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- km substrato o cofattore: se mi sposto come concentrazione o al di sot-
to o al di sopra della km ho che la concentrazione di substrato in-
fluisce sulla velocità.
Per portarmi nella zona dove la velocità è funzione solo dell’enzima,
devo inserire una concentrazione di substrato almeno dieci volte mag-
giore la sua km. Infatti a concentrazioni inferiori di substrato la ve-
locità dipende anche dalla sua concentrazione; è funzione non solo del-
l’enzima.
2. spettrofluorimetrici
3. in luminescenza
5. immunochimici
6. ecc.
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Spettrofotometro
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fruttosio 1,6 bifosfato -aldolasi-> gliceraldeide 3P + diidrossiaceton-P
Spettrofluorimetro
- sono fluorescenti al NADH e NADPH, sono quindi utili per reazioni ac-
coppiate.
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Confrontando la spettrofotometria con la spettrofluorimetria, nella prima
la quantità minima richiesta sono 100ng, la seconda 100pg (10-9), c’è una
sensibilità 1000 volte superiore.
Possiamo quindi usare la fluorescenza per dosare aa come Fnl, Tyr; cari-
oni; ormoni e metaboliti; lipidi; enzimi…
Luminometria
- alta sensibilità
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- luciferasi di lucciola:
Luciferina + ATP + O2 -(luciferasi lucciola)-> ossiluciferasi + AMP +
Pirofosfato + LUCE(posso misurarla).
- luciferasi batterica:
malato + NAD+ -(malatodeidrogenasi)-> ossalacetato + NADH
NADH + H+ + FMN -(oxreduttasi)-> FMNH2 + NAD+
FMNH2 + RCHO + O2 -(luciferasi batterica)-> FMN + RCOOH + H2O + LUCE.
(flavin mononucleotide ridotto + aldeide) (ossidato + ac.carboss.)
metodi radioisotopici
Nel caso del dosaggio della galattosio chinasi, si utilizza del galatto-
sio che contiene nel carbonio 1 il C14 che emette particelle beta.
Il decadimento del C14 è molto lungo, ca 4500 anni. Devo avere uno stru-
mento capace di dosare le particelle 𝛽 emesse.
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Dosaggio di proteine
Per dosaggio di proteine intendiamo farci una misura relativa non posso
pesare in termini quantitativi le proteine.
Relativa quindi perchè devo usare una curva di taratura di una proteina
standard.
Assorbimento UV
Metodo di Lowry
Metodo biureto
Metodo silver-binding
Metodo di Kjeldahl
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Enzimopatie
Il galattosio è uno dei primi composti che vengono utilizzati nel periodo
neonatale, costituente del lattosio, deve essere metabolizzato dalle cel-
lula. Si possono avere le galattosemie.
In particolare:
- carenza galattochinasi: galattosemia e galattosuria, il galattosio è
eliminato con l’urina;
- carenza uridiltrasferasi: danni epatici, ritardi mentali.
Oltre alla PK, tutti gli enzimi della glicolisi possono essere deficitari
(esochinasi, glucosio fosfato isomerasi, PFK, TPI, PGK, 2,3-DPGM…).
Nella via dello shunt dei pentosi (importante per la sintesi degli acidi
nucleici), i cui enzimi sono difesa dallo stress ossidativo, oltre alla
G6PDH può esservi anche un deficit di glutatione, glutatione reduttasi,
glutatione perossidasi, deidrgogenasi, etc.
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Nella cellula devono esserci dei rapporti ottimali tra i vari metaboliti:
il rapporto GSH/GSSG deve essere 500/1, tutto quello che si forma deve
essere immediatamente riconvertito.
Nel caso del glicogeno, esistono malattie per ogni enzima deficiente, op-
pure anche per il metabolismo amminoacidico etc.
Un enzimopatia quindi può essere presente per ogni metabolismo, solo che
alcune sono più comuni.
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- preparati di leucociti
- altri materiali.
