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Lezioni del corso di

VEICOLAZIONE E DIREZIONAMENTO DEI FARMACI


Tenute dal Prof. G. Di Colo
Si distinguono i seguenti tipi di direzionamento:
Direzionamento di 1 ordine:
somministrazione a uno specifico organo o tessuto.
Direzionamento di 2 ordine:
somministrazione a un tipo specifico di cellule entro un dato tessuto o organo (ad es.,
distinzione tra cellule tumorali e cellule normali)
Direzionamento di 3 ordine:
somministrazione a uno specifico compartimento intracellulare (ad es., ai lisosomi).
Sono stati fatti i seguenti approcci al direzionamento dei farmaci:
Del proiettile magico: il principio attivo allo stesso tempo potente e selettivo nei
confronti di un particolare sito di azione.
Del profarmaco: un derivato farmacologicamente inerte del principio attivo viene
attivato (trasformato nel principio attivo) da una reazione chimica o enzimatica quando esso
raggiunge il sito bersaglio.
Del missile magico: un sistema macromolecolare biologicamente inerte trasporta il
principio attivo al sito specifico di azione, dove il farmaco si accumula e produce il suo effetto.
Approccio del proiettile magico
Questo approccio non realistico e, come dice il nome, rientra pi nel campo della magia che
in quello della ricerca scientifica. Quindi non ci riguarda.
Approccio del profarmaco
I profarmaci possono offrire i seguenti vantaggi:
- Aumento di biodisponibilit dovuto a passaggio facilitato attraverso le biomembrane
- Somministrazione sito-specifica
- Prolungamento dellazione farmacologica
- Minori tossicit e effetti collaterali
- Miglioramento della formulazione
- Miglioramento delle propriet organolettiche

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Tipi di trasformazioni da farmaco a profarmaco sfruttando la reattivit di gruppi funzionali sulla
molecola del farmaco (F) per formare legami scindibili chimicamente o enzimaticamente:
Gruppo funzionale del F
OH

COOH

NH2
NH

Derivato
OCOR estere
OPO32 estere fosfato
OSO3 estere solfato
OCORN(R)2 dialchilamminoacil
OCOCH2SO3H sulfoacetil
OCOROCOR acilossiacil
OCONH2 carbamoil
Esteri
Ammidi
COOROCOR acilossialchil esteri
COOROCOORalcossicarbonilossialchil
esteri
Ammidi, peptidi
NCOOR carbammati
Sali di ammonio quaternario

N
CHCO
CONH2
CO
NH
CO

CCOCOR esteri enolici


NCH2OR con R = COCH3; PO32
idrossimetil esteri

Aumento della biodisponibilit e della velocit di attraversamento delle biomembrane


Se si considera la molecola del F liberata dal suo veicolo, una bassa biodisponibilit dovuta
a metabolismo sistemico o a una bassa velocit di assorbimento. Questultima pu essere
dovuta a:
1. Bassa permeabilit del F attraverso la biomembrana al sito di assorbimento (caso di
molecole troppo polari)
2. Bassa velocit di dissoluzione nei fluidi fisiologici al sito di assorbimento (caso di F troppo
poco solubili in acqua)
Il problema 1. pu essere risolto trasformando il F in un profarmaco meno polare, che ha un
coefficiente di ripartizione pi favorevole alla biomembrana, e quindi, una permeabilit
maggiore. Una volta attraversata la membrana, il F viene rigenerato dal profarmaco per
biotrasformazione ad opera di un enzima.
Questo approccio stato applicato allampicillina e ad altri antibiotici -lattamici.

ampicillina
La molecola dellampicillina in forma zwitterionica ai pH del tratto GI, per la salificazione
interna del gruppo amminico da parte del carbossile, e per questa polarit lassorbimento
orale solo del 30-40%. La parte non assorbita viene degradata dalla flora intestinale dando
luogo a effetti collaterali tossici. Nei profarmaci il gruppo carbossilico viene esterificato, cos
abbassando drasticamente la polarit della molecola:
profarmaci: FCOOR
R = CH2OCOC(CH3)3
pivaloilossimetil estere
(pivampicillina)

pivampicillina esterasi F + CH2O + acido pivalico

R = CHOCOOC2H5

bacampicillina esterasi

F + CH3CHO + CO2 + C2H5OH

talampicillina

F+

Si assunto che la CH2O


viene rapidamente trasformata in
CO2, quindi non produce danni.

CH3
-etossicarbonilossietil estere
(bacampicillina)
R=
esterasi

acido ftalaldeidico
ftalide
(talampicillina)
I gruppi estere di questi profarmaci vengono scissi dalle esterasi non specifiche.
Altra applicazione:

-metil DOPA (diidrossifenilalanina)


antiipertensivo orale

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Questo F scarsamente assorbito per la sua elevata polarit (forma uno zwitterione).
Profarmaco: FCOOCHOCOC(CH3) esterasi

FCOOCHOH + ac. pivalico

CH3
-etossipivaloil estere

CH3
scissione
rapida
F + CH3CHO

Il principio di diminuire la polarit e quindi aumentare la lipofilia del F stato applicato anche
per aumentare la permeabilit attraverso la cute e la barriera ematoencefalica.
Problema 2.: solubilit in acqua troppo scarsa.
Caso della fenitoina :
5,5-difenilidantoina (fenitoina, antiepilettico)

Profarmaci:
O
CH2OR

esterasi
NCH2OH + ROH
scissione
rapida
F + CH2O

idrossimetil esteri
R = COCH2N(CH3)3 CH3COOH
R = PO32- Na2+
I radicali R sono molto idrofili, quindi aumentano molto la solubilit, e quindi, la velocit di
dissoluzione nei fluidi fisiologici acquosi dei profarmaci rispetto al farmaco:
Lidrossimetil derivato della difenilidantoina si forma per reazione del suo gruppo N H acido
con CH2O, seguita da esterificazione del gruppo idrossimetilico.
Per evitare linattivazione pre-sistemica per metabolismo first-pass sono stati estesamente
sudiati F contenenti gruppi fenolici che subiscono tale inattivazione. Sono stati preparati
profarmaci con i gruppi fenolici protetti:

terbutalina (broncodilatatore)

Profarmaci:
CH3
R = CON
CH3
dimetilcarbamoil estere (Bambuterol)
R=
estere p-pivaloilossibenzoico
(D2438)

Lidrolisi di first pass scinde il legame pivaloilico,


mentre il F permane protetto dallestere
p-idrossibenzoico, che viene scisso dopo la
distribuzione

Somministrazione sito-specifica
Si possono fare due approcci:
1) Il profarmaco applicato direttamente al sito di assorbimento e la sua struttura molecolare
favorisce la permeazione attraverso la particolare membrana di tale sito.
2) Il profarmaco pu avere una diffusa distribuzione nellorganismo, ma viene attivato soltanto
al sito di azione a causa di una particolare propriet del sito stesso, ad es., il pH o unalta
attivit di particolari enzimi.
Il caso 1) si verifica quando la biomembrana che il F deve attraversare per esercitare la sua
azione la cornea o la cute. In questi casi il profarmaco deve favorire in modo specifico
lattraversamento di tali biomembrane.
Caso dellepinefrina

epinefrina
E usata contro il glaucoma. Lassorbimento corneale basso a causa dellelevata polarit
della molecola e della rapida degradazione metabolica.

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Profarmaco:

Dipivefrina

R = COC(CH3)3
Aumentato assorbimento transcorneale, con minore tossicit cardiovascolare in quanto pu
essere ridotta la dose.
Molti profarmaci sono stati proposti per aumentare la permeazione attraverso la pelle di
steroidi, 5-fluorouracile, 6-mercaptopurina, teofillina, metronidazolo.
Approccio 2):
F attivi nel colon vengono trasportati da profarmaci che rigenerano il F al sito, per via di
enzimi specifici.
Caso dellidrocortisone. Profarmaco:

glucoside dellidrocortisone con il galattosio


Il glucoside viene scisso dalla glucosidasi prodotta dalla flora batterica del colon rigenerando
il farmaco. Il glucoside idrofilo ha la funzione di trasportare il F attraverso il tratto GI
impedendo il suo assorbimento prima di arrivare al colon.
Questo approccio stato usato anche per prednisolone e desametasone. Pu essere usato
anche per F antiprotozoici, lassativi, antibatterici.
Caso dellacido 5-amminosalicilico (5-ASA).
Viene usato nella colite ulcerosa, ma se immodificato verrebbe assorbito prima di arrivare al
colon. Allora viene trasformato nel profarmaco Sulfasalazina:

Sulfasalazina

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Questo arriva fino al colon, dove lazo gruppo viene scisso dallenzima azoreduttasi con
formazione di due gruppi amminici. Si ha cos rigenerazione del 5-ASA, che esercita la sua
azione sulla colite ulcerosa, e formazione di un sulfamidico che viene assorbito nel colon
causando effetti collaterali indesiderati nel 20% dei pazienti.

Azodisal
Un profarmaco migliore lAzodisal sodio, meno tossico perch la scissione enzimatica
dellazo-gruppo genera due molecole di 5-ASA.
La somministrazione sito-specifica sistemica pi difficile da ottenere, in quanto il F deve
essere trasportato attraverso la circolazione sistemica al sito-bersaglio, superando varie
barriere. Uno sviluppo importante in questo campo il sistema redox diidropiridina-piridinio
per la somministrazione specifica allencefalo.

R un radicale alchilico, X un raggruppamento che permette lattacco del F al sistema di


trasporto.
Il diidroderivato lipofilo, somministrato per via sistemica, viene rapidamente distribuito
nellorganismo, compreso il cervello. Nellorganismo, tale derivato viene ossidato alla forma
quaternaria (ione piridinio), la quale viene rapidamente eliminata dallorganismo, mentre la
barriera ematoencefalica impedisce leliminazione dello ione piridinio dallencefalo. Gli enzimi
presenti nellencefalo scindono il composto quaternario, rigenerando il F, mentre il
trasportatore, avendo basso peso molecolare, viene gradualmente escreto.
Somministrazione sito-specifica nel rene.
Nel rene lenzima -glutamil transpeptidasi, presente in elevata concentrazione, scinde i glutamil derivati di F con funzioni amminiche. E stato studiato in modelli animali il -glutamil
derivato dellL-DOPA come profarmaco per la somministrazione nel rene. In effetti il F veniva
rigenerato selettivamente nel rene. La L-DOPA rigenerata nel rene viene poi trasformata in
dopamina dalla decarbossilasi degli L-amminoacidi, anchessa presente nel rene.

