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Dosaggi Enzimatici

Attività specifica: quantità di enzima in rapporto alle proteine totali,


ossia quanta esochinasi c’è rispetto al contenuto totale di proteine.

AS = unità totali enzima/quantità totale proteine




Quindi si opero delle diluizioni, il rapporto non cambia perchè diluisco
anche le proteine totali, è un rapporto che mi da il termine reale di en-
zima.

Indice di purificazione: attività specifica rispetto alla preparazione


originaria. Con le purificazioni diventa un numero molto grande in quanto
il denominatore è piccolo; la utilizzo per sapere quante volte ho purifi-
cato la mia proteina.

IP = attività specifica della frazione/attività preparato originale

Resa: unità enzimatica della frazione/unità enzimatiche della pr. origin.

Un enzima viene misurato attraverso l’unità internazionale di enzima


(UI), ossia la quantità di enzima capace di trasformare una micromole di
substrato in un minuto a 25 gradi.

METODI DI DOSAGGIO ENZIMATICO

Per diagnosticare un enzimopatia devo diagnosticare la presenza o l’as-


senza di un enzima, inoltre gli enzimi sono un mezzo diagnostico ossia la
loro presenza in liquidi biologici sono la prova di alcune patologie.

Per esempio i marker di un infarto miocardico sono tre enzimi: fosfocre-


atinchinasi, lattato-deidrogenasi, aspartato-transaminasi che compaiono
nel plasma. La troponina-i e -t sono due proteine che compaiono nel plas-
ma esclusivamente in successione all’atto miocardico, quindi se abbiamo
degli anticorpi capaci di legare la troponina e formare il complesso
antigene anticorpo, siamo capaci di identificarla.

S+E = ES = P+E - schema generale di una reazione biochimica

Se chiudiamo un enzima in provetta, la possibilità che abbiamo di vederlo


e dosarlo è farlo lavorare, quindi dobbiamo dargli tutti gli strumenti
necessari affinché lui possa lavorare in un ambiente ideale.

Per dosare un enzima dobbiamo conoscere:

- stechiometria della reazione a cui partecipa


- presenza di cofattori (ioni metallici o coenzimi)

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- km substrato o cofattore: se mi sposto come concentrazione o al di sot-
to o al di sopra della km ho che la concentrazione di substrato in-
fluisce sulla velocità.

Per portarmi nella zona dove la velocità è funzione solo dell’enzima,
devo inserire una concentrazione di substrato almeno dieci volte mag-
giore la sua km. Infatti a concentrazioni inferiori di substrato la ve-
locità dipende anche dalla sua concentrazione; è funzione non solo del-
l’enzima.

- pH ottimale, aggiungendo un tampone.


- temperatura ottimale, solitamente 25/30°, essendo una proteina, dove le
condizioni sono ottimali per l’enzima e lui riesce a dare la massima
attività. Allontanandoci dalla temperatura ottimale si vanno, per esem-
pio, a rompere i legami idrogeno, quelli che mi determinano la strut-
tura 3d e quindi l’attività.

- disponibilità di un metodo analitico per misurare la scomparta di sub-


strato o la comparsa di prodotto, valutando quindi l’attività enzimati-
ca.

I dosaggi enzimatici si basano sulla misura in condizioni controllate


della velocità di consumo del substrato o della velocità di formazione
del prodotto. I dosaggi possono essere di tipo:

- continuo, o cinetici, cioè posso osservare in contemporanea il lavoro


che svolge l’enzima, che nel caso specifico è un pennino che si muove
in una carta;

- discontinuo ossia faccio lavorare l’enzima e ad intervalli temporali


controllo l’andamento dell’attività.

Nel caso in cui ci sia un enzima in bassa quantità ma sufficiente per


svolgere il suo compito, non posso lavorare in continuo perchè ci sono
delle variazioni minime; dovrò quindi operare in modo discontinuo.

Per poter osservare le variazioni di prodotto o substrato vengono utiliz-


zati dei metodi analitici che sono:

1. spettrofotometrici nel VIS e UV

2. spettrofluorimetrici

3. in luminescenza

4. radioisotopici, utilizzo di un isotopo instabile come substrato.

5. immunochimici

6. ecc.

Scendendo dall’alto verso il basso, la tecnica si complica ma aumenta la


sensibilità. Passo dall’1 ai successivi nel caso in cui le prime tecniche
non siano sensibili a quella determinata attività enzimatica.


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Spettrofotometro

E’ costituito da una sorgente luminosa monocromatica (con un monocroma-


tore è possibile individuare la lunghezza d’onda opportuna) che attraver-
sa una soluzione in cui le proteine, o il prodotto o il substrato, assor-
bono. La quantità di assorbimento è poi letta da un rivelatore.

Lambert beer: correlazione tra concentrazione e assorbimento.

Tuttavia in una reazione enzimatica la chimica dei prodotti e reagenti


non viene stravolta, abbiamo bisogno dei metodi sensibili che ci permet-
tono di discriminare tra prodotto e substrato.

Es: glucosio+ATP —esochinasi-> G6-fosfato+ADP

Se il glucosio assorbe alla stessa lunghezza d’onda del glucosio 6 fosfa-


to, la riduzione del reagente e l’aumento del prodotto non è registrato.
Come posso fare?

Partendo dal maltosio (glucosio+glucosio), invece di 2 glucosio metto di
sintesi il para-nitrofenolo che inganna la maltasi (scinde g+g): va ad
occupare il sito attivo del maltosio (soluzione incolore) e viene scisso
formando glucosio + para-nitrofenolo; la soluzione diventa gialla.

Quindi se la soluzione si colora di giallo so che c’è la maltasi.

Tuttavia non posso ancora discriminare g e g6f ma scopro che se faccio


una scansione della molecola NAD, sottoponendola ad un assorbimento al
variare della lunghezza d’onda, il NAD e NADP hanno il massimo di assor-
bimento a 260nm. La forma ridotta invece, NADH o NADPH hanno un assorbi-
mento a 340nm. Quindi se in una reazione il NAD diventa NADH lo riesco a
vedere.

Quindi: nella provetta ho aggiunto glucosio, atp, temperatura ottimale


etc, se c’è l’esochinasi si forma glucosio6 fosfato e adp. A questo punto
aggiungo io la glucosio 6P diedrogenasi che per lavorare ha bisogno del
NADP; si forma quindi fosfo 6 gluconolattone e nadph.

Se ho fissato la lunghezza d’onda a 340nm aumenta l’assorbimento perchè
si è formato NADH.

**Utilizzando le reazioni accoppiate posso anche dosare i metaboliti,


come nel caso del glucoso, inserendo tutti i reagenti e i prodotti,
tranne il glucoso; in base a quando nadh prodotto so quanto glucoso era
presente. Per esempio ho il siero e voglio sapere quanto glucosio c’è.
Preparo in cuvetta quindi una soluzione che contiene ATP, MgCl2 e aggiun-
go io l’esochinasi, la G6P DH e il NADPH; per cui sfruttando il lavoro
dell’enzima ottengo la riduzione del NADP a NADPH e quanto ne ottengo
dipende dalla quantità di glucosio che c’era.

Es. 2: devo dosare la fosfofruttochinasi

fruttosio-6P + ATP + Mg -PFK-> fruttosio 1,6-bifosfato

Non riesco a discriminarli, quindi aggiungo al sistema l’aldolasi:

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fruttosio 1,6 bifosfato -aldolasi-> gliceraldeide 3P + diidrossiaceton-P

Non ho risolto il problema. Allora aggiungo la gliceraldeide 3P deidroge-


nasi che forma 1,3 difosfoglicerato ed è NAD dipendente; il NAD diventa
NADH; l’assorbimento a 340nm aumenta quindi c’è fosforouttochinasi.

Es. 3: Dosaggio piruvato cinasi; è uno degli enzimi causa di enzimopatie;


il suo disagio è semplice:

fosfoenolpiruvato + ADP -PK+Mg/K-> Piruvato + ATP

Piruvato + NADH + H+ -lattato DH-> Lattato + NAD+

In questo caso la concentrazione di NADH diminuisce all’avanzare della


reazione, quindi l’assorbimento a 340 nm diminuisce.

Le reazioni accoppiate prevedono in genere una deidrogenasi. Ce ne sono


di diverse tra cui quelle NAD dipendenti, NADP dipendenti oppure NAD/NADP
dipendente.

Con uno spettro fotometro sono quindi capace di dosare i carboidrati e


metaboliti del glucosio, azoto non proteico, urea, acido urico…

Esistono però delle situazioni che non consentono concentrazioni di


prodotto tale da non essere rilevata d uno spettrofotometro, dovuto al-
l’esiguità dell’enzima che li produce o della reazione di partenza. Oc-
corre uno strumento più sensibile, come uno spettrofluorimetro.

Spettrofluorimetro

E’ costituito da una sorgente di raggi X (lampada di mercurio) che irra-


dia una civetta contenente il campione, dove tra i costituenti c’è uno
che colpito dal raggio emette una fluorescenza ad una lunghezza d’onda
diversa dal raggio incidente. Basta poi selezionare con un monocromatore
la lunghezza d’onda attesa dal rivelatore.

E’ uno strumento molto sensibile;

- sono fluorescenti al NADH e NADPH, sono quindi utili per reazioni ac-
coppiate.

- E’ utile per composti a basse concentrazioni, siamo in un caso in cui


il NADH e NADPH si formano, è quindi presente l’enzima ma a concen-
trazioni troppo basse per essere rilevate da uno spettrofotometro

- Possiamo utilizzarlo per dosare le vitamine, NADH, NADPH, pesticidi,


colesterolo, ….

Anche in questo caso vale la lambert beer, ossia la fluorescenza è diret-


tamente proporzionale alla concentrazione.

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Confrontando la spettrofotometria con la spettrofluorimetria, nella prima
la quantità minima richiesta sono 100ng, la seconda 100pg (10-9), c’è una
sensibilità 1000 volte superiore.

Fattori che influiscono sull’analisi sono la temperatura, molto di più


rispetto al primo, la polarità del solvente, lo smorzamento o quenching
(il raggio che deve attraversare il campione è smorzato da altre mole-
cole, interferendo con la lettura).

E’ opportuno che le concentrazioni siano basse, quindi, in quando ci sono


poche molecole, poche collisioni: il raggio arriva pulito al rivelatore
dov’è quantizzato.

Il sistema lavoro può essere inoltre interferito da sostanze che sono


naturalmente fluorescenti come i detersivi, grasso, carta da filtro, al-
cuni tessuti. Per cui è un sistema che necessita di opportune condizioni
affinché lavori nel modo opportuno e corretto.

