Corso di Valutazione di Impatto Ambientale

Tossicologia
La scienza che studia le
interazioni tra composti chimici e
i sistemi biologici al fine di
determinare i possibili effetti
avversi causati da agenti chimici
e fisici in organismi viventi e di
comprendere la natura,
lincidenza, il meccanismo
dazione e la reversibilit di tali
effetti, valutando
quantitativamente le alterazioni
biologiche indotte
Fattori della Tossicit
Una sostanza chimica diventa tossica solo quando, attraverso
unidonea via di contatto riesce a superare le barriere naturali
dellorganismo e a raggiungere gli organi o tessuti bersaglio ad
una concentrazione o dosi in grado di determinare effetti
dannosi.

RELATIVI AL TOSSICO: RELATIVI AL TEMPO DI CONTATTO:

DOSE DURATA
FREQUENZA DELLESPOSIZIONE
FORME DI TOSSICIT: VIE E SITI DI ESPOSIZIONE
ACUTA TOSSICIT IMMEDIATA
SUBACUTA SU BASE GENETICA
CRONICA TOSSICIT TARDIVA
Fattori della Tossicit
FARMACOCINETICI TOSSICIT FETALE
ASSORBIMENTO DIRETTA
DISTRIBUZIONE INDIRETTA
METABOLIZZAZIONE
ESCREZIONE
Tossicologia
Tossicologia clinica: studia situazioni patologiche
nelluomo indotte da sostanze tossiche
Tossicologia forense: si occupa degli aspetti medico-
legali derivati da intossicazione acuta accidentale o
volontaria
Tossicologia sperimentale: studia e realizza prove di
tossicit indispensabili per la valutazione del rischio
per luomo e lambiente da esposizione a sostanze
chimiche
Tossicologia
Tossicologia descrittiva (prove di tossicit e valutazione rischio)
Tossicologia molecolare o dei meccanismi(meccanismi di tossicit)
Tossicologia normativa o regolatoria (protocolli per la valutazione del
rischio)
Tossicologia forense (aspetti medico legali)
Tossicologia clinica
Reazioni avverse da farmaci
Farmacodipendenza
Tossicologia nutrizionale/alimentare
Tossicologia industriale o occupazionale(tossicit nellambiente di lavoro)
Tossicologia ambientale(impatto potenzialmente deleterio di sostanze)
Ecotossicologia (effetti su popolazioni di organismi in ecosistemi definiti)
Tossicologia bellica (armi chimiche/biologiche e fisiche)
DEFINIZIONI MEDICO LEGALE DI
VELENO
Per veleno si pu intendere ogni sostanza che introdotta
nellorganismo cagiona uno stato di malattia ed
eventualmente la morte con meccanismo chimico o
biochimico

Veleno ogni sostanza che provoca avvelenamento

Molte sostanze, a seconda della dose e delle circostanze

possono agire terapeuticamente o nuocere come veleni
Tossicologia
Tossicogenomica
In particolare si interessa di:
PROPRIET CHIMICO-FISICHE
EFFETTI
MECCANISMO DI AZIONE TOSSICA
Di sostanze chimiche, endogene ed esogene, capaci, in
particolari condizioni e circostanze, di interagire e
danneggiare in maniera reversibile e/o irreversibile gli
organismi viventi
Definizioni
TOSSICIT: Capacit di una sostanza di produrre un
effetto deleterio sullorganismo (Aspetto qualitativo)

RISCHIO: Probabilit con la quale una determinata

sostanza, usata in certe condizioni, provoca un effetto
tossico (Aspetto quantitativo)

PRESENZA di tossico Avvelenamento

Tossico o Veleno
Tutte le sostanze sono dei
veleni; non ne esiste una che
non sia un veleno

La giusta dose differenzia un

veleno da un rimedio

Philippus Aureolus
Theophrastus Bombastus von
Hohenheim detto Paracelsus o
Paracelso 1493-1541

La tossicit funzione della

concentrazione
Sostanze tossiche e tossine
Tossina
- origine biologica

Sostanza tossica
- antropogenica
- o non biologica
Una disciplina che affonda le proprie radici nel
tempo (1)
2695 a.C. Shen Nung Scrisse Pen ts'ao ching su 365 sostanze

1500 a.C. Papiro di Ebers contenente 811 ricette del periodo Amenofi I (o Amenhotep I)
su: cicuta; aconito; oppio; digitale; belladonna; piombo; rame; antimonio; ecc.

