline)
6. etc.
Lattivit biologica pu essere valutata in vitro o in vivo
STRUTTURA
Struttura primaria, secondaria (alfa elica, foglietto beta, etc) (fibrose o globulari), terziaria,
quaternaria. La struttura primaria dei polipeptidi con pi di 30 aminoacidi difficile da determinare
mediante sequenziazione diretta e oggi ricavata dalla sequenza del gene.
Le proteine possono essere semplici o coniugate (glico-, lipo-, metallo-proteine).

METODI GENERALI PER IL DOSAGGIO


I metodi principali per il dosaggio sono:
1.

2.

3.

Saggio del Biureto 1: specifico per i legami peptidici; per aggiunta di una miscela di solfato
di rame, tartrato di sodio e potassio, idrossido di sodio e ioduro di potassio, gli ioni rame
formano un complesso di colore blu con il legame peptidico, che pu essere quantificato a
545 nm.
Saggio di Lowry2: in parte simile al precedente ma la reazione colorimetrica dovuta alla
riduzione del reagente fosfomolibdico-fosfotungstico da parte del complesso rame-proteina
con un viraggio dal giallo al blu-viola;
Saggio di Bradford 3: basato sul viraggio del Coomassie Blue G in ambiente acido per acido
fosforico dal rosso al blu (quantificabile a 595 nm); linterazione non riguarda il legame
peptidico ma specifici aminoacidi, tra cui larginina; il saggio stato modificato
successivamente da Macart e Gerbaut 4 che hanno introdotto il detergente dodecil solfato di
sodio (SDS) che ha unazione denaturante sulle proteine, consentendo una validit pi ampia.

Gornall et al., (1949). Determination of serum proteinsa by means of the Biuret reaction. JBC 177:751-766.
Lowry et al., (1951). Protein measurement with the Folin Phenol Reagent. JBC 193:265-275.
3
Bradford (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
prinnciple of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254.
2

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I metodi di Bradford e Lowry sono pi sensibili del saggio del biureto che tuttavia
estremamente semplice e poco sensibile a interferenze da parte di sostanze non proteiche.
Per tutti e tre i metodi necessario preparare una curva standard interna con una proteina di
riferimento quale ad esempio lalbumina.

PURIFICAZIONE DI PROTEINE
DEFINIZIONE DELLA STRATEGIA
A differenza di quanto si verifica per le tecniche di biologia molecolare, che sono state
ampiamente standardizzate negli ultimi anni, la purificazione delle proteine dipende ancora da
molte variabili che devono essere valutate caso per caso sulla base delle conoscenze e delle
tecnologie disponibili. Ecco perch, ci si riferisce alla Chimica delle proteine definendola spesso
unarte.
La purificazione di una proteina pu essere un compito molto difficile che richiede la messa a
punto di una strategia: in particolare importante individuare:
1.

la fonte pi opportuna (organo intero, tessuto, fluido corporeo, etc): questa deve essere pi
ricca possibile del fattore desiderato e pi povera possibile di altre sostanze (impurezze) che
sono tanto pi indesiderate tanto pi possiedano propriet simili alla proteina in esame;

2.

uno o pi metodi di dosaggio biologico in vitro o in vivo: ci essenziale per calcolare la resa
in attivit biologica dopo ciascun passaggio, in modo da valutarne lefficacia;

3.

uno o pi metodi per il dosaggio quantitativo: ci essenziale per il calcolo della resa
quantitativa dopo ciascun passaggio;

4.

i fattori che maggiormente influenzano la stabilit della proteina durante la purificazione: tra
questi vi sono le elevate temperature, le basse concentrazioni, la presenza di proteasi, la
presenza di ossigeno e altri agenti ossidanti;

Tutti questi elementi devono essere valutati caso per caso attraverso esperimenti pilota che
sono generalmente ripetuti aumentando gradualmente la quantit di materiale di partenza (scaling
up).

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A titolo illustrativo, consideriamo la storia della scoperta dellinsulina, che avvenuta


secondo le seguenti tappe principali:

1869

1889
1900s
1911

19161920
1921

1922

1923

1960
1963
1972
1978

Tabella 1. La scoperta dellinsulina5


Paul Langerhans, uno studente di medicina tedesco, descrive due tipi di cellule
pancreatiche, quelle acinari, che secernono gli enzimi digestivi, e cellule raggruppate
in isole, per le quali egli ipotizza una funzione diversa;
Minkowski e von Mering dimostrano nel cane che la pancreatectomia provoca una
sindrome analoga al diabete mellito;
Zuelzer, un medico tedesco, prova un estratto pancreatico su un paziente diabetico
morente osservando un effetto benefico anche se transitorio;
Gli esperimenti di Scott, uno studente americano, con estratti alcolici pancreatici su
cani diabetici non sono presi nella considerazione che meritano, anche per la
mancanza di un metodo affidabile per il dosaggio degli zuccheri;
Il fisiologo Rumeno Paulesco descrive leffetto di estratti pancreatici sui livelli urinari
di zuccheri e chetoni di cani diabetici; limportanza di questi studi verr compresa solo
dopo molti anni;
Banting, un giovane chirurgo canadese, comincia a lavorare nel laboratorio del
fisiologo Macleod, con lassistenza di Best, uno studente in Medicina; avendo intuito
che il fattore antidiabetico prodotto dalle isole di Langerhans possa essere sensibile
allazione degradativa degli enzimi prodotti dalle cellule acinari essi procedono alla
legatura dei dotti pancreatici, provocando degenerazione selettiva del tessuto acinare:
estratti etanolici di tessuto pancreatico ottenuto dopo la legatura, risultarono efficaci
nel ridurre la concentrazione ematica del glucosio in cani diabetici;
In difficolt per la scarsa riproducibilit dellestrazione, Banting chiede aiuto a
Macleod e a Collip, un chimico noto per la sua esperienza nellisolamento
delladrenalina;
ad appena un anno dalla divulgazione della scoperta, viene conferito a Banting e
Macleod il premio Nobel, che scatener furibonde polemiche per lattribuzione dei
rispettivi meriti: Banting dichiara di voler dividere il premio con Best e Macleod con
Collip;
linsulina, cristallizzata da Abel pochi anni dopo la sua scoperta, fu sequenziata da
Sanger;
sintesi completa;
determinazione della struttura tridimensionale da parte di Hodgkin e collaboratori;
Yalow mette a punto il primo dosaggio ormonale di tipo radioimmunologico.