-glutamil derivato di L-DOPA


La dopamina nel rene causa vasodilatazione e quindi diuresi. Questi risultati hanno indicato
che vari F possono essere indirizzati al rene e nel tratto urinario convertendoli nei rispettivi glutamil derivati. Un altro esempio il sulfametossazolo, il cui -glutamil derivato si
dimostrato un antibatterico specifico.
Direzionamento verso cellule tumorali (2 ordine).
E stato riportato che la -glucosidasi presente in maggiore quantit nelle cellule tumorali
che in quelle normali: derivati glucosidici di antitumorali sono considerati profarmaci selettivi.
Caso del 5-fluorouracile:

5-fluorouracile
Profarmaco:

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Caso della 6-mercaptopurina:

6-mercaptopurina
Profarmaco:

Prolungamento dellazione del F


Questo problema opposto a quello dellaumento della biodisponibilit. Oltre ai sistemi
farmaceutici a rilascio modificato, trattati nel corso di Chimica Farmaceutica Applicata, si
possono usare profarmaci di caratteristiche fisico-chimiche adatte a rallentare lassorbimento,
ad es. diminuendo la solubilit per rallentare la dissoluzione. Derivati adatti sono esteri o
ammidi che aumentano la lipofilia.
Diminuzione della tossicit o effetti indesiderati
Certi problemi specifici di tossicit possono essere risolti con i profarmaci. Leffetto ulcerativo
dei FANS dovuto al carbossile presente nella loro molecola. I metilesteri di aspirina, acido
flufenamico, indometacina non causano ulcerazione. Altri profarmaci di FANS sono trigliceridi
sostituiti nella posizione 2 della glicerina con il FANS (casi dellaspirina, naproxen,
indometacina).
Miglioramento della formulazione
In particolare, si tratta di rendere possibile la formulazione di soluzioni acquose dei F per fare
preparati iniettabili. Si aumenta la idrosolubilit e i profarmaci devono essere chimicamente
stabili in soluzione acquosa.
I profarmaci sono esteri solubili: FOR
R = COCH2CH2COO
emisuccinato
2
R = PO3
fosfato
R = COCH2NRR
N,N-dialchilglicinato
Caso in cui il profarmaco aumenta la stabilit chimica in soluzione acquosa:

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lampicillina molto instabile in soluzione acquosa in quanto il gruppo amminico della catena
laterale attacca lanello -lattamico di una seconda molecola dando luogo a formazione di
resine. Il profarmaco Etacillina blocca tale ammino gruppo mediante reazione con acetone:

Etacillina
In soluzione acquosa concentrata il profarmaco stabile. Quando la soluzione viene diluita
nei fluidi dellorganismo viene rigenerato il F con liberazione di acetone per idrolisi chimica.
Approccio del trasportatore polimerico (missile magico)
Il polimero trasportatore (carrier) biologicamente inerte, e pu essere:
- Trasportatore particellare
- Trasportatore solubile
Il F pu essere:
- Intrappolato nel trasportatore a livello molecolare
- Legato al trasportatore con legame covalente (coniugato F-carrier)
Il vantaggio del trasportatore polimerico che la distribuzione del F nellorganismo dipende
dalle propriet fisico-chimiche del carrier e non da quelle del F, quindi il direzionamento
(targeting) pu essere realizzato scegliendo un appropriato carrier.
Il targeting pu essere:
- Passivo (TP)
- Attivo (TA)
- Fisico (TF)
Il TP si basa sul naturale modello di distribuzione del sistema F-carrier. Ad es., particelle di
dimensioni 5 m sono prontamente allontanate dal sangue dai macrofagi del MPS
(mononuclear phagocyte system). Questo meccanismo naturale di difesa del MPS d
lopportunit di indirizzare il F, incapsulato in, o coniugato con un appropriato carrier, verso i
macrofagi con localizzazione finale nel fegato (cellule di Kupffer).
Altro esempio di TP: il bloccaggio, da parte dei capillari di un certo organo, di carrier di grosse
dimensioni particellari pu essere sfruttato per indirizzare il F a quellorgano, ad es., ai
polmoni tramite il flusso venoso, o ad altri organi tramite il flusso arterioso. Leffetto
farmacologico nellorgano bersaglio (target) si ottiene poi mediante il rilascio controllato del F
dal carrier.
Il TP consiste anche nella somministrazione del sistema F-carrier direttamente a un
particolare organo (regione del tratto GI, occhi, naso, bocca, articolazione, polmoni, vagina,
retto, tratto respiratorio, pelle, ecc.)
Il TA impiega una molecola/particella F-carrier appositamente designata per riconoscere e
interagire con un particolare tipo di cellule, tessuto, organo. La progettazione del carrier pu

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prevedere e prestabilire il PM (peso molecolare) le propriet superficiali, lincorporazione di
anticorpi antigene-specifici, lattacco di ligandi recettore-specifici.
Il TF si ha quando il sistema F-carrier rilascia il F solamente quando si trova in un
microambiente specifico per pH, temperatura, campo magnetico applicato dallesterno.
Sistemi F-carrier particellari
Il concetto di usare particelle per somministrare F a siti specifici si originato dal loro uso
come agenti radiodiagnostici per fegato, milza, midollo spinale, noduli linfatici, tratto GI, ecc.
Sistemi multiparticellari vengono introdotti nella circolazione centrale per iniezione
endovenosa, o somministrati a un dato organo, ad es., per iniezione in una articolazione, per
aerosol ai polmoni o al naso. La via sottocutanea stata usata per la somministrazione al
sistema linfatico.
Con i sistemi particellari si ha TP, il quale dipende da dimensioni, forma, carica superficiale,
idrofobicit superficiale delle particelle. Dopo somministrazione endovenosa particelle >7 m
vengono trattenute nei pi piccoli capillari dei polmoni, mentre particelle <7 m (2-7 m)
passano attraverso tali capillari e vengono intrappolate nel reticolo dei capillari del fegato e
della milza.
Le particelle possono essere iniettate anche nelle arterie e vengono trattenute nel primo
reticolo di capillari che incontrano (targeting di 1 ordine). Ad es., liniezione nellarteria
mesenterica porta allintrappolamento delle particelle nellintestino, liniezione nellarteria
portale porta al fegato, larteria renale porta allintrappolamento nei reni. Nel caso che
lorgano porti un tumore questo approccio pu portare alla localizzazione nelle cellule
tumorali.
Particelle di 0.05-2 m vengono rapidamente allontanate dal sangue (emivita <1 min) ad
opera dei macrofagi con localizzazione finale nel fegato (cellule di Kupffer). Particelle con
carica negativa vengono allontanate dal sangue pi rapidamente delle neutre o positive. La
velocit dellallontanamento dipende anche dalla dose di particelle ed pi bassa a dosi pi
alte.
Per evitare lendocitosi da parte dei macrofagi le particelle sono state legate ad anticorpi
monoclonali, a glicoproteine, immunoglobuline, per evitare loro di essere riconosciute come
estranee dal MPS, e per ottenere il TA di 2 ordine verso cellule specifiche, anche tumorali.
Oppure sono state modificate in superficie con tensioattivi non ionici in modo da evitare
lendocitosi da parte dei macrofagi.
Il targeting del carcinoma della prostata e della vescica stato fatto mediante particelle
polimeriche con incorporata una sostanza ferromagnetica (ad es. Fe 3O4) per poter indirizzare
le particelle al tumore con un campo magnetico esterno (esempio di TF)
Microparticelle e nanoparticelle
Sono state definite microparticelle quelle di dimensioni >1 m, ma abbastanza piccole da non
sedimentare in acqua.
Sono state definite nanoparticelle quelle di dimensioni nellintervallo 10-1000 nm (0.01-1 m)
I metodi di preparazione pi comuni sono:
1. Polimerizzazione in emulsione
2. Polimerizzazione in micelle
3. Polimerizzazione interfacciale
4. Coacervazione
5. Evaporazione del solvente e estrazione del solvente

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Metodo 1. Polimerizzazione in emulsione
La miscela di F e monomero viene riscaldata sotto vigorosa agitazione in una fase (acquosa
o non) contenente un iniziatore di polimerizzazione, un tensioattivo (di solito al disopra della
CMC) e uno stabilizzante dellemulsione. In questo modo si ha una dispersione, nella fase
continua, di goccioline di monomero inglobanti il F e avviene la polimerizzazione del
monomero per dare particelle polimeriche, contenenti il F, di dimensioni che possono anche
essere <1 m. Un inconveniente importante di questo metodo la presenza di monomero
residuo.
Metodo 2. Polimerizzazione in micelle
Come il metodo 1., tranne che il F, il monomero e liniziatore sono inglobati nelle micelle del
tensioattivo, prima che cominci la polimerizzazione, che avviene allinterno delle micelle. Il
metodo consente di ottenere particelle polimeriche non pi grandi delle micelle.
Metodo 3. Polimerizzazione interfacciale
I monomeri reagiscono allinterfaccia tra due fasi liquide immiscibili per dare un film di
copolimero che incapsula la fase dispersa. Lo stadio iniziale lemulsionamento di una fase
acquosa contenente un monomero e il F in una fase continua non acquosa. Quindi viene
aggiunto un secondo monomero alla fase continua: i monomeri copolimerizzano allinterfaccia
e si ottengono microcapsule contenenti il F.
Metodo 4. Coacervazione
Si tratta della denaturazione e desolvatazione per riscaldamento o per via chimica di proteine
o carboidrati naturali in soluzione contenente il F. I F insolubili possono essere microsospesi. I
polimeri naturali denaturandosi e desolvatandosi si aggregano e precipitano formando
microparticelle che contengono il F (coacervi).
Metodo 5. Evaporazione o estrazione del solvente
Il polimero pre-formato e il F vengono sciolti in solvente organico e la soluzione viene
emulsionata in acqua o olio sotto agitazione. Per successiva evaporazione o estrazione del
solvente dalla fase dispersa si ottengono particelle solide disperse di polimero contenente il F.
Per ciascuno di questi metodi, dopo la preparazione delle particelle occorrer un metodo per
isolarle e raccoglierle. I prodotti risultanti dalle suddette preparazioni sono polveri sterili
ottenute per liofilizzazione e di solito contengono 0.1% di tensioattivo non ionico per favorire
la ridispersione in soluzione fisiologica, la quale viene somministrata per iniezione.
Materiali pi importanti per la preparazione di TDS (Targeted Delivery System) particellari
Materiali di origine naturale:
albumina, amido, gelatina, lipoproteine.
Materiali di sintesi:
poliacrilammide (PAAm): (CH2CH)n
CO
NH2

