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Il complesso fenantolina rame I invece necessità di una iniziare ossidazione in CuIII da parte del
perossido di idrogeno attivandosi e determinando una serie di reazione che porteranno anch'esse al
taglio del DNA. N.B la professoressa non vuole che le impariamo,ma si accontenta se siamo in
grado di discutere la slide a lezione in particolar modo concentrandoci sulle prime reazioni) N.B vi
faccio anche notare come la reazione preveda in ultima istanza gli stessi intermedi visti nella
reattività del DNA del metodo di maxam e gilbert.
L'EDTA FeII ha il medesimo meccanismo del MPEII, ma non necessità dell'intercalazione;
intercalazione che potrebbe essere impedita da particolari elementi di disavvolgimento nel DNA.
Concluderei dicendo che il migliore è sicuramente il complesso EDTA FEII (considerazione mia).
Gli ultimi 3 reattivi sono i meno utilizzati.Il DEPC ha una debole attività di cleveage per il DNA di
tipo B, mentre questa attività si manifesta intensamente quando ci troviamo a trattare DNA
polimorfico di tipo Z. Il permanganato di potassio e il tetrossiodo di Osmio (entrambi ossidanti)
richiedono delle condizioni di reazione molto estreme che possono denatura il DNA, cosa
assolutamente da evitare sia qualora eseguissimo il footprinting per protezione. La professoressa
dice che quest'ultimi due non possone essere adoperati per quello d'interferenza.
Finora abbiamo visto due tipologie di sonde, quelle enzimatiche e quelle che prevedono la
formazione di radicali ossidrilici in grado di bersagliare lo zucchero.
Tratteremo adesso di due sonde specifiche per l'interazione con i fosfati: la etilnitrosourea e lo ione
uranilico. Entrambi con i meccanismi proposti nella slide determinano la scissione del legame
fosfodiestereo.
Per le basi azotate possiamo usare agenti metilanti del tipo DMS, quest'ultimo è in grado di metilare
N7 e N3 di Adenina e Guanina determinando come vedete in figura la modifica del pattern di
legame a livello del solco maggiore e del solco minore. Queste tipologie di sonde possono essere
adoperate sia per l'interferenza che per la protezione. Per portare l'esempio della protezione, il fatto
che N7 non venga metilato e successivamente scisso grazie all'azione della piperidina non dipende
necessariamente da un contatto diretto, ma dal possibile ingombro sterico.
(La prof ha ripetuto 3 volte questo concetto...fateci molta attenzione ;-) ).
Le reazioni successive che adoperano rispettivamente acido formico e idrazina (ricordate Maxam e
gilbert) per generare un sito apurinico e un sito apirimidinico ureidico possono essere adoperati per
evidenziare la presenza di contatti a livello del solco minore o maggiore per quelle tipologie di basi.
N.B se notate rispetto a maxam e gilbert non eseguiamo la seconda tappa cioè il trattamento con la
base piperidina che mi determina lo strand breakeage.
Tutte i reattivi/ sonde finora analizzate hanno il limite di non essere informativi per quanto rigurda
la Timina.
Se vi ricordate la coppia A-T nel pattern di legame del solco maggiore presenta un CH3
fondamentale per interazioni idrofobiche con a.a del tipo ala,val ecc... Per risolvere queste
problematiche è possibile introdurre un'ultima tecnica molto simile alla NAIM che fa utilizzo di
analoghi tiotrifosfatiribonucleotidi.
La differenza con la Naim e che non eseguire il saggio funzionale, ma sfrutteremo l'incidenza
dell'analogo di incidere sul legame della proteina determinando quindi Interferenza.
La procedura consiste quindi nel partire come al solito con un primer marcato radioattivamente (vi
ricordo come la DNA pol. necessiti un'estremità 3'OH libera). Successivamente si sfrutta un
filamento come stampo per sintetizzare il dsDNA inserendo grazie a polimerasi modificate
nucleotidi tiotrifosfato (se non ricordate il motivo per il quale si usano nucleotidi tiotrifosfato vedete
la lezione della NAIM). A quel punto, come nel caso del footprinting d'interferenza, da una parte
scindiamo il DNA per farlo correre e adoperarlo come controllo (Lane 1).
Analogamente prendiamo un'aliquota del dsDNA prima di scinderlo e lo incubiamo con la nostra
proteina d'interesse.Selezionando il dsDNA tra legato e non, scindendolo e infine separandolo
sfruttando la corsa elettroforetica avremo delle informazioni ben più dettagliate rispetto al
footprinting per interferenza.
La prof nell'ultima slide proposta al corso ci fa degli esempio tra gli analoghi nucleotidici riportati
nell'immagine successiva. Vale lo stesso discorso fatto per la tecnica NAIM e le interazioni deboli.