Spettrofluorimetria utile per:

- dosaggi enzimatici e studi di cinetica (voglio vedere come lavora l’en-


zima, variando il substrato, il cofattore, etc)

- struttura delle proteine, verificando la presenza del triptofano e co-


fattori (es FAD); in assenza di composti fluorescenti posso aggiungere
sonde fluorescenti che vanno a legare la struttura (esempio: il legame
e il rilascio di cofattori, inibitori, substrati, etc, in siti vicino
alla sonda modificano lo spettro di fluorescenza), come la fluores-
ceina, il danzil cloruro… Sono quindi utili per studi modificazioni
conformazionali, denaturazioni…

Possiamo quindi usare la fluorescenza per dosare aa come Fnl, Tyr; cari-
oni; ormoni e metaboliti; lipidi; enzimi…

Luminometria

Deve misurare la luce emessa. Si introduce in una cuvetta, protetta dalla


luce, una miscela di reazione. La mia soluzione produce luce che colpisce
il fotomoltiplicatore, questo, grazie alle sue lastre, converte l’inten-
sità luminosa in intensità elettrica (emette elettroni).

Abbiamo due sistemi di luciferasi, quella da lucciola e quella batterica.


Nel primo caso doso l’ATP (ATP se c’è l’enzima diventa ADP, cala ATP),
nel secondo caso NADH, NADPH e FMNH. Possono quindi essere parametri imp-
iegati in dosaggi enzimatici e rilevati da un luminometro.

Metodi di luminescenza, caratteristiche:

- alta sensibilità

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- luciferasi di lucciola: 

Luciferina + ATP + O2 -(luciferasi lucciola)-> ossiluciferasi + AMP +
Pirofosfato + LUCE(posso misurarla).

- luciferasi batterica: 

malato + NAD+ -(malatodeidrogenasi)-> ossalacetato + NADH

NADH + H+ + FMN -(oxreduttasi)-> FMNH2 + NAD+

FMNH2 + RCHO + O2 -(luciferasi batterica)-> FMN + RCOOH + H2O + LUCE.

(flavin mononucleotide ridotto + aldeide) (ossidato + ac.carboss.)

metodi radioisotopici

Nel caso del dosaggio della galattosio chinasi, si utilizza del galatto-
sio che contiene nel carbonio 1 il C14 che emette particelle beta.

*Gal + ATP -(GalK)-> *Gal1P + ADP

Il decadimento del C14 è molto lungo, ca 4500 anni. Devo avere uno stru-
mento capace di dosare le particelle 𝛽 emesse.

C’è un sistema: scintillazione liquida. Cioè quando arrivano le parti-


celle 𝛽 il liquido scintilla, emette dell’energia luminosa (fotomoltipli-
catore); l’energia luminosa è proporzionale alla quantità di particelle
emesse.

Quindi: aggiungo galattosio marcato 100 di reattività; faccio lavorare la


GK. Dopo 30 min blocco la reazione, quanto sarà la reattività?

Sarà sempre 100 perchè intanto si è formato il gal1P marcato.

Dovrò quindi cercare di allontanare prodotti e reagenti in modo da capere


la quantità di Gal consumato e di Gal1P prodotto.

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Dosaggio di proteine
Per dosaggio di proteine intendiamo farci una misura relativa non posso
pesare in termini quantitativi le proteine.

Per esempio posso usare la BSA (albumina), facilmente ricavabile in forma


pura, facendo una serie di concentrazioni di albumina e guardi come
risponde il metodo. Faccio poi una curva di taratura per conoscere il nu-
mero totale di proteine.

Relativa quindi perchè devo usare una curva di taratura di una proteina
standard.

Metodi analitici per il dosaggio proteico:

- assorbimento della luce ultravioletta


- metodo di lowry (derivazione, l’aa invisibile diventa visibile, si for-
ma un derivato amminoacidico)

- metodo del Biureto


- metodo con blu di Comassie (saggio di Bradford)
- metodo silver-binding
- analisi di kjedahl
- metodi turbinometrici.

Assorbimento UV

L’assorbimento a 280 nm è dovuto alla tirosina e al triptofano, aa aro-


matici. Poiché ogni proteina ha una diversa quantità di questi aa, ogni
proteina ha un suo assorbimento caratteristico e possiamo, in maniera ap-
prossimativa, conoscere la quantità di proteine.

La sensibilità è fino 10 ng/ml.

Possiamo avere delle interferenze data dalla presenza di acidi nucleici,


che assorbono a 260nm.

Il vantaggio di questo metodo è che non è distruttivo e permette la mis-


urazione in continuo.

Metodo di Lowry

Metodo più diffuso di dosaggio. Utilizzare una miscela di composti chimi-


ci (solfato di rame, fosfato, molibdato). 

Il gruppo fenolico delle tirosine reagiscono con il reattivo, sviluppando
una colorazione blu porpora (massimo assorbimento a 660 nm).

L’intensità di colore che si sviluppa è un indice del contenuto totale di
proteine.
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La sensibilità è 10mg/ml.

E’ il metodo più diffuso, anche se abbiamo delle possibili interferenze


(tris, hepes, edta)

Metodo di Blu di Coomassie

Il colorante che si complessa alle proteine sviluppa un massimo assorbi-


mento a 595 nm.

Ha la caratteristica di essere semplice per la preparazione del reattivo,


sviluppo immediato del colore e stabilità del complesso.

E’ un po meno sensibile del precedente, 22mg/ml.

Il legame colorante proteine dipende dal contenuto di aa basici.

Metodo biureto

Soluzione di solfato di rame + tartrato potassio di sodio.

Gli ioni rammendi formano un complesso di coordinazione con 4-NH, svilup-


po di colore e assorbimento a 540-560 nm.

La sensibilità è bassa, 1 mg/ml per vedere le proteine.

Metodo silver-binding

si basa sulla capacità delle proteine di legare l’argento.

E’ estremamente sensibile (200 mg/ml) ma può subire interferenze da EDTA,


DTT che si possono allontanare con gel filtrazione.

Metodo di Kjeldahl

determina il contenuto di azoto in un qualsiasi composto. E’il metodo più


antico ma meno utilizzato. Solitamente si assume che il peso di N nelle
proteine sia il 16%.

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Enzimopatie
Il galattosio è uno dei primi composti che vengono utilizzati nel periodo
neonatale, costituente del lattosio, deve essere metabolizzato dalle cel-
lula. Si possono avere le galattosemie.

Il galattosio infatti deve essere convertito in glucosio 6 fosfato e si


impiegano 3 enzimi: galattochinasi, urini trasferìasi ed epimerasi; uno
di questi tre enzimi può essere difettoso e determinare enzimopatie.

Se il galattosio non viene metabolizzato resta all’interno della cellula


determinando tossicità: può subire un aldosoreduttasi e diventare galat-
titolo provocando cataratta, ossia opacizzazione della lente del
cristallino. L’unica terapia è sottrarre il galattosio dalla dieta.

In particolare: 

- carenza galattochinasi: galattosemia e galattosuria, il galattosio è
eliminato con l’urina;

- carenza uridiltrasferasi: danni epatici, ritardi mentali.

Anemie emolitiche enzimopeniche

Anemia: carenza globuli rossi

emolitica: parte dei globuli rossi si rompono, vanno in emolisi.

enzimopenica: la rottura è legata ad un enzima.

La carenza enzimatica può essere sia a livello della glicolisi anaerobia


che per lo shunt dei pentosi. La sopravvivenza del globulo rosso dipende
dalla integrità del suo apparato enzimatico, quindi dalla glicolisi
anaerobia e dallo shunt.

A causare anemie emolitiche enzimopeniche posso essere, le più importan-


ti, una deficienza-non produzione o cattiva sintesi-della piruvato chi-
nasi (glicolisi anaerobia) oppure di G6PDH (anemia emolitica acuta).

Oltre alla PK, tutti gli enzimi della glicolisi possono essere deficitari
(esochinasi, glucosio fosfato isomerasi, PFK, TPI, PGK, 2,3-DPGM…).

Nella via dello shunt dei pentosi (importante per la sintesi degli acidi
nucleici), i cui enzimi sono difesa dallo stress ossidativo, oltre alla
G6PDH può esservi anche un deficit di glutatione, glutatione reduttasi,
glutatione perossidasi, deidrgogenasi, etc.

Lo shunt dei pentosi è fondamentale per il glutadione, scudo per l’ossi-


dazione . Il glutadione è un tripeptide (glicina-cisteina-glutammato),
l’SH può ossidarsi legando due molecole di glutadione formando un ponte
disolfuro (2G-SH -> G-S-S-G). La quota di glutadione deve quindi sempre
essere presente per proteggere la cellula dallo stress ossidativo. Questa
sostanza è quindi di fondamentale importanza nel globulo rosso, che
trasporta ossigeno; il glutadione nella forma ossidata è ridotto grazie
al NADPH, che si ossida. Se non c’è il G6PDH non produco NADPH quindi non
posso ridurre il glutadione; lo stress ossidativo trasforma il Fe2+ in
Fe3+.

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Nella cellula devono esserci dei rapporti ottimali tra i vari metaboliti:
il rapporto GSH/GSSG deve essere 500/1, tutto quello che si forma deve
essere immediatamente riconvertito.

Nell’eritrocita il GSH mantiene l’Hb nello stato ridotto (Fe2+).

Eritrociti molto sensibili all’esaurimento del GSH:

- in RBC la via dei pentosi è la sola che produce NADPH


- nella carenza di G6PDH esiste un attività residua del 10%, capace di
mantenere la routine del globulo rosso, che determina, in condizioni
normali, una corretta difesa cellulare (asintomatici in assenza di
stress).

LA carenza di G6PD determina un anemia emolitica acuta, riscontrata nel


11% degli americani e in 160 milioni di africani. Questo perchè sono zone
dove è comune la malaria, associato al favismo per mezzo del NAPH. Ossia
la malaria, per svilupparsi, ha bisogno di NADPH, carente nel caso di un
enzimopatia G6PDH.

Nel caso del glicogeno, esistono malattie per ogni enzima deficiente, op-
pure anche per il metabolismo amminoacidico etc.

Un enzimopatia quindi può essere presente per ogni metabolismo, solo che
alcune sono più comuni.

Enzimi e diagnostica enzimatica

Siamo di fronte ad una patologia non legata alla carenza enzimatica, ma


una patologia diagnosticatile con il dosaggio enzimatico. In alcuni liq-
uidi biologici, cioè, la presenza di un enzima non è giustificata: un en-
zima è presente dove opera. La cellula infatti ha un sistema di controllo
dei suoi enzimi che spende per la vigilanza, per trattenere gli enzimi
all’interno della cellula; tuttavia qualche molecola sfugge. C’è però un
valore basale che non si può superare*.