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CN
polialchilcianoacrilati: (CH2C)n
COOR
R = radicale alchilico
CH3
polimetilmetacrilato (PMMA): ( CH2C)n
COOCH3
CH3
poli(acido lattico) (PLA). (OCHCO)n
R
copolimero acido lattico-acido glicolico (PLGA): (OCHCO)n
R = H, CH3
Rilascio dalle e stabilit delle particelle
Il rilascio interpretabile caso per caso con i principi di base illustrati nel corso di Chimica
Farmaceutica Applicata. Riassumendo, per microsfere monolitiche esso pu essere
determinato da:
1. Erosione superficiale del polimero
2. Disintegrazione della particella
3. Rigonfiamento del polimero
4. Desorbimento delle molecole di F adsorbite in superficie, e poi, diffusione del F dallinterno
allesterno della particella
5. Scambio ionico del F adsorbito sul polimero ionico con ioni penetrati dai fluidi fisiologici
esterni, e poi, diffusione del F liberato dallinterno allesterno della particella.
La disintegrazione in genere causata dallattacco enzimatico. E necessario un equilibrio tra
stabilit e biodegradabilit. Per questo opportuno un grado di reticolazione (crosslinking)
controllato del polimero. Il grado di crosslinking pu influire sul rilascio dei farmaci dalle
particelle in quanto influisce sulla biodegradazione e sul rigonfiamento del polimero, nonch
sulla diffusione del F nel polimero. Naturalmente, il rilascio dipende anche dalla superficie
specifica, e quindi, dalle dimensioni delle particelle, a meno che queste non si disintegrino.
Tossicit delle particelle
La tossicit dovuta alla natura dei materiali generalmente impiegati bassa, alle dosi
studiate. La tossicit dipende molto, e in modo diretto, dalle dimensioni e, a parit di
dimensioni, dal numero di particelle somministrate.
Microparticelle (dimensioni >1 m)

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Un esempio costituito da microsfere biodegradabili di amido (sistema SPHEREX ). Il
materiale amido di patate idrolizzato. Le microsfere (diametro medio 45 m) vengono
preparate per reticolazione del polimero con epicloridrina con il metodo della reazione in
emulsione (vedi sopra):
O
ClCH2CHCH2
epicloridrina

OH OH

OH

[ ClCH2CHCH2 ]
instabile

Cl(CH2CHCH2O)nH
oligomero
ROH

OH
RO(CH2CHCH2O)nR
legame crociato tra due
catene di amido
ROH = catena di amido con evidenziato un ossidrile reattivo
Si apre il gruppo epossidico dellepicloridrina dando luogo a un diolo vicinale instabile che
polimerizza risultando in un oligomero con n unit di ripetizione. Ciascuna delle due estremit
reattive della molecola di oligomero condensa con un ossidrile di una catena di amido dando
luogo a un legame crociato, e quindi, a reticolazione. Un oligomero ha una molecola
composta di poche unit di ripetizione (oligos greco per poco).
Le particelle rigonfiano in acqua per dare particelle di idrogel. Queste provocano ischemia
temporanea nei tessuti di organi bersaglio (targeting di 1 ordine) dopo appropriata infusione
arteriale. Ci stato dimostrato da studi sul fegato (arteria portale), intestino (arteria
mesenterica) e altri organi di modelli animali. Le microsfere restano intrappolate nelle arteriole
dellorgano-bersaglio. Se nella sospensione delle microsfere disciolto un F, questo viene
ritenuto nellorgano per il tempo in cui il flusso ematico bloccato o considerevolmente
ridotto. Se in tale tempo il F pu attraversare la parete dei capillari e penetrare nelle cellule
dellorgano il targeting realizzato. Questo stato applicato in pazienti con cancro al fegato,
iniettando carmustina insieme alle microsfere nellarteria epatica.

ClCH2CH2NHCONCH2CH2Cl
NO
carmustina (N,Nbis(2cloroetil) Nnitrosourea)
Si osservata una notevole riduzione dellesposizione sistemica al F e anche picchi di
concentrazione sistemica.
Altri risultati incoraggianti sono stati ottenuti in modelli animali con doxorubicina (adriamicina),
5-fluorouracile, direzionati al fegato, e actinomicina D e altri F direzionati al rene attraverso
larteria renale.
Le microsfere vengono poi degradate dallamilasi.

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Tossicit: le dosi di microparticelle proposte per luso clinico possono essere ritenute sicure.
Microsfere biodegradabili di albumina del siero umano (HSA) per iniezione intraarteriale
Preparazione con il metodo dellestrazione del solvente:
Una soluzione di HSA+F in tampone isotonico pH 7 viene dispersa per agitazione in un
eccesso di olio di oliva. Si aggiunge etere etilico che disidrata la fase dispersa in modo che le
goccioline disperse si trasformano in microsfere di 1-50 m. Usando oli pi viscosi si possono
ottenere particelle pi piccole (0.1-1 m).
Queste particelle sono state stabilizzate per reticolazione della HSA con glutaraldeide
(OHC(CH2)3CHO), che viene aggiunta alla soluzione acquosa.
Pi di 90 farmaci sono stati incorporati in questo tipo di particelle. Farmaci poco solubili in
acqua sono stati incorporati facendone una microsospensione. In tal caso le dimensioni delle
microsfere salgono a 100 m.
Il rilascio dei farmaci da queste particelle, studiato in vitro, ha mostrato un rapido rilascio
iniziale (burst effect), dovuto a desorbimento delle molecole di F adsorbite in superficie,
seguito da lento rilascio di 1 ordine, dovuto a diffusione del F dallinterno allesterno della
particella. Particelle di dimensioni <1 m danno un rilascio troppo rapido per essere di
interesse terapeutico.
Le microsfere sono biodegradabili per attacco enzimatico in vivo. Questo pu influire sul
rilascio se questo abbastanza lento rispetto alla degradazione.
Nanoparticelle
Le dimensioni particellari sono nellintervallo 10-1000 nm.
Nanoparticelle di PMMA
Sono stati usati due metodi di preparazione:
1) Polimerizzazione radicalica per irraggiamento di una soluzione acquosa di monomero
MMA + F con raggi gamma.
2) Polimerizzazione radicalica del monomero MMA in soluzione acquosa in presenza del F e
di persolfato di ammonio ((NH4)2S2O8) come iniziatore radicalico, riscaldando a circa 65 C
C la possibilit che il F rimanga legato al polimero con legami covalenti. In questo caso
questi devono poter essere scissi in vivo in modo da liberare il F.
Il PM del PMMA e le dimensioni delle nanoparticelle aumentano con la concentrazione del
monomero. Questultima, tuttavia, non supera la sua solubilit in acqua che 1.5%. A parit
di temperatura e concentrazione di monomero, aumentando la concentrazione delliniziatore
aumenta il numero di radicali di nucleazione e diminuisce il PM. Nella miscela di
polimerizzazione possono anche essere presenti agenti biologici per il TA, se sono resistenti
alle condizioni di reazione.
La biodegradazione di PMMA molto lenta, quindi queste nanoparticelle sono adatte per
vaccini per prolungata immunizzazione
Nanoparticelle di polialchilcianoacrilati
Preparazione:
Il monomero viene disperso in mezzo acquoso sotto vigorosa agitazione e avviene la
polimerizzazione con il seguente meccanismo:

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CN
OH + CH2+C-

CN
HOCH2C + monomero

COOR

COOR

CN
CH2C + H
COOR

alchilcianoacrilato
monomero
CN
HO(CH2C)nH
COOR
polialchilcianoacrilato
R = radicale alchilico
La polimerizzazione iniziata dagli OH dellacqua (o da farmaci basici). Poich rapida, per
far formare nanoparticelle occorre dare importanza alla reazione di termine, mantenendo pH
acido. Questo rende basso il peso molecolare del polimero per cui le particelle sono molto
morbide e tendono ad agglomerarsi. Allora necessario un emulsionante per stabilizzarle.
I farmaci presenti nella soluzione acquosa vengono inglobati durante la polimerizzazione.
Farmaci basici possono rimanere legati alla catena polimerica con legami covalenti. Se si
vuole evitare questo, i farmaci vengono introdotti per ripartizione nelle nanoparticelle gi
polimerizzate.
Nanoparticelle di polialchilcianoacrilato in forma di nanocapsule sono state fatte per
polimerizzazione interfacciale:
Il monomero e il F vengono sciolti in olio + etanolo e la soluzione aggiunta lentamente a
una fase acquosa contenente tensioattivi. Lacqua fa iniziare la polimerizzazione allinterfaccia
con le goccioline di olio, per cui si formano nanocapsule costituite da goccioline di olio
contenenti F, circondate da una parete polimerica formata per polimerizzazione anionica.
La biodegradazione del polimero rapida e leliminazione dallorganismo avviene nellarco di
pochi giorni. Il gruppo estere viene idrolizzato e il risultante poliacido si scioglie e viene
eliminato grazie al basso PM del polimero. Si ha erosione superficiale delle nanoparticelle.
Le nanoparticelle di polialchilcianoacrilato esercitano un leggero effetto tossico sulle cellule
con cui interagiscono. La tossicit dipende dal PM del radicale R e si esercita in quanto in
vivo questo viene scisso dal polimero con formazione di ROH. Si trovato che ROH a pi alto
PM sono meno tossici.
Nanoparticelle di gelatina, sieroalbumina bovina (BSA) e umana (HSA), caseina, etilcellulosa
sono state preparate per desolvatazione delle macromolecole. La desolvatazione pu
avvenire per cambiamenti di carica, di pH, o per aggiunta di agenti desolvatanti, come
etanolo, solfato di sodio o ammonio ("salting out"). La desolvatazione provoca precipitazione
o coacervazione. Prima della separazione di fase le macromolecole cambiano conformazione
contraendosi. I farmaci possono essere legati a siti di binding delle proteine. Le particelle
possono essere indurite per reticolazione con aldeide glutarica (OHC(CH2)3CHO).

17
Liposomi
I liposomi sono trasportatori microparticellari o colloidali di farmaci.
- Dimensioni, 0.05-5.0 m
- Si formano spontaneamente quando certi lipidi vengono idratati in mezzi acquosi
- Sono composti di materiale relativamente biocompatibile e biodegradabile
- Consistono in vescicole in cui un volume acquoso intrappolato in uno o pi doppi strati
di lipidi naturali e/o sintetici. La grandezza delle vescicole critica nel determinare
lemivita di circolazione ematica. La grandezza e il numero dei doppi strati influenza il
grado di incapsulazione dei farmaci
- Farmaci di molto varia lipofilicit possono essere incapsulati nei liposomi, o nel doppio
strato (bilayer) lipidico, o nel volume acquoso intrappolato, o allinterfaccia tra bilayer e
volume acquoso. I farmaci lipofili sono i pi adatti ad essere intrappolati e danno meno
problemi nei processi a cui i liposomi sono sottoposti. Per questo sono stati preparati
profarmaci lipofili
- Sono stati introdotti in liposomi farmaci: antineoplastici, antimicrobici, agenti chelanti,
steroidi, vaccini, sostanze genetiche.