400 a.C. Ippocrate descrive Tossicologia clinica con la biodisponibilit nella terapia e
sovradosaggio

400 a.C. Giobbe 6:4 Descrive veleni per frecce

370-286 a.C. Teofrasto nel De historia plantarum include numerose piante

40-90 d.C. Dioscoride scrive il De materia Medica dove descrive e classifica veleni vegetali
animali e minerali

82 a.C. Antica Roma avvelenamenti largamente praticati da richiedere la Lex Cornelia de

sicariis et veneficis
Una disciplina che affonda le proprie radici nel
tempo (2)
Omero scriveva nel 600 A.C.(Odissea):
Ulisse prese aglio come antidoto del veleno di Circe

Il veleno si pensa fosse Daturastramonium, o"erba delle

streghe".Glialcaloidi(l-josciaminaescopolamina) inducono una
forma di estasi psichica, amnesia, allucinazioni e delirio;
succesivamente resta lo stato confusionale e un vuoto riempito
da confabulazioni

Lantidoto si pensa fosse Galanthus nivalis Amarillidacee

(Bucaneve) contenente, nei bulbi, la galantamina un inibitore
reversibile della colinaesterasi
Tossicologia storica
Cicuta bevanda >>Socrate
Dose letale uomo 2-4 g di
frutti verdi
Coniina
LD50= 1 mg/kg (orale, nel
topo)
Cleopatra Aspide egiziana
per suicidi
Lucrezia Borgia Arsenico
100-300 mg di As3+letale
Tossico o veleno
Tossina: sostanze tossiche di origine naturale
(stricnina, nicotina, tossina botulinica)

Sostanza tossica: direttamente o indirettamente

antropogenica (diossina, metotressato)
sostanza che non presenta alcun effetto benefico
Sostanza con basso coefficiente terapeutico
(rapportoLD50/ED50)
sostanza che presenta gravi azioni tossiche per
dosi molto piccole (g o mg)
Interazioni delle diverse aree della tossicologia
Classificazione degli effetti tossici
Organo bersaglio:
Fegato, rene, sistema ematopoietico, sistema
immunitario, ecc.
Uso:
Farmaco, fitofarmaco, solvente, addittivo alimentare,
ecc.
Fonte:
Tossine naturali, sostanze di sintesi
Effetto:
Mutazione, cancro, danno epatico, danno renale, ecc.
Risposte graduali per nutrienti ed essenziali
Relazione Dose-Effetto
Curva Dose-Risposta
Classificazione UE
Scale di tossicit
Classificazione delle sostanze tossiche in relazione al loro
potenziale
Interazione Tossico Bersaglio
Tossicocinetica tossicodinamica
Vie di Esposizione
Cutanea

Potenziale tossico
Orale
Intradermica
Intramuscolare
Sottocutanea
Intraperitoneale
Inalatoria
Endovenosa
Effetto Farmacologico

inefficacia
efficacia medicamentosa
tossicit
Potenza ed efficacia tossicologica
Potenza:
B; C; D > A
C = D solo al Dl50
D>ABC

Efficacia
A = C stessa pendenza
Valutazione della tossicit
Gli effetti tossici di una sostanza risultano
significativamente correlati alla durata dellesposizione

STUDI DI TOSSICIT A BREVE TERMINE

STUDI DI TOSSICIT A MEDIO TERMINE
STUDI DI TOSSICIT A LUNGO TERMINE
Valutazione della tossicit
Curva Dose-Risposta
Tossicit Acuta
La dose a cui reagisce il 50% degli individui usata
come misura della tossicit (DT50) o della letalit
(DL50) della sostanza in esame

Quando la via di esposizione quella inalatoria, si

parla di concentrazione letale (CL50) e di tempo letale
(TL50)
Dalle cavie alluomo
LD50
La tossicit dei pesticidi
Tossicit Cronica
NOAEL
(No Observable Adverse Effect
Level): Livello pi alto di
dose che non produce effetto
tossico

LOAEL
(Lowest Observable Adverse
Effect Level): Livello pi basso
di dose che produce effetto
tossico
Endpoint di Tossicit Cronica
Effetti di Tossicit Cronica
Sono effetti cronici:
Cancerogenicit: insorgenza di forme tumorali
Genotossicit: alterazioni genetiche (DNA)
Mutagenicit: mutazioni genetiche (DNA)
Teratogenicit: alterazioni dello sviluppo embrionale

