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Antonio Simone Laganà – Medicina e Chirurgia

COMPENDIO
DEL
CORSO INTEGRATO DI
BIOLOGIA E GENETICA

… dedicato a tutti quelli che vanno avanti con le proprie forze … lottando contro l’indifferenze generale
Antonio Simone Laganà

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Antonio Simone Laganà – Medicina e Chirurgia

1 Aneuploidia e poliploidia
2 Anse del t-RNA
3 Canali ionici (sistemi a controllo di ligando, di potenziale, a deformazione meccanica)
4 Caratteri bio-quantitativi
5 Caricamento degli amminoacidi
6 Ciclo cellulare
7 Citoscheletro
8 Come avviene la sintesi del secondo filamento di c-DNA dopo la sintesi del primo?
9 Come si costruisce una molecola di c-DNA
10 Come si realizzano le banche cromosomiche?
11 Complesso del poro nucleare
Condizioni che modificano la struttura della cromatina (attivazione/inattivazione):
12
metilazione, fosforilazione, acetilazione
13 Cosa sono i geni concatenati? Quali conseguenze portano?
14 Cos'è la cromatina facoltativa? (es. corpo di Bahr)
15 Crossing-over
16 Da dove prende la peptil-transferasi il ribosoma?
17 Differenze nella fase di allungamento tra procarioti ed eucarioti
18 Diffusione facilitata (proteine canale)
19 Duplicazione del DNA
20 Epistasi
21 Equilibrio chimico del potenziale di membrana.
22 Funzione dei centromeri
23 Funzione della telomerasi e telomeri
24 Genetica mendeliana
25 Geni procariotici
26 Il collagene
27 Integrine
28 La genetica dei gruppi sanguigni
29 La via di Ras
30 Lisosomi
31 Marcatori dei vettori artificiali (marcatori selettivi dominanati)
32 Matrice extracellulare
33 Meccanismi di insorgenza della mutazioni geniche
34 Microvillo
35 Mutazioni cromosomiche
36 Nucleo
37 Organizzazione del genoma virale
38 PCR
39 Polimeria (caratteri quantitativi, es. delle cariossidi del grano)
40 Pompa Na+/K+
41 Possibilità o meno del crossing-over (frequenza di ricombinazione)
42 Prioni
43 Proteina p53
44 Proteine di membrana
45 Proteine G e funzione
46 Qual'è la cromatina che può essere trascritta?
47 Qual'è la frequenza massima di ricombinazione?
48 Qual'è la funzione delle lamine nella mitosi?
49 Qual'è la sequenza di Shine-Dalgarno?
50 Quali fattori intervengono nel processo di allungamento della traduzione?
51 Quali sono i sistemi di controllo del ciclo cellulare e come agiscono?
52 Regola della somma - regola del prodotto
53 Retroinibizione enzimatica
54 Reversioni cromosomiche
55 Schaffold proteico

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56 Segregazione
57 Senquenze palindromiche
58 Sintesi proteica (tutte le fasi della traduzione del messaggio genetico)
59 Sito cos del concatamero (struttura, posizione e funzioni)
60 Spiralizzazione del DNA: differenza tra dominio funzionale e dominio strutturale
61 Struttura del t-RNA
62 Superavvolgimento del DNA
63 Test-cross (reincrocio)
64 Tipi di cromatina e differenze
65 Traporto passivo
66 Trasporto attivo
67 Vettori di clonazione (plasmidi,cosmidi e differenze)
68 Vettori di clonazione artificiali del lievito (YAC)

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DOMANDE DI BIOLOGIA
• Canali ionici (sistemi a controllo di ligando, di potenziale, a
deformazione meccanica)
La struttura dei canali ionici è quella di un poro molto piccolo rivestito da gruppi
laterali di amminoacidi idrofili, per questo sono molto selettivi. La selettività si
attua principalmente per differenza di carica o di dimensioni. Molti canali ionici
sono controllati, possono cioè essere aperti e chiusi mediante cambiamenti
conformazionali della proteina, regolando così il flusso degli ioni. Nelle cellule
animali, 3 diversi tipi di stimoli inducono cambiamenti conformazionali nei canali
controllati:
1) i canali a controllo di potenziale si aprono e si chiudono in risposta a
cambiamenti del potenziale di membrana.
2) i canali a controllo di ligando sono innescati dal legame alla proteina canale di
sostanze specifiche.
3) i canali a controllo meccanico rispondono a forze meccaniche che agiscono
sulla membrana.
La trasmissione dei segnali elettrici da parte delle cellule nervose dipende dai
cambiamenti rapidi e controllati degli ioni Na+ e K+, attraverso i loro rispettivi
canali. Oltre a questo tipo di regolazione a breve termine, molti canali ionici sono
soggetti a regolazione a lungo termine, più che altro per controllo ormonale.
Le porine sono proteine transmembrana multipasso. La caratteristica principale
delle porine è che i segmenti transmembrana attraversano la membrana non in
forma di alfa-elica, ma di beta-foglietto cilindrico chiuso denominato beta-barrel, il
quale ha nella parte centrale un poro ripieno di acqua. La parte interna del poro è
tappezzata di catene laterali polari, mentre la parte esterna è formata da porzioni
apolari che interagiscono con la porzione idrofoba della membrana. Il complesso
della porina permette così il passaggio di diversi soluti idrofili.
Le acquaporine permettono il passaggio veloce di acqua all'interno e all'esterno
della membrana. Le acquaporine sono proteine integrali di membrana con sei
segmenti transmembrana elicoidali. Nel caso di AQP-1, l'acquaporina presente bei
tubuli renali, l'unità funzionale è costituita da un tetramero formato da 4 monomeri
identici. Tali subunità formano un canale grazie ai loro segmenti transmembrana.

• Ciclo cellulare
Nel ciclo cellulare di una cellula eucariotica si distinguono le fasi G1, S, G2 e M, le
quali si succedono ciclicamente. Le fasi della mitosi sono Prometafase, Metafase,
Anafase e Telofase. La fase S è la fase in cui il DNA della cellula viene
raddoppiato, le fasi G1 e G2 sono fasi detta gap (intervallo) ma sono comunque
fasi di accrescimento, la fase M (mitotica) consiste di due eventi sovrapposti: la
mitosi e la citocinesi. Durante la mitosi, il fuso mitotico segrega i cromosomi
condensati e duplicati nei 2 nuclei fligli; durante la citocinesi il citoplasma si
divide generando 2 cellule figlie geneticamente identiche. Il complesso delle fasi
G1, S e G2 viene detto interfase. Lo stato G0 è quello delle cellule che restano

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bloccate in fase G1 per lungo tempo (tipo neuroni).


Il sistema di controllo del ciclo cellulare deve controllare che tutti i diversi
processi delle diverse fasi siano stati portati a termine al tempo dovuto e nella
sequenza corretta, deve assicurare che ogni fase del ciclo sia stata completata
prima di permettere l'ingresso nella nuova fase, e deve controllare se l'ambiente
esterno sia idoneo alla divisione (presenza di nutrienti e di fattori di crescita).
Questi compiti sono svolti attraverso una serie di punti di controllo. Il primo punto
di controllo è alla fine della fase G1; nel lievito questo punto di controllo G1 è
detto Start, per passare Start la cellula di lievito deve aver sufficienti nutritienti e
aver raggiunto una certa dimensione. Nelle cellule animali il punto di controllo G1
è detto punto di restrizione. La capacità di passare oltre il punto di restrizione è
controllata per lo più da proteine extracellulari, i fattori di crescita.
Al punto di controllo G2, che si trova al confine tra la fase G2 e la fase M, è
richiesto che la sintesi del DNA sia stata completata prima dell'ingresso in mitosi.
Il terzo punto di controllo è detto punto di controllo di assemblaggio del fuso, al
passaggio tra metafase ed anafase. Per superare tale punto di controllo tutti i
cromosomi devono essere attaccati al fuso.
Il MPF, fattore che induce la mitosi, è necessario per indurre il superamento del
punto di controllo di G2 e l'entrata in mitosi. La proteina codificata dal gene cdc2
è una delle 2 proteine che fanno parte di MPF. La proteina codificata dal gene
cdc2 del lievito funziona come una proteina chinasi, perché catalizza il
trasferimento di un gruppo fosfato dell'ATP a determinate proteine bersaglio (la
fosforilazione delle proteine da parte delle chinasi, e la loro defosforilazione da
parte delle fosfatasi, è un comune meccanismo di regolazione dell'attività delle
proteine). Sebbene la proteina prodotta dal gene cdc2 sia una proteina chinasi,
questa è attiva solo quando è legata ad una ciclina. La proteina prodotta dal gene
cdc2 è quindi una chinasi ciclina-dipendente (Cdk).
Le cicline coinvolte nel passaggio da G2 a M sono dette cicline mitotiche, e le
molecole di cdk a cui si legano sono detto cdk mitotiche. Analogamente le cicline
coinvolte nel punto di controllo di G1 e nel passaggio alla fase S sono dette
cicline G1 e ele molecole cdk a cui si legano sono dette cdk G1.
Un livello di controllo di queste proteine chinasi è dato dalla disponibilità delle
cicline necessarie per l'attivazione delle cdk, e un altro è basato sulla
fosforilazione delle stesse molecole di cdk.
Ora possiamo renderci conto che il MPF e il complesso cdk-ciclina mitotica sono
la stessa cosa.
Appena la ciclina mitotica si lega alla cdk mitotica, il complesso è inattivo. Per
attivarsi, il complesso deve ricevere un gruppo fosfato su un particolare
amminoacido della molecola cdk. Prima dell'aggiunta di questo fosfato, tuttavia,
una chinasi inibitoria fosforila la cdk in 2 altre porzioni, bloccandone il sito attivo.
A questo punto una chinasi attivatoria aggiunge il gruppo fosfato attivatore.
L'ultimo passaggio delle sequenza di attivazione è la rimozione dei fosfati inibitori
da parte di una fosfatasi specifica. Quando la fosfatasi inizia a rimuovere i fosfati
inibitori, si instaura un processo di retroazione positiva, per il quale il complesso
cdk-ciclina attivato generato da questa reazione stimola la fosfatasi, causando
una accelerazione del processo di attivazione.
Una volta attivato, il complesso cdk-ciclina svolge le funzioni di MPF attivo e, con
la sua attività di protein-chinasi, induce l'entrata in mitosi. Per quanto riguarda la
disgregazione dell'involucro nucleare, MPF attivo fosforila e induce altre chinasi a
fosforilare le LAMINE della lamina nucleare (proteine a cui è associata la

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membrana nucleare interna). La fosforilazione induce la depolarizzazione delle


lamine che porta alla disgregazione della lamina nucleare. La perdita della mina
nucleare destabilizza l'involucro nucleare, che si disperde in piccole vesicole
membranarie.
La condensazione cromosomica è indotta dalla fosforilazione di alcune proteine
cromosomiche, tra cui l'istone H1 e il complesso multiproteico della condensina.
La fosforilazione delle proteine associate ai microtubuli può facilitare la
formazione del fuso mitotico.
Operazioni relative al punto di controllo G1: il bersaglio principale è la prteina Rb,
un amolecola che controlla l'espressione di geni i cui prodotti proteici sono
necessari per poter oltrepassare il punto di controllo G1 e entrare nella fase S. La
proteina Rb esercita questo tipo di controllo legando il fattore trascrizionale E2F,
una proteina che, quando non è legata ad Rb, attiva la trascrizione dei geni che
codificano per enzimi ed altre proteine necessarie per iniziare la replicazione del
DNA. Finché la proteina Rb è legata a E2F tale molecola è inattiva, e questi geni
restano inespressi, impedendo l'entrata della cellula in fase S.
Nelle cellule che hanno ricevuto uno stimolo proliferativo (per esempio da parte di
un fattore di crescita), la via del segnale mediata da fattori di crescitaporta alla
produzione e all'attivazione di complessi cdk-ciclina che catalizzano la
fosforilazione della proteina Rb. Le molecole di Rb fosforilate perdono così la
capacità di trattenere E2F, e E2F libero attiva la trascrizione dei geni i cui prodotti
sono necessari per l'ingresso in fase S.
La proteina codificata dal gene p53 svolge un ruolo cruciale nell'impedire che le
cellule con il DNA danneggiato superino il punto di controllo G1 con un
meccanismo di azione che si basa in parte sulla inibizione della via che porta alla
fosforilazione di Rb.
L'inizio dell'anafase invece, è indotto da una via di degradazione delle proteine
attivata verso la fine della mitosi ad opera di MPF (il complesso mitotico cdk-
ciclina che agisce al punto di controllo G2). MPF consente il superamento del
punto di cocntrollo dell'assemblaggio del fuso catalizzando una o più reazionidi
fosforilazione di proteine che portano all'attivazione del complesso che promuove
l'anafase. Il ruolo di questo complesso è quello di segnare il destino degradativo
di alcune proteine bersaglio, legandole alla ubiquitina, una molecola il cui legame
a una proteina ne induce la distruzione.
Il complesso che promuove l'anafase segna il destino degradativo di almeno 2 tipi
di proteine. In primo luogo, induce la degradazione degli inibitori dell'anafase, che
in condizioni normale impediscono l'inizio dell'anafase mantenendo legati i due
cromatidi fratelli. Il secondo tipo di proteina a cui viene legata la ubiquitina è la
ciclina mitotica, la cui concentrazione alla fine della mitosi si abbassa
drasticamente. Essendo la ciclina mitotica una componente di MPF, anche MPF
smette di funzionare. Il complesso che promuove l'anafase induce sia l'inizio
dell'anafase, (attraverso la degradazione degli inibitori dell'anafase) sia il
successivo completamento della mitosi (attraverso la degradazione della ciclina
mitotica). Il completamento di questo passaggio è controllato dai cinetocori dei
cromosomi che, fin quando non sono attaccati ai microtubuli del fuso, rilasciano
una proteina, la Mad2. Mad2 inibisce il complesso che promuove l'anafase,
impedendo quindi l'inizio dell'anafase. Quando tutti i cinetocori sono stati
attaccati al fuso, Mad2 non è più rilasciata, il complesso che promuove l'anafase
non è più inibito e l'anafase può avere inizio.
Gli organismi multicellulari utilizzano proteine extracellulari chiamate fattori di

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crescita, come segnali che contrallano il tasso di crescita cellulare. (fattore di


crescita di derivazione piastrinica PDGF, fattore di crescita epidermico EGF).
I fattori di crescita come PDGF e EGF agiscono legandosi a recettori di membrana
situati sulle cellule bersaglio. I recettori dei fattori di crescita hanno attività
tirosina chinasica. Il legame del il fattore di crescita al recettore ne stimola
l'attività tirosina chinasica, che provoca la fosforilazione di residui di tirosina
situati nella regione intracitoplasmatica del recettore. In tutta la cascata di eventi
che si relazza successivamente ha un ruolo chiave la via di ras.
Il meccanismo con cui la via di ras induce il superamento del punto di controllo di
G1 e l'entrata in fase S ha sei passaggi:
1) il fattore che stimola la crescita si lega al recettore di membrana.
2) questo legame stimola la attività tirosina chinasica del recettore, causando
quindi la fosforilazione dei residui di trosina
3) le tirosine fosforilate servono come sito di legame per una serie di proteina
adattatrici che, a loro volta, attivano una proteina G associata alla membrana, la
proteina ras. Come nel caso di altre proteine G, la attivazione della proteina ras è
accompagnata al legame di GTP e al rilascio di GDP.
4) la molecola ras attivata stimola una cascata di reazioni di fosforilazione, che
inizia con la fosforilazione di una proteina chinasi detta raf. Nella forma attiva raf
fosforila le serine e le treonine di una proteina chinasi chiamate MEK, che a sua
volta fosforila le treonine e le tirosine di un gruppo di proteine chinasi dette MAP
chinasi.
5) le MAP chinasi attive entrano nel nucleo e fosforilano diversi fattori
trascrizionali, cioè proteine che attivano la trascrizione di geni specifici. Tra le
proteine attivate da questo meccanismo di fosforilazione vi è Jun ( che fa parte
del fattore trascrizionale AP-1) e alcune proteine della famiglia di fattori
trascrizionali ETS. Questi fattori trascrizionali così attivati accendono la
trascrizione dei geni precoci che codicficano per latri fattori trascrizionali come
Myc, Fos e Jun, che, a loro volta, attivano la trascrizione di alcuni geni tardivi: uno
di questi codifica per il fattore E2F.
6) tra i geni tardivi ci sono anche i geni per chinasi e cicline, la cui produzione
porta alla formazione di processi di complessi ciclina-chinasi che fosforilano la
proteina Rb e quindi inducono il passaggio da G1 a S.
alcuni fattori di crescita in realtà inibiscono la proliferazione cellulare. Un esempio
è il fattore di traformazione-beta (TGF-beta), una proteina che, a seconda del tipo
di cellula bersaglio, può avere sia funzione di inibizione che di attivazione della
crescità. Tra le attività anti-proliferative di TGF-beta c'è un'azione antagonista nei
confronti dell'effetto stimolante della crescita di altri fattori come PDGF e EGF.
Quando agisce come inibitore della crescita, TGF-beta legandosi al suo recettore
di superfice, stimola una serie di eventi che fanno aumentare i livelli della proteina
p15, che sopprime l'attività dei complessi cdk-ciclina, bloccando quindi la
progressione del ciclo cellulare. La proteina p15 funziona quindi come cdk
inibitore. un altro fattore che funzione come cdk inibitore è la proteina p21, che
svolge un ruolo cruciale nell'impedire che le cellule che hanno danni al DNA
superino il punto di controllo G1.

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• Citoscheletro
L'interno delle cellule eucariotiche è organizzato attraverso il citoscheletro, che è
strutturato come una rete proteica complessa di filamenti e tubuli interconnessi
che si estende nel citosol, dal nucleo alla faccia interna della membrana
plasmatica. Il citoscheletro serve principalmente nei processi di movimento e di
divisione cellulare e nel posizionare e muovere gli organelli collegati alle
membrane all'interno del citosol, ma prende anche parte ai processi di
segnalazione e di adesione cellulare.
I tre principali elementi strutturali del citoscheletro sono i microtubuli, i
microfilamenti ed i filamenti intermedi (presenti SOLO nelle cellule eucariotiche).
I microtubuli sono composti della proteina tubulina ed hanno un diametro di 25
nm, i microfilamenti sono polimeri di actina ed hanno un diametro di 7 nm, i
filamenti intermedi sono possono essere composti da varie proteine ed hanno un
diametro di 8-12 nm. Inoltre ad ogni filamento possono essere associate diverse
proteine accessorie. Microtubuli e microfialmenti sono strettamente associati alla
motilità cellulare. I microfilamenti sono i componenti strutturali delle miofibrille
muscolari, mentre i microtubuli formano ciglia e flagelli.