Commenti: diverse osservazioni inducono a ipotizzare che la funzione del pancreas non sia solo quella di produrre
enzimi digestivi: quelle anatomiche di Langerhans e quelle fisio-patologiche di Minkowski e von Mering: siamo di
fronte ad un attivit biologica nuova; la ricerca di un fattore biologico nuovo richiede anche conoscenze tecniche
specifiche: i risultati di Scott non sono sufficientemente apprezzati sia per la scarsa apertura scientifica del suo
gruppo, ma anche perch egli non dispone delle metodiche per il dosaggio degli zuccheri con cui avrebbe potuto
validare megli i suoi esperimenti; anche Banting e Best sono costretti a chiedere aiuto ad altri a causa di difficolt
tecniche durante la preparazione degli estratti; I risultati di Paulesco non hanno avuto limpatto scientifico che
meritavano: oggi, grazie alleccezionale sviluppo delle vie di divulgazione delle scoperte, una situazione del genere
non si potrebbe verificare facilmente: anzi i ricercatori odierni hanno accesso ad una mole di conoscenze scientifiche
spesso superiore alle loro possibilit di elabora una tale mole di informazioni; Lintuizione vincente di Banting e Best
la suscettibilit del fattore biologico alla degradazione: attraverso la legatura dei dotti essi ottengono la giusta
fonte di fattore biologico da cui eseguire; Limportanza del saggio biologico: la determinazione della riproducibilit
dellestrazione presuppone la disponibilit di un modello sperimentale quale il cane diabetico e di tecniche per il
dosaggio degli zuccheri nel sanguee nelle urine;

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ESTRAZIONE
Al fine di ottimizzare la resa di estrazione di una proteina da un tessuto essenziale
individuare la migliore fonte possibile:
1.

proteine extracellulari: nel caso di proteine secrete allesterno delle cellule, queste ultime
possono essere allontanate mediante centrifugazione utilizzando come materiale di partenza il
supernatante;

2.

proteine intracellulari: dopo aver preparato un omogenato del tessuto si cerca di isolare i tipi
cellulari maggiormente ricchi del fattore ricercato; successivamente, se la proteina ha una
localizzazione cellulare precisa, pu essere utile preparare un lisato isolando la frazione
subcellulare (membrana plasmatica, mitocondri, ribosomi, nuclei, etc.); a seconda del tipo di
cellule (animali, vegetali, batteriche) la lisi pu essere indotta per semplice shock osmotico
oppure richiedere condizioni drastiche (ad esempio ultrasuoni); durante queste procedure le
cellule e le successive frazioni sono immerse in un tampone la cui composizione deve essere
scelta sulla base delle seguenti considerazioni principali:
A. pH: la stabilit della maggior parte delle proteine dipende strettamente dal pH ed esiste un
valore ottimale per cui essa massima: questultimo pu anche differire dal valore al quale
lattivit biologica della proteina massima;
B. forza ionica: per riprodurre il valore biologicamente pi comune si aggiunge spesso cloruro
di sodio alla concentrazione di 0.15 M (0.9%);
C. agenti riducenti: diverse proteine possiedono gruppi tiolici liberi che sono essenziali per
lattivit biologica: una volta estratte dallambiente riducente intracellulare, le proteine
possono essere ossidate e perdere attivit: per evitare ci al tampone sono aggiunte sostanze
quali 2-mercaptoetanolo, ditiotreitolo, glutatione ridotto, etc;
D. detergenti: per favorire lestrazione di proteine strettamente legate ad altre componenti
cellulari possono essere usati detergenti, la cui natura e concentrazione operativa devono
essere scelte in modo da minimizzare la denaturazione proteica: tra i detergenti pi usati vi
sono i sali biliari (es. acido colico) ed alcuni derivati di sintesi (CHAPS, CHAPSO, etc);
E. chelanti: gli ioni di metalli pesanti possono avere effetti molto negativi sulle proteine
soprattutto per quelle che possiedono gruppi sulfidrilici liberi: gli agenti riducenti sopra
menzionati possono non essere sufficienti e pu essere necessario aggiungere sostanze
chelanti come lEDTA;
F. inibitori delle proteasi: in seguito alla lisi della cellula e degli organelli subcellulari, possono
essere liberate proteasi che degradano il principio attivo: queste proteasi possono essere
inibite con diisopropilfluorofosfato (DIFP), fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF),
leupeptina, fosforamidone; queste sostanze sono molto tossiche ed in alcuni casi possono
interagire negativamente con il principio attivo;
G. agenti stabilizzanti: glicerolo o saccarosio al 10% aumentano la stabilit di molte
preparazioni proteiche anche se possono influenzare negativamente lefficienza di alcune

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separazioni cromatografiche; inoltre questi agenti impediscono il congelamento delle


preparazioni che effetti indesiderati sulla stabilit 6
PURIFICAZIONE PRELIMINARE
Lestratto grezzo contiene pu contenere particelle di varia natura tra cui detriti cellulari, etc
che possono essere eliminate mediante filtrazione attraverso membrane 7 con porosit di 0.2 m.
Lestratto filtrato, anche nel migliore dei casi, contiene oltre al principio attivo altre proteine e
sostanze non proteiche, tra cui carboidrati, lipidi, acidi, nucleici, sali, etc. Al fine di arricchire
lestratto in principio attivo eliminando sostanze indesiderate possibile utilizzare:
1.