La prima cosa che trovo del siero in seguito ad un infarto miocardico, è


la presenza della troponina (inibizione legame actina-miosina), che è la
prima che giunge nel sangue. Abbiamo poi anche la lattatodeidrogenasi,
aspartatoDH,…

La diagnostica enzimatica serve per:



- accertamento di lesioni e/o altre alterazioni della funzionalità
degli organi.

- diagnostica di alcune malattie metaboliche (enzimopatie più o meno
congenite).

Questi studi sono condotti su alcuni materiali biologici quali:



- siero (parte liquida del sangue priva di anticoagulanti)

- succhi digestivi

- emolizati di RBC

- feci


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- preparati di leucociti

- altri materiali.

Meccanismi responsabili delle variazioni dell’attività degli enzimi del


siero in condizioni patologiche: perchè posso diagnosticare la patologia?
Perchè in condizioni normali non è prevista nel siero la presenza di un
enzima; si vanno a ricercare degli enzimi che normalmente non ci sono in
condizioni fisiologiche.

Gli enzimi possono aumentare per:



- aumento della mobilizzazione degli enzimi cellulari

- incremento della sintesi enzimatica in un organo

- fenomeni di induzione o riattivazione genica

- affezioni iperplastiche o neoplastiche (proliferazione abnorme di 

tessuto tumorale; aumenta l’apporto di enzimi perchè ci sono più
cellule

- diminuita escrezione urinaria (es. amilasi)

- necrosi cellulare: come nel caso del miocardio che comporta
l’escrezione di 3 enzimi: creatin fosfochinasi, lattato
diedrogenasi, aspartato transaminasi.

Distorsione o deviazione del quadro enzimatico sieroso, dipende:



- diversa localizzazione intracellulare

- diversa velocità di fuga

- diversa inattivazione extracellulare

- diversa eliminazione

* ogni enzima ha un tempo di comparsa serica diversa nella patologia.

Alcuni enzimi hanno una scarsa specificità, possono essere di diversi


tessuti. E’ possibile decifrare la provenienza sfruttando il concetto di
isoenzima ossia enzimi con la stessa funzione ma caratteristiche chimico-
fisiche diverse. Questo comporta una grave limitazione alla diagnosi enz-
imatica di una lesione e/o alterazione funzionale di un organo.

Esistono anche enzimi che sono organo specifici: epatici, miocarditi,


pancreatici, muscolari, prostatici, etc.

Se l’enzima, es lattato DH, ha diverse provenienze, come faccio a de-


cifrare?

La diversa provenienza focalizza anche diverse forme isoenzimatiche, che
presentano una diversa composizione AA, però non tale da alterare fun-
zionalità enzimatica ma tale da modificare la struttura elettrica: per
cui può essere identificato attraverso l’elettroforesi.

Enzimi organo-specifici
Aspartato transaminasi

E’ legato ai miticondri, tempi di fuga diversi quindi. E’ un enzima ubiq-


uitario perchè lo troviamo nel fegato, miocardio, muscolo scheletrico,
rene, cervello.

Aumenta nelle epatopatie e molte altre malattie.

Fraz. citoscheletrica = 60% - fraz. mitocondriale = 40%

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Enzima aspecifico. Aumenta in maniera fisiologica nei neonati, ma quando
l’aumento è eccessivo è legato, per esempio, ad infarto del miocardio
(III enzima che si muove nel tempo), nelle epatiti virali o nella necrosi
epatica da intossicazione.

Gli aumenti più consistenti sono maggiori nel caso di epatiti virali
rispetto all’infarto del miocardio, perchè dipende dalla quantità di tes-
suto interessato.

Aumenta nella cirrosi, metastasi epatiche.

Dosaggio: 

- ossalacetato e piruvato sono prodotti dall’alanina transaminasi

- ossalacetato diventa - liberando CO2 - piruvato

Aspartato + α-chetoglutarato -> glutammato + ossalacetato

- aggiungendo 2,4-difenilidrazina al piruvato si forma idrazine che


può reagire con la transaminasi. 

Se è presente enzima il colore diventa bruno.

Alanina transaminasi

Si trova nel citosol e in minima quantità nei mitocondri. E’ presente


fondamentalmente nel fegato, aumenta nelle epatopatie.

Fosfatasi alcalina

E’ presente in molti organi e tessuti: fegato, ossa, intestino, placenta,


reni. Ha numerosi isoenzimi per ogni organo.

Aumenta in maniera fisiologica durante l’accrescimento osseo e in gravi-
danza. In patologia l’aumento è associato ad epatopatie e malattie ossee.

* basica perchè allontana un gruppo fosforico in ambiente basico.

E’ un enzima aspecifico ubiquitario, non possiamo subito risalire al-


l’organo di provenienza. Anche qui ciò che ci aiuta sono le diversità aa
non determinati per la funzione biologica ma con diverse cariche in modo
da avere diverso comportamento in elettroforesi.

E’ presente nelle cellule dei dotti biliali, negli osteoclasti, mucosa
intestinale, placenta. Queste sono le possibili fonti di ALP.

Aumenta:

- fisiologicamente durante la gravidanza, accrescimento, negli anziani


l’isoenzima intestinale dopo i pasti

- in caso di iperattività osteoclastica (morbo di paget, iper-


paratiroidismo, avitaminosi D, metastasi osteoblastiche)

- ostruzione biliale
Il dosaggio degli isoenzimi ALP permette di identificare aumenti nel
siero di origine epatica, ossea, placentare, intestinale.

Fosfatasi acida

E’ un enzima ubiquitario: complesso di isoenzimi presenti: RBC, pias-


trine, prostata, ossa, fegato, milza, rene.

Aumenta nelle patologie prostatiche.
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Lattato DH

Enzima ubiquitario, presente in tanti organi: miocardio, RBC, reni,


milza, pancreas, tiroide, linfonodi, fegato, muscolo.

Aumenta nella necrosi o danneggiamento del tessuto; marcatamente con in-
farto del miocardio, anemie persiciose ed emolitiche, leucemie, distrofia
muscolare, neoplasie, epatopatie.

E' possibile trovarne 5 isoenzimi che hanno lo stesso lavoro e stessa ca-
pacità ma presentano piccole differenze nella composizione amminoacidica
che non influenzano l’enzima ma possono diventare dei ganci per differen-
ziare tra loro i diversi isoenzimi. Determinano piccole differenze elet-
triche che possono essere discriminati in elettroforesi.

Dosaggi:

Piruvato + NADH + H+ -LDH-> lattato + NAD+

è la reazione che permette la ricostituzione di nad affinché non si bloc-


chi la glicolisi.

Se dovessi costituire un sistema di dosaggio, anzitutto metto un tampone,


piruvato con concentrazione 10 volte la km e poi vado a vedere nel plasma
se è presente la LDH. Se è presente avrò la formazione di NAD quindi un
assorbimento decrescente. Se non c’è, l’assorbimento a 340nm resta
costante.

Le differenze elettriche degli isoenzimi fanno si che in un campo elet-


trico migrano con velocità leggermente diverse, in modo da distinguere 5
bande:

- LDH 5 fegato; 2-13% -

- LDH 4 ; 6-16%
- LDH 3 polmone; 18-30%
- LDH 2 polmone e miocardio; 28-40%
- LDH 1 miocardio; 18-33% +

Quindi se abbiamo un enzima ubiquitario il diverso organo di provenienza,


determina un isoenzima che riusciamo a distinguere.

In elettroforesi la migrazione non è visibile se non previa colorazione;


per il dosaggio si deposita sul gel il lattato e il NAD che, in presenza
di LDH forma piruvato e NADH.

Nella zona che determina la fine della migrazione, avendo depositato i
substrati della sua reazione, si formerà NADH, il quale:

NADH + sale di tetrazolio -> formazano + NAD

Sviluppo di colore; la quantità e la grandezza della banda ci identifica


la presenza di isoenzima.

Dai valori standard di isoenzima, in seguito a patologie, i valori cam-


biano.

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Creatin fosfochinasi

Quasi esclusivamente utilizzato nella diagnostica dell’infarto del mio-


cardio. Presente prevalentemente nel muscolo scheletrico, miocardio,
cervello. 

Ci sono 3 fome isoenzimatiche; l’enzima operativo è l’associazione di due
monomeri di provenienza muscolare e celebrale: MM, MB, BB.

gamma-glutamil-transpeptidasi (ɣ-GT)

E’ una glicoproteina legata alla membrana, responsabile della sintesi del


glutatione.

Aumenta fortemente negli alcolisti: l’etanolo induce un’elevata pro-
duzione da parte del fegato. Alcuni fenomeni che inducono danni ossida-
tivi portano ad un incremento delle gamma-GT: antiepilettici.

Amilasi

Ha molti isoenzimi; in circolo riscontiriamo le amilasi riconducibili a


due siti di provenienza: 30% epatico; 60% salivare; 10% fegato, ghiandole
sudoripare, muscoli, tessuto adiposo, polmoni.

Colinesterasi

Prodotto dal fegato; diminuisce quando è danneggiata la capacità di sin-


tesi epatica di proteine. 

Nella diagnosi di epatopatie è poco utile, in quanto se il fegato ha
problemi il livello si abbassa dopo la prima settimana di malattia.

Esistono delle forme diverse: normale e atipica; quella atipica non è in
grado di idrolizzare alcuni miorilassanti (es succinil colina) usati in
anestesia, determinando un apnea prolungata.

Comportamento degli enzimi



in condizioni patologiche
Enzimi del miocardio, in caso di infarto:

- Aspartato transaminasi

- lattato deidrogenasi

- creatinfosfatochinasi

Questi enzimi si muovono in modo diverso a livello plasmatico (siero) in


seguito all’infarto, secondo uno schema.

- tempo 0: evento doloroso


- 24 h: il primo enzima che compare è la CPK, che, essendo un supporto
energetico muscolare, in seguito all’infarto la sua concentrazione
plasmatica aumenta fino ad arrivare al massimo dopo 24h.

In contemporanea al raggiungimento della massima concentrazione, inizia
a muoversi l’AT

- 48 h: raggiunge il picco l’AT


- 4 gg: si inizia a muovere dopo 48h e raggiunge il suo massimo dopo 4 gg
la LDH.
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Abbiamo anche altri modi per evidenziare un infarto. La CK, dopo il suo
massimo, diminuisce fino a scomparire dopo 5gg. La stessa considerazione
è valida anche per l’AST e LDH. Nel caso in cui nel giro di 24 h ci sia
un secondo o terzo evento, il quadro si modifica per cui ci consente di
visualizzare la risposta farmacologica del soggetto.

Altri enzimi del muscolo:

ALDOLASI: la si dosa se si è alla ricerca di alcune miopatie, epatite


acuta, infarto miocardio e carcinoma metastatizzato.