Microtubuli

I microtubuli sono gli elementi più grossi del citoscheletro. Nelle cellule
eucariotiche possono essere suddivisi in 2 gruppi:
• il primo gruppo è quello dei microtubuli assonemali, e comprende i microtubuli
altamente organizzati e stabili che si trovano in strutture subcellulari specifiche
associate con il movimento, quali ciglia e flagelli e corpi basali. La struttura
portante o assonema è formata da un fascio di microtubuli assonemali molto
organizzati.
• il secondo gruppo è costituito dalla rete dei microtubuli citoplasmatici. Tali
microtubuli hanno varie funzioni, per esempio servono a mantenere la forma
polarizzata della cellula, oppure servono per formare il fuso mitotico e meiotico
necessario per il movimento dei cromosomi durante la divisione cellulare,
inoltre contribuiscono alla disposizione nello spazio ed al movimento
direzionale di vescicole ed organelli, fornendo un sistema organizzato di fibre-
guida per il movimento. Per esempio servono a controllare la localizzazione del
Golgi e del reticolo endoplasmatico, e sono coinvolti nel movimento attivo delle
vescicole.
I microtubuli sono cilindri cavi con un diametro esterno di 25 nm e uno interno di
15 nm. La parete laterale dei microtubuli è formata da fasci longitudinali di
polimeri lineari chiamati protofilamenti. Generalmente un microtubulo è formato
da 13 protofilamenti accostati fianco a fianco attorno alla cavità centrale.
La subunità di base di un protofilamento è un eterodimero di tubulina. Gli
eterodimeri che formano i protofilamenti sono composti da una molecola di
tubulina-alfa e una di tubulina-beta, che, subito dopo sintesi si associano a
formare l'eterodimero alfa-beta. Ogni proteina si organizza in 3 domini funzionali:
un dominio ammino-terminale che lega il GTP, un dominio centrale a cui si può
associare la colchicina, ed un terzo dominio carbossi-terminale che interagisce
con le proteine associate ai microtubuli (MAP). All'interno di un microtubulo, i
dimeri di tubulina sono orientati nella stessa direzione, e questo comporta una

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sorta di polartà funzionale del protofilamento, perché le due estremità del


protofilamento sono diverse dal punto di vista chimico e strutturale.
Una tappa critica nella formazione dei microtubuli è quella della nucleazione, cioè
l'aggregazione dei dimeri di tubulina in oligomeri, che servono da nuclei da cui i
nuovi microtubuli possono crescere. Quando un microtubulo è stato nucleato,
cresce per aggiunta di subunità ad una estremità, e tale processo e detto
allungamento. La formazione dei microtubuli è inizialmente lenta, dando origine
alla cosidetta fase di ritardo nell'assemblaggio dei microtubuli. Questa fase riflette
il processo relativamente lento di nucleazione, la fase di allungamento è invece
veloce. La massa dei microtubuli aumenta sino ad un punto dove la
concentrazione di tubulina libera diventa limitante e conduce alla fase di
stabilizzazione in cui l'assemblaggio ed il disassemblaggio dei microtubuli si
bilanciano (concentrazione critica).
Un'estremità del microtubulo può crescere o contrarsi più rapidamente dell'altra.
L'estremità in crescita rapida è chiamata estremità positiva, mentre l'altra è detta
estremità negativa. La diversa velocità di crescita alle estremità positive e
negative dei microtubuli riflette le diverse concentrazioni critiche richieste per
l'assemblaggio alle due estremità, concentrazione che è più bassa per l'estremità
positiva che per quella negativa. La simultanea crescita e depolimerizzazione del
microtubulo producono un fenomeno chiamato treadmilling, che si verifica
quando ogni molecola di tubulina incorporata all'estremità positiva è
controbilanciata da una molecola di tubulina che si depolimerizza all'estremità
negativa. Ogni eterodimero di tubulina lega 2 molecole di GTP, una alla porzione
alfa e una alla beta. Il GTP è idrolizzato colo quando l'eterodimero si associa ad un
microtubulo. Secondo il modello di instabilità dinamica c'è l'esistenza di due
popolazioni di microtubuli, una che si accresce in lunghezza per polimerizzazione
continua dell'estremità positiva, l'altra che si accorcia per depolarizzazione,. La
distinzione tra queste due popolazioni sta nel fatto che quella in accrescimento
lega il GTP all'estremità positiva, mentre quella che si accorcia porta legato il
GDP. Poiché le molceole di tubulina che legano il GTP sembrano avere più affinità
fra di loro rispetto alla tubulina che lega il GDP, la presenza di un gruppo di
molecole di tubulina associate al GTP all'estremità positiva crea un cappuccio di
GTP che può associare stabilmente altri dimeri. La perdita del GTP invece crea
un'estremità instabile, a cui può avvenire rapidamente la depolarizzazione.
I microtubuli originano da una struttura cellulare detta MTOC, centro di
organizzazione dei microtubuli. Tale MTOC serve come ounto di assemblaggio e
di ancoraggio di un'estremità dei microtubuli. Molte cellule nell'interfase hanno un
MTOC detto centrosoma, localizzato vicino al nucleo. Il centrosoma delle cellule
animali è normalmente associato con due centrioli circondati da materiale
pericentriolare. All'interno del centrosoma vi è la presenza di un'isoforma di
tubulina, la tubulina-gamma, associta con la proteina pericentrina. La tubulina-
gamma si struttura in anelli alla base dei microtubuli che emergono dal
centrosoma. Il MTOC è in grado di nucleare ed ancorare i microtubuli, per cui i
microtubuli si estendono dall'MTOC verso la periferia della cellula, così l'estremità
negativa resta ancorata al MTOC mentre l'estremità positiva si estende verso la
periferia.gli MTOC influenzano anche il numero di microtubuli di una cellula,
perché hanno limitati siti di nucleazione e di aggancio.
I microtubuli sono anche molto importanti nel corso della mitosi. Prima della
profase il centrosoma si duplica in due centrosomi figli. Questi si separano
durante l'inizio della profase e migrano ai poli opposti della cellula, dove servono

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come poli per la formazione del fuso mitotico. Quando si rompe l'involucro
nucleare, i cromosomi vengono portati ai poli tramite i microtubuli, grazie al fatto
che ogni cinetocore di ogni cromosoma si lega all'estremità positiva dei
microtubuli. Quindi, i microtubuli crescendo dal polo del fuso, incontrano il
cinetocora e si stabilizzano. Quelli che non trovano il cinetocore si destabilizzano
per instabilità dinamica: così ogni cromosoma riesce ad agganciare un
microtubulo tramite il cinetocore e a collegarsi al fuso mitotico.
Le MAP (proteine associate ai microtubuli), costituiscono un ulteriore livello di
regolazione dell'organizzazione dei microtubuli. Le diverse MAP variano
soprattutto per la loro capacità di collegare i microtubuli fra loro o con altre
strutture e nella loro regolazione a livello di polarizzazione/depolarizzazione. Le
MAP si dividono in 2 classi: le MAP motrici, che includono la dineina e la
chinesina, usano ATP per guidare il trasporto di vescicole o d organelli e per
creare forze di scorrimento tra i microtubuli.
La dineina produce un movimento verso l'estremità negativa del microtubulo
(movimento centripeto), la chinesina invece produce un movimento verso
l'estremità positiva del microtubulo (movimento centrifugo).
Le MAP non motrici sono in grado di regolare l'organizzazione microtubulare. Ne
sono esempi la MAP specifica degli assoni Tau (che produce micrtotubuli in fasci
compatti) e la proteina MAP2 (che produce estroflessione del tipo dendritiche). La
funzione di alcune MAP può essere modificata attraverso fosforilazione
(nell'Alzheimer c'è un progressivo deterioramento delle funzioni mentali dovuto
alla morte di cellule neuronali nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo, e questi
ammassi neurofibrillari sono dovuti principalmente alla fosforilazione anomala
della proteina Tau, che perde così la capacità di legare i microtubuli e forma
invece filamenti ad elica accoppiati, che precipitano associati ad altre proteine).

Microfilamenti

I microfilamenti hanno un diametro di 7 nm, ed hanno la principale funzione nella


contrattilità delle cellule muscolari dove interagiscono con la miosina( la miosina
di tipo I, monomero, è responsabile del movimento lungo il filamento di actina, la
miosina di tipo 2, filamento, è responsabile del movimento lungo il filamento di
actina nel sarcomero della cellula muscolare) e sono comunque associati a
funzioni di movimento (movimento ameboide, correnti citoplasmatiche, solco di
clivaggio durante la citocinesi). Fasci paralleli di microfilamenti formano anche la
struttura portante dei microvilli.
L'actina, una volta sintetizzata, si organizza in un struttura ad U che lega ATP o
ADP nella cavità centrale. Le singole molecole di actina sono chiamate actina G
(globulare). Le catene di actina G poi polimerizzano per formare i microfilamenti, e
questa forma è detta actina F (filamentosa). Vi sono inoltre molte proteine che
legano l'actina e ne regolano l'attività. Le actine possono essere divise in due
gruppi principali: le actine muscolo-specifiche (actine alfa) e le actine non
muscolari (beta e gamma), inoltre sono presenti le proteine correlate all'actina
(ARP) che sembrano avere una funzione critica nel processo di nucleazione dei
microfilamenti, come lo aveva la tubulina gamma nel processo di nucleazione dei
microtubuli. I filamenti di actina F che si formano sono composti da due catene
parallele lineari di actina G avvolte ad elica. Anche i microfialementi hanno una
polarità intrinseca. Il frammento S1 della miosina si lega ai microfilamenti di
actina conferendogli una tipica forma a punta di freccia, con tutte le molecole di

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S1 rivolte nella stessa direzione: si stabilisce così estremità appuntita l'estremità


negativa, ed estremità sfrangiata quella positiva. La polarità fa sì che i filamenti di
actina G siano aggiunti e sottratti più rapidamente all'estremità positiva e più
lentamente a quella negativa. Man mano che l'actina G è polimerizzata in actina F
nei microfilamenti, avviene l'idrolisi di ATP ad ADP, così come avviene con il GTP
relativamente ai microtubuli. LE proteine G monomeriche Rac, Rho e Cdc42
regolano l'assemblaggio dei filamenti di actina attivando enzimi chiansi che
fosforilano gli inositoli di membrana, causando quindi un aumento degli inositoli
fosforilati.
Le estremità dei microfilamenti possono essere bloccate da proteine cappuccio
che, inibendo ulteriori aggiunte di o sottrazioni di subunità, stabilizzano il
microfilamento. La proteina cappuccio che lega l'stremità positiva dei
microfilamenti è chiamata capZ, e il suo legame impedisce l'aggiuntà di nuove
subunità all'estremità positiva, mentre la sua rimozione permette di riprendere il
processo di addizione delle subunità.

Filamenti intermedi

I filamenti intermedi hanno un diametro di circa 8-12 nm, sono singoli o


organizzati in fasci ed hanno la funzione strutturale o di sostegno della tendione
cellulare, sono inoltre le strutture più stabili e meno solubili del citoscheletro, si
trovano solo negli organismi multicellulari,e differiscono profondamente come
composizione amminoacidica da tessuto a tessuto. I filamenti intermedi possono
essere raggruppati in sei classi: le classi 1 e 2 comprendono le cheratine, proteine
che organizzano i tonofilamenti delle cellule epiteliali che ricoprono la superficie
del corpo e le sue cavità. Le cheratine di classe 1 sono le cheratine acide, mentre
quelle di classe 2 sono le cheratine basiche o neutre. La classe 3 comprende la
vimentina, la desmina e la proteina fibrillare acida della glia (GFA). La classe 4 è
costituita dalle proteine dei neurofilamenti. La classe 5 è costituita dalle lamine
nuclaeri A, B e C. La classe 6 è data dalla nestina (si trova nei neurofilamenti del
sistema nervoso embrionale). La tipizzazione dei filamenti intermedi serve anche
come strumento diagnostico in medicina ed è particolarmente utile nella diagnosi
di tumori, in quanto le cellule tumorali mantengono i filamenti intermedi
caratteristici del tessuto d'origine, indipendentemente dalla localizzazione del
tumore del corpo. Le proteine dei filamenti intermedi sono fibrose,anziché
globulari, e sono caratterizzate da un dominio centrale a bastoncello formato da
circa 310-318 amminoacidi. Questo dominio centrale consiste di 4 segmenti di
eliche avvolti a spirale inframmezzati da 3 corti segmenti di giunzione. Ai fianchi
dell'elica centrale sono presenti due domini, ammino e carbossi terminale che
rendono conto della diversità funzionale dei diversi filamenti intermedi tessuto-
specifici. La struttura di base dei filamenti intermedi consiste di due polipeptidi
avvolti tra loro in una struttura a spirale. I domini centrali ad elica dei due
polipeptidi sono paralleli ed allineati, mentra i domini ammino e carbossi
terminale sporgono come strutture globulari alle due estremità. Due dimeri si
associano lateralmente a formare un tetramero detto protofilamento. I
protofilamenti interagiscono tra loro e si associano per sovrapposizione laterale e
longitudinale per costituire la struttura filamentosa. Quando è del tutto
assemblato, un filamento intermedio è sotituito da 8 protofilamenti, connessi
testa-testa con sovrapposizione sfalsata.
Nelle cellule epiteliali i tonofilamenti costituiti da cheratina sono connessi a

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placche chiamate desmosomi che formano robuste giunzioni di connessione tra


due cellule vicine. Un'altra struttura, l'emidesmosoma, connette la superficie
basale delle cellule epiteliali con la matrice extracellulare.
Malattie connesse ai filamenti intermedi: epidermolisi bollosa (EBS), sclerosi
laterale amiotrofica (ALS), cardimiopatie ereditarie, Epidermolisi bollosa associata
a distrofia muscolare (EBS-MD, quando manchi l'espressione della proteina
plectrina).
Nel nucleo delle cellule, i filamenti intermedi formano una struttura di supporta
detta lamina nucleare, localizzata al di sotto della membrana interna del nucleo.
La lamina nucleare è composta da 3 proteine distinte dei filamenti intermedi,
chiamate lamine nucleari A, B e C. queste lamine sono fosforilate e si
disorganizzano nel momento in cui una parte dell'involucro nucleare si disgrega
all'inizio della mitosi. Al termine della mitosi, delle fosfatasi specifiche rimuovono
i gruppi fosfato, permettendo all'involucro nucleare di riformarsi.
I 3 elementi citoscheletrici concorrono al mantenimento della tensegrità cellulare,
atta a sopportare lo stress meccanico.

• Complesso del poro nucleare


Il nucleo è circondato da un involucro nucleare costituito da due membrane
interna ed esterna, separate da uno spazio perinucleare con dimensione interna di
20-40 nm. Ogni membrana è spessa 7-9 nm e presenta un'organizzazione
trilaminare. La membrana nucleare interna è appoggiata su una rete di fibre di
sostegno chiamata lamina nucleare, mentra la membrana nucleare esterna è in
comunicazione col reticolo endoplasmatico, rendendo così lo spazio perinucleare
continuo ripetto al RE. Come le membrane del reticolo endoplasmatico rugoso, la
membrana esterna è spesso ricoperta sulla superficie esterna dai ribosomi attivi
nella sintesi proteica.
Sulla membrana nucleare ci sono i pori nucleari, ogni poro è costituito da un
piccolo canale cilindrico che si estende attraverso tutte e due le membrane
dell'involucro nucleare, permettendo la comunicazione fra citosol e nucleoplasma.
La membrana esterna e interna sono fuse tra loro a livello di ogni singolo poro,
formando un canale tappezzato da un'intricata struttura proteica detta complesso
del poro nucleare (NPC), che ha un diametro di circa 120 nm e contiene più di 100
tipi di subunità proteiche diverse. Le sue subunità presentano organizzazione
ottagonale, alcuni complessi del poro presentano granuli centrali. Tale complesso
si struttura quasi come una ruota appoggiata all'interno dell'involucro nucleare:
ognuno dei due anelli paralleli appoggiati sei bordi della ruota consiste di otto
subunità. Otto bracci si estendono dagli anelli verso il mozzo della ruota che
rappresenta il granulo centrale. Tale granulo è chiamato trasportatore, e ci sono
anche proteine che si estendono dal bordo verso lo spazio perinucleare che
ancorano il complesso all'involucro,ed inoltre alcune fibre che si estendono dagli
anelli verso il citosol ed il nucleoplasma. Quelle che si estendono verso il
nucleoplasma formano il "cesto nucleare" (basket).
L'involucro nucleare protegge l'RNA non ancora maturo dell'essere usato dai
ribosomi citoplasmatici o dagli enzimi. Tutti gli enzimi e le proteine necessarie nel
nucleo, per la replicazione dei cromosomi e per la trascrizione del DNA devono
essere importati nel nucleo dal citoplasma. Al contrario, tutte le molecole di RNA
e i ribosomi parzialmente assemblati necessari per la sintesi proteica nel
citoplasma devono arrivare dal nucleo.