test in vivo su animali da laboratorio

test in vitro su colture cellulari o su organi bersaglio
Effetti Teratogeni
Classificazione degli effetti teratogeni:
Aberrazioni (rottura e riarrangiamento): difetti morfologici
che coinvolgono strutture interne e/o esterne, nonch
anomalie funzionali. Questo tipo di danno coinvolto nella
cancerogenesi e nello sviluppo di anomalie fetali e malattie
congenite
Riassorbimento: espressione della morte del prodotto del
concepimento
Tossicit fetale: pu manifestarsi o come riduzione del peso
corporeo o come aumento del numero dei feti non vitali
Meccanismi di tossicit
NON VI DIFFERENZA SOSTANZIALE FRA LAZIONE
DI:
FARMACI
VELENI
SOSTANZE BIOATTIVE IN GENERALE
Risposte graduali (nutrienti e microlementi)
Elaborazione Curve dose risposta
La risposta del tipo tutto o nulla; es., morte, comparsa
di tumori, presenza di anticorpi ad antigeni specifici
si misura la frequenza di risposta alle diverse dosi, cio la
percentuali di soggetti in cui compare la risposta

Le curve dose-risposta graduali possono essere

trasformate in curve quantali fissando un limite minimo di
intensit della risposta; si considera come rispondente un
soggetto la cui risposta superiore al limite fissato.
Elaborazione Curve dose risposta
Le vittime
Artemia salina

Daphnia spp.
Daphnia magna, D.pulex e le altre
Variabilit individuale
Curve di risposta quantali
Riportando in un grafico cartesiano la % di soggetti che rispondono in
funzione della dose si ottiene una curva dose-risposta cumulativa; cio, ad
ogni dose corrispondono non solo i soggetti che rispondono solo a quella
dose, ma anche i soggetti che rispondono a dosi pi basse
Indice Terapeutico

Indice terapeutico: DL50/DE50 un indicatore approssimativo della sicurezza di un

farmaco; non tiene conto delle pendenze delle curve
Margine di sicurezza: DL1/DE99 un indicatore migliore della sicurezza del farmaco
Confronti tra curve Dose-Risposta

DE50 diverse, dosi soglia uguali

pendenze diverse

Curve con uguale DE50 ma pendenze e

dosi soglia diverse
Tossicocinetica e tossicodinamica
Esposizione a sostanze tossiche
Durata dellEsposizione
Rischi reali e percepiti
Attivit e Rischio

*Il Rischio espresso come probabilit di morte per un anno di esposizione

arrotondato per eccesso
La percezione del Rischio
Estrapolazione

Sostanze cancerogene -genotossiche

Estrapolazione
Concetto di Dose
DGA: Dose Giornaliera Ammissibile
ADI: Acceptable Daily Intake
TDI: Tolerable daily intake
TDC: Tolerable daily concentration

ADI la quantit di sostanza (espressa in mg/kg p.c.) che pu

essere assunta giornalmente dalluomo per tutta la vita senza
apprezzabile rischio per la salute: corrisponde alla centesima
parte della quantit risultata senza effetti tossici sugli animali
da laboratorio misurata in mg/Kg di peso corporeo.

2000 mg/kg Animale 20 mg/Kg Uomo

Animal Risk Assessment (MeHg)
2.5 g/kg - NOAEL (animals)
0.25 g/kg - Human
0.025 g/kg - Sensitive populations

Fattore di sicurezza 10 100 -1000

Dal NOAEL allADI
Classificazione di Tossici
per effetto
Asfissianti: prevengono larrivo dellossigeno ai vari tessuti -
es. monossido di carbonio
Allergeni/sensibilizzanti: causano reazioni allergiche che
possono anche essere fatali (anafilassi) - isocianati,
organofosfati, metalli pesanti
Carcinogeni: causano tumori-benzene
Teratogeni: tossine che possono danneggiare il feto -
diossine
Mutageni: tossine che possono interferire o danneggiare il
materiale genetico
Fattori che condizionano gli effetti tossici
Fattori dellospite
Differenze intra e interspecie
glicol etilenico (acido ossalico): gatto>ratto>coniglio
anilina (o-aminofenolo): gatto>cane>ratto>criceto
acetilatori lenti e rapidi
Sesso: barbiturici pi potenti nelle femmine che nel maschio
di ratto
Et: neonati (piombo e DDT) ed anziani

Fattori ambientali
Temperatura (colchicina e digitale tossiche ratto>rana, ma.)
TOSSICIT SELETTIVA
Risposte multiple allo stesso composto tossico
principalmente dovute a

Differenze nella superficie di esposizione

Differenze nellaccumulo
Tassi di trasformazione (biotransformazione)
Differenze nei percorsi biochimici
Tossicologia locale e sistemica
Locale sostanze chimiche irritanti (es. HCl,
NH3) se inalate producono effetti tossici locali ai
polmoni