CREATINFOSFOCHINASI: è preferibile il dosaggio di questo enzima rispetto


all’aldolasi perchè è più specifico nelle malattie del muscolo.

Enzimi dell’osso:

Nelle malattie dell’osso è utile il dosaggio della ALP. L’isoenzima osseo


viene sintetizzato dagli osteoclasti.

L’ALP è fisiologicamente elevata durante l’accrescimento e aumenta pato-


logicamente in tutte le situazioni in cui sia esaltata l’attività osteo-
clastica.

Aumenta in caso di: fratture, rachitismo, morbo di Paget, iper-


paratiroidismo, mieloma, metastasi ossee.

Enzimi del pancreas:

AMILASI: AMY, è un indice di patologia pancreatica e salivare; L’AMY


idrolizza amido e glicogeno rompendo i legami α 1-4 glicosidici.

E’ prodotta da pancreas, ghiandole salivari e tube di falloppio.

Aumenta nelle pancreatici acute e croniche; occlusione intestinale alta


con interessamento del pancreatico; coliche biliali; ulcera gastrica; ap-
pendice acuta; paraotiti.

Isoenzimi P (pancreatico) e S (salivare) possono quindi essere clinica-


mente utili.

Enzimi della prostata:

FOSFATASI ACIDA: prodotta anche nelle ossa, nel rene, nelle piastrine,
nello stomaco e nel fegato anche se non modificano notevolmente i loro
valori.

Vi è invece un notevole aumento in caso di carcinoma prostatico.

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Enzimi epatici:

Si verificano tre situazioni che possono identificare il tipo di patolo-


gia epatica:

1. di secrezione - si vuole vedere se il fegato lavora bene



- colinesterasi (CHE)

- fattori di coagulazione

2. di citolisi - avvelenamento con conseguente necrosi



- aspartato transaminasi

- alanina transaminasi

- lattato deidrogenasi

- ornitina-carbamil-trasferasi


3. di colostasi - ostruzione

- fosfatasi alcalina

- leucin-amino-peptidasi

- 5-nucleotidasi

- gamma-GT

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Metabolomica
Voglio valutare quali e quanti metaboliti ci sono nella cellula. Se nella
cellula non sono presenti enzimi blocco la sua situazione metabolica, la
sua attività cellulare. Se voglio vedere la quantità di metaboliti pre-
senti non devo fare altro che bloccare l’attività, devo produrre degli
estratti cellulari dove si lascia inalterata la quota di metaboliti: ATP,
NAD, etc.

Diversi metodi:

1. bollitura (poco limpido): le proteine si denaturano, perdono attività


e precipitano. Quello che resta in soluzione sono i metaboliti che ri-
mangono inalterati dalla bollitura.

2. aggiungo del tricloro acetico, precipita le proteine e la situazione


metabolica (buono quando i metaboliti vanno dosati allo spettrofo-
tometro).

3. aggiungo acido perclorico, ottima limpidezza ma produce un precipitato


nel quale restano intrappolati alcuni metaboliti; occorre quantificare
la quota di metaboliti che precipita. E’ utile per composti moderata-
mente acido-labili (ATP, ADP, AMP…); non utilizzabile per composti es-
tremamente acido labili (andicap di questo metodo) come NADPH-NADH o
facilmente ossidabili come GSH, altera la carica ossidoriduttiva.

4. idrossido di bario, zinco solfato, particolarmente utile per lo studio


degli zuccheri.

5. estrazione basica; in sostituzione dell’acido perclorico, non si forma


un precipitato, tutta la struttura cellulare è distrutta e le proteine
aggregate. Posso calcolare il rapporto NAD/NADH e NADP/NADPH. Dopo
centrifugazione che non permette il passaggio di proteine, ma di nu-
cleotidi e i metaboliti restano in soluzione. Successivamente si es-
egue un analisi di HPLC:


2ml sangue diluito con KCl + glucosio 5M

+ 2ml KOH 0,25N;

non si forma precipitato; deproteinizzo su Vortex (centrifuga); 5’ in
ghiaccio; neutralizzazione; analisi HPLC, alta qualità.


*HPLC fase inversa: In questa cromatografia abbiamo una fase
stazionaria apolare C18(di natura idrofobica non solubile in acqua) e
una fase mobile polare (di solito una miscela di acqua e
acetonitrile). Questa cromatografia permette di separare le proteine/
molecole in base alla polarità. L’eluizione si fa aumentando l’polar-
ità della F.M., al contrario di quella tradizionale dove si aumenta la
polarità della F.M.. E’ possibile discriminare ATP e ADP.

Per conoscere l’attività cellulare devo sapere la carica energetica:

[ATP] + 1/2 [ADP]



[ATP]+[ADP]+[AMP]

Devo quindi conoscere tutte le concentrazioni, anche di AMP.


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L’attività della cellula è condizionata da Ec, ossia dall’energia deter-
minata dall’ATP. C’è un punto di equilibrio, chiamato equilibrio metabol-
ico dove EC=0,9. Volevano vedere se questo valore si modifica con l’eta
dell’eritrocita.

I valori di NADH, NADPH, NAD, etc invece danno i valori dello stato redox
della cellula.

L’aspettativa era di ottenere i valori di ATP, ADP, AMP, NAD, NADP, etc
in un momento preciso, immortalarli.

L’interesse per lo stato energetico dell’eritrocita è giustificato dal
fatto che l’ATP assolve a tante funzioni, tutte fondamentali nella vital-
ità della cellula:

- modulatore glicolisi (unica via energetica)



- mantiene attività pompa Na/K

- mantiene la forma biconcava per la max superficie scambio

- metabolismo Ca

- mantiene la forma Fe2+, l’unica funzionale dell’Hb

Inoltre perchè le cose nel RBC funzionino ci deve essere un rapporto ben
definito tra ATP, ADP e AMP: 100 ATP, 10ADP, 1AMP. 

L’AMP è il punto di partenza per la degradazione dei nucleotidi adeninici


Per dosare l’ATP si utilizza la reazione dell’esochinasi.

glucosio + ATP -> glucosio 6P + ADP

Si legge attraverso la reazione accoppiata con NADP. 



Quindi metto il glucosio e non metto ATP, metto esochinasi e Mg; se c’è
l’ATP si formano i prodotti; quindi glucosio 6P DH e formo NADPH, che in
base alla sua quantità mi dice quanto ATP c’era.

Cosa cambia in un soggetto che fa attività fisica? 90 secondi di eser-


cizio al massimo livello a digiuno.

- acido lattico aumenta 20 volte


- globuli rossi
- grado di degradazione dei nucleotidi adeninici.

L’AMP oltre a significare una situazione di necessità di energia, mi da


una misura della scarsità di energia, infatti è un effettore positivo
glicolitico legandosi alla PFK. Ma l’AMP è anche il punto di partenza
della degradazione dei nucleotidi adeninici che porta a ipoxantina come
prodotto finale, e in certe cellule a xantina e acido urico.

Nei metodi precedenti non si poteva avere misura della degradazione dei
nucleotidi adeninici perchè AMP a ATP uscivano insieme.

Per risolvere questo problema, utilizzando la ion pair chromatography,
modificando la situazione ionica di ATP, AMP… aggiungendo tetrabutilammo-
nio modificando le molecole costituisce una coppia ionica. Cosa si ot-
tiene sono picchi ben distinti che discriminano AMP, il risultato è quel-
lo di ottenere tutti gli elementi che sono marcatori del degradamento nu-
cleotidico, anche xantina, ipoxantina.
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Elettroforesi
PROTEOMICA

Ci permette la visuale del proteoma, ossia identificare la qualità e
quantità delle proteine presenti. La grandezza delle “macchie” determina
al quantità della proteina.

L’elettroforesi è un metodo di separazione che si basa sulla migrazione


di particelle CARICHE sotto l’influenza di un campo elettrico. In questa
migrazione si separano le une dalle altre.

L’applicabilità in campo biologico si estende agli aa (al di sopra o al


di sotto del pi), nucleotidi, acidi nucleici. Questa presenza di cariche
sono la possibilità di applicare l’elettroforesi in ogni settore. Ad ogni
pH in soluzione queste molecole sono cationi, quindi migrano verso il
catodo, mentre se sono anioni, andranno verso l’anodo (+).

L’apparecchiatura è costituita da un alimentatore che fornisce corrente e


una cella elettroforetica dove avviene la migrazione. E’ possibile l’uti-
lizzo di un gel verticale o orizzontale; l’utilizzo nella cella dei gel è
stata la carta vincente per lo sviluppo di questa tecnologia.

Una molecola migra con una sua velocità di migrazione, una diversa dalle
altre. La velocità di migrazione è funzione di due parametri: la carica,
in maniera diretta, e al raggio, in maniera inversa. (Q/k・ɣ)

Per cui in elettroforesi il risultato lo possiamo ottenere se:



- la molecola è carica

- posso sfruttare la carica o la massa oppure posso giocare su
entrambe, ottenendo una tecnica molto efficiente 

(elettroforesi bidimensionale).

Se dipende dalla massa, significa che è presente attrito; questa funzione


è chiamata forza funzionale, dipende quindi dalle dimensioni idrodi-
namiche, forma della molecola, dimensione dei pori, viscosità del tam-
pone, PM. 

C’è bisogno della presenza di una tampone, che fa da strada dove possono
viaggiare le proteine, gli a. nucleici, AA, etc. Nell’ambito delle pro-
teine il gel più utilizzato è la poliacrilammide.

Quando si fa elettroforesi si applica una intensità di corrente a due


elettrodi, collegati per mezzo di un tampone che chiude il circuito. Il
problema da risolvere è la tempistica: maggiore intensità di corrente e
maggiore è la velocità di migrazione, però la potenza del sistema è dis-
sipata come calore che determina la formazione di bande (area occupata da
una molecola) meno definite e denaturazione delle proteine. Si deve quin-
di trovare un compromesso tra intensità e tempistica al fine di ottenere
una buona e ottimale separazione.

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L’aumento di 1°C produce un incremento del 2% nella velocità di mi-
grazione. Per oviare a questo problema è possibile dotare l’elettroforesi
di uno strumento refrigerante.

Il tampone, che chiude il circuito, nel ambito delle proteine mi risponde


a due esigenze:

- fornire ioni che si muovono tra anodo e catodo

- mantenimento delle proteine al di sopra o al di sotto del pi

Al punto isoelettrico il computo delle cariche positive e negative del


gruppo R è nullo; al di sotto è carica positivamente, al di sopra negati-
vamente.

I tamponi utilizzati sono tris, borato, acetato, fosfato, ossia tutti
tamponi utilizzabili in un ampio range pH. Sia il pH che la forza ionica
vanno ad incidere sulla velocità di migrazione, quindi sul risultato.