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La velocità di ingresso delle particelle nel nucleo è inversamente proporzionale al


loro diametro. Particelle con un diametro maggiore di 10 nm sono escluse dal
passaggio, per questo si è concluso che il complesso del poro contiene dei
piccoli canali acquosi di diffusione, attraverso i quali possono liberamente
muoversi piccole particelle. I pori hanno indicato che i canali acquosi hanno circa
9 nm di diametro, e ci sono 8 canali localizzati alla periferia del complesso del
poro, fra i bracci, e forse anche un nono canale al centro del trasportatore. Le
grosse proteine, come gli enzimi della sintesi del DNA e RNA e i complessi
ribonucleoproteici dell'mRNA e le subunità ribosomiali, attraversano il poro con
un meccanismo di trasporto attivo. Il meccanismo alla base di questo processo è
meglio conosciuto per le proteine che sono attivamente trasportate dal citosol al
nucleo. Queste proteine posseggono uno o più segnali di localizzazione nucleare
(NLS).il limite massimo per questo tipo di trasporto attivo nel complesso del poro
è di 26 nm. Il meccanismo di trasporto attivo all'interno del nucleo comprende 3
passaggi:
1)la proteina contenente il segnale NLS è convogliata dal citosol verso un poro
nucleare. Questo passaggio coinvolge delle proteine citoplasmatiche che fungono
da recettore, le importine, che si legano al segnale NLS e che mediano il
movimento della proteina-NLS verso un poro, forse con l'ausilio delle fibre
citoplasmatiche del poro che in qualche modo funzionano da binari.
• Il complesso importina-proteina-NLS lega la parte citoplasmatica del
complesso del poro nucleare.
• Questo passaggio è energia-dipendente. Il complesso importina-proteina-NLS
è trasportato all'interno del nucleo dal trasportatore, localizzato al centro del
poro. Questo trasporto richiede la presenza di una proteina che idrolizza GTP,
nota come Ran.
Per il processo di esportazione di ribonucleoproteine dal nucleo al citoplasma il
meccanismo è principalmente lo stesso. Le componenti proteiche da esportare
contengono segnali diesportazione nucleare (NES), e questi segnali sono
riconosciuti da proteine dette esportine.

• Trasporto passivo o Diffusione facilitata


Molte sostanze presenti nelle cellule sono troppo grandi o troppo polari per poter
attraversare le membrane per diffusione semplice a velocità ragionevoli, anche se
il processo è esorgonico. Per questo è necessario l'intervento di proteine di
trasporto che mediano tale movimento di soluto entro e fuori la membrana. Se tale
processo è esorgonico, viene definito diffusione facilitata, o trasporto passivo,
perché il soluto diffonde secondo il gradiente di concentrazione o il gradiente
elettrochimico senza che vi sia apporto di energia.
Tutte le proteine di trasporto coinvolte in tali processi sono proteine integrali di
membrana con parecchi segmenti transmembrana. Tali proteine si dividono dal
punto di vista funzionale, in 2 gruppi:
1) le proteine carrier (trasportatori o permeasi), si legano ad una o più molecole di
soluto su un lato della membrana e poi subiscono un cambiamento
conformazionale, che determina il trasferimento del soluto sul lato opposto della
membrana. Una proteina carrie si lega alle molecole del soluto in modo tale da
proteggerne i gruppi polari o provvisti di carica dalla parte interna apolare della
membrana.
• le proteine canale invece formano attraverso la membrana dei canali idrofili

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che permettono il passaggio dei soluti senza alcun cambiamento


conformazionale. Alcuni di questi canali sono larghi e aspecifici, come i pori
presenti nelle membrane di batteri, mitocondri e cloroplasti. I pori sono formati
da proteine transmembrana dette porine, che permettono il passaggio di soluti
idrofili selezionati fino a 600 Da. Tuttavia alcuni di questi canali sono altamente
selettivi, ed altri ancora sono coinvolti nel passaggio di ioni e sono detti canali
ionici.
Una proteina carrier è una proteina allosterica che si alterna tra due stadi
conformazionali, in maniera tale che il sito della proteina a cui si lega il soluto è
aperto o accessibile prima su un lato della membrana e poi sull'altro.
Le proteine carrier funzionano un po’ come gli enzimi, perché attuano una
dimuzione dell'energia di attivazione della reazione dovuta al coinvolgimento della
proteina catalizzatrice, e per questo tali processi seguono le cinetica di Michaelis-
Mentev. Le proteine carrier inoltre sono altamente specifiche. Le proteine carrier
sono soggette anche ad inibizione competitiva.
Quando una proteina carrier trasporta attraverso la membrana un singolo soluto, il
processo è chiamato uniporto. Quando due soluti vengono trasportati
contemporaneamente ed il loro trasporto è accoppiato in modo tale che il
trasporto dell'uno si interrompe se l'altro è assente, il processo è definito
cotrasporto o trasporto accoppiato. Nel cotrasporto, il processo viene chiamto
simporto,se i due soluti si spostano nella stessa direzione, o antiporto se i due
soluti si spostano in direzioni opposte.
Il passaggio di glucosio all'interno di un eritrocita è un esempio di trasporto
facilitato attraverso la membrana plasmatica, mediato da una proteina carrier
uniporto chiamata GluT. La bassa concentrazione intracellulare di glucosio, che
rende possibile per la maggior parte delle cellule animali la diffusione facilitata,
viene mantenuta grazie al fatto che il glucosio, appena entrato, viene subito
fosforilato a glucosio-6-fosfato dall'enzima esochinasi, con l'intervento dell'ATP
che funge da donatore di fosfato e da fonte di energia. La fosforilazione del
glucosio ha anche l'effetto di mantenere il glucosio nella cellula, poiché la
membrana plasmatica dell'eritrocita non possiede una proteina di trasporto per il
glucosio-6-fosfato.
Una proteina carrier antiporto presente nella membrana plasmatica dell'eritrocita è
la proteina scambiatrice di anioni,o scambiatore cloruro-bicarbonato o proteina
della banda 3, con accoppiamento obbligatorio degli ioni cloruro e bicarbonato.
Il flusso rapido degli ioni bicarbonato, reso possibile da questa proteina, è
essenziale per il ruolo espletato dall'eritrocita nel trasporto della CO2 dai tessuti ai
polmoni. Nella forma gassosa la CO2 non è molto solubile nelle soluzioni acquose
quali il citoplasma o il plasma sanguigno. La proteina scambiatrice di anioni,
tuttavia, facilita il trasporto di CO2: non appena la CO2 diffonde nell'eritrocita,
viene convertita in anioni bicarbonato dall'anidrasi carbonica, un enzima del
citosol, che vengono poi trasportati all'esterno mentre gli ioni cloro si muovono
all'interno per bilanciare la carica. Nei polmoni il processo è invertito: gli anioni
bicarbonato entrano nell'eritrocita scambiandosi con gli ioni cloro e sono
convertiti in CO2 dall'anidrasi carbonica. La CO2 poi diffonde al di fuori
dell'eritrocita e all'interno delle cellule che tappezzano i vasi capillari del polmone.
La quantità di bicarbonato trasportato in questo modo è sufficiente per reggere il
ritmo della produzione di CO2 nel corpo.
Vi sono principalmente 3 tipi di proteine canale transmembrana: i canali ionici, le
porine e le acquaporine.

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La struttura dei canali ionici è quella di un poro molto piccolo rivestito da gruppi
laterali di amminoacidi idrofili, per questo sono molto selettivi. La selettività si
attua principalmente per differenza di carica o di dimensioni. Molti canali ionici
sono controllati, possono cioè essere aperti e chiusi mediante cambiamenti
conformazionali della proteina, regolando così il flusso degli ioni. Nelle cellule
animali, 3 diversi tipi di stimoli inducono cambiamenti conformazionali nei canali
controllati:
1) i canali a controllo di potenziale si aprono e si chiudono in risposta a
cambiamenti del potenziale di membrana.
2) i canali a controllo di ligando sono innescati dal legame alla proteina canale di
sostanze specifiche.
3) i canali a controllo meccanico rispondono a forze meccaniche che agiscono
sulla membrana.
La trasmissione dei segnali elettrici da parte delle cellule nervose dipende dai
cambiamenti rapidi e controllati degli ioni Na+ e K+, attraverso i loro rispettivi
canali. Oltre a questo tipo di regolazione a breve termine, molti canali ionici sono
soggetti a regolazione a lungo termine, più che altro per controllo ormonale.
Le porine sono proteine transmembrana multipasso. La caratteristica principale
delle porine è che i segmenti transmembrana attraversano la membrana non in
forma di alfa-elica, ma di beta-foglietto cilindrico chiuso denominato beta-barrel, il
quale ha nella parte centrale un poro ripieno di acqua. La parte interna del poro è
tappezzata di catene laterali polari, mentre la parte esterna è formata da porzioni
apolari che interagiscono con la porzione idrofoba della membrana. Il complesso
della porina permette così il passaggio di diversi soluti idrofili.
Le acquaporine permettono il passaggio veloce di acqua all'interno e all'esterno
della membrana. Le acquaporine sono proteine integrali di membrana con sei
segmenti transmembrana elicoidali. Nel caso di AQP-1, l'acquaporina presente bei
tubuli renali, l'unità funzionale è costituita da un tetramero formato da 4 monomeri
identici. Tali subunità formano un canale grazie ai loro segmenti transmembrana.

• Equilibrio chimico del potenziale di membrana.


Un potenziale di membrana è una proprietà fondamentale di tutte le cellule che
deriva dal fatto che la cellula a riposo in genere ha un eccesso di carico negativa
all'interno ed un eccesso di carica positiva all'interno, si dice appunto che la
cellula ha un potenziale di membrana a riposo negativo.Nelle cellule che hanno
eccitabilità elettrica (nerovose, muscolari, isole del pancreas endocrino), alcuni
tipi di stimoli inducono una rapida sequenza di modificazioni del potenziale di
membrana detta potenziale di azione. Durante il potenziale di azione, in poco più
di un millisecondo il potenziale di membrana cambia da negativo a positivo per
poi tornare negativo. Nelle cellule nervose tale cambiamento del potenziale di
membrana temporaneo ha la funzione di trasmettere il segnale elettrico lungo
l'assone.
Il potenziale di membrana a riposo si genera per il diverso contenuto di anioni e
cationi fra il citosol della cellula e il fluido extracellulare. Il fluido extracellulare è
una soluzione acquosa di sali, tra cui il cloruro di sodio e, in quantità minore, il
cloruro di potassio. Il catione principale del citosol, invece, a causa dell'azione
della pompa Na+/K+ è il potassio e non il sodio. Gli anioni contenuti nel citosol
sono per lo più macromolecole, come proteine, RNA ecc. queste macromolecole
cariche negativamente non riescono a passare all'esterno della membrana

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plasmatica e restano quindi all'interno della cellula. La presenza nel citosol di


questi anioni non diffusibili è il motivo principale per cui la cellula ha un
potenziale di membrana a riposo.
Le cellule in genere hanno una concentrazione di ioni potassio alta all'interno e
bassa all'esterno: questa diversa distribuzione degli ioni potassio è detta
gradiente dello ione potassio, per cui gli ioni potassio avranno la tendenza ad
uscire dalla cellula. Nel citosol i cationi K+ bilanciano la carica degli anioni
(macromolecole proteiche), mentra all'esterno della cellula, i cationi Na+
bilanciano la carica degli anioni Cl-. La tendenza di due ioni a riunirsi è detta
potenziale. Nel momento in cui due ioni con carica opposta si muovono per
riunirsi si genera una corrente, misurata in ampére. Per questi principi si genera il
potenziale di membrana a riposo: la membrana plasmatica, in genere, è
permeabile al potassio in quanto provvista di alcuni tipi di canali del potassio, che
permettono una certa diffusione di questi ioni all'esterno della cellula. Non
esistono invece canali per le macromolecole cariche negativamente. Quindi,
quando il potassio esce dal citosol, rimangono intrappolati all'interno anioni privi
di controione; nel citosol si accumula così un eccesso di carica negativa, mentre
all'esterno si accumula un eccesso di carica positiva, per cui si genera così il
potenziale di membrana.
Si raggiunge un equilibrio quando la forza di attrazione dovuta al potenziale di
membrana controbilancia la tendenza del potassio a diffondere lungo il suo
gradiente di concentrazione. Questo tipo di equilibrio, in cui un gradiente chimico
è controbilanciato da un potenziale elettrico, si definisce equilibrio elettrochimico.
Il potenziale di membrana al punto di equilibrio viene detto potenziale di
membrana all'equilibrio. Dato che il gradiente di ioni potassio svolge il lavoro di
separare le cariche negative da quelle positive fino al raggiungimento di un
potenziale di membrana all'equilibrio, l'ampiezza del gradiente di ioni potassio
determina il valore del potenziale di membrana all'equilibrio.

• Il collagene
I componenti più abbondanti della matrice extracellulare (MEC) delle cellule
animali sono una famiglia di proteine chiamate collageni, che formano fibre con
elevata resistenza alla trazione. I collageni sono secreti da diversi tipi di cellule
dei tessutio connettivi quali i fibrioblasti. Il collagene è presente soprattuttoo nei
tendini e nei legamenti. Tutti i collageni hanno in comune due caratteristiche
specifiche: la presenza di una tripla elica rigida di tre catene polipeptidiche
avvolte tra loro e una composizione amminoacidica inusuale. In particolare i
collageni sono caratterizzata dall'elevata presenza degli amminoacidi glicina,
idrossiprolina, idrossilisina. La presenza della glicina rende possibile la
formazione della tripla elica in quanto la spaziatura della glicina nella sequenza
amminoacidica la posiziona sull'asse dell'elica e questo è l'unico amminoacido
sufficientemente piccolo da trovar spazio all'interno della tripla elica stessa.
Ciascuna fibra di collagene è composta da numerose fibrille. Una fibrilla a sua
volta è costituita da numerose molecole di collagene, ciascuna delle quali
consiste di 3 catene polipeptidiche, chiamate catene alfa, avvolte tra loro in una
tripla elica destrorsa rigida. Le molecole di collagene hanno una lunghezza di
circa 270 nm ed diametro di 1,5 nm, e sono allineate lateralmnte con legame testa-
coda all'interno della fibrilla.

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Nel lume del reticolo endoplasmatico tre catene alfa si assemblano formando una
tripla elica chiamata pro-collagene. Ad entrambe le estremità della tripla elica
sono presenti brevi tratti di sequenze amminoacidiche non strutturate che
prevengono la polimerizzazzione in fibrille all'interno della cellula. Una volta
secreto nella spazio pericellulare, il pro-collagene è convertito in collagene ad
opera di una peptidasi specifica, un enzima che rimuove i tratti amminoacidici alle
estremità ammino e carbossi terminale della molecola di pro-collagene. Le
molecole così modificate interagiscono spontaneamente e polimerizzano
formando le fibrille collageniche mature che successivamente si associano
formando la fibra. La stabilità delle fibre collagene è rinforzata ponti H che
coinvolgono gli ossidrili dei residui di idrossiprolina e di idrossilisina delle catene
alfa. Questi ponti H formano legami crociati sia all'interno che tra le singole
molecole di collagene presenti in una fibrilla.
Nei vertebrati sono note 25 catene alfa differenti, ciascuna delle quli è codificata
da un gene specifico e possiede una sequenza amminoacidica caratteristica.
Queste catene alfa si associano in varie combinazioni generando 15 tipi differenti
di molecole di collagene, la maggioranza delle quali si trova in tessuti specifici. I
collageni 1,2,3 sono i più abbondanti. Le fibrille di collagene 1,2,3,5 mostrano una
striatura caratteristica formata da bande trasversali che si ripetono con un
periodo di 67 nm.

• Integrine
Le fibronectine e le laminine si legano alle cellule, poiché queste espongono sulla
membrana recettori glicoproteici che riconoscono e legano regioni specifiche di
queste proteine della matrice. Questi recettori, insieme a recettori per altre
molecole della matrice extracellulare, appartengono ad una famiglia di
glicoproteine transmembrana chiamate integrine, il cui ruolo è appunto quello di
integrare meccanicamente e funzionalmente la matrice extracellulare con il
citoscheletro. Le integrine sono importanti recettori,tramite i quali le proteine
della matrice, quali i collageni, le fibronectine e le laminine possono legarsi alle
cellule controllandone l'organizzazione e la funzione.
Le integrine sono costituite da due catene polipeptidiche transmembrana, le
subunità alfa e beta, che si associano in modo non covalente formando un
dimero. Il dimero alfa/beta alla superficie esterna della membrana forma un sito di
legame per le proteine adesive extracellulari. La specificità di legame dipende in
modo particolare dalla subunità alfa. Sul versante citoplasmatico della membrana,
le integrine legano molecole del citoscheletro specifiche, permettendo così
l'interazione fisica tra il citoscheletro e la matrice extracellulare attraverso la
membrana plasmatica. La presenza di diverse subunità alfa e beta porta alla
formazione di un numero elevato di eterodimeri di integrine che differiscono nella
capacità di legame con le proteine della matrice e che sono espressi su diversi
tipi cellulari.
Le integrine che contengono la subunità beta1 sono presenti sulla membrana di
quasi tutte le cellule animali e mediano l'adesione di queste alla matrice
extracellulare. Le integrine che hanno la subunità beta2 sono presenti solo sulla
membrana dei leucociti e controllano le interazioni cellula-cellula. Molte integrine
riconoscono la sequenza RGD nelle glicoproteine della matrice che cono capaci di
legare.
Il recettore della fibronectina è l'integrina meglio caratterizzata. Il recettore della

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fibronectina è una proteina transmembranaria con un sito di legame per la


sequenza RGD della fibronectina sul versante esterno della membrana. Sul
versante esterno il recettore ha un sito di legame per la talina, una proteina del
citoscheletro che a sua volta lega la vincolina e quindi i microfilamenti di actina.
L'affinità dell'integrina per la talina dipende dallo stato di fosforilazione di una
tirosina presente nel sito di legame per questa proteina. quando la tirosina non è
fosforilata, il sito di legame ha un'alta affinità per la talina. Tuttavia, quando la
tirosina è fosforilata da una chinasi specifica, l'affinità di legame diminuisce
portando alla dissociazione della talina, e quindi alla rottura del legame tra la
fibronectina e i microfilamenti di actina del citoscheletro.
Le integrine giocano un ruolo chiave nella connessione della matrice
extracellulare con il citoscheletro grazie alla capacità di legare i componenti della
matrice extracellulare alla superfice esterna ed i filamenti di actina alla superficie
citoplasmtica della membrana. Grazie a questa interazione la matrice
extracellulare e il citoscheletro si influenzano a vicenda.