Sistemica Molte sostanze tossiche esercitano i

loro effetti negativi su organi lontani da quello
attraverso il quale avvenuta lassimilazione
Solitamente un tossico particolarmente nocivo su
alcuni organi in particolare che per questo motivo
sono detti organi bersaglio
Tossicit immediata e ritardata
Immediata - HCN, CO, H2S

Ritardata - phosgene, tri-orthocresyl phosphate

Lunga Latenza i composti cancerogeni hanno

molto spesso un periodo di latensa di 20-30 anni
Meccanismi di Tossicit
Le sostanze chimiche assorbite possono agire sia
come tossici di tipo sistemico per lintero
organismo, oppure possono attaccare organi
(target) specifici.

Differenze nei meccanismi possono essere

dovute a:
1. Differenze nelle caratteristiche chimiche che ne
condizionano la capacit di attraversare le membrane
cellulari
2. Solubilit differente nei diversi tessuti
3. Vie preferenziali sanguigne verso tessuti specifici
4. Differenze nelle reattivit chimiche
 BIOTRASFORMAZIONE
Le trasformazioni chimiche che avvengono negli
organismi possono dare origine a composti figli pi o
meno tossici
alcol etilico viene detossificato dallossidazione a gruppo
aceticilico che pu essere inserito nel normale corso del
metabolismo cellulare (ciclo dellacido citrico)
lalcol metilico (metanolo) ossidato dallo stesso enzima d
origine alla formaldeide che pi tossica dellalcol di
partenza.

la velocit di queste trasformazioni metaboliche cambia

da individuo ad individuo e da specie a specie
(Tossicit Selettiva).
Differenze nei percorsi biochimici
MALATHION
(relativamente inattivo)
Lenta (insetti)
Rapida (insetti) Rapida (mammiferi)
Lenta (mammiferi)

Ossidazione
(enzimi microsomiali) Idrolisi
binding

MALAOXON
Sottoprodotti
(attivo)
(inattivi)
Idrolisi
(A-esterasi)

Lenta (insetti)
Rapida (mammiferi)
Tossicit sede / reversibilit
 Tossicit ambientale
Degradabilit
Mobilit
Bioaccumulo
Bioincremento
Bioaccumulo
Le sostanze tossiche (metalli, DDT, ecc.) possono
presentare il fenomeno della bioconcentrazione e
biomagnificazione: le loro concentrazioni
aumentano progressivamente nel passaggio attraverso
i diversi anelli della catena biologica alimentare

Per esempio le ostriche e i mitili possono contenere

livelli di mercurio e di cadmio 100.000 volte superiore a
quelli presenti nelle acque in cui vivono
Biomagnificazione
Studi di tossicit
I test di tossicit non sono finalizzati a dimostrare che
un dato composto chimico (farmaco, cosmetico,
additivo alimentare, fitoterapico, fitofarmaco) sicuro
(cio assolutamente senza rischio):
ogni sostanza pu indurre effetti sfavorevoli (o nocivi o
tossici, in base alla dose);
quindi importante arrivare a determinare la stima del
rischio, associato alluso della sostanza, sottoponendola
a test appropriati per far emergere il livello di
pericolosit del contatto
Uso degli animali da esperimento
Il modello animale (mammifero) rappresenta il sistema di massima complessit
biologica a rappresentazione dellimpatto clinico
Lanimale insostituibile ad un certo livello della sperimentazione: nessun
protocollo di sperimentazione di una nuova molecola prevede, per ora, solo test In
vitro
Esistono comunque norme etiche che devono guidare la sperimentazione: rispetto
della vita e moderazione della sofferenza degli animali durante lesperimento e al
momento della soppressione (sacrificio). Locali di stabulazione e personale addetto
sono soggetti ad approvazione da parte del Ministero della Sanit
Legislazione: Gazzetta Ufficiale D.L. n. 116, suppl; 18.2.1992 e successive; DIRETTIVA
2010/63/UE e successivamente nel DECRETO LEGISLATIVO del 04 marzo 2014 N.
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Protocolli sperimentali controllati: devono seguire le norme di legge vigente o essere
approvati in caso di deroghe; sono previste visite periodiche di un veterinario
responsabile, specialmente durante la sperimentazione a lungo termine da parte
Organismo preposto al Benessere Animale (OpBA).
http://www.unich.it/ricerca/sperimentazione-animale/ceisa
http://www.nc3rs.org.uk/page.asp?id=7https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/
Sperimentazione in vivo
Vantaggi
Valuta effetti sistemici;
Permette di monitorare pi
parametri biologici
contemporaneamente;
Consente di studiare, anche in
tempi prolungati, processi
biologici complessi:
cancerogenesi, teratogenesi,
comportamento
Tiene conto dei meccanismi di
tossicocinetica
Svantaggi
Ha un costo elevato
Presenta la necessit di strutture
e processi di stabulazione
adeguati
Prevede unampia variabilit
biologica delle rilevazioni
sperimentali
Non permette di ottenere alcuna
informazione sul fine
meccanismo dazione a livello
molecolare
Metodi alternativi allanimale
Simulazioni al computer modelli matematici complessi che non
sono comunque in grado di considerare tutte le variabili di una
matrice biologica

