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Calligaro/Casasco

Morfologia Umana: ISTOLOGIA


Struttura & funzione: La forma è espressione plastica della funzione. Ruffini.
istogenesi
esami: isto, embrio, commentazione di un preparato
libri: Citologia e istologia (Casasco); Embriologia umana

-- apparati
-- organi
-- TESSUTI (sostanza vivente organizzata)
-- cellule
-- nucleo (cromatina, nucleolo) & citoplasma (organuli, inclusi)
-- molecole (DNA, RNA, proteine, glucidi, lipidi,...)
-- legami
-- atomi

tessuto connettivo con vasi sanguigni

differenziamento cellulare

gametogenesi:
ovaio - espulsione uovo (ovocita) - tubi - fecondazione con spermatozoo

morula (8 cellule identiche - blastomeri)

1 gene -> 1 proteina o polipeptide


sequenza di triplette di nucleotidi
1 tripletta -> 1 AA

specializzazione (processi a senso unico):

accumulo di:

X emoglobina (556 AA) -> globulo rosso (120 giorni di vita, non può più dividersi)

X cheratina -> citoscheletro -> epidermide (idrofoba, cellule morte del tutto riempite)

Più elevato il differenziamento, minore è la capacità di dividersi. Le cellule diventano meno proliferanti.
Una biopsia può rilevare la probabilità di riprodursi velocemente.

Fattori di differenziamento - modulazione, fattori locali (molecole), sollecitazioni meccaniche dall’esterno (zb
Hornhautbildung) --> alterazione

Evitare artefatti provocati dalla morte cellulare!


I nervi possono sopravvivere solo 15 sec senza fornimento di ossigeno da parte dei vasi sanguigni.
Liquido fissatore.
Microscopio luce e elettronico.

MICROSTRUTTURA - ULTRASTRUTTURA - FUNZIONE

Galileo -- utilizzo lenti per indagare la natura.


Leeuwen-Hoek -- animalicoli (=spermatozoo), microorganismi, «Experimenta et Contemplationes»
1665 Robert Hooke -- «Micrrographia», “cellula”
1755 nascita istologia senza microscopio
1839 Th. Schwann -- «Mikroskopische Untersuchungen über Struktur und Wachstum der Tiere und Pflanzen
--> TEORIA CELLULARE (anche Schneider)
1870 Rudolf Virchow -- «Cellularpathologie in der Begründung der Gewebslehre.
1873 Golgi -- scopre la reazione nera -> è possibile lo studio delle cellule nervose. Premio Nobel 1906.
ca. 1950 Microscopia con tecniche integrate.

MEZZI PER STUDIARE CELLULE VIVENTI (in vivo, appartenente all’organismo)


COLTURE IN VITRO (prelevati dall’organismo)

sul vitrino. sminuzzare campione, trattare con enzimi (es. tripsinizzare), contare, centrifugare e rimuovere
enzimi, seminarle in un recipiente, aggiungere terreno nutritivo.

X Milza: distruzione eritrociti attraverso macrofaghi -> Emacateresi. Fagocitosi (gl. rosso perde la membrana)

X Cellule nervose: introdurre microelettrodi (dare impulso, registrazione)

MICROSCOPIO A CONTRASTO DI FASE


B-N, senza coloranti (tossici!)

TECNICA DELLO STRISCIO (Abstrich)


X goccia di sangue (secondo vetrino a 45 gradi)

Allestimento attraverso fissazione, desidatazione,...

PV-6-3-96
PREPARATI STABILI

diagnostica, istopatologia.
vetrino istologico (confronto, documentazione)

campione di tessuto estratto dall’organismo vivo


-> cambiamenti di struttura, processi biochimici, morte cellulare.

X cellule nervose - morte dopo poche decine di secondi senza rifornimento di ossig.

(A) FISSAZIONE

--CONGELAMENTO RAPIDO
espansione rapida di CO2 (g): H2O (l) -> H2O (s) solidificazione.
Protoplasma: 90% costituito da H2O
Non possibile nel freezer. Si deve evitare lo svantaggio dello stato cristallino!
ESTEMPORANEO - diagnosi di cellule tumorali
Vantaggi:
-- velocità
-- nessun trattamento chimico, ma solo fisico -> dimostrazione della presenza di determinate sostanze.