• La via di Ras
Il meccanismo con cui la via di ras induce il superamento del punto di controllo di
G1 e l'entrata in fase S ha sei passaggi:
1) il fattore che stimola la crescita si lega al recettore di membrana.
2) questo legame stimola la attività tirosina chinasica del recettore, causando
quindi la fosforilazione dei residui di trosina
3) le tirosine fosforilate servono come sito di legame per una serie di proteina
adattatrici che, a loro volta, attivano una proteina G associata alla membrana, la
proteina ras. Come nel caso di altre proteine G, la attivazione della proteina ras è
accompagnata al legame di GTP e al rilascio di GDP.
4) la molecola ras attivata stimola una cascata di reazioni di fosforilazione, che
inizia con la fosforilazione di una proteina chinasi detta raf. Nella forma attiva raf
fosforila le serine e le treonine di una proteina chinasi chiamate MEK, che a sua
volta fosforila le treonine e le tirosine di un gruppo di proteine chinasi dette MAP
chinasi.
5) le MAP chinasi attive entrano nel nucleo e fosforilano diversi fattori
trascrizionali, cioè proteine che attivano la trascrizione di geni specifici. Tra le
proteine attivate da questo meccanismo di fosforilazione vi è Jun ( che fa parte
del fattore trascrizionale AP-1) e alcune proteine della famiglia di fattori
trascrizionali ETS. Questi fattori trascrizionali così attivati accendono la
trascrizione dei geni precoci che codificano per latri fattori trascrizionali come
Myc, Fos e Jun, che, a loro volta, attivano la trascrizione di alcuni geni tardivi: uno
di questi codifica per il fattore E2F.
6) tra i geni tardivi ci sono anche i geni per chinasi e cicline, la cui produzione
porta alla formazione di processi di complessi ciclina-chinasi che fosforilano la
proteina Rb e quindi inducono il passaggio da G1 a S.

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• Lisosomi
Il lisosoma è un organulo contenente enzimi digestivi capaci di degradare tutte le
capaci di degradare tutte le principali classi di macromolecole biologiche, che
includono i lipidi, i carboidrati, gli acidi nucleici e le proteine. Gli enzimi digestivi
sono necessari per degradare materiali extracellulari introdotti per endocitosi, e
per digerire strutture intracellulari e macromolecole che sono danneggiate o non
più necessarie.
I lisosomi contengono fosfatasi acida, beta-glucuronidasi, una
desossiribonucleasi, una ribonucleasi, e una proteasi. Il lisosoma è circondato da
una singola membrana, questa membrana è determinante per proteggere il resto
della cellula dagli enzimi idrolitici contenuti in esso. Pompe protoniche ATP-
dipendenti mantengono all'interno del lisosoma una ambiente acido (ph 4-5) che
favorisce la digestione enzimatica delle molecole denaturandole parzialmente. I
prodotti della digestione vengono così trasportati, passivamente o attivamente,
attraverso la membrana del citosol, dove entrano in varie vie sintetiche o vengono
espulsi dalla cellula.
Tutti gli gli enzimi lisosomali hanno la proprietà comune di essere idrolasi acide,
ed idrolici con un PH ottimale intorno a 5. Ci sono 5 fosfatasi, 14 proteasi e
peptidasi, 2 nucleasi, 6 lipasi, 13 glicosidasi, 7 solfatasi. Un'ampia glicosilazione
dei componenti della membrana esposti all'interno del lisosoma maturo protegge
la membrana lisosomale della degradazione. Gli enzimi lisosomiali vengono
sintetizzati dai ribosomi adesi al RE rugoso e trasferiti nel lume del RE, prima di
essere trasportati al complesso di Golgi. Dopo aver subito modificazione e
maturazione nel RE e nel complesso di Golgi ad opera di alcuni degli stessi
enzimi che modificano e maturano le glicoproteine di secrezione e della
membrana plasmatica, gli enzimi lisosomiali sono selezionati dalle altre proteine
del TGN. Gli enzimi lisosomiali vengono impacchettati in vescicole rivestite da
clatrina che gemmano dal TGN, perdono i loro rivestimenti proteici e viaggiano
verso uno dei compartimenti endosomiali. Un endosoma tardivo è un orgulo con
un corredo completo di idrolasi acide, ma non ancora impegnato nell'attività
digestiva. Dopo che le idrolasi acide provenienti dal TGN si sono unite al
materiale extracellulare e intracellulare portati da un endosoma precoce,
l'endosoma tardivo forma un lisosoma pienamente attivo. Durante questo
processo l'attività continuata delle pompe protoniche ATP-dipendente abbassa il
ph da circa 5,5 nell'endosoma tardivo a 4-5 nel lisosoma, favorendo l'attivazione
delle idrolasi acide e la parziale denaturazione del materiale destinato alla
degradazione.
Per distinguere tra i lisosomi maturi di origine diversa denominiamo lisosomi
eterofagici quei lisosomi che contengono ostanze di origine extracellulare, mentre
quelli con materiale di origine intracellulare vengono chiamati lisosomi autofagici.
I processi specifici in cui vengono coinvolti gli enzimi lisosomiali sono la
fagocitosi, l'endocitosi mediata da recettore, l'autofagia e la digestione
extracellulare.
Tali vescicole di endocitosi possono accumulare proteine lisosomiali mediante:
• la fusione con vescicole di trasporto che provengono direttamente dal TGN
• la formazione di associazioni transitorie con endosomi precoci o tardivi, mai
fondendosi in maniera permanente con un compartimento lisosomiale.
• La fusione diretta con endosomi tardivi

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Alla fine comunque rimane nel lisosoma soltanto il materiale non digerito che,
quando la digestione cessa, diventa un corpo residuo (causando l'invecchiamento
cellulare). La digestione degli organuli o delle altre strutture cellulari vecchie o
danneggiate è definita autofagia: macrofagia e microfagia.
La macrofagia comincia quando un organulo, o un'altra struttura,viene avvolta da
una doppia membrana di derivazione dal RE. La vescicola che si viene a formare è
chiamata vacuolo autofagico. La microfagia comporta la formazione di un vacuolo
autofagico molto più piccolo, circondato da un solo doppio strato fosfolipidico
che racchiude piccole parti di citoplasma.
Alcune malattie infiammatorie, come l'artrite reumatoide, sono determinate da
un'involontaria liberazione di enzimi lisosomiali all'interno delle articolazioni. Si
ritiene che il cortisone e l'idrocortisone, ormoni steroidei, siano agenti anti-
infiammatori efficaci, grazie alla loro azione di stabilizzazione delle membrane
lisosomiali e perciò di inibizione della liberazione degli enzimi.
Le malattie connesse al malfunzionamento dei processi di dogestione lisosomiale
sono per lo più date dall'accumulo di prodotti indigeriti e dannosi.
La glicogenosi di tipi 2 è causata dall'accumulo di quantità eccessive di glicogeno
nel fegato, nel cuore e nei muscoli scheletrici, per carenza dell'enzima lisosomiale
alfa-1,4-glicosidasi.
Vi sono anche la sindrome di Hurler (l'enzima difettoso è la alfa-L-ialuronidasi) e la
sindrome di Hunter, e la malattia di Tay-Sachs, una condizione ereditata come
carattere recessivo, cha a causa della mancanza dell'enzima lisosomiale beta-N-
acetilesosamminidasi, responsabile della scissione della N-acetil-galattosammina
terminale dalla porzione glucidica del ganglioside, e tale situazione determina
l'accumulo dei gangliosidi a livello dei tessuti nervosi.

• Matrice extracellulare
Le strutture extracellulari negli organismi eucarioti hanno caratteristiche comuni:
consistono di lunghe molecole fibrose flessibili immerse in una matrice cellulare
idratata amorfa di glicoproteine e polisaccaridi ramificati. Tale matrice
extracellulare (MEC) è importante per i processi di motilità, differenziamento e
adesione.
La MEC delle cellule animali è formata da 3 classi di molecole:
1. proteine strutturali, quali i collageni e le elastine, che conferiscono restistenza e
flessibilità.
• complessi di proteine e polisaccaridi definiti proteoglicani che costituiscono le
molecole idratate in cui sono immerse le proteine strutturali
• glicoproteine adesive quali le fibronectine e le laminine (i loro recettori sono le
integrine).
• Collagene = vedi risposta specifica sul collagene
• Elastina = le elastine sono ricche di amminoacidi glicina e prolina. Tuttavia la
prolina non è idrossilata né sono presenti residui di idrossilisina. Le molecole
di elastina sono legate fra loro da legami crociati covalenti tra i residui di lisina.
• Fibronectina = è formata da due catene polipeptidiche molto grandi legate in
prossimità del carbossi-terminale da due ponti disolfuro.ogni subunità è
organizzata in una serie di regioni globulari connesse da brevi tratti flessibili.
Alcuni frammenti di fibronectina hanno la capacità di legare i recettori di

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membrana grazie ad una sequenza specifica detta RGD, (arginina-glicina-


aspartico). Tale sequenza è riconosciuta da diversi recettori della famiglia delle
integrine.
• Laminine = rappresentano la seconda grande famiglia di glicoproteine adesive.
Le laminine sono presenti esclusivamente nelle lamine basali, una struttura
planare di proteine della matrice di circa 50 nm di spessore, frapposta tra le
cellule epiteliali e il connettivo sottostante. Tutte le forme di lamina basale
contengono collagene di tipo 4, proteoglicani e una proteina detta entactina. La
laminina è una glicoproteina molto grande, costituita da 3 lunghe catene
polipeptidiche chiamate alfa, beta1 e beta2. Le tre catene formano una struttura
a croce stabilizzata da ponti disolfuro con parte del braccio lungo avvolto in
una spirale a 3 filamenti. Come la ficronectina, anche la laminina consiste di
regioni differenti capaci di legare il collagene di tipo 4, l'eparina, eparan-solfato,
entactina. Queste proprietà di legame permettono alla laminina di fungere da
molecola-ponte tra le cellule e la lamina basale.
• Integrine = vedi risposta apposita.
• Glicocalice = le cellule animali presentano subito al di sopra della membrana
plasmatica, una zona con un elevato numero di carboidrati detta glicocalice,
che protegge la superficie cellulare, permette denomeni di riconoscimento e di
adesione e forma una barriera di permeabilità. Consiste di due porzioni:
glicocalice ancorato, che consiste di elementi che fanno parte della membrana
stessa (catene glucidiche legate covalentemente alle glicoproteine integrali di
membrana o ai glicolipidi); e glicocalice disancorato, consiste di porzioni che
possono essere rimosse senza danneggiare la cellula o la membrana.
L'adesione fra le cellule è mediata dal legame di una molecola di N-cam (molecola
adesiva dei neuroni) su una cellula con una molecola uguale su di un'altra cellula.
Un'altra famiglia di glicoproteine adesive che mediano il riconoscimento cellulare
è quella delle caderine, che richiedono ioni calcio per un cambiamento
conformazionale che permette l'adesione. Le caderine sono tessuto-specifiche.
Un altro tipo di proteine che favoriscono l'adesione sono le lectine.

• Giunzioni cellulari
Sono di tre tipi: adesive, occludenti e comunicanti.
• Le giunzioni adesive permettono il collegamento fra il citoscheletro di due
cellule diverse. Delle giunzioni adesive fanno parte le giunzioni aderenti, i
desmosomi e gli emidesmosomi. Queste tre giunzioni contengono 2 tipi di
proteine: le proteine di ancoraggio intracellulare, che permettono il legame
della giunzione con i filamenti di citoscheletro all'interno della cellula, e le
proteine di giunzione transmembrana, che sporgono dalla superficie della
cellula e permettono il legame con altre cellule o con la MEC. Le proteine di
ancoraggio intrecellulare formano uno strsto fibroso spesso indicato come
placca sul versante citoplasmatico della membrana plasmatica.
• Giunzioni occludenti non lasciano spazio tra le membrane delle cellule, e
servono principalmente per isolare spazi del nostro corpo permettendo una
netta compartimentazione. Ogni giunzione appare come una serie di filamenti
intrecciati che costituisce una fascia di giunzione, e ciascuno dei filamenti è
costituito da un insieme di proteine giunzionali transmembrana.
• Giunzione comunicante è una regione dove le membrane di due cellule sono
allineate ad una distanza di di 2-3 nm. Questa connessione mette in contatto il
citoplasma delle due cellule, permettendo lo scambio di ioni e piccole molecole

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e quindi instaurando una comunicazione chimica ed elettrica. in questa regione


le membrane delle due cellule sono legate da connessoni, strutture a cilindro
cavo formate da proteine transmembrana strettamente addossate. Ogni
connessone è un cilindro cavo formato da sei subunità di una proteina
chiamata connessina.

• Microvillo
I microvilli sono strutture caratteristiche della porzione apicale delle cellule della
mucosa intestinale, ogni microvillo è lungo 1-2 micron ed ha un diametro di 0,1
micron. I microvilli servono principalmente ad aumentare la superficie assorbente
della cellula. La struttura portante del microvillo è data da un denso fascio di
microfilamenti. Le estremità positive sono rivolte verso la punta, dove sono
ancorate alla membrana tramite una placca amorfa elettrondensa. I microfilamenti
sono inoltre connessi anche lateralmente alla membrana plasmatica tramite le
proteine misonia 1 e calmodulina. Microfilamenti adiacenti sono in stretto contatto
grazie a legami a distanze regolari resi possibili dalle proteine fimbrina e villina.
Alla base dei microvilli, i fasci di microfilamenti si estendono in una rete di
filamenti detta trama terminale, ed in tale trama i filamenti sono arricchiti da
miosina e spectrina, che collegano i filamenti uno all'altro ed a proteine localizzate
nella membrana plasmatica e forse anche con la rete di filamenti intermedi
localizzata sotto la trama terminale. La trama conferisce rigidità ai microvilli
ancorando i fasci di microfilamenti in modo che essi si possano proiettare in alto
verso superficie cellulare.

• Nucleo
Il nucleo è il luogo all'interno della cellula eucariotica dove sono localizzati e
replicati i cromosomi e dove il DNA in essi contenuto, viene trascritto. il nucleo
rappresenta quindi sia il luogo di deposito della maggiore parte delle informazioni
genetiche della cellula, sia il centro di controllo per l'espressione di questa
informazione. Il nucleo è circondato da un involucro nucleare costituito da due
membrane interna ed esterna, separate da uno spazio perinucleare con
dimensione interna di 20-40 nm. Ogni membrana è spessa 7-9 nm e presenta
un'organizzazione trilaminare. La membrana nucleare interna è appoggiata su una
rete di fibre di sostegno chiamata lamina nucleare, mentra la membrana nucleare
esterna è in comunicazione col reticolo endoplasmatico, rendendo così lo spazio
perinucleare continuo ripetto al RE. Come le membrane del reticolo
endoplasmatico rugoso, la membrana esterna è spesso ricoperta sulla superficie
esterna dai ribosomi attivi nella sintesi proteica.
Sulla membrana nucleare ci sono i pori nucleari, ogni poro è costituito da un
piccolo canale cilindrico che si estende attraverso tutte e due le membrane
dell'involucro nucleare, permettendo la comunicazione fra citosol e nucleoplasma.
La membrana esterna e interna sono fuse tra loro a livello di ogni singolo poro,
formando un canale tappezzato da un'intricata struttura proteica detta complesso
del poro nucleare (NPC), che ha un diametro di circa 120 nm e contiene più di 100
tipi di subunità proteiche diverse. Le sue subunità presentano organizzazione
ottagonale, alcuni complessi del poro presentano granuli centrali. Tale complesso
si struttura quasi come una ruota appoggiata all'interno dell'involucro nucleare:

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ognuno dei due anelli paralleli appoggiati sei bordi della ruota consiste di otto
subunità. Otto bracci si estendono dagli anelli verso il mozzo della ruota che
rappresenta il granulo centrale. Tale granulo è chiamato trasportatore, e ci sono
anche proteine che si estendono dal bordo verso lo spazio perinucleare che
ancorano il complesso all'involucro,ed inoltre alcune fibre che si estendono dagli
anelli verso il citosol ed il nucleoplasma. Quelle che si estendono verso il
nucleoplasma formano il "cesto nucleare" (basket).
L'involucro nucleare protegge l'RNA non ancora maturo dell'essere usato dai
ribosomi citoplasmatici o dagli enzimi. Tutti gli enzimi e le proteine necessarie nel
nucleo, per la replicazione dei cromosomi e per la trascrizione del DNA devono
essere importati nel nucleo dal citoplasma. Al contrario, tutte le molecole di RNA
e i ribosomi parzialmente assemblati necessari per la sintesi proteica nel
citoplasma devono arrivare dal nucleo.
La velocità di ingresso delle particelle nel nucleo è inversamente proporzionale al
loro diametro. Particelle con un diametro maggiore di 10 nm sono escluse dal
passaggio, per questo si è concluso che il complesso del poro contiene dei
piccoli canali acquosi di diffusione, attraverso i quali possono liberamente
muoversi piccole particelle. I pori hanno indicato che i canali acquosi hanno circa
9 nm di diametro, e ci sono 8 canali localizzati alla periferia del complesso del
poro, fra i bracci, e forse anche un nono canale al centro del trasportatore. Le
grosse proteine, come gli enzimi della sintesi del DNA e RNA e i complessi
ribonucleoproteici dell'mRNA e le subunità ribosomiali, attraversano il poro con
un meccanismo di trasporto attivo. Il meccanismo alla base di questo processo è
meglio conosciuto per le proteine che sono attivamente trasportate dal citosol al
nucleo. Queste proteine posseggono uno o più segnali di localizzazione nucleare
(NLS).il limite massimo per questo tipo di trasporto attivo nel complesso del poro
è di 26 nm. Il meccanismo di trasporto attivo all'interno del nucleo comprende 3
passaggi:
1)la proteina contenente il segnale NLS è convogliata dal citosol verso un poro
nucleare. Questo passaggio coinvolge delle proteine citoplasmatiche che fungono
da recettore, le importine, che si legano al segnale NLS e che mediano il
movimento della proteina-NLS verso un poro, forse con l'ausilio delle fibre
citoplasmatiche del poro che in qualche modo funzionano da binari.
• Il complesso importina-proteina-NLS lega la parte citoplasmatica del
complesso del poro nucleare.
• Questo passaggio è energia-dipendente. Il complesso importina-proteina-NLS
è trasportato all'interno del nucleo dal trasportatore, localizzato al centro del
poro. Questo trasporto richiede la presenza di una proteina che idrolizza GTP,
nota come Ran.
Per il processo di esportazione di ribonucleoproteine dal nucleo al citoplasma il
meccanismo è principalmente lo stesso. Le componenti proteiche da esportare
contengono segnali di esportazione nucleare (NES), e questi segnali sono
riconosciuti da proteine dette esportine. La lamina nucleare è una sottile e densa
rete di fibre che tappezzano la superficie interna della membrana nucleareinterna
che serve da sostegno per l'involucro nucleare. La lamina nucleare è spessa circa
10-40 nm ed è costituita da filamenti intermedi costituiti da proteine chiamate
lamine. Alcuni di questi filamenti sembrano essere connessi con le proteine della
membrana nucleare interna. Oltre a essere un supporto per l'involucro nucleare,
la lamina nucleare può anche fornire punti di attacco per la cromatina.
La lamina nucleare può aiutare l'organizzazione della cromatina legando certi