Enzimi organo-specifici
Aspartato transaminasi
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Enzima aspecifico. Aumenta in maniera fisiologica nei neonati, ma quando
l’aumento è eccessivo è legato, per esempio, ad infarto del miocardio
(III enzima che si muove nel tempo), nelle epatiti virali o nella necrosi
epatica da intossicazione.
Gli aumenti più consistenti sono maggiori nel caso di epatiti virali
rispetto all’infarto del miocardio, perchè dipende dalla quantità di tes-
suto interessato.
Aumenta nella cirrosi, metastasi epatiche.
Dosaggio:
- ossalacetato e piruvato sono prodotti dall’alanina transaminasi
- ossalacetato diventa - liberando CO2 - piruvato
Alanina transaminasi
Fosfatasi alcalina
Aumenta:
- ostruzione biliale
Il dosaggio degli isoenzimi ALP permette di identificare aumenti nel
siero di origine epatica, ossea, placentare, intestinale.
Fosfatasi acida
E' possibile trovarne 5 isoenzimi che hanno lo stesso lavoro e stessa ca-
pacità ma presentano piccole differenze nella composizione amminoacidica
che non influenzano l’enzima ma possono diventare dei ganci per differen-
ziare tra loro i diversi isoenzimi. Determinano piccole differenze elet-
triche che possono essere discriminati in elettroforesi.
Dosaggi:
- LDH 4 ; 6-16%
- LDH 3 polmone; 18-30%
- LDH 2 polmone e miocardio; 28-40%
- LDH 1 miocardio; 18-33% +
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Creatin fosfochinasi
gamma-glutamil-transpeptidasi (ɣ-GT)
Amilasi
Colinesterasi
Enzimi dell’osso:
FOSFATASI ACIDA: prodotta anche nelle ossa, nel rene, nelle piastrine,
nello stomaco e nel fegato anche se non modificano notevolmente i loro
valori.
Vi è invece un notevole aumento in caso di carcinoma prostatico.
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Enzimi epatici:
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Metabolomica
Voglio valutare quali e quanti metaboliti ci sono nella cellula. Se nella
cellula non sono presenti enzimi blocco la sua situazione metabolica, la
sua attività cellulare. Se voglio vedere la quantità di metaboliti pre-
senti non devo fare altro che bloccare l’attività, devo produrre degli
estratti cellulari dove si lascia inalterata la quota di metaboliti: ATP,
NAD, etc.
Diversi metodi:
I valori di NADH, NADPH, NAD, etc invece danno i valori dello stato redox
della cellula.
L’aspettativa era di ottenere i valori di ATP, ADP, AMP, NAD, NADP, etc
in un momento preciso, immortalarli.
L’interesse per lo stato energetico dell’eritrocita è giustificato dal
fatto che l’ATP assolve a tante funzioni, tutte fondamentali nella vital-
ità della cellula:
Inoltre perchè le cose nel RBC funzionino ci deve essere un rapporto ben
definito tra ATP, ADP e AMP: 100 ATP, 10ADP, 1AMP.
L’AMP è il punto di partenza per la degradazione dei nucleotidi adeninici
Una molecola migra con una sua velocità di migrazione, una diversa dalle
altre. La velocità di migrazione è funzione di due parametri: la carica,
in maniera diretta, e al raggio, in maniera inversa. (Q/k・ɣ)
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L’aumento di 1°C produce un incremento del 2% nella velocità di mi-
grazione. Per oviare a questo problema è possibile dotare l’elettroforesi
di uno strumento refrigerante.
Per far si che il gel sia distribuito in maniera uniforme tra due lastre
di vetro, con spessore di 1-2mm, lo verso in forma ancora liquida tra le
lastre e lo gelifico successivamente.
Poliacrilammide
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ragione, in questo caso ho una fotopolimerizzazione per 2-3h (luce); la
riboflavina produce radicali liberi etc…
Un altro aspetto importante è la dimensione dei pori che, nel caso degli
acidi nucleici, per esempio, non ci permette la discriminazione. Si può
quindi costruire un sistema che sfrutti la capacità selettiva dimension-
ale del poro.