ultrafiltrazione: sono disponibili commercialmente membrane a porosit estremamente ridotta


che consentono di separare molecole di grandi dimensioni (ad esempio > 10 Kd 8) da piccole
molecole; la porosit della membrana talmente ridotta 9 che il passaggio del liquido avviene
solo in presenza di una forza applicata mediante centrifugazione o pressione da parte di un gas
inerte (tipicamente N2); lultrafiltrazione molto utile nel caso di purificazioni da campioni
molto diluiti come lurina, il liquido cerebrospinale, etc oppure da mezzi di coltura cellulare;
oltre a concentrare il campione, questa tecnica consente di dializzarlo, ovvero di eliminare
componenti di piccolo molecolare equilibrando il campione rispetto ad un campione
desiderato;

2.

precipitazione: alcuni sali molto solubili come il solfato dammonio precipitano le proteine
(salting out), sottraendo lacqua di solvatazione necessaria alla loro permanenza in soluzione;
la precipitazione favorita a valori di pH prossimi al punto isoelettrico (pI) 10 della proteina:
le preparazioni proteiche pi stabili possono essere frazionate anche per aggiunta di solventi
organici come letanolo; un esempio classico lo schema di frazionamento delle proteine
plasmatiche, sviluppato da Cohn e collaboratori durante la II guerra mondiale 11.

3.

cromatografia 12 convenzionale: lestratto filtrato pu essere frazionato su una colonna


cromatografica che sia selettiva per il composto di interesse: in questa fase della purificazione
la tecnica pi usata lo scambio ionico grazie alla elevata capacit 13 delle resine attualmente

I processi di congelamento e scongelamento se avvengono lentamente provocano la formazione di cristalli di ghiaccio


che alterano localmente le condizioni di pH e forza ionica con forti effetti denaturanti: pertanto si sceglie a volte di
non congelare le preparazioni proteiche mantenendole a +4C in presenza di opportuni inibitori delle proteasi e della
crescita di microrganismi (es. azide di sodio), oppure di portarle a bassa temperatura in presenza di agenti che
osmotici quali glicerolo e saccarosio; nei casi in cui si sceglie di congelare una preparazione proteica, la procedura
deve essere condotta in modo estremamente rapido utilizzando bagni di N2 liquido, o ghiaccio secco/acetone, etc.
7
Devono essere usate membrane a bassa affinit per le proteine come lacetato di cellulosa per evitare il rischio di
perdere parzialmente il principio attivo durante la filtrazione. Inoltre grazie ad apposite tabelle compilate dal fornitore
della membrana, possibile verificare la sua stabilit in presenza dei diversi componenti del tampone di estrazione.
8
Il chilodalton (Kd) lunit di misura pi comune per indicare il peso molecolare delle proteine: esso corrisponde
approssimativamente a 1000 atomi di idrogeno.
9
Ad esempio, le membrane suddette sono in grado di trattenere una proteina globulare di circa 50 Kd come lalfa1antitripsina, il cui diametro di circa 5 nm.
10
Corrisponde al valore di pH al quale la proteina possiede carica complessiva nulla: in queste condizioni la repulsione
elettrostatica tra le diverse molecole minima e la precipitazione favorita.
11
Durante quel periodo furono condotte intense ricerche al fine di ottenere preparazioni proteiche stabili da utilizzare
come espanditori plasmatici per i feriti di guerra.
12
La cromatografia un metodo di separazione basato sulla distribuzione tra fasi. In campo biologico si utilizza
normalmente tecniche di cromatografia liquida in cui le sostanze soggette a separazione, disciolte in un mezzo liquido
(spesso acquoso), interagiscono con una fase fissa: a seconda del tipo di interazione si distinguono tecniche
cromatografiche basate sullo scambio ionico, la ripartizione-adsorbimento, la gel permeazione, laffinit, etc.
13
La capacit una misura del numero di molecole che possono interagire con una quantit fissa di resina.

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disponibili e allassenza di limitazioni per quanto riguarda il volume di campione


frazionabile 14; Le resine a scambio ionico sono costituite da polimeri inerti come il destrano,
la cellulosa agarosio, polistirene, etc: la scelta dipende da vari fattori tra cui le dimensioni
delle particelle, la granulometria, la forma dei granuli, la velocit del flusso 15, la stabilit, il
costo, etc. Questi polimeri recano dei gruppi carichi positivamente [es. carbossimetile (CM),
residui solfonici (S) scambio cationico) o negativamente [dietilaminoetil (DEAE), gruppi
ammonici quaternari (QA) scambio anionico]; le propriet di legame (selettivit) delle
resine dipende dalla forza ionica e dal pH della fase mobile: questultimo parametro influenza
sia lo stato di ionizzazione delle molecole del campione, sia quello degli eventuali gruppi
acido-base deboli, dal pH della fase mobile.

14

Per alcune tecniche cromatografiche come la gel permeazione il volume di campione frazionabile limitato dal
volume complessivo della fase fissa, mentre per lo scambio ionico, la ripartizione-adsorbimento, e laffinit il limite
non dato dal volume del campione ma solo dal numero di molecole in esso presenti: questo un notevole vantaggio
in questa fase della purificazione in quanto il volume di campione spesso notevole; inoltre in questo modo
possibile anche concentrare il campione senza dover ricorrere alla ultrafiltrazione, ma solo ad una dialisi
convenzionale;
15
La velocit di flusso della fase mobile un parametro fondamentale della cromatografia liquida: tuttavia in questa
fase della purificazione essa pu essere subordinato al costo della resina, soprattutto nel caso di quantit notevoli di
campione.