L’elettroforesti è stata ideata da Tiselus, che pensò di mettere degli


elettrodi interposti da un campo elettrico in una soluzione liquida; tut-
tavia utilizzando un ambiente fluido, la diffusione e le correnti ioniche
non garantivano un ottimale risultato. E’ stato però visto che utilizzan-
do una fase solida, le molecole migrano in maniera compatta e definita,
aumentando la risoluzione.

Si è passato quindi ad un supporto meccanico poroso, bagnato di tampone


che permette il passaggio delle cariche, permettevano risultati eccellen-
ti.

Quindi carta da filtro o lastrine a strato sottile di cellulosa o silice


o allumina. Un ottimo risultato si otteneva con aa, paptidi e car-
boidrati, molecole piccole.

Per le molecole più grandi, macromolecole, come proteine a acidi nucle-


ici, il supporto poroso non era idoneo. Si sono sviluppati quindi gels,
il primo è stato l’amido, oggi sono utilizzati agarosio (ac.nucleici) e
poliacrilammide (proteine). Un gel è un intermedio tra le caratteristiche
statiche di un solido e le caratteristiche di un liquido.

Un gel, si fa, in un opportuno contenitore, creando dei polimeri e poi


dei leganti trasversali (legami crociati). Per esempio ho gel di Amido,
Agaroso (biologia molecolare con a. nucleici), Poliacrilammide (usato
nelle proteine).

Per far si che il gel sia distribuito in maniera uniforme tra due lastre
di vetro, con spessore di 1-2mm, lo verso in forma ancora liquida tra le
lastre e lo gelifico successivamente.

Poliacrilammide

Nel caso del Poliacrilammide (PAGE), è costituita da lunghe catene di


acrilammide unite da bis-acrilammide. Aggiungo dei monomeri di acrilam-
mide che polimerizzano mediante una reazione di catalisi radicalica a
catena, grazie all’aggiunta di persolfato e temed che producono radicali
che scatenano una reazione a catena, finché non diventerà Poliacrilam-
mide, gel uniforme. Si può anche usare della riboflavina per la stessa

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ragione, in questo caso ho una fotopolimerizzazione per 2-3h (luce); la
riboflavina produce radicali liberi etc…

Con questo gel posso ottenere l’80% delle separazioni proteiche.

Un altro aspetto importante è la dimensione dei pori che, nel caso degli
acidi nucleici, per esempio, non ci permette la discriminazione. Si può
quindi costruire un sistema che sfrutti la capacità selettiva dimension-
ale del poro.

Variando la concentrazione di acrilammide e bisacrillamide, in partico-
lare abbassando la seconda aumento la dimensione dei pori.

A concentrazione 10%-20%, nell’ambito delle proteine, otteniamo una cel-
lula efficace.

Agaroso

Anche in questo caso dobbiamo ottenere la gelificazione. Il polimero è


una combinazione di galattosio e galattosio anidro. Se scaldo l’agaroso a
60-70° resta liquido, man mano che si raffredda si formano dei legami H
tra i vari polimeri, producendo la gelificazione.

Anche qui la concentrazione è misura della grandezza del poro: bassa con-
centrazione = pori grandi.

L’agaroso può essere utilizzato si nell’ambito di proteine che acidi nu-


cleici anche se nelle proteine è più utilizzato il PAGE.

Blotting

Con il gel io ottengo la separazione di proteine, quindi una zona che si


chiama banda elettroforetica che contiene la molecola di mio interesse.
Se voglio continuare a studiarla devo trasferirla in provetta -> Blot-
ting: trasferimento di una molecola da un gel ad un altro materiale.

- Western blotting: trasferimento di una proteina dal gel ad una matrice


dove la posso studiare;

- Southern blotting: trasferimento dal gel del dna in un altra matrice

- Northern: trasferimento dal gel del rna ad un altra matrice.


Le matrici utilizzate nel trasferimento sono: nitrocellulosa, nylon, PVDF
e devono avere: alta capacità di assorbimento per le proteine e bassa ca-
pacità di legare la sonda utilizzata nella fase di rivelazione.

Il trasferimento delle proteine avviene per: diffusione, elettroeluizione

SDS-PAGE
Nell’ambito di separazione di proteine la strategia più utilizzata è
quella che viene chiamata SDS-PAGE - sodio dodicilsolfato poliacrilammide
gel elettroforesi - sempre sulla base di piccole differenze di peso mole-
colare, di massa.

E’ più utilizzata nell’analisi quantitativa di proteine, usata negli step
di purificazione.

Serve anche per determinare la massa molecolare relativa.

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L’SDS è un detergente anionico, cioè una molecola che si lega alle pro-
teine in maniera specifica; una molecola di SDS ogni 2AA, ricoprendo in
maniera globale la proteina di questo mantello di cariche negative, an-
nullando le cariche proprie delle proteine. Migrano tutte verso l’anodo.

Le proteine vengono denaturate mediante battitura per 5’ in 𝛽-mercap-


toetanolo, un agente riducente. Si aggiunge nella soluzione che andremo a
sottoporre in un campo elettrico, blu di bromo-fenolo, che ci permette di
seguire visivamente lo scorrere delle molecole. E’ una macchia blu che va
dal catodo verso l’anodo; è un tracciante ionizzabile colorato.

Si preferisce che le molecole non siano libere di muoversi per cui si


blocca il movimento aggiungendo una soluzione più densa: glicerolo o sac-
carosio.

2 fasi nel gel:

-stacking gel: per impalcare le proteine in


una banda molto stretta.

I pori sono molto larghi (10% acrilammide).

Poi si aggiunge nella soluzione dove sono av-
volte tutte le proteine con SDS ioni cloruro
+ glicinato; questo perchè Cl- e glicinato,
sottoposti ad un campo elettrico, migrano da-
vanti e dietro la proteina, il glicinato da-
vanti e il cloruro dietro, pressando la pro-
teina.

- running gel: qui le proteine danno sfogo allo loro migrazione che sarà
in base al loro PM, quelle più piccole più veloce.

A corsa finita il gel viene colorato di blu di Coomassie per alcune ore,
colorando tutta la superficie del gel; si procede a decolorare in modo da
rimuovere il colorante e lasciarlo solo sulle proteine a cui si è legato.

A fine corsa vengono anche aggiunti acido acetico o metanolo, in questo


modo le proteine vengono precipitate e ancorate alla trama del gel.

* domanda: come posso determinare il PM? Se è quello relativo, attraverso


un gel filtrazione (crom. ad esclusione molecolare) o attraverso un
SDS.


Isoelettrofocalizzazione - IEF
La separazione avviene sulla base di un diverso punto isoelettrico.

PI= valore di pH proprio di ogni proteina, dove la carica a quel pH è


nulla. Porta cariche negative e positive uguali che si annullano; a quel
livello di pH non avremo migrazione, la proteina si ferma.

Determiniamo quindi nel gel tra i due elettrodi un gradiente di pH; le


proteine sono cariche, migrano, e quando incontrano un valore di pH=PI si
fermano.

E’ caratterizzato da una sensibilità molto alta: 0,01 unità pH.

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Sviluppo del gel

Acrilammide + bis-acrilammide, liquidi; se però aggiungo la riboflavina e


sottopongo a luce produce radicali e innesca una reazione a catena. I
monomeri di acrilammide diventano poliacrilammide e la bisacrilammide
lega i posti trasversali: gel.

Di solito in IEF si fa in un tubicino, alle cui estremità si collegano i


due elettrodi. Aggiungo degli infoliti, degli acidi poli-amminocar-
bossilici sinteticoi, i quali se sottoposti ad un campo elettrico si
dispongono nel tubicino determinando un gradiente di pH, una variazione
uniforme di pH.

A A+B B

Anodo + Catodo - 

pH 3 pH 4 pH 8


A pH 4 carico le due proteine A+B. A ha un PI=3 e B ha PI=8.

- A: con un PI 3 andrà verso l’anodo, la proteina ha un valore di pH mag-


giore del PI quindi carica negativa; a pH 3 si ferma

- B: con PI 8 andrà al catodo perchè è carica positivamente


Impiegano circa 2-3h le proteine a migrare.

Anche qui dopo la migrazione le proteine sono ancorate al gel con


metanolo e acido acetico e colorate con blu di Coomassie.

Uso sia per separazioni analitiche che quantitative.

Retta di calibrazione PI

Carico in parallelo un altro tubicino dove le proteine di cui conosco il


PI mi fanno da riferimento; determino il PI relaxivo.

Quindi, nel caso di tre proteine uguali, però mono/bi/tri fosforilate, in


SDS PAGE ottengo una sola banda perchè la differenza di PM è troppo es-
igua, in IEF invece ottengo 3 bande, alta risoluzione (è infatti usata
per separare isoenzimi).



Elettroforesi bidimensionale
Con questa strategia ottengo due separazioni:

- I dimensione: IEF, in base al PI


- II dimensione: SDS-PAGE, in base al PM.
Prendo il ubichino dove le proteine si sono disposte in base al PI e lo
immergo in una soluzione di SDS. La proteina perde così la sua carica e
si ricopre di un mantello negativo che migra verso l’anodo.
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L’abbinamento di queste due strategie mi separa tutte le proteine presen-
ti in un cellula: ottengo così il proteoma.

Può identificare 1.000-2.000 proteine presenti in una cellula, ma anche
fino a 10.000.

* Brilliant blu di Coomassie

0,1 % metanolo + H2= + acido acetico + colorante

Metanolo e acido acetico ancorano le proteine alla trama del gel. 



Si lascia il tutto 2h e tutto il colorante occupa la superficie del gel.
Decolorazione con acido + metanolo in agitazione, privo di colorante; il
colorante in questo modo la dove non è ancorato al gel lascia il gel e va
in soluzione; si ottengono delle macchie che sono le proteine.

* colorazione ad argento - Silver Stain

Utilizzo un sale d’argento che a contatto con le proteine si riduce ad


argento metallico, dando una macchia nera (Ag+ -> Ag0).

L’argento produce la macchia nella zona dove viene ridotto, non macchia
tutto il gel per cui non è necessaria una decolorazione.

Elettroforesi in condizioni native


Queste strategie ovviamente compromettono quella che è la funzione bio-
logica di una proteina. In condizioni native è usata ogni volta che è im-
portante conservare l’attività funzionale delle proteine.

Si usa solo gel PAGE.

Per la separazione si può sfruttare la diversa mobilità o il **** moleco-


lare. 

Non viene alterata la struttura tridimensionale di una proteina, non
viene alterata attraverso l’aggiunta di colorante la sua funzione biolog-
ica. Per andare ad identificare la proteina che poi voglio studiare, fac-
cio formare sul gel un secondo gel che è arricchito ad esempio - nel caso
di un enzima - dal suo substrato. L’identificazione avviene dopo in-
cubazione del gel con il substrato che sviluppa prodotto colorato.