Rappresentazione schematica di una vescicola liposomiale con ingrandimento del bilayer


lipidico. Ogni lipide rappresentato con un circoletto (testa polare) e due serpentine (code
apolari idrocarburiche). Dal punto di vista delle dimensioni i liposomi sono classificati in LUV
(Large Unilamellar Vesicles) (>0.1 m);
SUV (Small Unilamellar Vesicles) (<0.1 m);
MLV (Multi Lamellar Vesicles) (>0.1 m) in cui il volume acquoso intrappolato da pi di un
bilayer;
MVV (Multi Vesicular Vesicles) (>1 m) in cui pi vescicole sono racchiuse luna nellaltra:

Schema di MVV

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La maggior parte dei lipidi presenti nei doppi strati dei liposomi convenzionali sono fosfolipidi
naturali. Questi rappresentano pi del 50% del peso dei lipidi presenti nelle membrane
biologiche.
La spina dorsale (backbone) della molecola la struttura della glicerina due dei cui ossidrili
sono esterificati con acidi grassi insaturi (code lipofile), mentre il terzo esterificato con
fosfato a cui attaccato un residuo R (testa polare) che d il nome al fosfolipide (o fosfatide).

R1 e R2 = catene di acidi grassi


R = CH2CHOHCH2OH, fosfatidilglicerina (FG)
R = CH2CH2N+H3, fosfatidiletanolammina(FE)
R = CH2CH2N+(CH3)3, fosfatidilcolina (lecitina) ( FC)
R = CH2CHCOOH, fosfatidilserina (FS)
NH2
R=

, fosfatidilinositolo (FI)

I pi abbondanti fosfatidi nel regno vegetale e animale sono la lecitina e la


fosfatidiletanolammina, che sono la pi importante parte strutturale delle membrane
biologiche.
Gli R1 e R2 differiscono nel numero di atomi di C e nel grado di insaturazione.
Fosfolipidi sintetici
Dipalmitoil, distearoil, dioleil derivati:
dipalmitoil: R1 = R2 = C15H31
distearoil: R1 = R2 = C17H35
dioleil: R1 = R2 = C17H33
La distribuzione nei tessuti e leliminazione dei liposomi dipende dalla composizione del
bilayer lipidico e dalla carica superficiale. Una maggiore intensit di carica allunga i tempi di
sopravvivenza dei liposomi nella circolazione sanguigna.

19
Nel bilayer dei liposomi viene introdotto colesterolo che esercita diverse funzioni.

Struttura del colesterolo


Le funzioni del colesterolo nel bilayer sono le seguenti:
1. Aumentare la fluidit del bilayer
2. Ridurre la permeabilit del bilayer alle molecole idrosolubili (farmaci) intrappolate nel
volume acquoso dei liposomi
3. Aumentare la stabilit del bilayer nei fluidi biologici, come il sangue. I liposomi privi di
colesterolo tendono a reagire con le proteine plasmatiche, per cui ne viene ridotta lutilit
come sistemi di somministrazione di farmaci.
Nel doppio strato il colesterolo si orienta tra le molecole dei fosfolipidi con lOH rivolto verso la
fase acquosa
Formazione dei liposomi
Non tutti i fosfolipidi formano strutture vescicolari a doppio strato. Possono formarsi altre
forme di aggregati per abbassare lenergia libera delle molecole anfifiliche in soluzione
acquosa(ad es., micelle) aventi propriet completamente differenti dai liposomi. La capacit di
formare doppi strati dipende dalla forma molecolare. In particolare importante se larea della
superficie occupata dalla testa polare idratata del lipide minore o maggiore dellarea della
superficie occupata dalla coda lipofila.
Nella seguente tabella il tipo di lipide correlato con il tipo di aggregato a cui d luogo in
soluzione acquosa..
Lipide
Lipidi a catena singola (lisofosfolipidi) con
grosse teste polari
Lipidi a catena singola, con teste polari
piccole (poco idratate per la presenza di sali)
Lipidi a catena doppia (fluida) con grosse
teste polari (fosfatidi naturali, come FC, FS,
FG, FI)
Lipidi a catena doppia (satura, gelificata) e
piccole teste polari (poco idratate per la
presenza di sali) (FE satura, FS+Ca2+)
Lipidi a doppia catena (insatura) con piccola
testa polare (FE insatura)

Tipo di aggregato
Micelle sferiche
Micelle cilindriche
Doppi strati a vescicola (liposomi)
Doppi strati planari
Micelle inverse

20
Se si cambia il pH o la temperatura pu cambiare il tipo di aggregato.
Il tipo di aggregato cambia se si fa una miscela di lipidi. Ad es.:
la liso-FC, che tende a formare micelle, in miscela con acidi grassi forma liposomi;
la FE, che tende a formare micelle inverse, in miscela con colesterolo pu formare liposomi.
Una caratteristica importante nel processo di formazione dei liposomi la rigidit del bilayer.
Questo pu essere in uno stato liquido cristallino (fluido) o in uno stato gelificato (rigido).
Esiste una temperatura critica ,Tc, alla quale si ha transizione da uno stato allaltro. La Tc
dipende:
1. Dalla lunghezza della catena acilica
2. Dal grado di insaturazione di tale catena
3. Dalla testa polare
La Tc pu variare da 15 C (caso della FC del tuorlo duovo, in cui le catene aciliche hanno
elevato grado di insaturazione e varia lunghezza) fino a pi di 50 C per la distearoil-FC. Per
la formazione dei liposomi si scelgono condizioni in cui si generano doppi strati nello stato
liquido-cristallino.
Come si visto, il colesterolo un usuale componente del doppio strato dei liposomi. Esso
tende ad abbassare la Tc della transizione gel-liquido al disotto della temperatura ambiente.
Limpacchettamento del bilayer viene aumentato e la sua permeabilit viene ridotta dal
colesterolo.
I liposomi costituiti solo da fosfolipidi neutri (ad es., la FC) non si formano spontaneamente,
ma c bisogno di fornire energia. Una volta formati, questi liposomi sono intrappolati in
cosiddette trappole cinetiche metastabili in cui possono esistere anche per tempi molto
lunghi, pur non essendo termodinamicamente stabili. Nel caso di liposomi
termodinamicamente instabili il metodo di preparazione influenza la loro struttura.
Invece, i fosfolipidi portanti carica elettrica (come ad es., la FG, carica negativamente) in certe
condizioni formano liposomi spontaneamente.
In soluzione i liposomi si comportano come colloidi. Due popolazioni di liposomi di carica
opposta tendono ad aggregarsi, con una velocit dipendente dalle forze di attrazione tra le
particelle. Il fenomeno pu essere controllato tramite aggiunta di piccole quantit di lipidi acidi
o basici alla formulazione.
Sulla base della composizione e del meccanismo di rilascio intracellulare del farmaco i
liposomi si possono classificare in:
1. Convenzionali
2. pH-sensibili
3. Cationici
4. Immunoliposomi
5. A lunga circolazione
1) Liposomi convenzionali (CL)
Sono costituiti da fosfolipidi neutri e/o carichi negativamente, pi colesterolo. I farmaci
contenuti in questi liposomi possono diffondere, dopo lendocitosi da parte delle cellule,
dallendosoma al citoplasma, oppure essere rilasciati nei lisosomi dove i bilayer sono distrutti.
Questi liposomi sono utili per il targeting del MPS, dal quale sono assorbiti molto
rapidamente.
2) Liposomi pH-sensibili

21
Sono formulati con FE o dioleil-FE e colesteril emisuccinato o acido oleico. Questi liposomi
portano nel loro bilayer il carbossile del colesteril emisuccinato o dellacido oleico, per questo
sono pH-sensibili. Subiscono endocitosi, poi, al pH acido dellendosoma si fondono con la
membrana dellendosoma e rilasciano il farmaco nel citoplasma. Questi liposomi sono adatti a
somministrare allinterno delle cellule basi deboli (che interagiscono con i carbossili nel
doppio strato) e macromolecole.
3) Liposomi cationici
Il bilayer costituito da lipidi cationici (testa polare carica positivamente). Esempi:
(C18H37)2N+(CH3)2 Br (o Cl)
O-oleil
CH2CHCH2N+(CH3)3 Cl
O-oleil

CH3(CH2)7CHCH(CH2)7 CO
oleil

O-miristil CH3
CH2CHCH2N+CH2CH2OH Br
O-miristil

CH3

CH3(CH2)12CO
miristil

Nel bilayer dei liposomi, lipidi cationici di questo tipo si trovano insieme a dioleil-FE.
Dopo lendocitosi da parte della cellula il bilayer del liposoma si fonde con la membrana
dellendosoma e il farmaco contenuto nel liposoma viene rilasciato nel citoplasma.
Questi liposomi sono adatti alla somministrazione intracellulare di macromolecole cariche
negativamente (DNA, RNA). Tuttavia essi sono strutturalmente instabili, sono tossici a dosi
elevate, per cui il loro uso limitato alla somministrazione locale.
4) Liposomi a lunga circolazione (LCL)
Sono costituiti da fosfolipidi neutri ad alta Tc, colesterolo, e 5-10% di distearil-FE coniugata
con PEG (PM 1900-5000). Le dimensioni dei liposomi sono 0.1 m. Il PEG pu essere
attaccato alla distearil-FE via carbammato: lipideNHCOO(CH2CH2O)nH
La catena idrofila del PEG che riveste la superficie del liposoma rallenta molto lendocitosi da
parte dei macrofagi del MPS. Lemivita di circolazione di circa 40 ore.
5) Immunoliposomi
Si tratta di liposomi convenzionali o a lunga circolazione con attaccati anticorpi
(immunoglobuline). Proteine possono essere attaccate ai liposomi in condizioni blande senza
perdita di attivit e senza che avvenga aggregazione dei proteoliposomi tramite crosslinking.
Questi liposomi sono soggetti a endocitosi mediata da un particolare recettore, dunque, sono
adatti al TA di 2 ordine.