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segmenti cromatinici a siti specifici dell'involucro nucleare. I segmenti di


cromatina che si legano in questo modo sono molto compatti, cioè sono costituiti
da etrocromatina. la maggior parte di questo materiale sembra corrispondere al
tipo di cromatina definita come eterocromatina costitutiva, che in ogni mometno
del ciclo cellulare ed in ogni cellula dell'organismo mantiene la sua struttura
altamente condensata. Il DNA che costituisce l'eterocromatina costitutiva consiste
di sequenze ripetute semplici (che sono corte sequenze organizzate come
ripetizioni in tandem che non sono trascritte). Le due maggiori regioni
cromosomiche costituite da etrocromatina costitutiva sono il centromero ed i
telomeri. Al contrario, l'eterocromatina facoltativa varia in relazione al momento
funzionale della cellula, e non sembra presentare zone cromosomiche che sono
state specificatamente rese inattive in una determinata cellula.
Il nucleolo è la "fabbrica dei ribosomi". Una cellula eucariotica di solito contiene
1-2 nucleoli. Il nucleolo appare costituito da fibrille e granuli: le fibrille contengono
DNA che viene trascritto in RNA ribosomiale (rRNA), i granuli rappresentano
molecole di rRNA associate a proteine importate dal citoplasma a costituire le
subunità ribosomiali. I nucleoli contengono la regione organizzatrice nucleolare
(NOR), un blocco di DNA che contiene copie di geni per l'rRNA. Le copie multiple
sono raggruppate in uno o più NOR, che possono essere localizzate in più di un
cromosoma. In ogni NOR le copie multiple sono organizzate in tandem. Il genoma
umano contiene 10 NOR per assetto cromosomico diploide, ognuno localizzato
vincino all'estremità di un cromosoma differente. Ma al posto di 10 nucleoli
separati, un nucleolo umano rapprsentativo mostra un singolo grande nucleolo
che contiene anse di cromatina derivate da dieci cromosomi separati. Il nucleolo
scompare durante la mitosi. Come la cellula si avvicina alla divisione la cromatina
si condensa a formare le strutture compatte dei cromosomi e
contemporaneamente si ha il disassembleggio e la scomparsa dei nucleoli: le
anse estese di cromatina del nucleolo cessano di essere trascritte e vengono
avvolte e condensate, ogni residuo di rRNA e di proteine ribosomiali viene quindi
disperso e degradato. Al termine della mitosi, la cromatina si decondensa, il NOR
riforma le anse e la sintesi di RNA ricomincia. Nelle cellule umane, questo è il solo
periodo in cui sono visibili i 10 NOR del nucleo diploide.

• Pompa Na+/K+
Una proprietà caratteristica della maggior parte delle cellule animali è costituita
relativamente alla parte intracellulare di un alta concentrazione degli ioni potassio
e da una bassa concentrazione di ioni sodio, e relativamente alla parte
extracellulare di una bassa concentrazione di ioni potassio e di un'alta
concentrazione di ioni sodio.
Queste differenze sono necessarie per assicurare uguali concentrazioni di soluti
ad entrambi i lati della membrana, mantenendo in tal modo l'equilibrio osmotico e
proteggendo la cellula dal rigonfiamento e dalla lisi. In più, i risultanti gradienti
degli ioni potassio e sodio sono essenziali come forza motrice per il cotrasporto,
così come per la trasmissione degli impulsi nervosi. La pompa sfrutta ATP come
fonte di energia ed è perciò considerata un esempio di ATPasa di trasporto.
L'ATPasi Na+/K+ o pompa sodio-potassio, accoppia l'idrolisi esorgonica dell'ATP
di trasporto all'interno degli ioni potassio e all'esterno degli ioni sodio.
Questa pompa possiede una direzionalità intrinseca: gli ioni potassio sono
sempre pompati all'interno e gli ioni sodio sono sempre pompati all'esterno. Gli

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ioni sodio e potassio, attivano l'ATPasi solo sul lato della membrana da cui sono
trasportati (gli ioni sodio dalla parte interna e gli ioni potassio dalla parte esterna).
Per gli eritrociti una molecola di ATP idrolizzata permette il trasporto di 3 ioni
potassio dentro e 2 ioni sodio fuori.
La pompa è costituita da una proteina tetramerica transmembrana, con due
subunità alfa e due beta. Le subunità alfa hanno attività catalitica e presentano i
siti di legame per l'ATP e per gli ioni sodio sul lato citoplasmatico (interno) e per
gli ioni potassio sul lato estreno della membrana. Sappiamo che le subunità beta
sono situate sul lato extracellulare e sono glicosilate. La pompa Na+/K+ è una
proteina allosterica, con due stati conformazionali alternativi, denominati E1 e E2
(per tale motivo spesso le ATPasi di tipo P sono denominate ATPasi e1e2). e1 è
aperta verso l'interno della cellula ed ha un'alta affinità per gli ioni sodio, mentre
e2 è aperta verso l'esterno della cellula ed ha un'alta affinità per gli ioni potassio.
La fosforilazione dell'enzima, evento innescato dal sodio, lo stabilizza nella
configurazione e2. La defosforilazione, invece, è innescata dal potassio e
stabilizza l'enzima nella forma e1.
Il meccanismo di trasporto inizia con un ineziale legame di 3 ioni sodio ad e1 sul
lato interno della membrana, il legame degli ioni sodio provoca la fosforilazione
dell'enzima da parte dell'ATP, che porta ad un cambiamento conformazionale da
e1 e e2. Di conseguenza, gli ioni sodio legati vengono trasferiti attraverso la
membrana sulla superficie esterna dove vengono rilasciati. Per gli ioni potassio
provenienti dall'esterno si legano alle subunità, provocando la defosforilazione ed
il ritorno alla configurazione iniziale. In questo modo gli ioni potassio sono
trasferiti all'interno, dove si dissociano, lasciando la proteina pronta ad accettare
altri ioni sodio.
La pompa sodio potassio è molto importante anche nel meccanismo di sinporto
Na+/glucosio. Quando gli ioni sodio si legano al loro sito sulla parte esterna della
membrana, la conformazione della proteina cambia, conferendo al sito di legame
del glucosio un'alta affinità per il glucosio stesso. Il legame del glucosio
presumbilmente provoca un'ulteriore cambiamento conformazionale della
proteina, che porta al trasferimento degli ioni sodio e del glucosio sulla superficie
interna della membrana. Qui, gli ioni si dissociano come risposta alla loro bassa
concentrazione intracellulare. Questo fatto provoca il distacco del glucosio dal
suo sito a dispetto del suo livello intracellulare, probabilmente perché l'affinità di
quel sito per il glucosio viene notevolmente ridotta della dissociazione degli ioni
sodio. La proteina quindi ritorna alla sua conformazione iniziale, e i siti di legame
vuoti ritornano sulla superficie esterna della membrana.

• Proteine di membrana
Le proteine di membrana differiscono per la loro affinità nei riguardi della regione
interna idrofoba della membrana, e quindi per l'estensione della regione con cui
esse interagiscono con il doppio strato lipidico. In base a tale criterio, le proteine
di membrana vengono classificate in 3 classi: integrali, periferiche ed ancorate ai
lipidi.
• Proteine integrali di membrana: molecole anfipatiche con una o più regioni
idrofobe che presentano affinità per il doppio strato lipidico. Tali proteine
possiedono anche delle regioni idrofile che sporgono all'esterno della
membrana, nella fase acquosa su uno o su entrambi i lati della membrana. Se le
proteine sporgono da un lato solo del doppio strato lipidico sono dette

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monotopiche. Se hanno invece regioni idrofile che sporgono da entrambi i lati


della membrana sono dette transmembrana. Le proteine transmembrana
possono essere monopasso (se attraversano la membrana una sola volta, tipo
glicoforina) o multipasso (se la attraversano più volte, tipo proteina della banda
3 della membrana dell'eritrocita). Alcune proteine multipasso possono essere
costituite da più di un polipeptidiche e sono dette multimeriche. nella maggior
parte dei casi la proteina attraversa la membrana secondo la conformazione ad
alfa elica, meno spesso nella conformazione a beta foglietto (porine).
• Proteine periferiche di membrana: alcune proteine associate alla membrana
sono prive di sequenze idrofobe distinte e quindi non penetrano all'interno del
doppio strato fosfolipidico. Queste proteine periferiche di membrana, mediante
forze elettrostatiche deboli e legami H, si collegano alle superfici di membrana
con le porzioni idrofile delle proteine integrali e anche con le teste polari dei
lipidi di membrana che sporgono.
• Proteine di membrana ancorate ai lipidi: le catene poipeptidiche di queste
proteine ancorate ai lipidi sono situate sulla superficie del doppio strato e unite
con legame covalente a molecole incluse nell'uno o nell'altro strato di
membrana.

• Proteine G e funzione (trasduzione del segnale II)


Esistono diverse molecole che funzionano come messaggeri chimici,
trasmettendo segnali da cellula a cellula. Alcune di queste, come gli ormoni, sono
prodotte in sedi molto distanti dal loro tessuto bersaglio e sono portate alle
diverse parti attraverso il sistema circolatorio. Altre, come ad esempio i fattori di
crescita, sono rilasciate localmente e agiscono solamente sui tessuti vicini.
Quando il messaggero raggiunge il suo bersaglio, si lega ai recettori sulla
membrana della cellula bersaglio, dando inizio al processo di trasduzione. Una
molecola, detta ligando, si lega ad un recettore di membrana. Altri ligandi, come
ad esempio gli ormoni steroidei, si legano a recettori intracellulari. In entrambi i
csi il ligando è detto primo messaggero. Il legame del ligando al recettore, in
genere, induce la produzione di altre molecole nella cellula che riceve il segnale.
Questi secondi messaggeri sono piccole molecole o ioni che spostano il segnale
all'interno della cellula, dando inizio ad una cascata di eventi che, molto spesso,
portano a modificazioni dell'espressione di geni specifici nella cellula ricevente. I
messaggeri possono essere di natura proteica, e avranno recettori di membrana.
Se invece sono di natura steroidea (idrofobici), avranno recettori citosolici o
nucleari, la cui funzione sarà quella di regola l'espressione di geni specifici.
Il messaggero forma legami non covalenti col recettore. Quando la presenza del
ligando e l'occupazione dei recettori persistono per un certo periodo di tempo, la
cellula va incontro a un processo di adattmento e cioè si desensibilizza e non
risponde più allo stimolo. A questo punto, per stimolare la cellula, c'è bisogno che
la concentrazione del ligando aumenti. La desensibilizzazione o down-
regolazione, è dovuta per lo più a modifiche delle proprietà o della localizza
cellulare del recettore e può avvenire per 1) rimozione del recettore dalla
superficie cellulare 2) modifiche del recettore che ne riducono l'affinità per il
ligando 3) modifiche del recettore che ne abbassano la capacità di indurre
modificazioni di alcune funzioni cellulari.
La rimozione del recettore dalla superficie cellulare può avvenire per endocitosi
mediata da recettore. L'isoprotenerolo e il propanololo, rispettivamente attivano e

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inibiscono i recettori beta-anedrergici. L'isoproterenolo è usato nel trattamento


dell'asma no come stimolante cardiaco, mentre il propanololo è usato per ridurre
la pressione sanguigna e la forza delle contrazioni cardiache e per combattere gli
attacchi d'ansia. La famotidina e la cimetidina legano e inibiscono un particolare
tipo di recettore istaminico presente sulle cellule delle pareti dello stomaco, e
serve a controllare l'acidità di stomaco.
I recettori sulla membrana plasmatica possono essere classificati in 2 famiglie: i
recettori associati a proteine G e i recettori associati a protein-chinasi.

Recettori associati a proteine G


I recettori associati a proteine g sono chiamati così in quanto il legame del
ligando induce una modifica conformazionale del recettore che attiva una proteina
G (proteina che lega un nucleotide guanina). La proteina g attivata si lega, a sua
volta, a una proteina bersaglio, un enzima o una proteina che forma un canale,
modificandone l'attività.
I recettori associati a proteine g hanno tutti una struttura simile. La proteina
recettore ha sempre 7 alfa eliche transmembranarie connesse ad anse
alternativamente citosoliche e extracellulari. La parte n terminale della proteina è
in contatto con il fluido extracellulare, mentre la parte c terminale è
intracitoplasmatica. L'ansa citosolica fra la quinta e la sesta alfa elica
transmembranaria è specifica per una determinata proteina g. le proteine g si
sttivano o si disattivano a seconda che leghino o meno una molecola di GTP o di
GDP. Eistono due diverse classi di proteine G: proteine g grandi eterotrimeriche e
proteine g piccole monomeriche. Le proteine g grandi eterotrimeriche sono
formate da 3 subunità alfa, beta e gamma.
Delle 3 subunità dell'eterotrimero alfabetagamma, la più grande, alfa, lega il
nucleotide guanina (GTP o GDP). Quando g-alfa è legata al GTP, si stacca dal
complesso beta-gamma. Le subunità beta-gamma restano invece sempre
accoppiate. Alcune proteine g, dette gs, fungono da stimolatori della trasduzione,
altre dette gi, fungono da inibitori.
Un messaggero che si lega a un recettore associato alla proteina g presente sulla
membrana esterna della cellula, induce una modificazione conformazionale del
recettore e il suo legame fa staccare il GDP e legare il GTP alla subunità alfa, che
si sgancia così dal complesso. A questo punto, a seconda della proteina g e del
tipo cellulare coinvolti, la subunità alfa-GTP libera o il complesso beta-gamma
fanno partire gli eventi di trasduzione. Alcune proteine g, interagendo
direttamente con canali ionici del calcio e del potassio, mediano l'azione di
neurotrasmettitori specifici. In alcuni organismi le proteine g attivano delle
chinasi. L'evento più importante connesso alle proteine g è comunque il rilascio
dei secondi messaggeri, e quelli più come sono l'AMP ciclico e gli ioni calcio,
quando la concentrazione intracitosolica dei secondi messaggeri è alta, viene
stimolata l'attività di specifici enzimi bersaglio.
L'AMP ciclico (cAMP) viene prodotto a partire da ATP citosolico dall'enzima
adenilato ciclasi. In condizioni normali, l'enzima è inattivo e resta tale fintanto che
non si lega alla subunità alfa di una specifica proteina g del tipo gs.
Quando un recettore associato a una proteina g è accoppiato ad una proteina gs,
l'attacco del ligando stimola il rilascio del GDP dalla subunità alfa, che si carica di
GTP. A sua volta questo evento induce il distacco della subunità alfa-GTP dalla
subunità beta-gamma e il suo legame all'adenilato ciclasi. Il legame della subunità
alfa-GTP all'adenilato ciclasi attiva l'enzima che converte l'ATP in cAMP. In

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seguito all'inattivazione della proteina g, l'adenilato ciclasi smette di sintetizzare


cAMP. I livelli intracitoplasmatici di cAMP rimarrebbero comunque elevati, se non
intervenisse un altro enzima, la fosfodiesterasi, che degrada il cAMP. Il principale
bersaglio intracellulare del cAMP è una chinasi cAMP dipendente, detta proteina
chinasi a (PKA). L'AMP ciclico regola l'attività della PKS causando il distacco delle
due subunità regolatorie dalle due subunità catalitiche. Quando le subunità
catalitiche sono libere, la PKA può catalizzare la fosforilazione di diversi substrati
cellulari. Ad Alte concentrazioni di cAMP nel muscolo scheletrico o nel fegato
viene attivati il catabolismo del glicogeno. Nel muscolo cardiaco, un innalzamento
dei livelli di cAMP fa aumentare le contrazioni cardiache; nel muscolo liscio, al
contrario, la contrazione viene inibita. L'innalzamento dei livelli di cAMP nelle
pastrine ne impedisce la mibilizzazione durante il processo di coagulazione, nelle
cellule epiteliali dell'intestino causa la secrezione di acqua e sali nel lume
intestinale.
L'aumento del livello di cAMP può essere ottenuto in due modi diversi:
stimolando la sintesi di cAMP o inibendo l'enzima fosfodiesterasi che degrada il
cAMP.
La tossina colerica ha un dominio enzimatico in grado di modificare
chimicamente la proteina gs, rendendola incapace di idrolizzare GTP a GDP, la gs
così non si spegne, i livelli di cAMP restano alti e le cellule intestinali continuano
a secernere grosse quantità di sali e acqua con conseguente disidratazione.
L'inositolo 1,4,5 trifosfato (Insp3), uno dei prodotti della degradazione dei
fosfolipidi derivati dall'inositolo, svolge un ruolo come secondo messagero.
L'insp3 deriva dal fosfatidil inositolo 4,5 difosfato (pip2), che, in seguito
all'attivazione della fosfolipasi c, viene scisso in 2 molecole: inositolo trifisfato e
diacilglicerolo (DAG). Insp3 e dag funzionano come secondi messageri, in
particolare nella via fosfatidil inositolo-calcio.
La sequenza di eventi inizia con il legame del ligando al recettore di membrana
che induce l'attivazione di una proteina g specifica, la proteina gp (attivatrice della
fosfolipasi c). la proteina gp a sua volta, attiva una particolare fosfolipasi c, la
fosfolipasi c-beta, che genera insp3 e dag. l'insp3 è idrosolubile e diffonde
rapidamente nel citosol, andandosi a legare a un canale del calcio a controllo di
ligando, il canale/recettore dell'insp3 presente sulle membrane del reticolo
endoplasmatico. In seguito al legame con l'insp3, il canale si apre e gli ioni calcio
vengono rilasciati nel citosol. Il calcio si lea alla calmodulina, e il complesso
calcio-calmodulina attiva altri processi.
Il dag prodotto per azione della fosfolipasi c resta nella membrana, dove attiva
una proteina chinasi c (PKC). la stimolazione della crescita da parte della PKC è
dovuta al fatto che tra i bersagli della PKC ci sono le MAP chinasi.
Gli ioni calcio CA2+ hanno un ruolo essenziale nella regolazione di diversi
processi cellulari. La regolazione è basata su variazioni della concentrazione del
calcio nel citosol in risposta a segnali esterni. Normalmente la concentrazione del
calcio nel citosol è mantenuta a livelli molto bassi dalle pompe del calcio, presenti
sulla membrana plasmatica e nel reticolo endoplasmatico. La pompa del calcio
sulla membrana plasmatica trasporta il calcio all'esterno, mentre la pompa del
calcio nel RE sequestra gli ioni calcio nel lume del RE. Alcune cellule hanno
inoltre degli scambiatori sodio-calcio che riducono ulteriormente la
concentrazione citosolica dela calcio. I mitocondri possono portare ioni calcio
nella matrice mitocondriale.
I livelli di calcio possono aumentare anche in seguito al rilascio del calcio dai

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depositi intracellulari. Gli ioni calcio sequestrati nel reticolo endoplasmatico


possono esser rilasciati attraverso i canali-recettori dell'insp3 e attraverso i
canali-recettori sensibili alla rianodina. Il ligando che apre i canali-recettori
sensibili alla rianodina sembra essere il calcio stesso (questo fenomeno è detto
appunto rilascio del calcio calcio-indotto).
La molecola della calmodulina è stata paragonata ad un braccio flessibile con una
mano alle sue estremità. Due ioni calcio si legano a ciascuna mano, inducendo
una modificazione conformazionale nella calmodulina che forma il complesso
attivo calcio-calmodulina. La maggior parte delle proteine che legano la
calmodulina sono enzimi della classe delle proteine chinasi e fosfatasi.