Es. gel 1 poliacrilammide, gel 2 agarosio + substrato.

Pulsed fied gel elettroforesis


In questo sistema introduco una seconda variabile: la direzione del campo
elettrico. Nel campo elettrico è inserita la direzione di propagazione,
cioè intermezzo le due direzioni di migrazione in un senso e nell’altro.

Questa tecnica ci permette di separare molecole molto lunghe come cromo-


somi. Qui non parliamo di PM ma di kilobasi (1000 coppie di basi).

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Pulsed= campi elettrici con differenti angolazioni applicati in maniera
alternativa; 

- nel primo campo elettrico si ha uno stiramento lungo il piano orizzon-
tale, cioè le molecole si srotolano e iniziano a migrare; 

- nel secondo campo le molecole si devono adeguare alla direzione per cui
quelle più piccole ci metteranno meno tempo, rispetto a quelle più grandi

Quando parliamo di strategie di separazione per molecole estremamente


lunghe come gli acidi nucleici, i cromosomi, viene utilizzato agarosio.

Devono comunque essere sempre molecole cariche che si muovono in un campo


elettrico; la differenza DNA-proteine in questo caso è solo la dimen-
sione.

La carica di un frammento di acido nucleico è negativa in quanto prevale
la presenza dei fosfati con le cariche negative sull’ossigeno, migrano
per cui verso l’anodo.

La carica per unità di lunghezza è la stessa poichè ogni singolo frammen-
to di DNA contiene dei gruppi fosfati; la separazione in questo caso è
legata alla grandezza.

E’ un metodo estremamente sensibile, anche la differenza di una singola


base è discriminata.

Di solito gli a. nucleici vengono separati su un gel orizzontale immerso


in un tampone, poi viene colorato aggiungendo al gel il bromuro di etidio
cheti intercala tra le molecole e, se colpite a 300nm con una luce
monocromatica, emette fluorescenza.

Gli stessi metodi valgono anche per RNA.

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Immunologia
Studio della risposta immunitaria, cioè la difesa a disposizione dell’or-
ganismo per rispondere ad un elemento esterno che arriva a contatto:

- risposta umorale: anticorpi

- risposta mediata da cellule

Le tecniche immunochimiche, in particolare, utilizzano gli anticorpi
coinvolti nell’immunità umorale.

Antigene: molecola o composto chimico o organismo esterno, diverso da


quello in cui si va ad insinuare, che attiva una serie di allerte che de-
terminano la mobilizzazione linfocitaria. I linfociti si attivano a plas-
macellule che producono molecole chiamate anticorpi.

L’antigene (Ag) è quindi una molecola esterna che induce le produzione di
anticorpi, Ig (immunoglobulina - veicolati nel sangue) o Ab (antibody).

Il legame antigene-anticorpo produce precipitazione, neutralizzazione e


morte mediata da fagocitosi; meccanismi che permettono alla difesa immu-
nitaria di bloccare la tossicità o il possibile danno di un non self.

Le immunoglobuline Ig presentano 5 classi: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. 



L’organismo le produce a seconda dei casi, anche se le più prodotte sono
le IgE - 80%.

Le tecniche immunochimiche presentano estrema specificità, che diventa


ancora più estrema quando uso anticorpi monoclonali. Inoltre con antigeni
Ag e anticorpi Ig radioattivi ho specificità + sensibilità.

Il principio fondamentale delle tecniche immunochimiche è basato su uno


specifico antigene che si lega allo specifico anticorpo producendo il
complesso antigene-anticorpo che di per se è poco solubile o insolubile.

Le tecniche immunochimiche sono usate a scopo:

1. Analitico: posso utilizzare degli anticorpi che ho precedentemente


prodotto per andare a ricercare la presenza di un antigene; se trova
l’antigene si forma il complesso che precipita. Se non ho formazione
di precipitato l’antigene non è presente, è negativo.

2. Preparativo: utilizzo un anticorpi perchè mi serve l’antigene; l’anti-


corpo va a pescare l’antigene e produce il complesso che precipita.
Nel precipitato c’è l’antigene, la proteina di interesse. 

E’ necessaria poi la dissociazione del complesso per ottenere antigene
o anticorpo da soli. Quindi:


- se Ag-Ig è insolubile recupero il precipitato


- se Ag-Ig è poco solubile, l’antigene ha prodotto un anticorpo che
posso utilizzare iniettandolo in un altro animale, dove sarà antigene,
che produrrà un secondo anticorpo; con questa strategia posso aggiun-
gere nella soluzione il I anticorpo e il II che riconosce il I: questo
complesso è insolubile perchè il II anticorpo determina la precipi-
tazione. 

Un altra soluzione è quella di aggiungere proteine che incrementano la
risposta immunitaria.


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- dissociazione finale Ag-Ig: devo utilizzare condizioni meno denatu-
ranti possibili, non devo compromettere l’integrità delle molecole;
devo quindi evitare valori di pH molto bassi, alte concentrazioni di
urea.


Terminologia:


Clone -> famiglia di cellule che hanno identico patrimonio genetico; si
ottiene a partire da una singola cellula che in maniera asessuata per mi-
tosi diventa una colonia di cellule.


Linfocita B -> cellula che per esposizione a contatto con uno specifico
antigene Ag è stimolato a dividersi, a trasformarsi in plasmacellule, ca-
paci di produrre anticorpi che si combinano specificatamente con quel-
l’epitopo.


Epitopo -> o determinante antigenico, è un tratto dell’antigene che viene
studiato dai linfociti che si occuperanno di quel tratto producendo
specifici anticorpi che lo riconoscono.


Siero policlonare -> significa che dei linfociti ognuno ha costruito una
famiglia di cellule identiche e ognuno di questi cloni produce un anti-
corpo che riconosce un tratto; 1000 cloni producono 1000 diversi anticor-
pi che riconoscono la stessa molecola. Ogni clone ha prodotto un tipo di
anticorpo specifico di un epitopo ma alla fine tutti gli anticorpi ri-
conoscono la stessa proteina per intero.


Anticorpo monoclonare -> anticorpo derivato da un singolo clone, da una
singola cellula; la strategia è quella di isolare un linfocita che ha
studiato la proteina, portarlo a moltiplicarsi mantenendo quel tratto
come unica memoria e quel clone produrrà un anticorpo che riconosce quel
tratto.


Produzione di anticorpi policlonali

Ho la mia proteina “pura”, la inietto ad esempio in u coniglio. Nel


coniglio la proteina è riconosciuta come non self e vengono attivati i
meccanismi di protezione quindi produzione di anticorpi.

Così se prelevo il sangue del coniglio, faccio coagulare la parte corpus-
colare e ottengo un liquido chiamato siero che contiene gli anticorpi.

Tempi:

- iniezione tempo 0. 

- 10 gg, cominciano a comparire le Ig

- 20gg, presenza degli anticorpi -> siero policlonare.

Se al coniglio poi faccio una seconda iniezione dello stesso antigene ho


tempi molto più veloci perchè non è necessaria l’attivazione linfoci-
taria; gli anticorpi sono al massimo dopo soli 10gg (ris. imm. II).

Se poi faccio ulteriori iniezioni diventa super immune, una fabbrica di


anticorpi contro la mia proteina.


27
Problemi: la proteina che ho iniettato non sveglia in maniera efficace il
sistema immunitario. Per composti debolmente antigenici, cioè che danno
bassa risposta anticorporale:


1. aggiunta di un coadiuvante, cioè qualcosa che stimoli il SI


2. aumento il tempo di esposizione, iniettando l’antigene sotto forma di
precipitato per cui viene a disciogliersi nell’organismo ospite in tempo
più lunghi. In particolare inietto una soluzione del mio antigene a cui è
stato aggiunto del solfato di Al o del solfato di K che precipitano la
proteina nella sede di iniezione.


3. aumento il numero di ulteriori iniezioni


4. si interviene sulla suscettibilità dell’animale verso l’estraneo ag-
giungendo della paraffina o un batterio della tubercolosi, inattivato al
calore, introduco cioè qualcosa che allerta la RI

Produzione di anticorpi monoclonali

Prendo un linfocita B, prima lo metto a contatto con l’antigene e poi lo


faccio crescere. Tuttavia un linfocita b in vitro sopravvive solo per
poche ore mentre le cellule di mieloma sono immortali in vitro.

Si potrebbe assemblare un linfocita con una cellula di mieloma. “Soprav-


vivenza” significa ricostituire per mitosi cellule figlie identiche, dan-
do tutti i costituenti per sopravvivere.

Ci sono due strategie per sintetizzare il DNA per distribuirlo nelle cel-
lule figlie:

1. De novo: cioè partire da basi puridiniche, piridiniche, deossiriposio


e fosfato inorganico ed essere capace di riassemblarli e fare DNA
identico; quesa strada viene bloccata se mettiamo in coltura un veleno
metabolico come amminopterina che produce inibizione

2. Via di salvataggio: dove esiste la possibilità di convertire tra loro


i nucleotidi per avere quelli necessari per ricostituire le stesse
molecole di DNA. Perchè questa via sia possibile io ho bisogno di un
enzima HGPRT (ipoxantina guaina fosforibosil trasferasi). Se c’è
questo enzima i veleno metabolico blocca quella de novo ma va la via
del salvataggio


HAT - ipoxantina amminopterina timidina

Ipoxantina e timidina vengono utilizzati dall’HGPRT per ricostituire DNA
identico a quello della cellula madre.

Il terreno sarà HAT dove cellule con HGPRT crescono e cellule con
HGPRT- , cioè mancanti o dove il gene HGPRT non funziona, non crescono
perchè non riescono a convertire le basi.

Allora si può pensare ad una simbiosi tra le cellule di mieloma e i lin-


fociti. E’ possibile selezionare cellule di mieloma di topo HGPRT- che
non possono vivere in HAT; al topo inietto la mia proteina e aspetto che
il SI produca anticorpi. 

Viene utilizzata la milza di topo come sorgente di linfociti B sensibi-
28
lizzati.

A questo punto le cellule di mieloma HGPRT- le fondo con i linfociti B
sensibili e viene messa in un terreno HAT.

Se la fusione è casuale si possono fondere tra loro anche due linfociti
che però muoiono in vitro.

Se le cellule di mieloma non si sono fuse muoiono perchè non sono HGPRT,
così come le cellule di mieloma fuse, perchè il terreno HAT ne blocca la
duplicazione cellulare.

L’ibridoma che funziona è linfocita B + mieloma HGPRT- , sopravvivono
perchè mieloma può vivere in vitro e lindociti B sono HGPRT.