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PURIFICAZIONE CROMATOGRAFICA
Premessa
La cromatografia un metodo di separazione basato sulla distribuzione tra fasi. Una fase
mobile (liquida, in LC) si muove percolando attraverso una fase fissa o stazionaria. Il processo di
separazione cromatografica il risultato di una serie elevatissima di azioni di ripartizione del soluto
tra le due fasi. Sostanze diverse disciolte nella fase mobile (soluti) sono separate in base ai rispettivi
valori di affinit per le due fasi.
Tappe fondamentali nella storia della cromatografia liquida
1903

Tsweet (Russia) separa alcuni pigmenti vegetali in bande colorate utilizzando una
colonna impaccata con polvere di gesso.

1930-31

Dopo un periodo di quasi completo oblio la tecnica viene riscoperta da Kuhn e


Lederer (Heidelberg, Germania) e rende possibili notevoli progressi nella
purificazione di sostanze in chimica organica e biochimica.

1952

Martin e James mettono a punto la tecnica di ripartizione gas-liquido (gascromatografia).

1956

van Deemter, Zuiderweg e Klinkerberg sviluppano la teoria della separazione


cromatografica.

1965-1969

Introduzione delle tecniche di cromatografia liquida ad alta


pressione/prestazioni (HPLC).

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10

Cromatografia convenzionale e HPLC


Tabella 2. Confronto tra cromatografia liquida classica (LC) e cromatografia liquida ad
alte prestazioni (HPLC)*

LC

lunghezza della colonna


diametro della colonna
dimensioni delle particelle della fase
stazionaria
distribuzione delle dimensioni delle particelle
velocit di flusso della fase mobile
tempo di frazionamento (ordine di
grandezza)
caricamento del campione

prestazioni complessive
costo

20-100 cm
0.5-5 cm
100-1000 m

HPLC
colonne
analitiche
10-50 cm
1-5 mm
1-20 m

HPLC
colonne
preparative
10-50 cm
5-50 mm
20-100 m

grossolana
5-50 ml/ora
ore/giorni

molto ridotta
0.5-2 ml/min
min

molto ridotta
1-50 ml/min
ore

richiede una
buona
manualit

basse
basso

preciso e
preciso e
riproducibile
riproducibile
anche per
anche per
piccole quantit piccole quantit
di campione
di campione
molto elevate
elevate
elevato
molto elevato

* Data la grande variabilit di colonne e tecniche cromatografiche disponibili i valori riportati


devono essere considerati solo indicativi.
Strumentazione HPLC
Figura 1. Rappresentazione schematica di un apparecchio HPLC

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11

Tecniche cromatografiche
1.

Adsorbimento-ripartizione-coppia ionica

2.

Scambio ionico

3.

Esclusione molecolare (anche detta gel permeazione o gel filtrazione)

4.

Affinit

Adsorbimento-ripartizione-coppia ionica

1.

I vantaggi delle fasi legate


equilibrio rapido con la fase mobile;

2.

utilizzabili con solventi polari e non polari (lavaggio, rigenerazione);

3.

utilizzabili in un ampio intervallo di pH (i limiti dipendono dalla stabilit della matrice: ad es.
per le colonne silicee pH<8);

Fase normale e fase inversa


In LC a fase normale la fase stazionaria polare (silice, allumina) ed i solventi pi forti sono
quelli polari e protici (in grado di formare legami idrogeno). In LC a fase inversa la fase stazionaria
idrofobica (fasi legate C4, C8, C18, etc.) ed i solventi pi forti sono quelli non-polari. In HPLC di
ripartizione/adsorbimento la composizione della fase mobile durante la corsa cromatografica pu
essere costante (eluizione isocratica) o pi spesso variabile (eluizione in gradiente).
Coppia ionica
E utile per sostanze altamente ionizzate ma scarsamente solubili in acqua, che risultano
difficilmente analizzabili con le tecniche di adsorbimento/ripartizione o di scambio ionico.

Si utilizzano:
1.

ALCHILSOLFONATI (etansolfonato, eptansolfonato, laurilsolfonato) a pH acido per i soluti


basici.

2.

SALI DI AMMONIO QUATERNARIO (solfato di tetrabutilammonio, tridecilammina) a pH


neutro/basico per i soluti acidi.

Scambio ionico
E stata discussa precedentemente.

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12

Cromatografia ad esclusione molecolare (gel permeazione/filtrazione)


Cromatografia di affinit
Tabella 3. Esempi di fasi cromatografiche ad affinit
ligando immobilizzato
anticorpi
proteina A
lectine (concanavalina A)
cofattori enzimatici
coloranti (Cibacron Blue)
avidina
enzimi proteolitici
acido poliuridilico,
acido adenilico etc.
farmaci (metrotressato)

sostanza isolabile
antigeni proteici
anticorpi
glicoproteine
enzimi
proteine seriche (albumina)
proteine contenenti biotina
frammenti proteici
mRNA, mRNA binding
proteins, trascrittasi inversa, etc.
enzimi (diidrofolico
reduttasi)

Rivelatori

Caratteristiche del rivelatore ideale:


1.
2.
3.
4.
5.
6.

alta selettivit
alta sensibilit
basso rumore di fondo
risposta lineare in un ampio intervallo di concentrazione
bassa deriva
scarsa sensibilit alle variazioni della composizione della fase mobile

In cromatografia liquida manca il rivelatore universale (conducibilit termica in


gascromatografia). Tra i pi utilizzati in campo biomedico vi sono quelli spettrofotometrici UV.
Negli ultimi anni sono stati compiuti notevoli progressi nella campo della spettrometria di massa in
associazione con le separazioni HPLC.