L'ossido nitrico (NO) è una molecola di gas tossica con emivita breve, prodotta
dalla conversione dell'amminoacido arginina a NO e citrullina ad opera dell'nziona
NO sintetasi. L'NO è il segnale rilasciato dalle cellule endoteliali responsabile del
rilassamento della muscolatura liscia dei vasi. L'No viene prodotto in seguito al
legame dell'acetilcolina sulla superficie delle cellule dell'endotelio dei vasi.
L'acetilcolina si lega a recettori associati a proteine g che attivano la via di
trasmissione del segnale del fosfatidil inositolo, inducendo la produzione di insp3
da parte delle cellule endoteliali. Insp3 causa il rilascio degli ioni calcio dal
reticolo endoplasmatico. Gli ioni calcio si legano alla calmodulina, formando un
complesso che stimola la NO sintetasi a produrre ossido nitrico. Tale ossido
nitrico è un gas che può diffondere rapidamente attraverso la membrana
plasmatica e passare dalle cellule endoteliali alle vicine cellule della muscolatura
liscia. All'interno delle cellule della muscolatura liscia, l'NO attiva l'enzima guanilil-
ciclasi, che catalizza la formazione di GMP-ciclico (cGMP). Il cGMP deriva dal GTP,
in maniera analoga alla produzione di cAMP da ATP, e come il cAMP anche il
cGMP agisceda secondo messagero. L'aumento della concentrazione del cGMP
attiva una proteina chinasi g che, catalizzando la fosforilazione di appropriate
proteine delle cullule muscolari, induce il rilassamento della muscolatura.
La nitroglicerina viene somministrata a pazienti con l'angina (dolori al petto per
insufficiente afflusso di sangue al cuore), appunto perché stimola la produzione di
NO, il quale rilassa la muscolatura liscia e permette di ridurre la costrizione dell
arterie coronarie.

Recettori associati alle proteine chinasi


La maggior parte delle chinasi coinvolte nella regolazione di enzimi cellulari
fosforilano residui di serina o treonina sull'enzima bersaglio e vengono quindi
dette chinasi serina/treonina. Molti recettori con attività tirosina chinasica
stimolano all'interno della cellula una catena di eventi di trasduzione del segnale.
I recettori con attività tirosina chinasica sono formati da una catena polipeptidica
unica con un unico segmento transmemebranario. A un'estremità della catena
polipeptidica si trova il dominio extracellulare con il sito di legame per il ligando.
All'altra estremità di trova il dominio intracitoplasmatico. La parte citosolica della
proteina è formata da un dominio con attività tirosina chinasica e una coda
citosolica. Nella parte citoslica sono presenti dei residui di tirosina che
costituiscono i substrati bersaglio della attività tirosina chinasica del recettore.
L'attività chinasica, in genere, è parte integrante della proteina recettore. In alcuni
casi però, l'attività di recettore e quella tirosina chinasica sono svolte da due
proteine diverse: in questo caso la tirosina chinasi è detta non associata al
recettore. La trasduzione del segnale, inizia con l'interazione ligando-recettore

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che causa l'aggregazione dei recettori con attività tirosina-chinasica. I recettori


con attività tirosina chinasica funzionano come dimeri. Quando i recettori
dimerizzano, la tirosina chinasi di ciascun recettore fosforila le tirosine del
recettore vicino. Questo processo di fosforilazione da parte di recettori dello
stesso tipo è detto autofosforilazione.
Quando la parte citoslica del recettore è fosforilata, vengono reclutate varie
proteine adattatrici presenti nel citosol che vanno ad interagire col recettore. Tutte
queste proteine si legano al recettore a livello dei residui di tirosina fosforilati. Per
legarsi al recettore, queste proteine devono contenere una sequenza
amminoacidica che riconosce sul recettorela fosfotirosina e alcuni amminoacidi
vicini. La parte della proteina che riconosce queste tirosine fosforilate è il dominio
SH2. I recettori con attività tirosina chinasica possono attivare
contemporaneamente diverse vie di trasduzione del segnale, tra cui la via che ha
come secondi messaggeri l'inositolo trifosfato-calcio, e la via della proteina Ras,
che culmina con l'attivazione dell'espressione di alcuni geni coinvolti nella
crescita e nello sviluppo.
Ras può essere legata sia al GDP che al GTP, ma solo quando è legata al GTP è
attiva. Se il recettore non è stimolato, Ras è nel suo stato normale legata al GDP.
Per essere attivata, ras deve rilasciare GDP e legare una molecola di GTP . perché
questo avvenga, ras ha bisogno dell'intervento di un'altra proteina, la proteina di
rilascio dei nucleotidi guanina (GNRP). La GNRP che attiva ras è sos. Perché sos
sia attivata, è necessario che si leghi al recettore con attività tirosina chinasica
indirettamente, attraverso un'altra proteina, la proteina GRB2. Questa proteina
contiene un dominio SH2 epuò quindi legarsi alle tirosine fosforilate del recettore.
Quindi per attivare ras devono essere fosforilate le tirosine sul recettore. GRB2 e
sos devono formare un complesso che si lega al recettore, e che attiva sos. Sos
attivata stimola il rilascio del GDP e il legame di GTP su ras, che così si attiva.
Viene così attivata la via di ras, in cui l'evento più importante è l'attivazione di una
classe di proteine chinasi, le MAP chinasi (MAPk) o proteine chinasi attivate da un
mitogeno. Una delle funzioni delle MAPK è la fosforilazione della proteina
nucleare jun. Quando jun è fosforilata, si associa ad altre proteine a formare il
fattore trascrizionale AP-1, che induce l'espressione di geni che cosificano per
proteine necessarie per la cerscita e la divisione cellulare.

Fattori di crescita come messaggeri


Il siero è pieno di fattore di crescita di derivazione piastrinica (PDGF). Molti altri
fattori di crescita stimolano recettori con attività tirosina chinasica. Tra questi
fattori citiamo l'insulina, il fattore di crescita insulino-simile di tipo 1, il fattore di
crescita dei fibroblasti, delle cellule epiteliali e dei neuroni.
I fattori di crescita dei fibroblasti (FGF) e dei loro recettori con attività tirosina
chinasica, i recettori per i fattori di crescita dei fibroblasti (FGFR), sono tra i più
studiati. È stato dimostrato che FGFR ha un ruolo importante nello sviluppo delle
cellule che derivano dal mesoderma. Una mutazione che annulla la funzione del
recettore normale è detta mutazione dominante negativa. Nell'uomo tali tipi di
mutazioni nel dominio transmembranario del FGFR-3 sono responsabili della
acondroplasia (nanismo) e della displasia tanatoforica.
La classe più importante di recettori con attività chinasica su serina e treonina è
rappresentata da una famiglia di proteina che lega alcuni componenti della
famislia dei fattori di crescita che include il fattore di crescita con effetto
trasformante beta (TGF-beta). Alcuni membri della famiglia del TGF beta formano

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dimeri fra loro prima di legare il recettore.


Prima di tutto il fattore di crescita si lega al dominio transmembranario.i memebri
della famiglia del TGF beta si legano a due tipi di recettori sulla cellula bersaglio: i
recettori di tipo 1 e 2. In seguito all'interazione con il ligando, il recettore di tipo 2
fosforila il recettore di tipo 1. I bersagli del recettore di tipo 1 sono le proteine
SMAD. In risposta ad un segnale specifico smad, fosforilata dal recettore attivato,
forma un complesso con una seconda proteina smad (detta co-smad)), e le due
smad si dirigono nel nucleo. All'interno del nucleo, il complesso smad, associato
a proteine che legano il dna, regola l'espressione di geni specifici.

Ormoni
Un ormone endocrino è una molecola che viene trasportata dalla cellula che la
secerna alla cellula bersaglio, di cui regola uno o più funzioni specifiche,
attraverso il sistema circolatorio. Un ormone paracrino invece può agire solo su
cellule vicine.
La somatotropina, ad esempio, è coinvolta nella regolazione della crescita del
corpo umano, mentre gli ormoni sessuali, gli androgeno i e gli estrogeni,
controllano il differenziamento dei tessuto e lo sviluppo dei caratteri sessuali
secondari. La tiroxina regola il livello di energia disponibile nell'organismo.
L'insulina controlla la concentrazione di glucosio nel sangue, l'aldosterone
controlla il livello di sodio e potassio a livello sangiugno, il paratormone controlla
i livelli di calcio nel sangue. La risposta dell'organismo allo stress è regolata
dall'epinefrina, norepinefrina, e cortisolo,e la risposta ai danni tissutali locali è
regolatadal rilascio di istamina e dalla produzione di prostaglandine.
Gli ormoni adrenergici si legano ai recettori adrenergici, una famiglia di recettori
associati alle proteine G, possono essere classificati in recettori alfa e beta
adrenergici. I recettori alfa adrenergici legano sia l'epinefrina che la norepinefrina,
mentre quelli beta adrenergici legano meglio l' epinefrina. I recettori alfa e beta
adrenergici sono associati a proteine g diverse, e stimolano quindi due diverse
vie di trasduzione del segnale. Le proteine g attivate da un tipo di recettori alfa
adrenergici, i rcettori alfa1 adrenergici sono proteine gp, mentre le proteine g
attivate dai rcettori beta adrenergici sono proteine gs. La attivazione della
proteina gs stimola la trasduzione del segnale mediata da cAMP e induce il
rilassamento di un parte della muscolatura liscia. La attivazione della proteina gp
stimola la fosfolipasi c con conseguente produzione di insp3 e dag, e
innalzamento dei livelli intracellulari di calcio.
Una delle azioni degli ormoni adrenergici è quella la stimolazione della
degradazione del glicogeno per fornire alle cellule muscolari un adeguato apporto
di zucchero. La demolizione del glicogeno è catalizzata dall'enzima glicogeno
fosforilasi che, aggiungendo fosfato inorganico, stacca dal glicogeno singole
molecole di glucosio, sotto forma di glucosio 1 fosfato. La sequenza di eventi
inizia con il legame di una molecola di epinefrina ad un recettore beta adrenergico
sulla membrana plasmatica di una cellula del fegato o del tessuto muscolare. Il
recettore attiva una proteina gs che,a sua volta, stimola l'adenilato ciclasi a
produrre cAMP. Tale aumento intracitoslico di cAMP attiva una proteina chinasi A.
questo enzima converte la glicogeno fosforilasi dalla forma b alla forma a, molto
più attiva, con conseguente aumento della degradazione del glicogeno. Il cAMP
stimola anche la inattivazione del sistema enzimatico di sintesi del glicogeno. La
PKA appunto fosforila l'enzima glicogeno sintetasi, che così si disattiva. L'effetto
complessivo del cAMP è quindi quello di aumentare la degradazione e bloccare la

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sintesi del glucosio.


I recettori alfa1 adrenergici stimolano la formazione di insp3, e del dag. i recettori
alfa1 adrenergici si strovano principalmente nella muscolatura liscia dei vasi
sanguigni, compresi quelli che controllano l'afflusso di sangue all'intestino. In
seguito alla stimolazione di un recettore alfa1 adrenergico e alla formazione di
insp3 la concentrazione di calcio intracellulare aumenta, provocando così
contrazione della muscolatura liscia con conseguente vasocostrizione e ridotto
afflusso di sangue.

• Qual'è la funzione delle lamine nella mitosi?


Per quanto riguarda la disgregazione dell'involucro nucleare, MPF attivo fosforila
e induce altre chinasi a fosforilare le LAMINE della lamina nucleare (proteine a cui
è associata la membrana nucleare interna). La fosforilazione induce la
depolarizzazione delle lamine che porta alla disgregazione della lamina nucleare.
La perdita della mina nucleare destabilizza l'involucro nucleare, che si disperde in
piccole vesicole membranarie.

• Retroinibizione enzimatica
È detta anche inibizione a feedback, (o da prodotto finale). Avviene ogni qualvolta
un prodotto metabolico della catena inibisce uno degli enzimi coinvolti nella
catena metabolica stessa che porta alla sintesi del prodotto. L'inibizione a
feedback è uno dei meccanismi più comuni utilizzati dalle cellule, per far si che le
sequenze di reazioni siano adeguati alle esigenze cellulari.

• Trasporto attivo
Il trasporto attivo si attua quando una molecola deve essere trasportata oltre la
membrana plasmatica contro un gradiente di concentrazione elettrochimico,
quindi si necessita dell'impiego di energia. Esso rende possibile l'assorbimento di
sostanze nutritive permette l'escrezione di sostanze di rifiuto e di secrezione e
consente di mantenere le concentrazioni intracellulari di potassio, sodio, calcio e
idrogeno in una situazione di costante non equilibrio. Le proteine di menbrana
coinvolte nel trasporto attivo sono dette pompe. Il trasporto attivo possiede una
direzionalità e si dice perciò che unidirezionale o vettoriale. I meccanismi del
trasporto attivo differiscono principalmente per la fonte di energia e se i due soluti
sono trasportati contemporaneamente o meno. In base alla fonte di energia il
trasporto attivo viene considerato diretto o indiretto. E' diretto quando l'accumulo
delle molecole di soluto o ioni su un lato della menbrana viene accoppiato
direttamente ad una reazione chimica esorgonica (più frequentemente l'idrolisi di
ATP). Le proteine di trasporto che sono attivate direttamente dall'idrolisi di ATP
sono dette pompe ATPasi. Il trasporto attivo indiretto dipende dal co-trasporto di
due soluti, in cui, il movimento secondo gradiente di uno attiva quello contro-
gradiente dell'altro. Il processo di trasporto è simporto o un antiporto. Le ATPasi
di trasporto o pompe sono responsabili del trasporto attivo diretto. Ci sono 4
ATPasi: ATPasi di tipo P, di tipo V, di tipo F, di tipo ABC.

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• Le ATPasi di tipo P vengono fosforilate in maniera reversibile dall'ATP (viene


fosforilato sempre un residuo di acido aspartico). Possiedono un singolo
polipeptide con 8-10 segmenti trans-menbrana. Sono tutte trasportatori di
cationi e sono responsabili del mantenimento del gradiente ionico. Tra questo
tipo di pompe c'è la pompa sodio-potassio. Altre esempi sono l'idrogeno
ATPasi che pompa protoni verso l'esterno, la CalcioATPasi che trasporti ioni
calcio contro-gradiente elettrochimico.
• Le ATPasi di tipo V pompano protoni in organuli quali le vescicole, i vacuoli, i
lisosomi, gli endosomi, il complesso di Golgi. Sono formate da due componenti
e più sub-unità: un componente integrale incluso nella membrana e un
componente periferico sulla superficie che contiene il sito di legame per l'ATP.
• L'ATPasi di tipo F sono implicate nel trasporto di protoni e sono formate da
due componenti, entrambi costituiti da complessi con più sub-unità. Il
componente integrale è detto F0 e serve da poro trans-menbrana per i protoni,
il componente periferico, detto F1 contiene il sito di legame per l'ATP. Possono
funzionare in due modi: pompare protoni contro-gradiente con consumo di ATP
oppure, tramite un flusso esorgonico di protoni (secondo gradiente
elettrochimico) sintetizzano ATP. Quando funzionano in questo modo si dicono
ATPsintetasi.
• L'ATPasi di tipo ABC sono dette anche cassette che legano l'ATP (ATPbinding
cassette). Il termine cassette è indicato per i domini catalici della pompa. Un
trasportatore ABC tipico possiede 4 domini, due dei quali altamente idrofobici e
inclusi nella menbrana, mentre gli altri due sono localizzati perifericamente sul
lato citoplasmatico della membrana; ciascuno dei due domini inclusi è
costituito da 6 segmenti trans-membrana che formano dei canali. I trasportatori
ABC sono importanti in quanto alcuni di essi pompano antibiotici o altri farmaci
fuori dalla cellula rendendola così resistente al farmaco. Alcuni tumori umani,
per esempio, hanno notevole resistenza ai farmaci a causa di una proteina del
tipo pompa ABC detta MDR. Una persona affetta da fibrosi cistica accumula
muco denso nei polmoni, questo perché le cellule sono incapaci di secernere
ioni cloro ed il difetto deriva da una proteina che dovrebbe funzionare coma
canale ionico per il cloro.