-- SOSTANZE OSSIDANTI O RIDUCENTI

--SOSTANZE CHE CREANO PONTI TRASVERSALI TRA I COSTITUENTI

--SOSTANZE CHE DETERMINANO LA COAGULAZIONE DI PROTEINE

X formalina (aldeide formica) al 4%


X soluzioni tampone a pH fisiologico

Temperatura alta - rottura delle proteine (60 gradi), aumento della velocità di reazione.

TONICITÀ del mezzo: Le soluzioni devono essere ISOTONICHE (equilibro osmotico)


ipotonico -> ringonfiamento, squash cellulare
ipertonico -> collisione, cellula raggrinzinta.

330 mOsM/kg liquido intercellulare.

(B) ESTRAZIONE DELL’ ACQUA

-- alcool: molto idrofilo, ma troppo “violente”


-- formalina, ac. picrico, ac. acetico, sali di potassio, etc.

Il microscopio a luce è a trasmissione (attraversamento del preparato da fasci di luce)


--> spessore minimo 5 - 10 micron
(C) INCLUSIONE (non inglobamento! Serve per rendere duro il campione)

Sostituzione completa dell’ H2O con sostanza solida.

-- paraffina: solidifica a temp. ambiente (liquida a +60 gradi). Idrofoba!

(B) DISIDRATAZIONE

Passaggi graduali in alcoli di concentrazione sempre aumentata --> alcool assoluto <-> H2O completamente
sostituito.
XILOLO - solvente intermedio tra alcol e paraffina.

Nel termostato per un intervallo di tempo con paraffina --> cubo di paraffina con campione incluso.

(D) SEZIONAMENTO (tramite MICROTOMO)

tagliare sezioni a spessore costante.

(E) COLORAZIONE

A base di
-- ELETTROSTATICA (cariche opposte)
-- CHIMICA (ac-b, b-ac, forza ionica)

Maggior parte dei coloranti sono in soluzione acquosa!


Xilolo -> alcol a concentrazione sempre minore (immergere la lamina)

(F) DISIDRATAZIONE

Goccia di balsamo di Canada (resina) - indurisce con indice di rifrazione uguale al vetro
--> rifrazione solo sulle strutture cellulari!
Vetrini portaoggetto & coprioggetto

(G) MONTAGGIO A DIAPPANIZZAZIONE

spessore unitario
microscopio tarato

COLORANTI classici: EMATOSSILINA E EOSINA

EMATOSSILINA:
violetto/blu
a carattere basico --> strutture acide (basofile)
X nucleotidi, polisaccaridi

EOSINA
rosso/rosa
a caratt. acido --> sost. acidofile (eosinofile)
X globuli bianchi (granuli eosiofili). Contagggio percentuale (malattie allergiche, parassitarie)

--> Mappa con colorazione gradulae secondo acidità & basicità

X Sopravitale (supravital) - verde Janus (colora sopravitalmente i mitocondri)


X formalina neutra (nero)
X Sudan Black (frozen-dried, coloraz. grassi in grigio)
X Feulgen (DNA, rosso, intesità prop. alla conc.)

ISTOCHIMICA

Biochimica - frullatore (congenizzatore), distruttivo

X Fegato:
bile nel duodeno
vena porta dall’ intestino --> proteine, AA, zuccheri
glicogeno si accumula nella cellula epatica (misura dell’attività metabolica)
cellule epatiche (diametro 30 micron) disposte radialmente attorno a venule.

METODO DELLE 2 SEZIONI SUCCESSIVE:

confronto

colorazione prima sezione.


trattamento seconda sezione con enzima che asporta la sostanza in esame (lisi).
colorazione seconda sezione.

X trattamento con ribonucleasi: nucleoli e citoplasma non si colorano più con Toluidine Blue o Ematossilina.

X efficacia di un farmaco inibente un enzima? Esaminare mantenendeo le proprietà topografiche. Misura


quantitativa.

MICROSCOPIO A LUCE:

obiettivo: es. 6,3/..


oculare: es. ../8x
--> ingrandimento effettivo 8 * 6,3

LIMITE DI RISOLUZIONE: d = ( 0,612 * ) / ( n * sen ) ; [n indice di rifrazione,  semiangolo di


apertura]
distanza più piccola tra 2 punti distinti.

APERTURA NUMERICA: n * sen

Obiettivi a breve distanza focale:  tende a 90 gradi.


Obiettivi ad immersione (olio): n >> 1

Semplificato: d =  / 2
Lunghezza d’onda della luce visibile: (IR...) 400-750 nm (...UV)

X Luce blu di 400 nm <--> d = 0,2 micron