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CARATTERIZZAZIONE CHIMICO-FISICA DI PROTEINE

ELETTROFORESI
Essendo le proteine molecole cariche a valori di pH diversi dal loro punto isoelettrico, esse sono
analizzate da molti anni mediante tecniche elettroforetiche.
Un notevole salto di qualit nella risoluzione di miscele proteiche, stato realizzato passando
dallelettroforesi in fase libera a quella stato zonale su supporti solidi. Questultima consente
di massimizzare la separazione di molecole con diversa densit di carica (rapporto carica/massa),
riducendo al minimo gli effetti non specifici di diffusione.
Quali supporti solidi sono stati utilizzati:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

carta
acetato di cellulosa
gel di silice
allumina
cellulosa
agarosio
amido
poliacrilamide

I pi indicati per le macromolecole biologiche sono gli ultimi tre, essendo caratterizzati da
una struttura reticolare con pori di dimensioni simili a quelle di acidi nucleici e proteine,
partecipano attivamente al processo separativo. Attualmente, lamido stato abbandonato poich,
essendo di origine naturale scarsamente riproducibile e pu contenere agenti contaminanti.
Lagarosio, la cui porosit maggiore, invece utilizzato prevalentemente in biologia molecolare
per la separazione di acidi nucleici. Il supporto utilizzato pi comunemente per la separazione di
miscele proteiche la poliacrilamide.

Elettroforesi analitica su gel di poliacrilamide (PAGE)


Le caratteristiche che hanno reso cos comune limpiego dei gel di poliacrilamide per lanalisi
elettroforetica delle proteine, sono principalmente le seguenti:
1.

sono preparabili facilmente, al momento delluso, da reagenti disponibili commercialmente


con elevato grado di purezza con un costo accessibile. I gel di poliacrilamide sono costituiti
da lunghe catene di poliacrilamide reticolate da composti bifunzionali come la bisacrilamide
(N, N-metilen-bisacrilamide).La polimerizzazione viene eseguita al momento delluso,
miscelando soluzioni madri tamponate a pH opportuni, contenenti lacrilamide, il
reticolante e agenti che catalizzano la reazione. Questi ultimi sono generatori di radicali
liberi quali lammonio persolfato o la riboflavina in presenza di luce, in associazione con
TEMED (N,N,N,N-tetrametilendiammina), che accelera il processo e facendo s che esso
si compia in 10-30 min. Il processo inibito a pH bassi ed in presenza di O2, ed
consigliabile il degassamento delle soluzioni.

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2.

la loro porosit pu essere variata in modo riproducibile utilizzando concentrazioni diverse


di monomero e reticolante: le caratteristiche meccaniche del gel, quali porosit, rigidit,
trasparenza, la tendenza al rigonfiamento, dipendono sia dalla concentrazione del
monomero che del reticolante, nella miscela iniziale. Infatti, le dimensioni dei pori dei gel di
poliacrilamide pu essere variata a piacere, cambiando la concentrazione di acrilamide nella
miscela iniziale. In particolare esse diminuiscono, aumentando la sua concentrazione: gel al
2.5% (rinforzati con 0.5% di agarosio) possono essere utilizzati per separare proteine con
3
peso molecolare intorno a 10 Kd, mentre gel al 30% consentono di frazionare peptidi di 2
Kd. La concentrazione pi comunemente utilizzata 10%, il cui intervallo di separazione
20-200 Kd. Inoltre la porosit del gel decresce allaumentare della concentrazione del
reticolante (bisacrilamide), raggiungendo un minimo in corrispondenza del 5%.

3.

sono chimicamente inerti e stabile in ampi intervalli di pH, temperatura, forza ionica;

4.

sono trasparenti;

Forma del gel


I gel di poliacrilamide possono essere preparati in forma di lastra o di cilindro (rod). I primi
sono i pi comunemente usati grazie ad una serie di vantaggi, tra cui:
1.

consentono di analizzare pi campioni contemporaneamente, consentendo il confronto tra


loro e con un eventuale marker, nelle stesse condizioni sperimentali.

2.

consentono un miglior scambio di calore, riducendo gli effetti di diffusione delle bande.

3.

consentono una pi facile analisi densitometrica, radiografica o fotografica delle bande.

I gel cilindrici sono invece usati preferenzialmente per eseguire la prima corsa dei gel a due
dimensioni e, data la loro maggiore capacit di campione, per le applicazioni preparative.
Scelta delle condizioni elettroforetiche
Tamponi continui o discontinui
Limpiego di sistemi di tampone discontinui consente un notevole aumento della risoluzione. ad
esempio uno dei sistemi pi utilizzati cos costituito:

TAMPONE SUPERIORE TRIS/GLICINA pH 8.3


STACKING GEL TRIS/HCl pH 6.7
RESOLVING GEL TRIS/HCl pH 8.9
TAMPONE INFERIORE TRIS/GLICINA pH 8.3
In questo sistema lelettroforesi viene condotta utilizzando due gel di poliacrilamide preparati
uno sullaltro. Il primo detto stacking (gel concentrante) un gel di bassa porosit nel quale sono
ricavati dei pozzetti con capacit di 50-200 l, in cui vengono caricati i campioni proteici. Esso non
partecipa alla separazione elettroforetica, ma consente di concentrare in bande molto strette le
proteine, facendo in modo che esse raggiungano il resolving gel (gel separante) riunite in bande
molto strette (stacks). La concentrazione delle proteine in stacks si realizza proprio grazie alla