Saggi biochimici che rappresentano una semplificazione di

sistema

Colture cellulari:
Colture primarie (estemporanee da tessuto, differenziate ma labili)
Linee immortalizzate (in grado di proliferare allinfinito)
Cellule tumorali (linee cellulari da ceppi specifici)
Cellule staminali (totipotenti, capaci di dare origine a qualsiasi
tipologia di differenziazione)
Sperimentazione in vitro
Vantaggi
Facilit di reperibilit dei dati,
minima variabilit biologica
Uniformit genetica (elevata
riproducibilit)
Possibilit di manipolazione
genetica
Predittivit dei meccanismi
dazione a livello molecolare
Possibilit di impiego di
materiale umano
Svantaggi
Impossibilit di rappresentare
processi biologici complessi (es.
tossicocinetica)
Difficolt ad estrapolare i
risultati in vivo
Non perfetta rappresentativit
delle cellule immortali (anche
umane) rispetto a quelle
differenziate
Prove di tossicit precliniche
da 2 a 5 anni, 40 milioni di euro per farmaco
commercializzato
tossicit acuta
dose singola (LD50)
tossicit subacuta
tre dosi
tossicit cronica
1-2 anni (durante la sperimentazione clinica)
tossicit riproduttiva
fertilit, teratogenicit, lattazione
tossicit mutagena
tumori, mutazioni batteriche
Test di Tossicit
Generica Particolare
Tossicit acuta Mutagenesi
Tossicit sub-acuta Cancerogenesi
Tossicit sub-cronica Teratogenesi
Tossicit cronica Sensibilizzazione (effetti
allergogeni)
Sperimentazione animale
Animale = uomo
mg/m2
differenze di specie
stesse vie di esposizione
esami clinici, strumentali, autoptici
Maggiore esposizione = maggiore incidenza
alte dosi
ridotto numero di animali
Dose/Superficie
Tossicit acuta
Obiettivi
Identificazione degli organi bersaglio e di altre
manifestazioni cliniche a rapida insorgenza
Informazioni sul meccanismo dazione tossica
Durata degli effetti
Reversibilit delleffetto tossico
Valutazione della letalit (DL50)
Stima dei livelli di dose da utilizzare negli studi
successivamente
Studi di tossicit sullanimale
Acuta
Sistemica (almeno 2 vie)
2 o + specie, reversibilit, organi bersaglio
osservazione per 14 giorni, esame autoptico
DL50
Supertossici: < 5mg/kg
Non tossici: > 15 g/kg
Locale
cutanea
oculare
Sensibilizzazione allergica
somministrazione cutanea o intradermica
sostanze adiuvanti
Fattori che possono far variare la DL50
Numero degli animali considerati
Specie (e in certi casi il ceppo, es. topi nude)
Sesso
Et
Peso
Dieta
Temperatura ambientale (e altre variabili
dellecosistema)
Periodo stagionale (cronobiologia)
Studi di tossicit sullanimale
Subacuta
3-4 somministrazioni
tre dosi
tossica (letale 10%)
non tossica
intermedia
Subcronica
via di esposizione umana, 90 giorni
dosi come nella subacuta
individuazione di NOAEL e LOAEL
Obiettivi degli studi di tossicit sub-cronica
Definire:
la relazione tra intensit degli effetti e dose assunta
gli organi bersaglio degli effetti tossici
la reversibilit/irreversibilit degli effetti
Indicazioni (dosaggi) per gli studi a lungo termine
Tossicit cronica
Mutagenesi
Mutazioni geniche o puntiformi: alterazioni in
una o poche coppie di basi

Mutazioni cromosomiche: alterazione della

struttura dei cromosomi (accorciamento,
alterazione della forma)