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DOMANDE DI GENETICA
 Aneuploidia e poliploidia
Un organismo ke ha un assetto normale di cromosomi è detto euploide. Un
organismo, o cellula aneuploide è caratterizzato da un numero cromosomico che
non è un multiplo esatto dell’assetto cromosomico aploide. Le cause della
aneuploidia sono da ricercare in una non-disgiunzione di uno o più cromosomi
durante la meiosi I o la meiosi II che portano alla formazione di gameti con un
numerp cromosomico anormale.
Una non disgiunzione alla meiosi I produce 4 gameti anormali: 2 gameti con un
cromosoma duplicato e 2 privi di quel cromosoma, quindi una fusione del primo
tipo di gamete con un gamete normale produrrà uno zigote con 3 copie del
cromosoma duplicato (mentre le altre coppie dei cromosomi rimarranno normali),
mentre una fusione del secondo tipo di gamete (in cui manca un cromosoma di
una coppia) darà origine ad uno zigote con una sola copia di quel particolare
cromosoma ( invece di aver una coppia normale di cromosomi) e tutte le altre
coppie cromosomiche normali.
Una non disgiunzione alla meiosi II produce due gameti normali e due anormali:
dei due gameti anormali uno conterrà due cromosomi fratelli (al posto di uno) e
l’altro non conterrà nemmeno una copia di quel determinato cromosoma. In
questo caso, con la fusione del primo tipo di gameti con gameti normali si
avranno zigoti trisomici, con la fusione del secondo tipo di gameti con gameti di
tipo normale si avrà uno zigote che manca completamente di una coppia di un
determinato cromosoma.
Tipi di aneuploidia:
1. nullisomia: implica la perdita di un paio di cromosomi omologhi.
2. monosomia: consiste nella perdita di un solo cromosoma di una
determinata coppia.
3. implica la presenza in più di un determinato cromosoma, cioè la
cellula ha 3 copie di un determinato cromosoma e 2 copie di tutti gli
altri.
4. tetrasomia: comporta una coppia cromosomica in più, cioè si
avranno 4 copie di un determinato cromosoma, e normalmente due
copie di tutti gli altri cromosomi.
L’anuploidia relativa ai cromosomi del sesso è meglio sopportata grazie al
meccanismo dell’inattivazione dell’x (lyonizzazione). La trisomia dell’8, del 13
(sindrome di Patau) e del 18 (sindrome di edwards) comporta morte in età
precoce, mentre si ha sopravvivenza fino alla vita adulta con la trisomia del 21
(sindrome di down). La sindrome di down può derivare anche da un tipo diverso
di mutazione cromosomica detta traslocazione robertsoniana, che porta alla
presenza di 3 copie del braccio lungo del cromosoma 21, questa forma di
sindrome di down è definita familiare. Una traslocazione robertsoniana è una
traslocazione in cui due cromosomi acrocentrici (cromosomi con i centromeri
vicini all’estremità) non omologhi si rompono a livello dei centromeri ed i bracci
lunghi si ritrovano attaccati ad un unico centromero. I bracci corti si uniscono a
loro volta a formare il prodotto reciproco, che generalmente contiene geni non

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essenziali e viene abitualmente perdute entro poche divisioni cellulari.

La monoploidia e la poliploidia implicano variazioni del numero di interi assetti


cromosomici, e possono derivare ad esempio quando la prima o la seconda
divisione meiotica è abortiva (assenza di citocinesi), oppure quando avviene una
noin disgiunzione meiotica che coinvolge tutti i cromosomi. La fusione di un
gamete con 2 assetti cromosomici con un gamete normale generà uno zigote
triploide, mentre la fusione di due gameti, ciascuno con 2 assetti cromosomici,
produce uno zigote tretraploide.
Esistono due classi di poliploidi: quelli che hanno un numero pari di assetti
cromosomici e quelli che ne hanno un numero dispari,quelli con un numero pari
di assetti cromosomici hanno almeno una maggiore probabilità di essere,dato che
esiste la possibilità per i loro cromosomi omologhi di segregare correttamente
durante la meiosi.
Nelle piante ci sono 2 tipi di poliploidia:
nella autopoliploidia tutti gli assetti cromosomici appartengono alla stessa specie,
questa condizione deriva da un difetto alla meiosi che porta a gameti diploidi o
poliploidi.
Nell’alloplolipoidia gli assetti cromosomici implicati derivano da specie diverse,
ahce se correlate: questa situazione può originarsi se due specie diverse si
incrociano generando uno zigote con 2 assetti cromosomici aploidi provenienti
da ciascuno genitore (un assetto da ciascuna specie) e poi entrami gli assetti
vengono raddoppiati.

 Anse del t-RNA


I tRNA sono rna lunghi 75-90 nucleotidi con la funzione di portare gli amminoacidi
al complesso mRNA-ribosoma, dove vengono polimerizzati in catene
polipeptidiche durante la sintesi proteica.
Ogni molecola di tRna ha una diversa sequenza nucleotidica, ma tutti hanno la
sequenza CCA all’estremità 3’. QUESTA SEQUENZA CCA è AGGIUNTA AL T-RNA
POST TRASCRIZIONALMENTE. Le differenze nella catena nucleotidica spigano la
capacità di un particolare tRNA di legare uno specifico amminoacido. Tutte le
molecole di tRNA sono modificate chimicamente in diversi punti da enzimi che
agiscono postrascrizionalmente.
La sequenza di tutti i tRNA può essere ripiegata in una struttura detta a trifoglio: la
struttura a trifoglio origina dall’appaiamento tra basi complementari in diverse
parti della molecola, che forma 4 strutture a stelo (stem) separate de 4 anse a
singola elica dette loop I, II, III, IV. L’ansa II contiene la tripletta nucleotidica
dell’anticodone, che durante la traduzione si appaia al corrispondente codone
dell’mRNA. Questo appaiamento codone-anticodone è fondamentale per
l’inserimento dell’amminoacido corretto specificato dall’mRNA nella catena
polipeptidica in crescita.
La porzione terminale 3’ che presenta la tripletta CCA è detta braccio accettare,
l’ansa I è detta D-loop perché contiene Diidrouridina, l’ansa II è quella che
contiene l’anticodone, l’ansa III è un’ansa variabile da 3 a 21 amminoacidi, l’ansa
IV è detta psi-loop perché contiene pseudouridina.
La forma a trifoglio viene ripiegata in una struttura più compatta, a forma di L
rovesciata. In questa struttura a L si trova ad una estremità la tripletta CCA dove
si lega l’amminoacido e all’altra estremità si trova l’ansa II che contiene

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l’anticodone.

 Caratteri bio-quantitativi
Un carattere che presenti solo pochi fenotipi distinti definito carattere
discontinuo: di solito per i caratteri discontinui esiste una relazione semplice fra
genotipo e fenotipo, del tipo che per ogni genotipo esiste un determinato fenotipo.
Noi sappiamo però che la relazione tra genotipo e fenotipo non è sempre così
semplice, perché intervengono fenomeni quali la penetranza e l’espressività
variabili, e l’epistasi e la pleiotropia, inoltre lo stesso genotipo interagendo con
ambienti diversi può dare una diversa norma di reazione. I caratteri continui sono
detti quantitativi. All’aumentare del numero di loci che controlla un carattere
(carattere poligenico), il numero dei genotipi diventa rapidamente molto grande.
Se ogni genotipo di un carattere poligenico codifica per un fenotipo diverso, si
avrà un carattere di tipo continuo. Se il fenotipo è influenzato da genotipi multipli
e da fattori ambientali il carattere è detto multifattoriale. I geni che controllano
elementi diversi del fenotipo possono essere influenzati pleiotropicamente l’uno
dall’altro: in pratica spesso due o più caratteri sono spesso correlati.
Per il carattere bioquantitativo del colore della cariosside del grano si è proposto
che ciascuna dose di un gene che controlla la produzione del pigmento permetta
la sintesi di una determinata quantità del pigmento stesso. In tal caso gli alleli che
contribuiscono al fenotipo sono detti alleli additivi, gli alleli che non hanno effetto
sul carattere quantitativo sono detti alleli non additivi.
Quando si riesca ad identificare grandi regioni del genoma e a correlarle con la
variabilità fenotipica per un carattere metrico, si può iniziare a stabilire i loci
importanti per la determinazione del carattere, i QTL (quantitative trait loci).

 Caricamento degli amminoacidi


L’amminoacido corretto viene legatomi al tRNA da un enzima detto amminoacil-
tRNA sintetasi. Questo processo è detto caricamento, e produce un amminoacil-
tRNA. L’amminoacilazione è ATP dipendente. Esistono 20 diversi tipi di
amminoacil-tRNA sintetasi per ognuno dei 20 amminoacidi: il sito di
riconoscimento per un amminoacil-tRNA sintetasi è enzima specifico, in molti casi
però è la regione dell’anticodone ad essere riconosciuta. Processo di
caricamento:
prima di tutto l’amminoacido e l’atp si legano all’amminoacil-tRNA sintetasi
specifica. L’enzima quindi catalizza la reazione per cui l’atp perde due gruppi P e
si lega come amp all’amminoacido per dare amminoacil-amp. In seguito il tRNA si
lega all’enzima, che trasferisce l’amminoacido dall’amminoacil-AMP sul tRNA,
rilasciando l’AMP. La molecola di amminoacil-tRNA così formata si stacca quindi
dall’enzima. Dal punto di vista chimico, l’amminoacido si attacca all’estremità 3’
del tRNA mediante un legame covalente tra il gruppo carbossilico
dell’amminoacido e il gruppo 3’ OH o 2’ OH dell’adeniva terminale della tripletta
CCA persente su tutti gli amminoacidi.

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 Come si costruisce una molecola di c-DNA


Per produrre una molecola di c-Dna bisogna partire da molecola di mRNA, i quali
hanno all’estremità 3’ le importanti code di poliA.
Gli mRNA rappresentano il momento funzionale specifico della cellula, perché ci
possono dare il quadro generale del tipo di proteine che stanno per essere
prodotte, in quanto l’mRNA subisce un processamento di splicing in cui vengono
eliminati gli introni. Le sequenza degli introni sono presenti appunto nei cloni
genici, ma non nei cloni di c-DNA.
Avendo una miscela di tutti gli RNA, gli RNA poliA possono venire purificati
(isolati dagli altri tipi di RNA), passando la miscela su una colonna di oligo dT:
quando le catene di mRNA poliA passeranno dalla colonna le code di poliA si
legheranno alle catene di oligo dT, quindi gli mRNA verranno bloccati mentre tutti
gli altri RNA verranno eliminati dalla colonna. Gli mRNA catturati verranno
rilasciati dalla colonna per esempio aumentando la forza ionica del tampone
presente sulla colonna, in maniera tale da rompere i ponti H.
Per prima cosa si associa un breve primer di oligo(dT) alla coda di poliA, il primer
viene così esteso dalla trascrittasi inversa (DNA polimerasi-RNA dipendente) a
dare una copia del DNA dal filamento di mRNA. Il risultato è a quseto punto una
molecola a doppia elica ibrida di DNA-mRNA: successivamente RNasi H, Dna
polimerasi I e DNA ligasi vengono usate per sintetizzare la seconda elica di DNA.
L’RNasi H degrada il filamento di mRNA nella molecola ibrida a doppia elica, la
DNA polimerasi I sintetizza la nuova elica a partire dai frammenti di mRNA
degradati che fungono in tale caso da primer di innesco e infine la DNA ligasi lega
i frammenti di DNA per formare una nuova catena completa.

 Come si realizzano le banche cromosomiche?


Prima di tutto bisogna separare i singoli cromosomi. Si può usare a tale scopo ad
esempio la tecnica della citofluorimetria, in cui i cromosomi di cellule in mitosi
(condensati) sono colorati con un prodotto fluorescente e passati attraverso un
raggio laser collegato con un rilevatore di luce. Questo sistema distingue i
cromosomi sulla base delle loro differenze nel legare il colorante e la rifrazione
risultante. Dopo che i cromosomi sono stati frazionati e raccolti si può costruire
una banca per ciascun tipo cromosomico.

 Come si realizzano le banche genomiche?


Quando del dna genomico viene isolato e digerito con un enzima di restrizione e
la popolazione di frammenti di dna viene clonata in un vettore, si parla di banca
genomica.

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 Come viene mantenuto il PH acido all'interno del Lisosoma


Grazie a delle pompe protoniche (pompe di tipo V = vescicolari) presenti sulla
superfice del lisosoma, che pompano continuamente contro gradiente all’interno
del lisosoma ioni H+ che determinano il pH acido del compartimento lisosomiale.

 Cosa sono i geni concatenati? Quali conseguenze portano?

I geni posti sullo stesso cromosoma sono detti sintenici. I geni che non si
assortiscono indipendentemente sono detti geni concatenati. Le classi della
progenie che presentano le combinazioni dei caratteri già presenti nei genitori
sono chiamate parentali, mentre quelle che presentano nuove combinazioni sono
dette ricombinanti. Utilizzando il reincrocio di prova è possibile capire quali geni
sono concatenati fra loro e costruire una mappa di concatenazione. Un marcatore
genetico è un altro nome per una mutazione che conferisce un fenotipo
distinguibile (parcamente è un allele che marca un cromosoma o un gene). I
marcatori di Dna sono invece marcatori molecolari cioè regioni del DNA che
differiscono fra individui e che possono essere identificati mediante analisi
molecolare del DNA.
Chiaramente come abbiamo detto ci sono i genotipi parentali (genotipi originari
dei due cromosomi dei genitori) e combinazioni non parentali di geni concatenati
che vengono appunto chiamate ricombianati. La frequenza di fenotipi ricombianati
attesa da Morgan nei suoi esperimenti sulla base dell’assortimento indipendente
sarebbe del 50%: la frequenza più bassa osservata sperimentalmente è segno che
i geni interessati sono fra loro concatenati.
La conclusione generale di Morgan fu che durante la segregazione degli alleli alla
meiosi, alcuni tendono a rimanere insieme perché sono vicini l’un laltro sul
cromosoma. In conclusione ciò avviene perché i ricombinanti vengono prodotti
per crossing-over fra i cromosomi omologhi durante la meiosi, e quanto più due
geni sono vicini su un cromosoma tanto meno è probabile il crossing –over (si
abbassa la frequenza di ricombinazione che è funzione della distanza in unità di
mappa, o centiMorgan). Il crossing-over si attua allo stadio di 4 cromatidi (tetrade)
durante la profase I della meiosi, e tale crossingover coinvolge 2 cromatidi su 4.
Si possono ottenere mappe genetiche in base alla ricombinazione in relazione a
reincroci di prova “a due punti” e “a 3 punti”. È caratteristico di questi incroci di
mappatura che la progenie non sia presente secondo quanto atteso sulla base
delle distanze di mappa. Quindi in qualche modo la presenza di un crossing over
interferisce con la formazione di un altro crossino over nelle vicinanze. Questo
fenomeno è detto INTERFERENZA. L’entità dell’interferenza è espressa come
cefficiente di coincidenza.
Un coefficiente di coincidenza di 1 indica che in una determinata regione sono
avvenuti tutti i possibili crossing over e sono stati ottenuti tutti i possibili
ricombinanti attesi sulla base di due eventi indipendenti, in tale caso si avrà che
l’interferenza è pari a zero. Se il coefficiente di coincidenza è zero, non avviene
nessuno dei suddetti eventi di crossing over attesi, quindi vi sarà un’interferenza
completa, con il primo crossingover che inibisce il secondo nella regione in
esame.

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 Cos'è la cromatina facoltativa? (es. corpo di Bahr)


i geni all’interno del DNA eterocromatinico sono generalmente trascrizionalmente
inattivi. Vi sono 2 tipi di eterocromatina:
l’eterocramatina cositutiva è persente in tutte le cellule in posizione identifica su
entrambi i cromosomi omologhi di un paio. Questa forma di eterocromatina
consiste per lo più di DNA ripetuto ed è esemplificata dalle regione
centromeriche.
L’eterocromatina facoltativa, al contrario varia di condizione nei diversi tipi
cellulari, o nei diversi stadi di sviluppo o a volte da un cromosoma omologo
all’altro. Questa forma di eterocromatina rappresenta segmenti eucromatina (di
solito trascrizionalmente attiva) che sono condensati e conseguentemente
inattivati. Un esempio di eterocromativa facoltativa è il corpo di Barr, un
cromosoma X che viene inattivato nelle femmine dei mammiferi per il meccanismo
della compensazione della dose (lyonizzazione).

 Crossing Over
quanto più due geni sono vicini su un cromosoma tanto meno è probabile il
crossing –over (si abbassa la frequenza di ricombinazione che è funzione della
distanza in unità di mappa, o centiMorgan). Il crossing-over si attua allo stadio di 4
cromatidi (tetrade) durante la profase I della meiosi, e tale crossingover coinvolge
2 cromatidi su 4.
Si possono ottenere mappe genetiche in base alla ricombinazione in relazione a
reincroci di prova “a due punti” e “a 3 punti”. È caratteristico di questi incroci di
mappatura che la progenie non sia presente secondo quanto atteso sulla base
delle distanze di mappa. Quindi in qualche modo la presenza di un crossing over
interferisce con la formazione di un altro crossino over nelle vicinanze. Questo
fenomeno è detto INTERFERENZA. L’entità dell’interferenza è espressa come
cefficiente di coincidenza.
Un coefficiente di coincidenza di 1 indica che in una determinata regione sono
avvenuti tutti i possibili crossing over e sono stati ottenuti tutti i possibili
ricombinanti attesi sulla base di due eventi indipendenti, in tale caso si avrà che
l’interferenza è pari a zero. Se il coefficiente di coincidenza è zero, non avviene
nessuno dei suddetti eventi di crossing over attesi, quindi vi sarà un’interferenza
completa, con il primo crossingover che inibisce il secondo nella regione in
esame.
A metà degli anni 60’ robert holliday propose un modello per la ricombinazione
reciproca. Il primo stadio del processo di ricombinazione è quello di
riconoscimento ed allineamento, in cui due doppie eliche di DNA omologhe si
allineano. Nel secondo stadio un’elica di ciascuna doppia elica si rompe, ogni
elica rotta invade poi l’opposta doppia elica e si appaia con i nucleotidi
complementari dell’elica opposta. Ognuno di questi passaggi è catalizzato da
enzimi specifici. Il processo lascia interruzioni che vengono saldate per azione di
una DNA polimerasi e DNA ligasi producendo un intermedio di Holliday di DNA
etroduplice. Le due doppie eliche del DNA dell’intermedio possono ruotare
facendo muovere il punto di ramificazione verso destra o verso sinistra.
Successivamente avverrà il tegli enzimatico, che può avvenire o sul piano

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orizzontale e si otterranno duplex pezzati (parentali), o può avvenire sul piano


verticale e si genereranno duplex congiunti (ricombinanti).