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presenza di tamponi a pH diversi. Infatti nello stacking gel, la mobilit elettroforetica delle proteine
intermedia tra quella dello ione cloruro e quella della glicina, scarsamente ionizzata a pH 6.7. Ci
fa s che le proteine vengano compresse tra i due fronti migratori, concentrandosi. Nel resolving
invece la mobilit elettroforetica della glicina supera quella della proteina e leffetto concentrante
cessa, rendendo possibile la loro separazione in base al peso molecolare.
Tamponi dissocianti o non dissocianti
La PAGE pu essere condotta utilizzando tamponi dissocianti, in grado cio di separare le
proteine oligomeriche nelle singole subunit, o tamponi non dissocianti. Le condizioni dissocianti
pi utilizzate sono quelle descritte da Laemmli (1970), che utilizz sodio dodecil solfato (SDS)
insieme ad un agente tiolico quale 2-mercaptoetanolo, per conseguire la completa separazione delle
proteine in subunit e quindi la loro denaturazione sino alla condizione di random coil. Inoltre,
lSDS, legandosi ai polipeptidi con un rapporto costante in peso (1.4 g SDS/ g polipeptide), rende
trascurabili le cariche intrinseche della proteina, facendo s che la separazione elettroforetica
avvenga solo sulla base di differenze di massa e non di carica. In tal modo proteine sconosciute
possono essere confrontate con proteine note determinando accuratamente il loro peso molecolare.
Quale agente dissociante, in alternativa allSDS, pu essere usata lurea 8M, sempre in
associazione con un agente tiolico, anche se il mancato mascheramento delle cariche proteiche
impedisce la determinazione esatta del peso molecolare. Urea inoltre un agente dissociante meno
efficace.

Tecniche di rivelazione
Coomassie Blue
Si tratta di una colorazione generale non molto sensibile ( 0.5 ug per lane) il gel viene
incubato nella seguente soluzione colorante su un agitatore per circa 30-60 min Coomassie Brilliant
Blue R-250 0.1%, alcool metilico 50 % , acido acetico 10%. Dopo la colorazione, si aggiunge la
soluzione decolorante che consiste in alcool metilico 10% , acido acetico 10% , in acqua distillata.
La decolorazione va protratta sino ad eliminazione completa del background ed essa dura diverse
ore. Infine il gel viene essiccato mediante una apposita apparecchiatura (Drygel) e conservato.
Silver Staining
E una colorazione molto sensibile (circa 30 ng di proteina per banda). Prima della colorazione
il gel viene sottoposto ad una serie di lavaggi per fissare le proteine e rimuovere tutte le sostanze
che sono presenti durante lelettroforesi e che possono interferire con la colorazione. Il meccanismo
di colorazione consiste nella riduzione dellargento cationico legato alla catena polipeptidica ad
argento metallico per aggiunta di formaldeide a pH alcalino.

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PREPARAZIONE DI ANTICORPI

ANTICORPI POLICLONALI
Gli anticorpi policlonali si ottengono dal sangue di animali immunizzati. In laboratorio
lanimale pi utilizzato il coniglio (es. New Zealand) o pi raramente il ratto, mentre alcune ditte
specializzate utilizzano anche animali di maggiori dimensioni, come le capre, da cui possono essere
ottenute quantit maggiori di sangue.
Limmunizzazione si esegue effettuando uniniezione sottocutanea o intradermica 16 di
unemulsione dellantigene con un adiuvante (tipicamente ladiuvante di Freund 17).Per un coniglio
di circa 2 Kg sono sufficienti circa 100-150 g di proteina altamente purificata per ciascuna
immunizzazione (a distanza di circa 5 settimane deve essere fatta eseguita uniniezione di richiamo
del tutto identica alla prima, preparata con ladiuvante incompleto di Freund in luogo del completo.
A partire dalla settimana successiva alliniezione di richiamo possibile effettuare dei prelievi
settimanali di sangue (sino a circa 50 ml dallarteria centrale dellorecchio).
ANTICORPI MONOCLONALI

Specificit
la capacit di un antisiero di distinguere un determinato antigene in presenza di altri. Per
quanto riguarda la specificit degli anticorpi monoclonali va osservato che essa determinata
parallelamente alla loro preparazione che comprende la fase finale di screening degli ibridomi per la
selezione di quello(i) che producono lanticorpo desiderato.
Nel caso degli anticorpi policlonali si dispone invece di un antisiero che va testato per
stabilire la sua specificit. Tra le tecniche disponibile per fare ci sono limmunoelettroforesi e
limmunoblotting. La prima si basa sullelettroforesi di una matrice biologica complessa contenente
lantigene in esame, su gel di agarosio in cui stato immobilizzato lantisiero. Nellimmunoblotting
il frazionamento elettroforetico avviene su gel di poliacrilamide in condizioni denaturanti per la
presenza di SDS e 2-mercaptoetanolo e lantigene viene riconosciuto dallanticorpo dopo il
trasferimento su carta di nitrocellulosa.
Reattivit crociata (cross-reactivity)
In alcuni casi possibile utilizzare un RIA messo a punto per un determinato antigene per
dosare un antigene ad esso cos simile che lanticorpo impiegato mostri elevata cross-reattivit per
esso. il caso di proteine omologhe di due specie simili quali il ratto e luomo per cui pu accadere
che i saggi RIA siano intercambiabili. Affinch i risultati siano affidabili necessario tuttavia che le
curve standard del saggio ottenute impiegando campioni contenenti i due antigeni siano parallele. A
tal fine sono disponibili appositi tests statistici per valutare il grado di parallelismo di due curve
sigmoidi. Generalmente la curva pi ripida generata dai campioni contenente lantigene verso cui
stato preparato lanticorpo.
16

Queste vie consentono un lento assorbimento dellantigene e dunque una prolungata esposizione dellospite ad esso.
Questo prodotto consiste in una sospensione di cellule di Mycobacterium tubercolosis uccise al calore in olio
minerale: la funzione delladiuvante non solo quella di ritardare lassorbimento dellantigene, ma anche di stimolare
sensibilmente la risposta immunitaria dellospite forse grazie ad alcuni componenti batterici, come dimostra lo scarso
potere adiuvante del preparato oleoso privo delle cellule batteriche (cosiddetto adiuvante incompleto di Freund).