Mutazioni genomiche: alterazioni nel numero

dei cromosomi

Le mutazioni possono:
insorgere in modo spontaneo mutazioni
spontanee;
Essere indotte da agenti chimici o fisici
mutazioni indotte
Cancerogenesi chimica
Nel 1775 osservazione: un considerevole aumento
nellincidenza del carcinoma dello scroto tra i soggetti
che in giovent avevano esercitato il mestiere di
spazzacamino

Nel 1873 osservazioni sullincidenza dei tumori cutanei

tra gli addetti alla lavorazione del catrame
Cancerogenesi virale
All'inizio degli anni '60 i virologi hanno dimostrato
che:
Il fenotipo tumorale poteva essere conferito a cellule
normali in coltura in seguito ad infezione con un virus
(Dulbecco, 1963)
Questi virus erano capaci di integrarsi nel genoma
cellulare tramite la trascrittasi inversa (Temin;
Baltimora, 1970)
Cancerogenesi fisica
Cancerogenesi da corpi estranei
Protesi dentarie difettose
Calcolosi
Fibre di Asbesto

Cancerogenesi da RADIAZIONI
Ultravioletto
Radiazione Solare
UV per uso cosmetico

Ionizzanti
Radiazione ambientale (Radon, raggi cosmici)
Raggi X
Raggi gamma
Radioisotopi per uso diagnosticoRadioisotopi contaminanti (Chernobyl Cesio
134 e 137)
Mutazioni indotte
Le lesioni premutazionali sono dovute a
Reazioni di deaminazione ossidativa: da acido nitroso a
nitrosamine
Formazione di epossidi/radicali liberi
Formazione di legami covalenti tra le basi: effetto dei
raggi UV
Reazioni di alchilazione, con legame di gruppi chimici
alle basi azotate: effetto degli agenti alchilanti
Inserimento o delezione di basi: agenti intercalanti
Test di Ames
Screening per gli agenti chimici che si sospettano capaci di
mutagenicit e cancerogenicit utilizzando ceppi di Salmonella
typhimurium
Si basa appunto sulla forte correlazione esistente tra
mutagenicit e cancerogenicit
Stabilisce la capacit della sostanza di indurre mutazioni in un
ceppo di salmonelle (in genere istidina +) in cui compromessa
la via biosintetica dellistidina per mutazione selettiva sul gene
corrispondente ad un enzima chiave della biosintesi (istidina -)
Il mutageno pu determinare con alta probabilit una nuova
mutazione corrispondente nel gene compromesso (reversione),
permettendo cos al batterio di risintetizzare laminoacido
essenziale istidina
Classificazione UE sostanze cancerogene
Categoria 1
Sostanze note per gli effetti cancerogeni per luomo. Esistono prove sufficienti
per stabilire un nesso causale tra lesposizione delluomo ad una sostanza e lo
sviluppo dei tumori
Categoria 2
Sostanze che dovrebbero considerarsi cancerogene per luomo. Esistono elementi
sufficienti per ritenere verosimile che lesposizione delluomo ad una sostanza
possa provocare lo sviluppo di tumori in base a:
adeguati studi a lungo termine effettuati su animali
altre informazioni specifiche

Categoria 3
Sostanze da considerare con sospetto per i possibili effetti cancerogeni
sulluomo per le quali, tuttavia, le informazioni disponibili non sono sufficienti
per procedere ad una valutazione soddisfacente. Esistono alcune prove
ottenute da adeguati studi sugli animali che non bastano tuttavia per
classificare la sostanza nella categoria 2.
La cancerogenesi
un processo pi complesso di quello che deriva dalla
semplice mutazione genetica

caratterizzata da due processi successivi:

Fase di iniziazione le cellule bersaglio subiscono lazione
dellagente cancerogeno, subiscono delle trasformazioni che
non si evidenziano fenotipicamente, o si evidenziano con
difficolt
Fase di promozione le cellule trasformate nella fase
precedente, pur in assenza dellagente cancerogeno (che
inizialmente le aveva trasformate), se sottoposte a determinati
stimoli, rivelano i caratteri acquisiti nella fase precedente
Esempi di promotori chimici
Induttori enzimatici: pesticidi organoclorurati (DDT),
idrocarbuti aromatici policiclici (PAI, es. benzopirene),
barbiturici
Agenti ormonali: estrogeni (tumori ormonosensibili)
Immunosoppressori: ciclosporina A, azatioprina,
diossina
Solidi cancerogeni: asbesto (amianto), plastiche