22
Preparazione dei liposomi
Le diverse tecniche di preparazione hanno in comune i seguenti passaggi:
1) I lipidi devono essere idratati
2) I liposomi devono essere dimensionati
3) Il farmaco non incapsulato deve essere allontanato.
In alcuni metodi di peparazione i passaggi 1) e 2) sono combinati. In alcuni casi il farmaco
completamente associato con i liposomi, quindi eliminato il passaggio 3).
1) Idratazione dei lipidi
a) Metodo meccanico
Un sottile film lipidico viene depositato da una soluzione in solvente organico sulla parete di
un pallone di vetro (evaporatore rotante). Il film viene idratato sotto agitazione a temperatura
superiore alla Tc del fosfolipide avente la pi alta Tc.
In questo modo si ottengono MLV con ampia distribuzione dimensionale, che pu essere
ristretta per estrusione a bassa pressione, o tramite ultrasuoni, passando da MLV a SUV. La
durata dellidratazione, pi che lintensit dellagitazione, determina direttamente la quantit
del volume acquoso intrappolato. Lidratazione e lintrappolamento sono tanto pi efficienti
quanto pi sottile il film lipidico secco depositato. Per renderlo sottile aumentando la sua
superficie esso pu essere fatto depositare sulla superficie di palline di vetro. Dunque, a
parit di composizione e concentrazione dei lipidi, differenti tempi di idratazione, spessori del
film lipidico, metodo meccanico di sospensione dei lipidi, portano a MLV molto differenti. Lipidi
carichi negativamente (FS, FG, FI) tendono ad aumentare la distanza interlamellare nelle
MLV, portando a un maggiore volume intrappolato totale. Lipidi carichi tendono a far
respingere i liposomi tra loro e quindi riducono la probabilit di aggregazione delle MLV.
b) Metodi basati sulla sostituzione di solventi organici con mezzi acquosi
I lipidi vengono sciolti in solvente organico e quindi la soluzione viene posta a contatto con
una fase acquosa. Successivamente, il solvente organico viene allontanato. I liposomi si
formano durante la fase di allontanamento del solvente. Le caratteristiche dei liposomi
dipendono dal procedimento usato.
Se il solvente organico immiscibile con la fase acquosa (etere etilico, cloroformio, freon) lo
stadio intermedio unemulsione.
Se il solvente organico miscibile con lacqua (etanolo) la formazione dei liposomi avviene
quando la concentrazione del solvente scende al disotto di un valore critico.
Il contenuto in solvente organico residuo accettabile nel prodotto finito dipende dal tipo di
solvente e dalla via di somministrazione. Per lallontanamento del solvente organico si usa in
genere levaporazione.
Caso di solvente immiscibile con acqua.
Un procedimento molto usato la cosiddetta tecnica REV (Reverse-phase Evaporation
Vesicles). Le vescicole REV sono liposomi unilamellari o oligolamellari. Si formano per
evaporazione controllata del solvente organico da unemulsione A/O (fase acquosa dispersa
nella fase oleosa), formata sottoponendo a ultrasuoni una soluzione di lipidi in solvente
organico (etere etilico, cloroformio) insieme a un tampone acquoso in difetto. Perch la
formazione di REV sia riproducibile determinante che sia appropriata e riproducibile
lemulsione A/O. Lo stadio critico si ha quando la maggior parte del solvente organico stata
allontanata: allora si forma un gel che richiede una agitazione vigorosa per essere
trasformato in un fluido viscoso contenente i liposomi. Presumibilmente, il collassamento del

23
gel coincide con la conversione dellemulsione A/O nella forma liposomiale. Aggiustando
adeguatamente le proporzioni solvente/acqua/lipidi si ottengono REV unilamellari. La tecnica
REV stata usata per incapsulare molecole piccole e grandi. RNA e vari enzimi sono stati
incapsulati senza perdita di attivit.
Caso di solvente miscibile con acqua
Una soluzione dei lipidi in etanolo viene iniettata nel tampone acquoso. La diluizione del
solvente con lacqua porta alla precipitazione dei lipidi, che si aggregano formando i liposomi.
Se liniezione rapida si formano SUV di 25 nm, se lenta le dimensioni sono maggiori.
Questa tecnica comporta i seguenti svantaggi:
- La bassa solubilit di molti lipidi in etanolo limita la concentrazione dei liposomi.
- Con i farmaci idrofili, che danno luogo a scarsa interazione con il doppio strato, lefficienza
di incapsulamento nei liposomi bassa.
- La rimozione quantitativa delletanolo dal doppio strato difficoltosa.
c) Metodi basati sulla rimozione del detergente
Dapprima vengono fatte formare micelle miste di detergenti con i componenti che si vogliono
inserire nel doppio strato (fosfolipidi, composti lipofili, proteine anfifiliche). Successivamente, il
detergente viene allontanato dalle micelle che diventano progressivamente pi ricche di lipidi
e infine formano vescicole unilamellari.
La rimozione del detergente pu essere indotta per diluizione, filtrazione su colonna di gel,
dialisi, aggiunta di adsorbenti. Il fenomeno della setacciatura molecolare un fattore
essenziale nella filtrazione su gel. Si usano particelle di idrogeli di destrano reticolato
(Sephadex). La grandezza e la forma delle molecole dei soluti determinano la loro
distribuzione tra idrogel e solvente interstiziale. Lavando la colonna in cui sono impaccate le
particelle di idrogel con acqua i componenti della miscela migrano a velocit differente e alla
fine compaiono nel filtrato in successione, in ordine decrescente di PM.
I detergenti usati in questi metodi hanno CMC relativamente alta (10-20 mM) in modo da
facilitare la loro rimozione. Sono stati spesso usati sali biliari come sodio colato o
deossicolato, oppure, detergenti sintetici come ottil glucoside:

ottil glucoside
In generale, liposomi generati con il metodo della rimozione del detergente hanno
relativamente bassa efficienza di incapsulamento per composti idrofili di basso PM, non
interagenti con il doppio strato. Daltra parte, tale metodo il migliore per incorporare
glicoproteine in liposomi. Sono stati avanzati dubbi sulla innocuit del detergente residuo nei
liposomi preparati con questo metodo. Ci dipende dal tipo di detergente e non si pu dire
niente in generale. Per quanto riguarda le dimensioni, generalmente una rimozione rapida del
detergente risulta in vescicole pi piccole. La presenza di colesterolo o di molecole portanti
carica influenzano le dimensioni. In condizioni sperimentali rigorosamente controllate sono
state ottenute distribuzioni dimensionali strette, con dimensioni medie <0.2 m.

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Dimensionamento dei liposomi
Le dimensioni e la distribuzione dimensionale dei liposomi determinano il loro comportamento
in vivo, dunque molto importante il dimensionamento dei liposomi. I metodi usati sono:
1) Frazionamento di una popolazione eterogenea per centrifugazione o cromatografia a
esclusione dimensionale
2) Omogeneizzazione di una dispersione per produrre una popolazione di vescicole pi
piccole con una distribuzione dimensionale pi stretta
3) Estrusione di una popolazione eterogenea attraverso membrane porose con pori di
diametro noto, per produrre una dimensione media che si avvicini al diametro dei pori.
Frazionamento per centrifugazione
Liposomi grandi possono sedimentare facilmente a valori di g (accelerazione radiale della
centrifuga misurata prendendo come unit di misura laccelerazione di gravit) che si hanno
normalmente nelle centrifughe convenzionali. I liposomi pi piccoli rimangono nel surnatante.
Questo metodo utile per fare separazioni rapide ma grossolane. I liposomi pi piccoli di 0.5
m richiedono alti valori di g e tempi lunghi per ottenere una separazione dalle particelle di
0.1-0.2 m.
Frazionamento per cromatografia su colonna a esclusione dimensionale
Questo metodo usato per separare le SUV dalle LUV. Ha lo svantaggio di comportare una
diluizione significativa del prodotto.
Omogeneizzazione
La curva di distribuzione dimensionale viene strettita facendo passare la dispersione di
liposomi attraverso un omogeneizzatore ad alta pressione. Spesso si ottiene una
distribuzione dimensionale bimodale (con due massimi di frequenza), con particelle intorno a
0.2 m insieme a particelle inferiori a 0.005 m.
Estrusione attraverso membrane porose
Una popolazione eterogenea di liposomi relativamente grandi viene forzata a passare
attraverso una membrana di policarbonato, che ha pori dritti, di diametro definito. Si ottiene
una sospensione pi omogenea di liposomi che presentano una dimensione particellare
media che si avvicina a quella dei pori.
Rimozione del materiale non incapsulato
Molti farmaci lipofili mostrano alta affinit per il doppio strato dei liposomi e sono
completamente associati con essi. Tuttavia, per composti pi idrofili lefficienza di
incapsulamento minore del 100%. La frazione di principio attivo non incapsulato pu
causare effetti collaterali indesiderati, e anche instabilit fisica dei liposomi. Per la rimozione
del materiale non incapsulato sono state descritte le seguenti tecniche:
- Dialisi e ultrafiltrazione
- Ultracentrifugazione
- Cromatografia su gel
- Reazioni di scambio ionico. Resine a scambio di cationi sono state usate per rimuovere
da dispersioni liposomiali farmaci cationici non incapsulati. Questi rimangono adsorbiti
sulla resina in seguito alla reazione di scambio.

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Stabilit dei liposomi
Poich liposomi contenenti farmaci o antigeni possono essere somministrati al paziente, o al
soggetto da vaccinare, dopo un tempo lungo dalla preparazione, in questo tempo la
dispersione liposomiale non dovrebbe cambiare le sue caratteristiche o perdere parte del
farmaco o antigene. In genere lindustria richiede almeno 1 anno di shelf life (tempo dalla
fabbricazione alla scadenza di un prodotto commerciale).
Stabilit chimica
E importante la stabilit chimica dei fosfolipidi. Le reazioni di degradazione sono di due tipi:
- Idrolisi dei gruppi estere
- Perossidazione di catene aciliche insature.
Stabilit fisica
Processi che rendono fisicamente instabili i liposomi sono la perdita di F e cambiamenti
dimensionali dovuti ad aggregazione e fusione.
Laggregazione la formazione di unit liposomiali pi grandi, costituite da pi liposomi. In
linea di principio questo processo reversibile applicando deboli sforzi di taglio
La fusione porta a nuove strutture colloidali. Essa irreversibile e i liposomi di partenza non
possono pi essere recuperati.
Le molecole del F possono uscire dai liposomi. La fuoriuscita dipende dalla composizione del
bilayer e dalla natura fisicochimica del F. I doppi strati allo stato di gel e quelli contenenti
sostanziali frazioni molari di colesterolo tendono a perdere F pi lentamente. La permeabilit
del bilayer pu cambiare a seguito di processi di degradazione chimica.
Approcci per aumentare la shelf life
Scelta dei componenti del bilayer
Con le dispersioni acquose di liposomi un appropriato intervallo di pH (6-7) e temperature
basse riducono le reazioni di idrolisi e di perossidazione dei lipidi. La FC con catene
idrocarburiche sature (ac. palmitico e/o stearico) stabile alla perossidazione. Se si usano
lipidi insaturi opportuno aggiungere alla formulazione antiossidanti, come -tocoferolo
(vitamina E), acido ascorbico (vitamina C), o complessanti, come EDTA, o inibitori di
fotoossidazione, come -carotene, e rimuovere lossigeno.
Per ostacolare la perdita di farmaci idrosolubili, non interagenti con il bilayer, questo dovrebbe
essere mantenuto allo stato gelificato o contenere sostanziali frazioni di colesterolo.
Per ridurre la probabilit di aggregazione o fusione spesso si include nel doppio strato un
agente che porta carica elettrica, come ad es., FG, FS, FI, colesterilemisuccinato, che
portano carica negativa.
Liofilizzazione
Quando le dispersioni liposomiali vengono rigenerate dopo la liofilizzazione i liposomi
possono trattenere pi del 90% dei farmaci lipofili, in quanto questi interagiscono fortemente
con il bilayer, mentre invece porzioni significative di farmaci idrosolubili vanno perdute.
Approccio del proliposoma
Il proliposoma una formulazione stabile che viene adeguatamente diluita con acqua
generando la dispersione liposomiale at the bedside, cio, al momento della