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SAGGI IMMUNOLOGICI

IMMUNO-BLOTTING
Dopo la SDS-PAGE le proteine separate nel gel possono essere trasferite elettroforeticamente
su membrane specifiche (tipicamente carta di nitrocellulosa o membrana di fluoruro di
polivinilidene) ottenendo cos una copia fedele del tracciato elettroforetico con il vantaggio di avere
le proteine maggiormente accessibili colorazione con reagenti che difficilmente penetrerebbero
allinterno del reticolo del gel come ad esempio gli anticorpi per le tecniche di colorazione
immunologica. La risoluzione tra le singole bande viene rispettata e mantenuta spazialmente
durante il processo di trasferimento. Questultimo si ottiene mediante lapplicazione di un campo
elettrico perpendicolare al sandwich gel-membrana e le proteine essendo legate allSDS migreranno
dal polo negativo a quello positivo. Esso viene condotto in tampone Tris-glicina contenente 20% di
metanolo.
Consente di visualizzare solo le bande corrispondenti ad una determinata sostanza proteica,
anche quando questa si trova in una miscela complessa. Dopo la separazione mediante SDS-PAGE,
le proteine vengono trasferite elettroforeticamente su membrana (carta di nitrocellulosa, PVDF) e si
procede allincubazione con una soluzione contenente immunoglobuline specifiche (antisiero
diluito, anticorpo monoclonale, immunoglobuline purificate). Quindi la membrana viene incubata
con un secondo reagente coniugato covalentemente ad un enzima. Normalmente si usa:
(1) Perossidasi coniugata a proteina A. La proteina A un polipeptide isolato da Staphilococcus
aureus, che lega il frammento Fc delle immunoglobuline di alcuni animali (ha scarsa affinit
per le immunoglobuline murine).
(2) Fosfatasi alcalina. Le immunoglobuline legate allantigene possono essere riconosciute
impiegando Ig anti-specie, ovvero dirette contro le Ig della specie animale in cui stato
preparato il primo anticorpo utilizzando fosfatasi alcalina coniugata covalentemente ad
immunoglobuline in luogo di perossidasi coniugata a proteina A consente di aumentare la
sensibilit del metodo e la sua applicabilit anche ai casi in cui il primo anticorpo consiste di
immunoglobuline di roditori come nel caso degli anticorpi monoclonali preparati da cellule
murine
.
Figura 2. Schema tipico di immunoblotting
proteina in esame (antigene Ag)
adsorbita sulla membrana (carta di nitrocellulosa, PVDF, etc)

immunoglobuline anti-Ag
(antisiero, immunoglobuline purificate, anticorpi monoclonali, etc)

perossidasi coniugata a proteina A,


fosfatasi alcalina coniugata a immunoglobuline anti-specie.
Etc.

opportuno substrato cromogenico dellenzima impiegato

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LECTIN BLOTTING
Le lectine sono proteine isolate da varie fonti come piante, funghi, batteri, spugne, uova di
pesci, dalle membrane cellulari di mammiferi etc. caratterizzate da una specifica affinit per le
glicoproteine. Ci fa s che esse possiedano attivit agglutinante e mitogeniche. Il ruolo fisiologico
preciso ancora sconosciuto anche se unipotesi suggestiva suggerisce che esse abbiano nel mondo
vegetale funzioni in parte simili a quelle delle immunoglobuline nel mondo animale. Esse sono
utilizzate in numerose applicazioni quali le colture di linfociti e la chimica dei carboidrati. La
concanavalina A (Con-A), ottenuta dal mughetto, una delle lectina maggiormente utilizzate. Essa
ha affinit specifica per i residui terminali alfa-D-mannosil e alfa-D-glucosil.

SAGGI RADIOIMMUNOLOGICI (RIA)


Il saggio radioimmunologico si basa sulla capacit di una quantit limitata di anticorpo di
legare una quantit costante di antigene marcato isotopicamente e della inibizione di questa
reazione da parte dellantigene non marcato (freddo). In tal modo la percentuale di legame del
marcato decresce allaumentare della concentrazione dellantigene freddo. Al fine di determinare la
percentuale di legame dellantigene marcato allanticorpo necessario separare la porzione legata e
quella non legata. ci pu essere effettuato inducendo la precipitazione dei complessi antigeneanticorpo mediante aggiunta di glicol polietilenico, o di un secondo anticorpo diretto contro le
immunoglobuline del primo antisiero, o di cellule batteriche che esprimano sulla superficie la
proteina A, una proteina con notevole affinit per le immunoglobuline di alcuni animali. La quantit
di antigene non marcato presente in un campione incognito pu essere determinata confrontando la
radioattivit del precipitato, previa centrifugazione con i valori stabiliti con campioni standard a
contenuto noto utilizzati nello stesso saggio.
Al fine di mettere a punto un RIA necessario disporre di:
1. una proteina altamente purificata
2. un anticorpo specifico, preparato contro di essa
Proteina purificata
necessaria sia per la preparazione dellanticorpo sia per la successiva marcatura isotopica.
La quantit maggiore di proteina purificata necessaria per la preparazione dellanticorpo.
Utilizzando tecniche tradizionali sono necessari circa 100-150 g di proteina anche se recentemente
sono stati individuati diversi artifici per ridurre queste quantit. La marcatura isotopica richiede
invece solo pochi g di proteina, anche se il relativo tracer si degrada rapidamente ed essa va
ripetuta circa ogni due settimane. La purezza richiesta elevata: approssimativamente un preparato
proteico pu ritenersi idoneo allimpiego in un RIA quando il suo frazionamento mediante SDSPAGE e la successiva colorazione del gel di poliacrilamide mediante Coomassie blue d luogo ad
una singola banda elettroforetica.
Anticorpo.
Al fine di evitare risultati non corretti essenziale che lanticorpo a disposizione sia altamente
specifico per lantigene che si desidera dosare. Sia anticorpi policlonali che monoclonali possono
essere impiegati per la messa a punto di RIA. In generale gli anticorpi policlonali tendono a dare
risultati caratterizzati da maggiore sensibilit ma minore specificit rispetto ai monoclonali. Inoltre
gli anticorpi monoclonali possono essere preparati praticamente in quantit illimitata, mentre la
quantit di antisiero ottenibile dopo unimmunizzazione limitata ed inoltre dipende dalla specie
animale impiegata.