Gli idrocarburi policlicici sono sia iniziatori che promotori

dei tumori e si definiscono perci cancerogeni completi
Inibitori della promozione
Retinoidi: analoghi della vitamina A
Vitamina A
Carotenoidi: -carotene, precursore della vitamina A
Favoriscono la differenziazione dei tessuti epiteliali
Progressione
Acquisizione di segnali proliferativi autonomi (benigni)
Diminuzione della sensibilit agli ormoni, fattori di
crescita, chemioterapici
Inibizione dei segnali inibitori della crescita
Immortalizzazione
Evasione dal programma di morte cellulare per apoptosi
Acquisizione di vasi sanguigni (angiogenesi)
Capacit invasiva
Capacit metastatica
Perdita della differenziazione
Alterazione della proliferazione
Slope factor
Risk assessment
Procedura per stimare la
probabilit che una
esposizione possa costituire
un pericolo per la salute

Slope factor
Incremento del rischio di
tumore misurato
sullaspettativa di vita in
risposta a una esposizione
Modelli per estrapolazione Rischio
Modelli per estrapolazione Rischio
Modelli matematici utilizzati per lestrapolazione del
rischio
Modelli matematici utilizzati per lestrapolazione del
rischio

Curva dose-risposta
secondo il
modello Weibull

Estrapolazione
alle basse dosi
basata su 6
diversi modelli
matematici
Modelli matematici utilizzati per lestrapolazione del
rischio
Relazione dose-risposta per
esposizione a vinilcloruro
la curva supralineare mette in
relazione la dose inalata con
la frequenza di angiosarcomi
epatici
lestrapolazione lineare
corretta solo nel tratto lineare
della curva dose-effetto
- la curva della relazione dose-risposta
diventa quasi lineare
- la stima di rischio (UR = 2,5 x 10-4),
derivata da una esposizione
discontinua nel ratto a 1 ppm,
coerente con quella derivata da studi
epidemiologici
Il risk assessment
luso di procedure per
stimare la probabilit
che una esposizione
possa costituire un
pericolo
Lo slope factor misura
lincremento del
rischio di insorgenza
del tumore durante
lintero arco di vita
associato a una
determinata dose di
esposizione
Alterazioni morfologiche
Atipie biochimiche e del metabolismo
Comparsa di proteine fetali: alfa-fetoproteina antigene
carcino-embrionale
Sintesi ectopicadi ormoni ed enzimi non presenti nei
tessuti che hanno dato origine alla neoplasia
Diminuzione di enzimi di superficie come
glicosiltransferasi, adenilatociclasi
Diminuzione degli enzimi della catena enzimatica
microsomale
Aumento degli enzimi difensivi
Aumento del metabolismo glicolitico
Aumento metabolismo di proteine e grassi
Alimentazione e cancro: procancerogeni
Affumicati/grigliati (presenza di benzopireni): attenzione ai cibi
affumicati e cotti su griglia, brace, barbecue (zone carbonizzate)
Fritti: trasformazione di grassi animali e oli di semi a basso punto di
cracking (rapido inscurimento)
Bevande alcoliche: etanolo acetaldeide
Nitrati-Nitriti/Nitrosamine: cibi proteici + nitroderivati usati come
conservanti
dal 1990 obbligatorio aggiungere Ac. Ascorbico agli insaccati
contenenti nitrati per impedire la trasformazione a nitriti e
nitrosamine
Tabacco: alcaloidi (nicotina) nitrosamine
catrami-PAI (benzopirene) derivati epossidici
Importanza modelli in vitro
Limiti degli studi a lungo termine nellanimale
Costi elevati
Specificit di specie e di ceppo
Peculiarit nelle vie di somministrazione
Difficolt nellestrapolazione alluomo
Pochissimi dati su miscele complesse

Pressioni dellopinione pubblica per la riduzione

delluso di animali nella sperimentazione
tossicologica
Costo elevato degli studi in vivo tradizionali
Difficile estrapolazione dei risultati ottenuti negli animali
alluomo
Modelli in vitro
VANTAGGI
rapidit, economicit, riproducibilit
controllo delle variabili sperimentali
valutazione delle relazioni dose-risposta
identificazione di parametri critici per gli effetti
avversi
studio dei meccanismi biochimici e molecolari alla
base degli effetti biologici
screening preliminare di nuovi materiali
Modelli in vitro
LIMITI
Non sono valutabili parametri fondamentali nella
azione biologica
Assorbimento
Distribuzione
Metabolismo

Possibilit di falsi positivi

Modelli non direttamente correlabili con lorgano
target
Colture cellulari
Colture cellulari
Vantaggi
Controllo condizioni ambientali e plasticit dei modelli
Caratterizzazione ed omogeneit
Economicit e rapidit risposta
Riduzione sperimentazione in vivo