26
somministrazione. Questo approccio pu essere usato soltanto per farmaci completamente
associati con i liposomi che si formano per idratazione del proliposoma, e inoltre, se
accettabile una distribuzione dimensionale dei liposomi assai ampia.
Procedimenti per ottenere preparazioni sterili e apirogene
Sterilizzazione in autoclave
Pu provocare danno al prodotto, come perdita di F e degradazione chimica dei componenti.
Lautoclavatura possibile se ricorrono condizioni quali:
- Il F lipofilo ed associato al bilayer
- Il F stabile allautoclavatura
- Le condizioni di pH sono scelte in modo appropriato
Sterilizzazione con raggi gamma
Anche questo metodo pu causare danno chimico ai componenti del doppio strato.
Filtrazione sterilizzante
Con questa tecnica si possono sterilizzare dispersioni di liposomi pi piccoli di 0.2 m.
Date le limitazioni di ciascuno di questi metodi i liposomi dovrebbero essere preparati e
manipolati in condizioni asettiche. Inoltre i materiali e le apparecchiature dovrebbero essere
depirogenati.
Applicazioni dei liposomi nella somministrazione di farmaci (drug delivery)
Somministrazione di farmaci lipofili
Farmaci idrofobi di solito vengono formulati per la somministrazione sistemica con tensioattivi
o co-solventi organici. Questo modo di solubilizzazione pu comportare tossicit. I liposomi,
invece, sono fatti di lipidi relativamente non tossici, non immunogenici, biocompatibili,
biodegradabili, e possono incapsulare unampia variet di F lipofili. Un esempio interessante
quello dellanfotericina B.
Somministrazione intracellulare
F con recettori intracellulari devono attraversare la membrana per esercitare lazione
farmacologica. I liposomi possono essere usati per trasportare questi farmaci nel citoplasma.
Un caso tipico quello del PALA (N-(fosfonacetil)-L-aspartato), che normalmente viene
scarsamente assorbito dalle cellule. Il PALA libero assorbito entro le cellule tumorali per
pinocitosi (endocitosi di una fase fluida). La somministrazione mediante liposomi pu essere
molto efficace, perch i liposomi possono contenere concentrazioni di F maggiori rispetto al
fluido extracellulare, e il processo di endocitosi tramite il quale i liposomi carichi
negativamente sono internalizzati dalle cellule pi efficiente della pinocitosi. In particolare,
lefficacia contro il tumore ovarico del PALA incapsulato in liposomi risultata 500 volte
maggiore rispetto al PALA libero.
Somministrazione di F a rilascio prolungato
Sistemi a rilascio prolungato sono richiesti per F, come lantileucemico citosina arabinoside
(Ara-C), che sono rapidamente eliminati in vivo e richiedono concentrazioni plasmatiche
terapeutiche per un periodo prolungato. E possibile progettare formulazioni di liposomi a

27
lunga corcolazione con una velocit di rilascio in vivo ottimale. Oppure, liposomi
convenzionali che si localizzano per fagocitosi nelle cellule del MPS possono agire come
deposito a rilascio prolungato, rilasciando lentamente il F dal MPS nella circolazione
generale.
Terapia genica
Un numero di malattie sistemiche sono dovute alla mancanza di enzimi o fattori, a causa di
deficienza genica. Liposomi cationici sono stati considerati come sistemi di somministrazione
di geni umani. Il materiale genetico, carico negativamente (ad es., plasmide) non
incapsulato nei liposomi, ma complessato con i lipidi cationici tramite interazioni
elettrostatiche. Il complesso entra nella cellula fondendosi con la membrana plasmatica o
endosomiale.
Somministrazione con esclusione di sito
I farmaci antineoplastici di solito hanno una finestra terapeutica stretta e possono essere
molto tossici verso i tessuti normali. Tale tossicit pu essere minimizzata minimizzando la
somministrazione a tali tessuti. I liposomi sono scarsamente assorbiti nel cuore, rene, tratto
GI, che costituiscono siti importanti in cui si esercitano gli effetti tossici di molti F
antineoplastici. Cos, i liposomi possono migliorare lindice terapeutico alterando la
biodistribuzione del F in modo da escludere tessuti sensibili. Ad es., lanfotericina B e la
doxorubicina hanno grave nefrotossicit e cardiotossicit, rispettivamente, che limitano la
dose. La formulazione in liposomi riduce gli effetti tossici senza cambiare lefficacia
terapeutica. Formulazioni liposomiali di questi due farmaci sono state approvate per luso
clinico.
Targeting sito-specifico
Targeting passivo Questo sfrutta la tendenza naturale di certe cellule, come le cellule di
Kupffer nel fegato, e i macrofagi circolanti del MPS, a internalizzare microparticelle estranee,
ad es., i liposomi. I macrofagi del MPS possono dunque essere il bersaglio di liposomi
convenzionali Inoltre, tali liposomi sono stati usati per il targeting di F immunosoppressivi
verso tessuti linfatici come la milza.
Targeting attivo Pu essere fatto attaccando anticorpi specifici ai liposomi
(immunoliposomi). Sono stati progettati immunoliposomi a lunga circolazione (vescicole 0.15
m, legate ad anticorpi e rivestite di polimeri idrofili) i quali, dopo somministrazione sistemica
sono capaci di riconoscere cellule-bersaglio con grande specificit, e legarsi ad esse.
Il TA mediante immunoliposomi presenta i seguenti vantaggi rispetto ai coniugati solubili
farmaco-anticorpo (che saranno trattati in seguito):
- Gli immunoliposomi possono trasportare un numero significativamente maggiore di
molecole di F rispetto ai coniugati solubili
- Gli immunoliposomi possono incapsulare F con propriet fisico-chimiche ampiamente
variabili
- I F possono raggiungere il loro bersaglio intracellulare per diffusione, dopo che sono stati
rilasciati dagli immunoliposomi associati con il tessuto bersaglio, per cui, a differenza dei
coniugati F-anticorpo, per gli immunoliposomi pu non essere necessaria
linternalizzazione mediata dal recettore per rilasciare il farmaco allinterno della cellula.

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Somministrazione intraperitoneale
E stato proposto che la somministrazione intraperitoneale diretta di agenti antineoplastici
terapeuticamente vantaggiosa per tumori che si sviluppano o metastasizano nella cavit
peritoneale. Tuttavia, la chemioterapia intraperitoneale non ha avuto molto successo con i
farmaci liberi a causa di una relativamente rapida eliminazione dei F dalla cavit
intraperitoneale. Invece, leliminazione dei liposomi da tale cavit significativamente pi
lenta che quella del farmaco libero e, quindi, si possono ottenere concentrazioni di farmaco
pi alte in prossimit del sito-bersaglio per lunghi periodi di tempo.
Coadiuvanti immunologici nei vaccini
I liposomi possono incapsulare antigeni nel loro volume acquoso, o incorporarli nel doppio
strato, a seconda della lipofilicit dellantigene. Quindi, i liposomi sono stati usati come
coadiuvanti non tossici con antigeni batterici, virali, protozoici, tumorali. Il primo vaccino a
base di liposomi conteneva il virus inattivato dellepatite A.
Formulazioni di liposomi approvate per uso umano
Formulazioni liposomiche di anfotericina B, doxorubicina, daunorubicina, vaccino per lepatite
A, sono state approvate per luso clinico in diversi Paesi:
Prodotto
Doxil

Farmaco
Doxorubicina

Formulazione
LCL

Ambisome
DaunoXome

Anfotericina B
Daunorubicina

CL
LCL

Epaxal

Vaccino epatite A

Indicazione
Sarcoma
di
Kaposi nellAIDS
Infezioni fungine
Sarcoma
di
Kaposi nellAIDS
Vaccino epatite A

Paese
USA, Europa
Tutto il mondo
USA, Europa
Svizzera

29
Niosomi
Si tratta di vescicole costituite principalmente da tensioattivi non-ionici. Una delle ragioni per
preparare i niosomi la maggiore stabilit chimica dei tensioattivi rispetto ai fosfolipidi.
I niosomi sono stati preparati a partire da diverse classi di tensioattivi non-ionici. Spesso nel
doppio strato viene intercalato un tensioattivo ionico per introdurre una repulsione
elettrostatica tra le vescicole, e quindi, aumentare la loro stabilit fisica.
Tensioattivi non-ionici usati per preparare i niosomi
C16H33OCHCH2OCHCH2OCHCH2OH
CH2OH
CH2OH
esadecil poli(3)glicerolo

CH2OH

ColesteroloO(CH2CH2O)24H
colesterol poli(24)ossietilene etere
C16H33OCHCH2O(CHCH2O)6H
C12H25OCH2 CH2OH
dialchil poli(7)glicerolo
H(CH2)nC6H11O6
alchilglucosidi
H(CH2)n(OCH2CH2)mOH
n=10, 12, 14, 16, 18
m=3-8
alchil poliossietilene eteri
CH2O(CH2)nH
CHO(CH2CH2O)mH
CH2O(CH2)nH
n=12, 14, 16, 18
m=6-30
dialchil poliossietilene eteri della glicerina
C15H31COOCHCH2OCHCH2OH
CH2OH
cetil diglicerol estere