Dopo 15 gg quindi le uniche cellule che sopravvivono sono l’ibridoma.

Il nostro intento è quello di isolare un ibridooma, un linfocita B, e di


portarlo in coltura dove inizia la duplicazione in un clone. Ci sono ib-
ridomi che producono Ig d’interesse, Ig non desiderato oppure non pro-
ducono Ig. Quelli che non producono Ig crescono di più per cui prendo
queste cellule e le elimino.

Devo portare ora su un volume 1 cellula di ibridoma: se ho 100 cell in


100ml, agito e ne prelevo 1ml alla volta e riempio 100 pozzetti così da
avere un alta probabilità di trovare 1 cellula in 1 pozzetto - max dil.

Fatto ciò ho eliminato quelle che non producono anticorpi; ora devo an-
dare a vedere in quale pozzetto si produce l’anticorpo di mio interesse;
si fa quindi uno screening degli ibridomi.

I cloni cresciuti vanno analizzati con ELISA e RIA, dei metodi che perme-
ttono di fare dosaggi immunochimici.

Svantaggi del metodo:



La fusione casuale tra linfocita B e cellule di mieloma è un intralcio
perchè determina molto tempo nella crescita e nell’analisi degli ibridi.

Per migliorare posso usare Biotina (vit. Idrosolubile) e Avidina (prot
molto affine alla biotina).

Prima della fusione posso marcare la cellula di mieloma con la biotina -
BIOTINILARE - e lego al linfocita B l’avidina. C’è quindi un attrazione
che determina l’avvicinamento delle due cellule; a questo punto una scar-
ica elettrica produce fusione ed così aumenta notevolmente la probabilità
che dalla fusione si siano formati solo ibridi.

Dosaggio radioimmunologico - RIA


Viene utilizzato in ricerche cliniche e biochimiche, per analisi quanti-
tativa, per ormoni, steroidi, farmaci.

Abbina la specificità che è propria di una reazione immunologica e la
sensibilità dell’uso di radioisotopi. 

Viene anche chiamato analisi a saturazione, analisi a spostamento e anal-
isi competitiva.


1. 4Ab + 4Ag* 4Ag*Ab

Ho un antigene che posso marcare con un radioisotopo e con quello ho


prodotto e dispongo di un anticorpo monoclonare.


29
Se metto in in soluzione un anticorpo con l’antigene marcato ottengo il
complesso di cui l’antigene Ag è totalmente marcato.

Qui la radioattività è massima, l’Ag si lega completamente all’Ab.


2. 4Ag + 4Ag* + 4Ab 2Ag*Ab + 2AgAb + 2Ag*

Si forma il complesso Ag*Ab come prima; ho messo questa miscela in un


liquido biologico e voglio sapere se c’è lo stesso antigene che ho uti-
lizzato. Se c’è è presente competizione nel formare il complesso, per cui
una parte di complesso la formerà l’antigene* che io ho messo e l’altra
quello che cercavo. Di anticorpi* se ne formerà la metà.

In questo caso la radioattività è più bassa la metà.

Quindi se io mi aspetto 1000 e trovo 50 vuol dire che era presente
l’antigene nel liquido biologico, nella stessa quantità dell Ag che ho
messo.


3. 12Ag + 4Ag* + 4Ab 1Ag*Ab + 3AgAb + 3Ag* + 3Ag

Ho messo la stessa quantità di Ag* e di Ab ma ne liquido ho una concen-


trazione 4 volte più alta rispetto all’Ag*; quindi 1 molecola di Ag* for-
ma il complesso e 3 molecole di Ag vengono costituite dal complesso.

Qui la radioattività è 1/4, il 25%.

Nel liquido biologico c’è l’antigene e c’è ne di più di quanto ne ho mes-
so.

Quindi in base alla radioattività io so se è presente e quanto.

Se metto in una provetta Ag* la radioattività è la stessa se faccio


avvenire la 2. Reazione dopo 1h. Quindi devo isolare il complesso Ag-Ab*
dall’antigene* che non ha formato il complesso, perchè è ancora in
soluzione.

E’ necessario ovviamente disporre di Ag puro con cui posso produrre anti-


corpi monoclonali o anche marcarlo usando Iodio 125 che va a legarsi al-
l’anello benefico della tirosina.


Vantaggi:

- può dosare qualsiasi immunogenico, ossia molecola che produce
risposta anticorpale

- elevata specificità e precisione

- elevata sensibilità - pg/cm3

- può essere automatizzata

Svantaggi:

- costi elevati nei reagenti e apparecchiatura

- durata dei reagenti; I125 (𝛽 emettitore)dura 60 giorni, 

I131 (gamma emettitore) dura 8 giorni.

- pericolosità dello iodio radioattivo

- personale altamente specializzato

30
Elisa
Enzime linked immunosorbent assay

Questa tecnica accosta: la specificità degli anticorpi e la sensibilità e


semplicità dell’uso di enzimi, mediante uno spettrofotometro, legato ad
un Ag o Ab.

L’enzima è facilmente disabile ed ha alto numero di turnover.


Elisa vs RIA 


- relativamente economico

- nessun rischio radiologico

- anche per piccoli laboratori

Può essere utilizzata per dosare antigeni e anticorpi:



- dosaggio antigeni con metodo competitivo e del doppio anticorpo

- dosaggio anticorpo specifico con metodo indiretto.


Metodo competitivo

E E
1. Ho un anticorpo e lo lego ad un materiale im-
mune assorbente (matrice solida) capace di legare
Ag Ag Ag Ag anticorpi.


2. Su di questa è versata una soluzione conti-
Ig nente l’antigene che vogliamo dosare e un secondo
antigene marcato con un enzima; una parte del Ig
lega l’Ag marcato e l’altra non marcato.

E E E E

Ag Ag Ag Ag 3. Ora viene immesso sempre sulla nostra Ig che
lega i due Ag un substrato che è in grado di rea-
gire con l’enzima e darci una colorazione colori-
Ig metrica che ci indica la concentrazione di enzima
marcato.

4. Ora ripetiamo il procedimento versando sull’Ig solo l’Ag marcato con


cui l’Ig impiega tutti i suoi legami; anche in questo caso aggiungiamo il
substrato e calcoliamo la concentrazione di enzima marcato.


5. È possibile così risalire alla concentrazione di antigene non marcato
per differenza.

Se nella nostra soluzione c’è un antigene, questo competerà con quello


marcato al 50% per il legame con l’anticorpo, che numericamente è inferi-
ore. In questo modo sappiamo la conc. di antigene.

31
Metodo del doppio anticorpo - ELISA sandwich

1. Ho una piastra su cui lego l’anticorpo,


Ag Ag Ag Ag prodotto per l’antigene che stiamo cercando.


2. Si introduce l’antigene che si legherà all’an-
Ig ticorpo. Si lava per eliminare l’eccesso.


3. si introduce un anticorpo specifico che ri-
E E E E
conosce lo stesso antigene e epitomo diverso.
L’anticorpo in questione è marcato con un enzima.


4. Aggiungendo il substrato si formerà un prodot-
Ag Ag Ag Ag to colorato che sta ad indicare la presenza del-
l’antigene. L’intensità della colorazione, grazie
ad uno spettrofotometro ci da la quantità.

Ig 

Se l’antigene non è presente, il secondo Ig non
si lega, non c’è enzima, non c’è prodotto.

Metodo indiretto

Ho l’antigene legato, voglio vedere se nel siero


di un soggetto circolano specifici anticorpi; in
caso si legano all’antigene.
Ag Ag Ag Ag
Io ho prodotto un II anticorpo, derivato da RI
nel coniglio al I, marcato con un enzima, che ag-
E E
giungo alla soluzione. Se trova il I legato al-
l’antigene resta immobilizzato in piastra.

Effettuo un lavaggio per rimuovere l’eccesso e


inserisco il substrato che, grazie al lavoro del-
Ag Ag Ag Ag
l’enzima diventa prodotto colorato.

Es. rosolia, produce danni per il feto. È importante in gravidanza ricer-


care gli anticorpi per la rosolia.

Amplificazione enzimatica

Il prodotto del primo enzima è utilizzato da un secondo sistema enzimati-


co ce origina una grande quantità di prodotto colorato.

Es. utilizzo accoppiato di fosfatasi e alcool deidrogenasi. La fosfatasi
è operativa sul NADP, il quale P è strappato, si forma NAD.

Il NAD è utilizzato da un secondo sistema (alccol DH) che converte NAD in
NADH e coinvolge nel suo meccanismo un colorante a base di tetrazolio che
è ridotto dagli elettroni del NADH. Grazie a questo sistema per ogni NAD
che produce il primo si formano 500 molecole di formazano, si amplifica
da 1 a 500.

32
Fasi solide ELISA (piastra)

- microsfere di destrano o poliacrilammide



- dischi di carta da filtro (cellulosa)

- provette di propilene

Il legame tra la piastra e l’antigene o l’anticorpo può essere aiutato da
Bromuro di cianogeno.

Applicazioni ELISA

- nella routine di laboratorio biochimico/chimico per la ricerca di Ig,


proteine oncofetali, fattori ematici, immunocomplessi, ormoni.

- Per studi di malattie infettive: tossine batteriche, candida albicans,


herpes simplex, epatiti B.

- Dosaggi di anticorpi prodotti da malattie infettive, contro funghi,


parassiti, virus.

Gli Ab o Ig possono anche essere coniugati con cromoforo fluorescente che


se illuminato da UV produce dei colori: verde (fluoresceina), arancione
(rodamina), blu (fluorescenza naturale).

Immuno-precipitazione
Se noi combiniamo un antigene con il suo anticorpo esistono delle concen-
trazioni critiche di incontro tra i due che quando si realizzano il comp-
lesso diventa insolubile e precipita.

In una piastra agar carico l’antigene che si propaga e produce delle or-
bite. Carico poi i liquido biologico in cui voglio cercare l’anticorpo.

Il liquido comincia a diffondere per cui c’è un incrocio delle due orbite
a diverse concentrazioni.

Si forma precipitato se la soluzione contiene l’anticorpo specifico.

33
Atomo
Numero atomico (Z) = n. Protoni = n. Elettroni.

Il maggior volume di un atomo è occupato dagli elettroni i quali con-
feriscono le proprietà caratteristiche all’atomo.

La massa di un atomo è invece legata al suo nucleo, in quanto i protoni
pesano 1850x gli elettroni.

Numero di massa (A) = Z + neutroni = nucleo

Per gli elementi a basso numero atomico il n di protoni e di neutroni del


nucleo è uguale ad 1.