Variando la concentrazione di acrilammide e bisacrillamide, in partico-
lare abbassando la seconda aumento la dimensione dei pori.
A concentrazione 10%-20%, nell’ambito delle proteine, otteniamo una cel-
lula efficace.
Agaroso
Anche qui la concentrazione è misura della grandezza del poro: bassa con-
centrazione = pori grandi.
Blotting
SDS-PAGE
Nell’ambito di separazione di proteine la strategia più utilizzata è
quella che viene chiamata SDS-PAGE - sodio dodicilsolfato poliacrilammide
gel elettroforesi - sempre sulla base di piccole differenze di peso mole-
colare, di massa.
E’ più utilizzata nell’analisi quantitativa di proteine, usata negli step
di purificazione.
Serve anche per determinare la massa molecolare relativa.
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L’SDS è un detergente anionico, cioè una molecola che si lega alle pro-
teine in maniera specifica; una molecola di SDS ogni 2AA, ricoprendo in
maniera globale la proteina di questo mantello di cariche negative, an-
nullando le cariche proprie delle proteine. Migrano tutte verso l’anodo.
- running gel: qui le proteine danno sfogo allo loro migrazione che sarà
in base al loro PM, quelle più piccole più veloce.
A corsa finita il gel viene colorato di blu di Coomassie per alcune ore,
colorando tutta la superficie del gel; si procede a decolorare in modo da
rimuovere il colorante e lasciarlo solo sulle proteine a cui si è legato.
Isoelettrofocalizzazione - IEF
La separazione avviene sulla base di un diverso punto isoelettrico.
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Sviluppo del gel
A A+B B
Anodo + Catodo -
pH 3 pH 4 pH 8
A pH 4 carico le due proteine A+B. A ha un PI=3 e B ha PI=8.
Retta di calibrazione PI
Elettroforesi bidimensionale
Con questa strategia ottengo due separazioni:
L’argento produce la macchia nella zona dove viene ridotto, non macchia
tutto il gel per cui non è necessaria una decolorazione.
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Pulsed= campi elettrici con differenti angolazioni applicati in maniera
alternativa;
- nel primo campo elettrico si ha uno stiramento lungo il piano orizzon-
tale, cioè le molecole si srotolano e iniziano a migrare;
- nel secondo campo le molecole si devono adeguare alla direzione per cui
quelle più piccole ci metteranno meno tempo, rispetto a quelle più grandi
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Immunologia
Studio della risposta immunitaria, cioè la difesa a disposizione dell’or-
ganismo per rispondere ad un elemento esterno che arriva a contatto:
- risposta umorale: anticorpi
- risposta mediata da cellule
Le tecniche immunochimiche, in particolare, utilizzano gli anticorpi
coinvolti nell’immunità umorale.
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- dissociazione finale Ag-Ig: devo utilizzare condizioni meno denatu-
ranti possibili, non devo compromettere l’integrità delle molecole;
devo quindi evitare valori di pH molto bassi, alte concentrazioni di
urea.
Terminologia:
Clone -> famiglia di cellule che hanno identico patrimonio genetico; si
ottiene a partire da una singola cellula che in maniera asessuata per mi-
tosi diventa una colonia di cellule.
Linfocita B -> cellula che per esposizione a contatto con uno specifico
antigene Ag è stimolato a dividersi, a trasformarsi in plasmacellule, ca-
paci di produrre anticorpi che si combinano specificatamente con quel-
l’epitopo.
Epitopo -> o determinante antigenico, è un tratto dell’antigene che viene
studiato dai linfociti che si occuperanno di quel tratto producendo
specifici anticorpi che lo riconoscono.
Siero policlonare -> significa che dei linfociti ognuno ha costruito una
famiglia di cellule identiche e ognuno di questi cloni produce un anti-
corpo che riconosce un tratto; 1000 cloni producono 1000 diversi anticor-
pi che riconoscono la stessa molecola. Ogni clone ha prodotto un tipo di
anticorpo specifico di un epitopo ma alla fine tutti gli anticorpi ri-
conoscono la stessa proteina per intero.