CH2OH

30
Come si visto per i liposomi, anche i niosomi si formano solo se la forma delle molecole dei
tensioattivi lo consente.
Anche per i niosomi esiste una temperatura critica per la transizione gel-fluido del doppio
strato.
Anche per i niosomi il colesterolo pu essere aggiunto per stabilizzare il bilayer.
Metodi di preparazione dei niosomi
Il metodo di preparazione dovrebbe essere scelto sulla base delluso dei niosomi, in quanto
tale metodo influenza il numero dei doppi strati, le dimensioni, la distribuzione dimensionale,
lefficienza di incapsulamento della fase acquosa e la permeabilit del bilayer.
I metodi di preparazione sono simili a quelli dei liposomi, e cos pure i metodi di
dimensionamento e di rimozione del F non incapsulato.
Tossicit dei niosomi
Sebbene ci sia in letteratura una quantit enorme di informazioni sulla tossicit delle molecole
dei tensioattivi, ci sono solo pochi dati sulla tossicit dei niosomi. E stato proposto un modello
per studiare la tossicit topica dei niosomi, basato sulla proliferazione dei cheratinociti dopo 3
giorni di incubazione con niosomi. In questo studio furono confrontati tensioattivi tipo-etere e
tipo-estere. I secondi risultarono meno tossici dei primi, probabilmente grazie alla scissione
del gruppo estere da parte di enzimi.
Le applicazioni farmaceutiche dei niosomi sono in fase preliminare
Lipoproteine
Una lipoproteina una macromolecola endogena consistente in un nucleo interno apolare,
costituito da esteri del colesterolo e trigliceridi, circondato da un monostrato contenente
colesterolo o proteine. Sulla base della loro velocit di flottazione in soluzione salina si
distinguono 4 tipi di lipoproteine:
1) Chilomicroni (dimensioni, 0.08-1 m; PM, 109; densit, <0.95 g/cm3)
2) Lipoproteine a densit molto bassa (dimensioni, 0.03-0.09 m; PM, 107; densit, <1.006
g/cm3)
3) Lipoproteine a bassa densit (dimensioni, 0.020-0.025 m; PM, 2.3x106; densit, 1.0191.063 g/cm3)
4) Lipoproteine ad alta densit (dimensioni, 0.008-0.012 m; PM, 3x105; densit, 1.063-1.210
g/cm3)
Le lipoproteine sono state suggerite come trasportatori di F in quanto:
- Sono macromolecole naturali e non comportano rischio di risposta immunitaria;
- Diversamente da altri trasportatori particellari non sono eliminate rapidamente dalla
circolazione ad opera del MPS;
- Lassorbimento cellulare delle lipoproteine avviene tramite recettori ad alta affinit;
- Il nucleo interno di una lipoproteina, costituito da trigliceridi e colesterolo, una
microregione ideale per trasportare farmaci molto lipofili, mentre farmaci anfifilici possono
essere legati al rivestimento fosfolipidico del nucleo;
- I F incorporati nel nucleo sono protetti nei confronti dellambiente esterno durante il
trasporto, mentre a sua volta, lambiente protetto nei confronti del farmaco;

31
-

I F incorporati nel nucleo non interferiscono con la specificit dei ligandi presenti sulla
superficie, che determinano il legame a cellule specifiche

Le lipoproteine a bassa densit sono state usate come trasportatori per somministrare
selettivamente agenti chemioterapici a cellule neoplastiche. Il principio di base che tali
cellule hanno quantit di recettori di tali lipoproteine maggiori rispetto alle cellule normali, e
quindi, possono essere prese come bersaglio per le lipoproteine.
E stato sintetizzato un tri-galattoside legato allossidrile del colesterolo che, una volta
incorporato nelle lipoproteine, consente lutilizzazione dei recettori delle macromolecole
terminanti con un residuo di galattosio per provocare lassorbimento cellulare delle
lipoproteine, in particolare nelle cellule del fegato.
Struttura del tri-galattoside:
GalOCH2
GalOCH2CNHCOCH2NHCOCH2CH2COOColesterolo
GalOCH2
Le lipoproteine a bassa e ad alta densit sono state modificate chimicamente in modo da
poter essere indirizzate selettivamente a vari tipi di cellule nel fegato. Alle lipoproteine stato
legato in modo covalente lattosio (D-galattosil-D-glucosio), cos la lipoproteina lattosilata
contiene un residuo D-galattosio come ligando. Invece, lincubazione di lipoproteine con
anidride acetica ha prodotto lipoproteine acetilate. Le lipoproteine modificate, iniettate nelle
circolazione sistemica, vengono rapidamente assorbite nel fegato. Le lipoproteine a bassa
densit, lattosilate, vengono assorbite specificamente nelle cellule di Kupffer, mentre quelle
ad alta densit, lattosilate, vengono assorbite nelle cellule parenchimali. Le lipoproteine a
bassa densit, acetilate, si accumulano di pi nelle cellule endoteliali e parenchimali che nelle
cellule di Kupffer.
Cos, le lipoproteine ad alta densit, lattosilate, possono essere usate per somministrare F
antivirali alle cellule parenchimali, mentre quelle a bassa densit, lattosilate, possono servire
come trasportatori di immunomodulatori, antivirali e antiparassitari alle cellule di Kupffer.
Daltro canto, le lipoproteine a bassa densit, acetilate, sono adatte per indirizzare farmaci
antiinfettivi verso le cellule parenchimali e endoteliali del fegato. Da notare che sia le cellule di
Kupffer che le cellule endoteliali del fegato sono coinvolte nellinfezione da HIV.

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Carrier macromolecolari solubili
I carrier (trasportatori) sono polimeri che hanno la funzione di indirizzare il farmaco verso siti
specifici. Allora occorre che il F sia legato al carrier con legame, in genere, covalente. Il
sistema F-carrier viene chiamato CONIUGATO. Questi coniugati, una volta iniettati in circolo,
possono penetrare in molti organi attraverso lendotelio dei vasi capillari.
Vengono poi assorbiti dentro le cellule con il meccanismo della pinocitosi.
Come carrier sono state usate macromolecole di origine naturale e sintetica. Rispetto ai
carrier particellari le macromolecole solubili hanno le seguenti caratteristiche:
- Incontrano un minor numero di barriere nellorganismo e possono penetrare in molti
organi passando attraverso lendotelio dei capillari;
- Penetrano nelle cellule per pinocitosi, fenomeno generale delle cellule che, a differenza
della endocitosi, non necessita di uno stimolo esterno;
- Si trovano nel sangue molte ore dopo la loro introduzione, mentre i sistemi particellari
vengono rapidamente rimossi dal MPS.
I carrier sono caratterizzati da:
1) Catena polimerica, detta spina dorsale (backbone)
2) Sistema di attacco del farmaco alla catena, eventualmente attraverso uno spaziatore
(a volte per il farmaco direttamente attaccato alla catena). Lo spaziatore pu
favorire linterazione F-recettore
3) Struttura che determina le caratteristiche chimico-fisiche del carrier (peso molecolare,
solubilit, bilancio idro-lipofilo (HLB), carica elettrica)
4) Struttura che fa da vettore specifico verso il sito bersaglio (tessuti, organi, cellule)
1

F
2
F
3
4

33
La reazione di accoppiamento F-carrier non deve modificare lattivit terapeutica del F.
Lemivita plasmatica di un coniugato dipende da: PM, natura ionica, configurazione delle
chiralit, interattivit. Il bersaglio naturale il MPS, ma il coniugato pu essere indirizzato
anche diversamente. Dati sperimentali indicano che macromolecole cariche negativamente si
accumulano nei tumori. Un sistema macromolecolare solubile ideale dovrebbe avere le
seguenti caratteristiche:
1. Il carrier deve essere biodegradabile, o comunque non si deve accumulare
nellorganismo. Il carrier e i prodotti della sua biodegradazione non devono essere tossici
n antigenici, n devono alterare lantigenicit degli agenti terapeutici trasportati.
2. Il carrier deve avere una adeguata capacit di carico, cio, deve avere un adeguato
numero di gruppi funzionali per lattacco chimico del F. Tali gruppi sono, in genere, dioli
vicinali, gruppi carbossilici, gruppi amminici.
3. Il carrier deve rimanere solubile in acqua dopo lattacco del F.
4. Il PM del carrier deve essere abbastanza grande da rendere relativamente lenta la
filtrazione glomerulare, e quindi, bassa clearance, ma abbastanza piccolo da raggiungere
tutti i tipi di cellule.
5. Il coniugato deve mantenere la specificit del carrier e lattivit farmacologica del F finch
non ha raggiunto il sito bersaglio.
6. Il coniugato deve essere stabile nei fluidi fisiologici, ma si dovrebbe degradare lentamente
negli ambienti extracellulari o nei lisosomi.
7. Per la somministrazione mirata ai lisosomi la macromolecola non deve interferire con il
fenomeno della pinocitosi n con quelli di fusione intracellulare. Inoltre, il legame Fmacromolecola deve essere sensibile alla idrolisi acida o alla degradazione da parte di
enzimi lisosomiali specifici.
Come carrier macromolecolari solubili sono state studiate macromolecole naturali e
sintetiche. Quelle naturali sono monodisperse (tutte le macromolecole hanno lo stesso PM),
hanno strutture rigide e sono in genere pi biodegradabili. Quelle sintetiche possono essere
fatte su misura (PM, carica elettrica, HLB, capacit di accogliere il F), la loro produzione pi
economica, le reazioni chimiche per attaccare i F sono molto meno laboriose, sono pi stabili
durante la manipolazione e la conservazione.
Macromolecole naturali
Anticorpi
Sono proteine del plasma del gruppo delle globuline. Interagiscono specificamente con i
determinanti antigenici (regioni molecolari degli antigeni) che consentono la loro formazione.
Nelluomo le pi abbondanti sono le immunoglobuline g (IgG).

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Schema della struttura di un anticorpo (IgG)

Le catene polipeptidiche si distinguono in pesanti (PM 50000) e leggere (PM 23000). Le


catene pesanti e leggere sono tenute insieme da legami non covalenti e da ponti disolfuro.
Ponti disolfuro si trovano anche allinterno di ogni catena. Ogni catena contiene una regione
con sequenza amminoacidica variabile (regioni V P e VL) e diverse regioni a sequenza
amminoacidica costante (regioni C L e CP1, CP2, CP3). Anticorpi della stessa classe hanno le
stesse regioni a sequenza costante nelle catene pesanti. La parte terminale della regione a
sequenza costante delle catene pesanti, che termina in gruppi carbossilici, forma la regione
Fc, responsabile del legame a recettori presenti in molte cellule. Lestremit delle regioni a
sequenza variabile, simile nelle catene pesanti e in quelle leggere, forma la regione F(ab) 2 e
costituisce la specificit di un particolare anticorpo. I gruppi amminici terminali della sequenza
variabile sono siti di legame con gli antigeni.
Lutilit clinica di un dato anticorpo, nel direzionamento dei farmaci, dipende dalla sua affinit
verso gli antigeni-bersaglio. Per migliorare la specificit di azione e la penetrazione verso il
sito-bersaglio, gli anticorpi sono stati scissi enzimaticamente e i prodotti della scissione ridotti
per ottenere frammenti Fab, che sono stati usati come trasportatori specifici.
A seconda della struttura chimica del F i coniugati F-anticorpo possono essere preparati
legando tra loro gruppi funzionali presenti sul F e sullanticorpo, ad es., carbossile e gruppo
amminico, o gruppo amminico e gruppo amminico, o gruppo amminico e tiolo.
In generale gli anticorpi sono molecole abbastanza stabili e sono influenzati poco dalle
comuni reazioni che si usano per preparare i coniugati.
Gli anticorpi sono anche stati adsorbiti o legati in modo covalente a vari altri sistemi di
trasporto (liposomi, micro- e nano-sfere) per indirizzarli selettivamente a siti specifici.