Svantaggi
Perdita di funzioni organo-specifiche, alcune attivita
enzimatiche, rigido controllo numero e struttura cromosomi
Alterazione del ciclo cellulare
Alterazioni morfologiche e proprieta antigeniche
Colture cellulari
Linee stabilizzate
popolazioni omogenee di cellule in coltura
immortalizzate
crescita rapida
Numero di divisioni in coltura indefinito

Cellule altamente differenziate

Colture primarie
Linee cellulari specializzate
Colture cellulari
COLTURE PRIMARIE
costituite da cellule che provengono direttamente dai
tessuti prelevati dagli animali

COLTURE SECONDARIE
sono costituite da cellule che provengono da una
coltura primaria e che si sono divise in vitro o sono
state propagate in vitro
Colture Cellulari
Trasformazioni cellulari
screening test di secondo livello per cancerogenesi
screening test per cancerogeni non genotossici
sostituzione di test in vitro di mutagenesi con attivit
predittiva simile o inferiore
Trasformazioni cellulari
Il modello BALB/c 3T3
Il modello:
Descrive la tossicit della miscela
Analizza la potenzialit cancerogena
Individua relazioni dose-risposta
Adatto allo studio di miscele complesse ambientali

I fibroblasti murini BALB/c 3T3 crescono in un monostrato

ordinato sensibile alla densit (inibizione da contatto)

Il trattamento con cancerogeni (singoli composti o

miscele complesse) determina linsorgenza di cloni di
cellule trasformate (foci) che crescono disordinatamente
in pluristrato
Inibizione da contatto
Le cellule normali
proliferano in coltura
finch raggiungono la
confluenza. A questo
punto le cellule diventano
quiescenti

Le cellule tumorali, al
contrario, continuano a
proliferare
indipendentemente dalla
densit
Inibizione da contatto
La migrazione di fibroblasti
normali inibita dal contatto fra le
cellule cos che essi formano un
monostrato orientato
ordinatamente sulla superficie
della piastra di coltura

Le cellule tumorali non risentono

dellinibizione da contatto,
migrano luna sullaltra e crescono
disordinatamente in pluristrato
MODELLO BALB/c 3T3
MODELLO BALB/c 3T3
MODELLO BALB/c 3T3
Il modello BALB/c 3T3

Il test di trasformazione
cellulare misura un
endpoint facilmente
individuabile
rappresentato dal focus
trasformato

Il numero dei foci

maligni direttamente
correlato con la dose
Il modello di trasformazione cellulare
Caratteristiche di un focus
maligno (tipo III) nel modello
BALB/c 3T3
Forte basofilia
Densa sovrapposizione di
cellule
Orientamento casuale
delle cellule alla periferia
del focus
Cellule fusiformi
(spindleshaped)
Formazione di criss-cross
alla periferia del focus
Infiltrazione del focus
ramificato nel monostrato
adiacente
Test in vitro a medio termine
Il Modello BALB/C 3T3:
Uno modello in grado di verificare le capacit trasformanti di
composti singoli e miscele complesse e di predire la potenza
cancerogena
Comprende differenti test che consentono di descrivere il ruolo e il
peso della miscela in esame nel processo di cancerogenesi
Test di citotossicit
Test di trasformazione in cellule BALB/c 3T3
Test di trasformazione in 2 fasi: iniziazione/promozione
Test delle comunicazioni intercellulari GJIC
Valutazione dellimpatto di promoventi sulla interazione cellula-
cellula
Test di chemiotassi/chemioinvasione
Valutazione delle tappe tardive della cancerogenesi multifasica
Test di apoptosi
Il rischio delle sostanze chimiche e il regolamento
REACH
Il modello BALB/c 3T3:
Modulazione della comunicazione intercellulare mediata
da gap junctions (GJIC)
Il modello BALB/c 3T3:
Morte cellulare programmata (apoptosi): un endpoint
per descrivere lattivit tossicologica delle miscele
ambientali
Teratogenesi
Si assiste allo sviluppo di malformazioni strutturali e/o
comportamentali irreversibili presenti alla nascita o rilevabili in
periodo perinatale (ecografia intrauterina o primi anni di vita)

Tossicit embrio-fetale
Si assiste a ritardo di sviluppo psicofisico senza evidenza di
malformazioni.

Le alterazioni possono essere permanenti o reversibili (es. crisi di

astinenza per tossici o farmaci)
Test di teratogenesi
Sostanze teratogene per luomo
Sostanze teratogene per luomo