Anticorpo monoclonare -> anticorpo derivato da un singolo clone, da una
singola cellula; la strategia è quella di isolare un linfocita che ha
studiato la proteina, portarlo a moltiplicarsi mantenendo quel tratto
come unica memoria e quel clone produrrà un anticorpo che riconosce quel
tratto.
Produzione di anticorpi policlonali
Tempi:
- iniezione tempo 0.
- 10 gg, cominciano a comparire le Ig
- 20gg, presenza degli anticorpi -> siero policlonare.
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Problemi: la proteina che ho iniettato non sveglia in maniera efficace il
sistema immunitario. Per composti debolmente antigenici, cioè che danno
bassa risposta anticorporale:
1. aggiunta di un coadiuvante, cioè qualcosa che stimoli il SI
2. aumento il tempo di esposizione, iniettando l’antigene sotto forma di
precipitato per cui viene a disciogliersi nell’organismo ospite in tempo
più lunghi. In particolare inietto una soluzione del mio antigene a cui è
stato aggiunto del solfato di Al o del solfato di K che precipitano la
proteina nella sede di iniezione.
3. aumento il numero di ulteriori iniezioni
4. si interviene sulla suscettibilità dell’animale verso l’estraneo ag-
giungendo della paraffina o un batterio della tubercolosi, inattivato al
calore, introduco cioè qualcosa che allerta la RI
HAT - ipoxantina amminopterina timidina
Ipoxantina e timidina vengono utilizzati dall’HGPRT per ricostituire DNA
identico a quello della cellula madre.
Il terreno sarà HAT dove cellule con HGPRT crescono e cellule con
HGPRT- , cioè mancanti o dove il gene HGPRT non funziona, non crescono
perchè non riescono a convertire le basi.
Fatto ciò ho eliminato quelle che non producono anticorpi; ora devo an-
dare a vedere in quale pozzetto si produce l’anticorpo di mio interesse;
si fa quindi uno screening degli ibridomi.
I cloni cresciuti vanno analizzati con ELISA e RIA, dei metodi che perme-
ttono di fare dosaggi immunochimici.
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Se metto in in soluzione un anticorpo con l’antigene marcato ottengo il
complesso di cui l’antigene Ag è totalmente marcato.
Vantaggi:
- può dosare qualsiasi immunogenico, ossia molecola che produce
risposta anticorpale
- elevata specificità e precisione
- elevata sensibilità - pg/cm3
- può essere automatizzata
Svantaggi:
- costi elevati nei reagenti e apparecchiatura
- durata dei reagenti; I125 (𝛽 emettitore)dura 60 giorni,
I131 (gamma emettitore) dura 8 giorni.
- pericolosità dello iodio radioattivo
- personale altamente specializzato
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Elisa
Enzime linked immunosorbent assay
Elisa vs RIA
- relativamente economico
- nessun rischio radiologico
- anche per piccoli laboratori
Metodo competitivo
E E
1. Ho un anticorpo e lo lego ad un materiale im-
mune assorbente (matrice solida) capace di legare
Ag Ag Ag Ag anticorpi.
2. Su di questa è versata una soluzione conti-
Ig nente l’antigene che vogliamo dosare e un secondo
antigene marcato con un enzima; una parte del Ig
lega l’Ag marcato e l’altra non marcato.
E E E E
Ag Ag Ag Ag 3. Ora viene immesso sempre sulla nostra Ig che
lega i due Ag un substrato che è in grado di rea-
gire con l’enzima e darci una colorazione colori-
Ig metrica che ci indica la concentrazione di enzima
marcato.
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Metodo del doppio anticorpo - ELISA sandwich
Metodo indiretto
Amplificazione enzimatica
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Fasi solide ELISA (piastra)
Applicazioni ELISA
Immuno-precipitazione
Se noi combiniamo un antigene con il suo anticorpo esistono delle concen-
trazioni critiche di incontro tra i due che quando si realizzano il comp-
lesso diventa insolubile e precipita.