In natura esistono tuttavia delle alterazioni del numero di massa, ossia
atomi che presentano un numero di protoni e neutroni non uguale; per es-
empio il carbonio ha 7 isotopi (stesso numero di protoni e diverso di
neutroni). La stabilità di un isotopo dipende dal rapporto N/P; isotopi
stabili hanno N/P=1, quelli instabili o radioisotopi emettono delle par-
ticelle o radiazioni elettromagnetiche, cercando di bilanciare il numero
di massa alterato.

Generalmente i radioisotopi utilizzati sono prodotti artificialmente.

Vita media

Nel caso del trizio (3H), una volta prodotto continua a decadere e rag-
giunge la configurazione stabile dopo 13 anni.

14C dopo 5760 anni; 135I dopo 9 ore; 15O in 2 minuti e 13N in 10 minuti

(inutilizzabili, troppo breve).

Decadimento radioattivo

Emissione di diversi tipi di particelle alla ricerca del raggiungimento


della stabilità. L’unità di misura dei livelli di energia associati al
decadimento è L’Elettronvolt.

α, 𝛽 e ɣ sono le particelle energetiche emesse da un radioisotopo.

Tipi di decadimento:

1. Decadimento per emissione di negatori o 𝛽 -

2. Decadimento per emissione di positroni o 𝛽 +

3. Decadimento per emissione di particelle α 

4. Decadimento per emissione di particelle ɣ


1. DECADIMENTO 𝛽 NEGATIVO: Radionucleotidi che decadono con questo mecca-


nismo: 3H, 14C, 35S, 32P

Queste particelle sono la conversione o l’energia che si libera dalla
conversione di un neutrone che si trasforma diventando protone + par-
ticella 𝛽; se il neutrone si converte in un protone il n. Atomico au-
menta e il numero di massa resta uguale.


146C -> 147N + 𝛽 abbiamo 7 protoni e 7 neutroni, si forma azoto.


34
2. DECADIMENTO 𝛽 POSITIVO: Un protone perde la carica sotto forma di 𝛽+ e
si converte in un neutrone. Il n. Atomico diminuisce e il n. Di massa
resta uguale.

Le particelle 𝛽+ sono utilizzate nella radiologia, nella tomografia ad
emissione di positroni per identificare aree attive ed inattive del
cervello.


2211Na -> 2210Ne + 𝛽+ non è un isotopo stabile


3. DECADIMENTO α: è per isotopi ad alto numero atomico Z.



Una particella α è un nucleo di He che contiene 2 protoni e 2 neu-
troni. Ogni particella α che abbandona l’isotopo si porta via 4 di
massa; quindi -2 di n. Atomico e -4 n. massa.

Le particelle α sono tossiche se ingerite.


4. DECADIMENTO Ɣ: Il protone cattura un elettrone, quello dell’orbita più


vicina al nucleo, diventando neutrone.

Quindi in ogni decadimento si abbassa il n.atomico e il n. di massa
resta uguale.


12553I -> 13552I + Ɣ P + e- = N + Ɣ

*Poichè c’è interazione tra particella e organismo bisogna utilizzare dei


metodi protettivi tra me e il radioisotopo.


Particelle α

L’energia associata ad una particella α incontra la materia e gli atomi


si cui sono costituiti e può eccitare l’elettrone esterno il quale salta
di un orbita e poi abbiamo il ritorno nell’orbita originaria -> 

eccitamento - temporaneo allontanamento degli elettroni.

Può anche verificarsi che l’energia associata agli α provoca l’allontana-


mento degli elettroni dell’ultima orbita ma in maniera definitiva -> 

ionizzazione.

Le particelle α sono grandi, per cui a causa della loro dimensione e del-
la bassa velocità di spostamento, impattano facilmente con la materia e
ogni impatto significa liberarsi di energia per cui provocano una intensa
ionizzazione ed eccitazione. Nel giro di poco spazio percorso hanno dis-
sipato tutta l’energia, dovuto a numerose collisioni, si dice quindi che
sono poco penetranti.

Particelle 𝛽

Sono meno ionizzanti rispetto alle α, quanto sono piccolissime e velocis-


sime la possibilità di collisione si riduce rispetto alle α che sono
lente e grosse. Quindi dissipano la loro energia ad una distanza più
ampia e si dice che sono più penetranti, cioè * probabilità di interagire
con la materia.

35
In base al radioisotopo la quantità di energia contenuta è diversa; per
esempio nel trizio 3H l’aria che impatta con le particelle 𝛽 emesse dal
trizio si spengono dopo alcuni mm, dissipano tutta l’energia; per il
cobalto ci vogliono 15 cm di acciaio affinché non venga a contatto con la
materia (emette particelle gamma, estremamente penetranti).

I radioisotopi quindi possono: ionizzare un gas, eccitare solidi o liqui-


di, possono attraverso l’energia dissipata impressionare una lastra fo-
tografica (Autoradiografia).

Scintillazione liquida

Utilizzata per 𝛽 emettitori come 3H, 14C, 35S.



La radiazione la poniamo in un solvente; il solvente viene quindi eccita-
to; si mette un scintillante primario il quale a sua volta si eccita; si
mette un scintillante secondario (o modificatore di lunghezza d’onda) che
si eccita ed emette luce che viene letta.

Il solvente solitamente è toluene.

La luce viene captata da un fotomoltiplicatore dove la luce urta le mole-


cole e gli atomi del moltiplicatore e si converte in un flusso di elet-
troni quindi corrente.

Scintillazione solida

Il contatto del radioisotopo con un cristallo, emette energia luminosa


che poi il fotomoltiplicatore converte in energia elettrica e quindi reg-
istrabile.

Applicazioni del radioisotopo in biologia



- studio del metabolismo

- turnover delle proteine

- studi farmacologici


Applicazioni analitiche

- dosaggi enzimatici o di legami a recettori

- dosaggi RIA


Altre applicazioni

- tecniche in biologia molecolare 

- diagnosi cliniche

- iodio 132: funzionalità renale

- studi ecologici

36
Chimica delle proteine
Tessuto -> omogenato -> purificazione -> voglio sapere la composizione AA
-> riduzione e carbossimetilazione (denaturare proteina - informazione
precisa per 50-70AA, se la catena è troppo lunga frammento la proteina) 

-> frammentazione -> purificazione dei peptidi -> sequenza -> oligonu-
clide sonda.


Ho la proteina pura.

- Se la proteina è costituita da più catene: le singole catene vengono


prima separate e poi recuperate

- Tutti i ponti disolfuro vengono ridotti e neutralizzati mediante car-


bossimetilazione

- Un aliquota della soluzione contenente la proteina pura, viene sotto-


posta ad idrolisi totale in modo da rompere tutti i legami peptidici e
ridurre le proteine a pool amminoacidico. L’idrolisi è fatta in ambi-
ente acido e in ambiente basico

- Un aliquota viene utilizzata per determinare i residui N terminale (AA


che ha messo in gioco il carbossile) e C terminale.

- Frammentazione della catena per l’impossibilità di avere informazioni


precise per più di 70AA. Abbiamo diverse modalità di frammentazione,
perchè vanno riassemblate nella giusta sequenza, avremo un riallinea-
mento dei frammenti sequenziati.

- Separazione dei frammenti ottenuti


- Composizione e sequenza AA.
- Determinazione dei ponti disolfuro, per vedere una cisteina con chi si
allinea.

Devo ridurre, per esempio con mercatoanolo, per rompere i ponti disolfuro
, e poi carbossimetilare, per esempio con iodio acetato così che gli -SH
non si riassemblano più. Vengono chiamati agenti alchilanti.

*in che modo denaturi la proteina? Urea o guanidina, agenti denaturanti.


Ora voglio identificare i C-terminali: faccio una riduzione con LiBr e
idrolisi formando un derivato del carbossi-terminale che identicico. 

Difatti può essere utile avere qualche informazione du qualche residuo AA
che compone la regione carboni o ammiro terminale. Per far ciò posso uti-
lizzare degli enzimi, delle peptidasi:

Carbossi-peptidasi: Sono delle esopeptidasi e aggrediscono la proteina


dalla regione C-terminale. Rimuovono un AA dopo l’altro dal residuo C-t.

Ce ne sono di due tipo A e B, estratti dalle ghiandole pancreatiche del
bovino:

A: rimuove velocemente gli AA aromatici e alifatici e lentamente glicini-
na e AA acidi; non rimuove lisina, arginina, prolina e istidina.

B: rimuove velocemente lisina e arginina; raramente o lentamente AA neu-

37
tri

C: rimuove tutto.

Ammino-peptidasi: Esopeptidasi; la M rimuove dalla catena l’ultimo AA N-t


tranne se è occupato dalla prolina. Informazione solo per 5-6 residui.

Piroglutammico ammino-peptidasi: rimuove anche la prolina

*Dalla parte ammino-t è possibile staccare uno alla volta un AA e dare


una sequenza alla proteina. Ma se ci sono AA N-t che per una ragione bio-
logica nella proteina sono acetilati, c’è l’N-t bloccato. (serina,
metionina, istidina, alanina)

Allora si fanno dei trattamenti per cercare di allontanare l’ostacolo:
tricloro acetico al 25%. 

Se non è possibile rimuovere AA possiamo dire che non è possibile sequen-
ziale la proteina, vado quindi a determinare solo la composizione senza
l’ordine; posso fare la massa molecolare.

Determinazione AA
Avviene per mezzo di idrolisi (in fase liquida o gassosa) e possono es-
sere acida (Hcl o acido metansolfonico), basica (NaOH) o enzimatica (pro-
teasi).

Idrolisi acida

La proteina viene messa in provetta pyrex; metto HCl 6N e lo porto a 110°


24h. Questo perchè la forza del legame peptidico è elevata, devo utiliz-
zare condizioni estremamente forti.

HCl in eccesso è poi allontanato, liofilizzando il campione sottovuoto.

L’idrolisi acida non è adatta per determinare il numero di cisteine e
cistine perchè si possono interconvertire o possono essere ossidati. 

Inoltre nelle condizioni in cui viene condotta l'idrolisi delle proteine,
tuttavia, alcuni amminoacidi come serina, treonina e tirosina vengono
parzialmente distrutti.

Idrolisi in fase gassosa

Si mette la provetta con la proteina in un atmosfera gassosa, riducendo


la possibilità di contaminazione.

Ho il recupero quantitativo di AA sensibili all’ossidazione e permette il
trattamento simultaneo di molti campioni. Sempre con HCl o metansolfonico

Idrolisi basica

Si usa NaOH 4N per determinare AA in campioni con alte concentrazioni di


zuccheri che interferiscono con la determinazione del triptofano.

Idrolisi enzimatica

Permette la completa idrolisi di proteina e il recupero quantitativo.

*Problema: nessuno dei 20AA assorbe nel visibile; solo tirosina, tripto-
fano, fenilalanina assorbono a 280nm.

38