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Ormoni
Sono stati suggeriti come trasportatori per somministrare tossine o agenti antineoplastici (ad
es., daunomicina) a cellule tumorali. Il principio di base che tali cellule spesso possiedono
recettori per ormoni. Altre ragioni sono che gli ormoni possono essere ottenuti in forma
chimicamente pura e non causano reazioni allergiche perch ormoni provenienti da specie
diverse sono strutturalmente simili.
Proteine di basso PM
Queste proteine endogene, somministrate per via endovenosa, si accumulano rapidamente in
alcuni tipi di cellule del fegato. Nei lisosomi di queste cellule esse vengono scisse dagli enzimi
lisosomiali negli amminoacidi. Per questa ragione sono state suggerite come carrier, in forma
di coniugati F-proteina. Il F liberato nelle cellule del fegato pu agire localmente o essere
trasferito nel lume tubulare del rene.
Glicoproteine
Sono proteine endogene consistenti in un backbone polipeptidico con oligosaccaridi come
catene laterali. Ogni catena oligosaccaridica contiene acido sialico come unit terminale.

acido sialico
Questo pu essere rimosso enzimaticamente. Le risultanti asialoglicoproteine sono
riconosciute e internalizzate da certe cellule del fegato in dipendenza dai residui zuccherini
terminali. Gli epatociti riconoscono e internalizzano glicoproteine con galattosio e Nacetilgalattosammina come gruppi terminali, mentre le cellule di Kupffer e le cellule endoteliali
riconoscono glicoproteine che terminano con fucosio, mannosio o N-acetilglucosammina. In
conclusione, le asialoglicoproteine coniugate con F possono essere usate come carrier
epatocito-specifici.
Albumina
E disponibile in forma altamente pura, poco tossica e biologicamente stabile. Il PM
dellalbumina del siero umano (HSA) 67000. E stata coniugata con metotrexato e vari
farmaci antivirali per trattare, rispettivamente, i tumori dei macrofagi e infezioni da virus che si
sviluppano nei macrofagi. Dopo penetrazione nella cellula lalbumina digerita dagli enzimi
lisosomiali, rilasciando il F. Lalbumina a cui sono stati legati residui zuccherini (lattosil,
galattosil e mannosil) come gruppi terminali si comporta come le glicoproteine ed stata
usata come carrier di antitumorali e antivirali alle cellule del fegato.

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lattosio

mannosio

glucosammina galattosammina

fucosio

Destrani
I destrani sono polisaccaridi colloidali prodotti dallo zucchero da microorganismi, oppure
enzimaticamente. Destrani per uso farmaceutico vengono ottenuti per idrolisi controllata e
frazionamento del destrano naturale. I residui zuccherini del destrano sono unit di glucosio
legate nelle posizioni 1-6 o 1-6 e 1-3 con legami -glucosidici. Le unit legate sia in 1-6 che in
1-3 costituiscono punti di ramificazione della catena polisaccaridica.

Schema della struttura del destrano


Limmunogenicit del destrano aumenta allaumentare del PM e del grado di ramificazione. I
destrani con PM 45000 sono completamente escreti nellurina entro 48 ore dalla
somministrazione endovenosa, mentra quelli con PM > 45000 rimangono nel sangue a lungo
e vengono allontanati dal MPS, che il bersaglio principale. I destrani si idrolizzano
lentamente in vivo, dando luogo principalmente a dimeri e trimeri, ad opera di un enzima che
si trova nella mucosa intestinale e nelle cellule del MPS. I destrani sono stati usati come
carrier di vari farmaci ed enzimi: agenti antimicrobici (ampicillina, kanamicina, tetraciclina),
citostatici (mitomicina, metotrexato, bleomicina, adriamicina, daunomicina), cardiaci
(alprenololo, procainammide), proteici (insulina, asparaginasi, carbossipeptidasi, e
amilasi), inibitori enzimatici (inibitore della tripsina pancreatica). Gli agenti possono essere
accoppiati
direttamente
o
tramite
spaziatori,
come
acido
-amminobutirrico
(NH2(CH2)3COOH),
amminocaproico
(NH2(CH2)5COOH),
-amminocaprilico
(NH2(CH2)7COOH), mediante reazioni per legare COOH con NH 2, NH2 con NH2, NH2 con
SH. Lesterificazione diretta pu essere usata per legare acidi organici.
I farmaci legati ai destrani sono pi efficaci dei farmaci liberi perch il coniugato rimane molto
pi a lungo nella circolazione sanguigna e si pu accumulare nei siti ammalati dove i capillari
sono pi permeabili. Per la somministrazione mirata a siti specifici hanno avuto successo
coniugati anticorpo-destrano-F. Sono stati preparati anche coniugati F-destrano in forma
anionica che hanno mostrato una pi lunga permanenza nella circolazione ematica e un
accumulo nei tumori. Qui, infatti, lestravasazione favorita mentre la ritenzione favorita

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dallassenza di drenaggio linfatico nei tumori (effetto EPR: Enhanced Permeability and
Retention).
Polimeri sintetici
Poliamminoacidi
La poli( L-lisina ) (NH(CH2)4CHCO)n ha mostrato affinit per le cellule tumorali. Per
NH2
questo stato preparato il coniugato metotrexato-poli(L-lisina) attaccando il F al polimero
mediante gruppi ammidici tra carbossile del F e gruppo amminico pendente del polimero. Il
coniugato si mostrato pi efficace nellinibire la crescita in vitro di cellule di tumori solidi
umani che quella di linfociti.
Hanno migliorato lindice terapeutico della daunomicina i coniugati di questo F con
poli(acido L-aspartico): (NHCHCH2CO)n e con
COOH
poli(acido glutammico): (NHCHCH2CH2CO)n
COOH
Poli(idrossipropilmetacrilammide (poli-HPMA)
CH3
(CH2C)n
CONHCH2CHCH3
OH
poli-HPMA
E un polimero non biodegradabile, non immunogenico, biocompatibile. Per essere eliminato
dallorganismo deve avere PM<45000. Infatti, la velocit con cui viene eliminato
dallorganismo dipende dal PM ed maggiore per PM minori. I PM maggiori sono suscettibili
alla cattura da parte dei macrofagi e hanno scarsa possibilit di attraversare la membrana
basale e altre barriere naturali.
La poli-HPMA stata legata a vari farmaci attraverso spaziatori oligopeptidici. Lo spaziatore
degradato dagli enzimi lisosomiali, liberando il F. La digeribilit delloligopeptide dipende
dalla lunghezza (tetrapeptide > tripeptide > dipeptide) e dalla sequenza amminoacidica dello
spaziatore. E poi importante che lo spaziatore oligopeptidico non si degradi nella circolazione
sanguigna. Lo spaziatore glicina-fenilalanina-leucina-glicina (Gli-Fen-Leu-Gli) possiede tutti
questi requisiti.

38
Gli

Fen

Leu

Gli

Il trasporto mirato a cellule specifiche stato realizzato attaccando alla poli-HPMA specifici
ligandi del recettore. Cos la poli-HPMA derivatizzata con glicil-glicil-galattosammina,

iniettata nella circolazione del ratto, viene efficacemente trasportata nelle cellule parenchimali
del fegato e arriva nei lisosomi. Solo pochi gruppi idrossipropilici sono sostituiti, lasciando gli
altri disponibili per lattacco del F.
Sono stati studiati sistemi di direzionamento pi complessi, come gli anticorpi.
Per ovviare allaccumulo di poli-HPMA nellorganismo sono stati preparati polimeri di PM
abbastanza basso da passare nel filtrato glomerulare, i quali sono stati reticolati con
oligopeptidi. I legami crociati oligopeptidici vengono degradati nei lisosomi delle cellule.

Anche questi polimeri escono dalla circolazione in modo dipendente dal PM (il PM determina
il passaggio attraverso le barriere e lendocitosi).
Studi sui ratti hanno dimostrato la comparsa nellurina di catene a basso PM 8-24 ore dopo la
somministrazione endovenosa.

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Copolimeri dellanidride maleica
Si tratta di copolimeri stirene-anidride maleica (SMA) e diviniletere-anidride maleica
(DIVEMA):

SMA

DIVEMA
Sia SMA che DIVEMA sono stati studiati come carrier della neocarcinostatina (NCS), un
antibiotico antitumorale naturale, e di altri antitumorali. La NCS formata da una proteina
(PM 12000) e da un cromoforo citotossico di basso PM. Una volta liberato dalla proteina il
cromoforo entra nelle cellule circostanti, interagisce con il DNA e uccide la cellula. La NCS
non pu essere usata clinicamente a causa della sua azione non-specifica e della sua breve
emivita (1.8 min).
Coniugati NCS-SMA sono stati sintetizzati per reazione di gruppi NH 2 pendenti sulla proteina
della NCS con il gruppo anidride sul copolimero SMA:
CHCH
OC

CO
O

+ NCSNH2

CH

CH

COOH CO
NH
NCS

Il coniugato viene ritenuto pi a lungo nella circolazione e si accumula nel tumore per leffetto
EPR. In uno studio clinico condotto in Giappone nel 1990 il rapporto tumore-sangue del
coniugato NCS-SMA risult >2500 (somministrazione intraarteriale) e si osserv regressione
significativa del tumore in casi di tumore del fegato, della prostata, delladenocarcinoma ai
polmoni, in circa 50% dei pazienti trattati.
E stato studiato anche il coniugato NCS-DIVEMA. Il suo principale vantaggio una minore
tossicit rispetto a NCS libera, che consente la somministrazione di dosi maggiori e
lottenimento di unattivit antitumorale 10 volte maggiore, mentre a dosi pi basse non
stata rilevata differenza tra NCS-DIVEMA e NCS libera.
La minore attivit antitumorale di NCS-DIVEMA rispetto a NCS-SMA stata attribuita alla
rapida scomparsa del primo coniugato dalla circolazione.
Il DIVEMA stato legato anche al metotrexato (MTX)(forse attraverso un gruppo amminico
nella struttura molecolare del MTX). Il coniugato (PM 22000) libera il farmaco per idrolisi. Il
coniugato MTX-DIVEMA risultato pi attivo contro la leucemia e il carcinoma dei polmoni
del coniugato NCS-DIVEMA.
Il DIVEMA ha attivit biologica anche da solo: un induttore di interferone; attivo contro vari
tumori solidi e virus; ha propriet antibatteriche, antifungine, anticoagulanti e
antiinfiammatorie; stimola lattivazione dei macrofagi:

40
La tossicit del DIVEMA aumenta allaumentare del PM.