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Marcatura isotopica dellantigene


La marcatura isotopica della proteina purificata consente di ottenere il tracer, ovvero
lantigene marcato che viene aggiunto in quantit costante in tutti i tubi di un radioimmunoassay.
Diversi isotopi radioattivi sono impiegati, tra cui 125I che consente di ottenere tracer di elevata
attivit specifica, ovvero elevata radioattivit per unit di peso di proteina.
La iodinazione di una proteina con iodio libero implica il rischio di contaminazione
delloperatore, con conseguenze gravi soprattutto per la tiroide in cui esso si concentra gi dopo
poche ore. Pertanto sono state messe a punto tecniche di iodinazione alternative che evitassero
limpiego dello iodio allo stato libero. Tra queste una delle pi diffuse la tecnica di Bolton-Hunter
(Bolton AE and Hunter WM. Biochem J 133:529-539; 1973). Il reagente di Bolton Hunter (BHR)
ha la seguente struttura molecolare:
Modalit duso
Esso disponibile commercialmente presso diverse fonti tra cui NEN, Amersham etc. da cui
viene fornito in forma di soluzione benzenica contenuta in una vial speciale. Il reagente pu essere
conservato alla temperatura di 4C e non congelato sino a tre settimane dalla data di produzione.
Qualsiasi manipolazione del reagente va condotta sotto unapposita cappa ventilata ispezionata dai
responsabili della sicurezza dei laboratori.
1. Essiccamento. Immediatamente prima delluso la soluzione benzenica deve essere portata a
secco utilizzando un leggero flusso di azoto. Una trappola contenente carbone attivo viene
generalmente fornita dal produttore per raccogliere eventuali tracce di iodio radioattivo libero che
potrebbe liberarsi durante questo passaggio.
2. Coniugazione della proteina con il reagente. Circa 5 g di proteina altamente purificata
sono dissolti in 0.1 M sodio borato pH 8.5 a 22C, e aggiunti alla vial gi portata a secco, e la
reazione lasciata procedere per circa 15 min a 0C. La reazione interrotta mediante laggiunta di
0.5 ml di glicina 0.2M nel tampone borato.
3. Separazione della proteina marcata dal reagente libero. Pu essere ottenuta mediante
cromatografia a gel permeazione su Sephadex (G10-G200 a seconda del peso molecolare della
proteina da marcare). si consiglia di aggiungere gelatina (0.2%) al tampone di eluizione per
prevenire il legame non specifico della proteina al Sephadex. Albumina non consigliata in quanto
tende ad assorbire il reagente BHR
Messa a punto del RIA
Tracer. Deve essere aggiunto in quantit tale da essere sempre in notevole eccesso rispetto
allantigene non marcato da dosare, in modo da ridurre fortemente lerrore dovuto alle piccole
variazioni sulla quantit aggiunta. Normalmente si usa aggiungere il tracer in quantit pari a 10000
conte per minuto (cpm) per tubo.
La sua attivit specifica, ovvero la radioattivit dellunit di sostanza in peso, deve essere
elevata. A tale scopo lisotopo pi comunemente utilizzato e 125I ( vita media 60 giorni).
Titolazione dellanticorpo. Stabilit la quantit di tracer da utilizzare in ciascun tubo,
necessario stabilire la quantit di antisiero da usare. Questa dipende dal titolo dellantisiero, ovvero
dalla concentrazione delle immunoglobuline reattive verso lantigene in esame e dalla loro affinit
per esso. Per la titolazione dellantisiero sufficiente incubare una quantit fissa di tracer con
quantit costanti di antisiero diluito in maniera successiva. Il titolo sar dato da quella diluizione in
grado di legare 1l 50% del tracer. In pratica poi per il RIA bene utilizzare quella diluizione che
fornisce 1l 30% di legame del tracer (binding).
Interferenze non specifiche nei RIA. La reazione antigene-anticorpo pu essere inibita da
numerosi fattori in grado di distruggere i reagenti o ridurre la loro affinit reciproca. Tra esse

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menzioniamo, alcune proteine, alcuni enzimi, alcuni sali, anticoagulanti quali eparina, agenti
batteriostatici quali il timerosale, inibitori enzimatici quali aprotinina.
La reazione antigene-anticorpo dipende dal pH del tampone ed generalmente inibita ai
valori estremi. In genere essa indipendente dal pH nell'intervallo 6.5-8.5.
Criteri da seguire per limpiego sicuro dello 125I
Limpiego di piccole quantit di 125I (alcuni mCurie) pu essere condotto senza particolari
rischi a patto di seguire alcune norme fondamentali che raccomandano di:
1. designare un locale apposito (HOT ROOM) in cui condurre la iodinazione proteica che
prevede limpiego di alcuni mCurie di 125I. La successiva preparazione del RIA prevede limpiego
di proteine marcate (tracer) la cui pericolosit di gran lunga inferiore al reagente impiegato per la
iodinazione. Pertanto essa pu avvenire in laboratorio a patto di prestare particolare attenzione per
evitare la contaminazione di banconi, pipette, centrifughe, etc.
Laccesso alla HOT ROOM deve essere strettamente controllato ed essa deve essere
sottoposta a monitoraggio periodico per individuare tempestivamente eventuali contaminazioni.
2. nel corso della iodinazione utilizzare quando possibile materiali usa e getta. Inoltre bene
ricoprire il piano della cappa ed il pavimento con materiale assorbente che possa essere eliminato
facilmente in caso di contaminazione accidentale.
3. la HOT ROOM deve essere provvista di una cappa speciale per lesecuzione della
iodinazione, provvista di trappola al carbone attivo per ridurre la contaminazione ambientale