In una piastra agar carico l’antigene che si propaga e produce delle or-
bite. Carico poi i liquido biologico in cui voglio cercare l’anticorpo.
Il liquido comincia a diffondere per cui c’è un incrocio delle due orbite
a diverse concentrazioni.
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Atomo
Numero atomico (Z) = n. Protoni = n. Elettroni.
Il maggior volume di un atomo è occupato dagli elettroni i quali con-
feriscono le proprietà caratteristiche all’atomo.
La massa di un atomo è invece legata al suo nucleo, in quanto i protoni
pesano 1850x gli elettroni.
Vita media
Nel caso del trizio (3H), una volta prodotto continua a decadere e rag-
giunge la configurazione stabile dopo 13 anni.
14C dopo 5760 anni; 135I dopo 9 ore; 15O in 2 minuti e 13N in 10 minuti
Decadimento radioattivo
Tipi di decadimento:
1. Decadimento per emissione di negatori o 𝛽 -
2. Decadimento per emissione di positroni o 𝛽 +
3. Decadimento per emissione di particelle α
4. Decadimento per emissione di particelle ɣ
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2. DECADIMENTO 𝛽 POSITIVO: Un protone perde la carica sotto forma di 𝛽+ e
si converte in un neutrone. Il n. Atomico diminuisce e il n. Di massa
resta uguale.
Le particelle 𝛽+ sono utilizzate nella radiologia, nella tomografia ad
emissione di positroni per identificare aree attive ed inattive del
cervello.
2211Na -> 2210Ne + 𝛽+ non è un isotopo stabile
Particelle α
Le particelle α sono grandi, per cui a causa della loro dimensione e del-
la bassa velocità di spostamento, impattano facilmente con la materia e
ogni impatto significa liberarsi di energia per cui provocano una intensa
ionizzazione ed eccitazione. Nel giro di poco spazio percorso hanno dis-
sipato tutta l’energia, dovuto a numerose collisioni, si dice quindi che
sono poco penetranti.
Particelle 𝛽
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In base al radioisotopo la quantità di energia contenuta è diversa; per
esempio nel trizio 3H l’aria che impatta con le particelle 𝛽 emesse dal
trizio si spengono dopo alcuni mm, dissipano tutta l’energia; per il
cobalto ci vogliono 15 cm di acciaio affinché non venga a contatto con la
materia (emette particelle gamma, estremamente penetranti).
Scintillazione liquida
Scintillazione solida
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Chimica delle proteine
Tessuto -> omogenato -> purificazione -> voglio sapere la composizione AA
-> riduzione e carbossimetilazione (denaturare proteina - informazione
precisa per 50-70AA, se la catena è troppo lunga frammento la proteina)
-> frammentazione -> purificazione dei peptidi -> sequenza -> oligonu-
clide sonda.
Ho la proteina pura.
Devo ridurre, per esempio con mercatoanolo, per rompere i ponti disolfuro
, e poi carbossimetilare, per esempio con iodio acetato così che gli -SH
non si riassemblano più. Vengono chiamati agenti alchilanti.
Ora voglio identificare i C-terminali: faccio una riduzione con LiBr e
idrolisi formando un derivato del carbossi-terminale che identicico.
Difatti può essere utile avere qualche informazione du qualche residuo AA
che compone la regione carboni o ammiro terminale. Per far ciò posso uti-
lizzare degli enzimi, delle peptidasi:
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tri
C: rimuove tutto.
Determinazione AA
Avviene per mezzo di idrolisi (in fase liquida o gassosa) e possono es-
sere acida (Hcl o acido metansolfonico), basica (NaOH) o enzimatica (pro-
teasi).
Idrolisi acida
Idrolisi basica
Idrolisi enzimatica
*Problema: nessuno dei 20AA assorbe nel visibile; solo tirosina, tripto-
fano, fenilalanina assorbono a 280nm.
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