 Da dove prende la peptil-transferasi il ribosoma?


La peptidil-transferasi è coinvolta nel processo di allungamento della catena
peptidica in crescita nella traduzione. In particolare è responsabile della
formazione del legame peptidico fra la formil-metionina (o un qualunque altro
amminoacido) presente nel sito P del ribosoma (ovviamente dopo rottura del
legame tra l’amminoacido e il suo tRNA presente nel sito P) e il nuovo
amminoacido portato dal nuovo tRNA nel sito A. dalle ultime ricerche appare che
la subunità 23s del ribosoma è quella responsabile di tale attivita peptil-
transferasica.

 TRADUZIONE (SINTESI PROTEICA) e Differenze nella traduzione


tra procarioti ed eucarioti

La sintesi proteica avviene sui ribosomi, dove il messaggio genetico codificato


sotto forma di mRNA viene tradotto. La molecola di mRNA viene prodotta in
direzione 5’->3’ (la stessa polarità con cui viene trascritto l’mRNA a partire dal
DNA), e la proteina viene sintetizzata dall’estremità N per finire con l’estremità C.
gli amminoacidi arrivano al ribosoma legati a molecole di tRNA: il codone
dell’mRNA riconosce l’anticodone del tRNA e non l’amminoacido che porta (la
specificità di riconoscimento del codone risiede nella molecola di tRNA e non
nell’amminoacido da essa portato).
Fase del caricamento degli amminoacidi: L’amminoacido corretto viene legatomi
al tRNA da un enzima detto amminoacil-tRNA sintetasi. Questo processo è detto
caricamento, e produce un amminoacil-tRNA. L’amminoacilazione è ATP
dipendente. Esistono 20 diversi tipi di amminoacil-tRNA sintetasi per ognuno dei
20 amminoacidi: il sito di riconoscimento per un amminoacil-tRNA sintetasi è
enzima specifico, in molti casi però è la regione dell’anticodone ad essere
riconosciuta. Processo di caricamento:
prima di tutto l’amminoacido e l’atp si legano all’amminoacil-tRNA sintetasi
specifica. L’enzima quindi catalizza la reazione per cui l’atp perde due gruppi P e
si lega come amp all’amminoacido per dare amminoacil-amp. In seguito il tRNA si
lega all’enzima, che trasferisce l’amminoacido dall’amminoacil-AMP sul tRNA,
rilasciando l’AMP. La molecola di amminoacil-tRNA così formata si stacca quindi
dall’enzima. Dal punto di vista chimico, l’amminoacido si attacca all’estremità 3’
del tRNA mediante un legame covalente tra il gruppo carbossilico
dell’amminoacido e il gruppo 3’ OH o 2’ OH dell’adeniva terminale della tripletta
CCA persente su tutti gli amminoacidi.
Inizio della traduzione: NEI PROCARIOTI, il primo passaggio della traduzione è
rappresentato dal legame della subunità ribosomiale 30s alla regione dell’mRNA
che porta il codone di inizio AUG. La subunità ribosomiale è complessata a 3
diversi fattori di inizio detti IF1, IF2 e IF3, ad una molecola di GTP e a ioni
magnesio. Il codone d’inizio AUG da solo non è sufficiente come segnale di
legame del ribosoma all’mRNA, ma è richiesta una sequenza a monte (al 5’ della
sequenza leader dell’mRNA) del codone di inizio AUG. Esiste infatti una regione
posta a circa 8-12 nucleotidi a monte del codone di inizio, ricca in purine

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denominata SEQUENZA DI SHINE-DALGARNO (AGGAGG) che è complementare


ad una sequenza ricca in pirimidine posta al 3’ terminale della subunità 16s: in tal
modo il ribosoma può posizionarsi correttamente sull’ mRNA.
Fatto ciò bisogna che si attui il legame del tRNA iniziatore al codone di inizio
AUG: tale codone è specifico per una metionina, quindi tutte le proteine nei
procarioti e negli eucarioti iniiano con una metionina che cmq poi può essere
rimossa. Nei procarioti in particolare la metionina iniziale è modificata: è infatti
una formil-metionina (fMet, che ha un gruppo formilico attaccato al gruppo NH
della metionina). La fmet è trasportata da un particolare tRNA detto tRNA-fMet.
Quando sulla molecola di mRNA si incontra una sequenza AUG che non sia un
codone di inizio interviene un’altra specie di tRNA diverso da quello specifico per
la fMet. (addirittura i due tRNA sono codificati da geni diversi).
Quando fMet-tRNA carico si lega al complesso 30s-mRNA viene rilasciato IF3 e
vine a formarsi così il complesso di inizio 30s. poi si lega la subunità 50s,
portando all’idrolisi del GTP e al rilascio di IF1 e IF2, e si forma il complesso di
inizio 70s. il ribosoma 70s possiede due siti di legame per gli amminoacil-tRNA: il
sito peptidilico (P) e il sito amminoacilico (A). il fMet-tRNA si lega al sito P.
NEGLI EUCARIOTI le differenze sono:
1. la metionina iniziale non è formilata, anche se esiste ancora un tRNA
specifico per il trasporto della prima metionina.
2. non si trovano sull’mRNA le sequenze di Shine-Dalgarno, in quanto i
ribosomi eucarioti utilizzano un altro meccanismo per riconoscere il
codone di inizio AUG. In principio, un fattore di inizio degli eucarioti, il eIF-
4F, che in pratica è un multimero proteico che contiene anche una proteina
detta cap binding protein (CBP), riconosce il cap presente all’estremità 5’
dell’mRNA e vi si lega. Poi si crea un complesso formato dalla subunità
ribosomiale 40s con il Met-tRNA di inizio, diverse preteine eIF e GTP: tale
complesso migra lungo l’mRNA, alla ricerca del codone di inizio AUG, che
si trova inserito all’interno di una sequenza detta SEQUENZA DI KOZAK.
(modello a scansione dell’inizio della traduzione). Una volta trovato il
codone di inizio, la subunità 40s si lega ad esso, seguita dalla subunità 60s
che spiazza gli eIF, e si forma il complesso di inizio 80s con il Met-tRNA
legato al sito P del ribosoma. Anche la coda di poliA degli mRNA eucarioti
ha un ruolo fondamentale nella traduzione: la proteina di legame della coda
poliA, detta PABP, lega da una parte la coda di poliA e dall’altra ad una
delle proteina del complesso eIF-4F del cap, portando così l3estremità 3’
dell’mRNA in prossimità dell’estremità 5’. In tal modo il poliA stimola l’inizio
della traduzione.
Fase dell’allungamento: all’inizio l’anticodone dell’fMet-tRNA è unito mediante
legami H al codone d’inizio AUG nel sito peptidilico del ribosoma. Il codone
successivo dell’mRNA si trova nel sito A. poi l’amminoacil-tRNA appropriato si
lega al codone esposto nel sito A ribosomiale. Tale amminoacil-tRNA viene
trasportato al ribosoma legato al fattore di allungamento EF-tu e ad un GTP.
Quando l’amminoacil-tRNA viene legato al sito A, viene idrolizzato il GTP il fattore
EF-tu viene rilasciato insieme al GDP. L’EF-tu viene rilasciato legato al GDP, e poi
viene riciclato per altri eventi di allungamento. Dapprima un secondo fattore di
allungamento, detto EF-ts si lega ad EF-tu sposta il GDP che è stato idrolizzato,in
seguito il GTP si lega al complesso EF-tu-EF-Ts per generare un complesso EF-tu-
GTP con rilascio simultaneo di EF-ts. Un amminoacil-tRNA si lega al complesso
EF-tu-GTP e quest’ultimo complesso può allora legarsi al sito A del ribosoma. La

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peptidil-transferasi è coinvolta nel processo di allungamento della catena


peptidica in crescita nella traduzione. In particolare è responsabile della
formazione del legame peptidico fra la formil-metionina (o un qualunque altro
amminoacido) presente nel sito P del ribosoma (ovviamente dopo rottura del
legame tra l’amminoacido e il suo tRNA presente nel sito P) e il nuovo
amminoacido portato dal nuovo tRNA nel sito A. dalle ultime ricerche appare che
la subunità 23s del ribosoma è quella responsabile di tale attivita peptil-
transferasica. Una volta formato il legame peptidico, sul sito P rimane un tRNA
privo del proprioamminoacido (tRNA scarico), mentre il tRNA sul sito A (dettto
peptidil-tRNA) è attaccato ai primi due amminoacidi della catena polipeptidica.
Fase di traslocazione: in tale fase il ribosoma si sposta di un codone lungo
l’mRNA verso l’estremità 3’. NEI PROCARIOTI la traslocazione richiede
l’interventp di un altro fattore proteico detto EF-G. un complesso EF-G-GTP si
associa al ribosoma, il GTP viene idrolizzato e il ribosoma si sposta mentre il
tRNA scarico passa dal sito P al sito E e viene eliminato. NEGLI EUCARIOTI la
traslocazione è simile, fa il fattore coinvolto non è EF-G ma eEF-2. dopo che la
traslocazione è avvenuta, il codone che prima era nel sito A ora si troverà nel sito
P, ed il sito A rimarrà libero. Così un nuovo tRNA carico potrà entrare nel sito A
secondo l’indicazione del codone dell’mRNA e l’allungamento continua. Sia negli
eucarioti che nei procarioti possono tradurre in maniera simultanea lo stesso
mRNA: si avrà un poliribosoma.
Termine della traduzione: la fine della traduzione viene segnalata da uno dei 3
cdoni di stop che sono UAG,UAA,UGA. Tali codoni di stop, gli stessi per
procarioti e eucarioti, non codificano per alcun amminoacido, pertanto non
esisteranno per tali codoni tRNA che presenteranno anticodoni corrispondenti. Il
ribosoma riconosce i codoni di stop solo grazie all’aiuto di proteine dette fattori di
terminazione o RF. E.coli possiede 3 RF, detti RF1, RF2, RF3. RF1 riconosce i
codoni di stop UAA e UAG, RF2 riconosce UAA e UGA, RF3 ha un ruolo
stimolatorio. Negli eucarioti esiste SOLO il fattore di rilascio eRF, che riconosce
tutti e tre i codoni di stop. EVENTI SPECIFICI DELLA TERMINAZIONE:
1. rilascio del polipeptide dal tRNA al sito P del ribosoma catalizzata dalla
peptidil transferasi.
2. rilascio del tRNA dal ribosoma
3. dissociazione delle due subunità ribosomiali e dei fattori RF dall’mRNA.

 SMISTAMENTO DELLE PROTEINE NEOFORMATE ALL’INTERNO


DELLA CELLULA
La distribuzione delle proteine nei comparti cellulari è sotto controllo genico,
mediato da specifiche sequenze leader delle proteine che li dirigono negli orfanelli
corretti. Le proteine sintetizzate sul RE rugoso vengono estruse nello spazio tra
le due membrane, le cisterne. Qui vengono dapprima glicosilate e poi trasferire al
Golgi, che è il centro di smistamento.
IPOTESI DEL SEGNALE: le proteine prive del segnale (estensione idrofobia
amminoterminale) rimangono nel citoplasma. Quando la sequenza segnale di una
proteina destinata ad esempio al RE viene tradotta ed esposta sulla superficie del
ribosoma, una particella di riconoscimento detta SRP (complesso RNA-proteine)
citoplasmatica si lega ad essa e blocca la traduzione finchè tale complesso si
legherà alla membrana dell’organello interessato, in questo caso il RE. Avvenuto

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tale aggancio, la SRP riconosce una proteina intergale di membrana detta


proteina di ancoraggio (detta anche sequenza di riconoscimento del segnale):
questo promuove l’inserimento di tale catena polipeptidica in crescita all’interno
della membrana. Non appena la traduzione riprende, SRP viene rilasciata. Questo
metodo di trasporto è detto COTRADUZIONALE. Quando la sequenza segnale
viene a trovarsi completamente all’interno della membrana interviene la segnal-
peptidasi che rimuove la sequenza segnale.

 Dominanza completa e Codominanza


La dominanza completa è quel fenomeno per cui un allele è dominante sull’altro, e
quindi il fenotipo dell’eterozigote è completamente indistinguibile da quello
dell’omozigote dominante. Con la recessività completa, l’allele recessivo si
esprime fenotipicamente solo in un organismo omozigote recessivo.
Quando un allele non è dominante completamente su un altro allele, si dice che
dimostra una DOMINANZA INCOMPLETA. Nel caso di dominanza incompleta il
fenotipo è intermedio tra quelli degli omozigoti per l’uno o per l’altro degli alleli
interessati. Un esempio di dominanza incompleta è quello dei polli blu andalusi
(Cb/Cw), che manifestano un carattere fenotipico intermedio fra un pollo a
piumaggio bianco (Cw/Cw) e uno a piumaggio nero (Cb/Cb).
Nella CODOMINANZA l’eterozigote manifesta i fenotipi di entrambi gli omozigoti. Il
sistema dei gruppi sanguigni AB0 è un esempio di codominanza: gli individui
eterozigoti Ia/Ib sono di gruppo AB perché vengono prodotti sia l’antigene A
(progotto dall’allele Ia) che l’antigene B (prodotto dall’allele Ib). Per cui gli alleli Ia
e Ib sono codominanti.
A livello molecolare nella codominanza c’è espressione proteica di entrambi gli
alleli presenti nell’eterozigote.
Nella dominanza incompleta per un eterozigote vi è l’espressione completa di un
solo allele (che darà fenotipo intermedio), per un omozigote per l’allele espresso
ci saranno invece due dosi di prodotto genico e ne deriverà un’espressione
fenotipica completa per uqel determinato allele.
Nella dominanza normale (completa) in un eterozigote un solo allele, producendo
solo metà del prodotto genico della condizione omozigote, è in grado cmq di dare
lo stesso fenotipo dell’omozigote. In tale condizione il gene è detto
aplosufficiente.

 Replicazione del DNA

La molecola di DNA si duplica secondo il modello semiconservativo: una volta


divise, ognuna delle due eliche può fungere da stampo per la sintesi di una nuova
elica di DNA. Così le due doppie eliche figlie che si verranno a formare saranno
costituite ciascuna da una elica parentale e da un’elica neosintetizzta. L’enzima
che catalizza la reazione di sintesi della nuova catena di DNA, tramite la
polimerizzazione dei precursori nucleotidici, è detto DNA polimerasi.
Replicazione del DNA nei procarioti:
All’estremità crescente della catena, la DNA ploimerasi catalizza la formazione di
un legame fosfodiesterico fra il gruppo 3’ OH del desossiribosio dell’ultimo
nucleotide ed il fosfato in 5’ del dNTP precursore. L’energia per la formazione del
legame fosfodiesterico deriva dalla liberazione di due o tre fosfati dal dNTP. LA

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CATENA CHE SI ALLUNGA FUNZIONE COME INNESCO (PRIMER) NELLA


REAZIONE. Ad ogni passaggio di allungamento la DNA polimerasi trova il
precursore (dNTP) giusto che può formare una coppia di basi complementari con
il nucleotide dell’elica stampo. LA DIREZIONE DI SINTESI DELLA NUOVA CATENA
DI DNA è SOLO 5’->3’. Esistono nei procarioti tre DNA polimerasi (I, II, III), di cui
solo la DNA polimerasi 1 ha attività esonucleasica 5’->3’, ma tutte hanno attività
esonucleasica 3’->5’. L’attività esonucleasica serve per correggere gli eventuali
errori di appaiamento di basi durante la duplicazione.
La replicazione del DNA procariotico e virale generalmente inizia in una zona
specifica del cromosoma, l’origine di replicazione. In questa zona la doppia elica
si denatura in singoli filamenti esponendo le basi per la sintesi di nuove eliche. La
denaturazione localizzata del DNA produce quella che viene chiamata una bolla di
replicazione, una regione del cromosoma dove il DNA è a singola elica e dal quale
la replicazione procede bidirezionalmente. Per prima cosa la GIRASI, un tipo di
topoisomerasi rilassa il DNA superavvolto. Quindi le proteine iniziatrici si legano
alla molecola di DNA parentale in corrispondenza della sequenza di origine di
replicazione. Poi la DNA ELICASI si lega alle proteine iniziatrici e viene portata sul
DNA. La DNA elicasi denatura il DNA utilizzando come energia di attivazione
quella derivata dall’idrolisi di ATP. L’idrolisi di ATP determina un cambiamento
nella struttura dell’elicasi, che consente all’enzima di muoversi lungo la singola
elica e di svolgere la doppia elica di DNA man mano che procede.
Successivamente l’enzima primasi si lega all’elicasi, formando un complesso
detto primosoma.
La primasi sintetizza un RNA primer di inesco, complementare alle prima porzione
di DNA da copiare, questo perché nessuna delle DNA polimerasi è in grado di
iniziare la sintesi ex novo di un filamento di DNA, ma ha appunto bisogno di
primer di innesco. I primer di solito iniziano con 2 nucleotidi purinici, di solito AG.
I primer di innesco di RNA vengono poi rimosso e rimpiazzati da DNA. Quando il
DNA si divide in due elica si forma appunto la forca replicativa, e, nei casi in cui ci
sia un DNA circolare, ci saranno due forche replicative che procederanno nelle
due direzioni opposte. Proteine SSB (single strand DNA binding proteins) si
legano al singolo filamento di DNA stabilizzandolo ed impedendo che rinaturi.
Successivamente la DNA polimerasi 3 polimerizza allungando i primer.
È importante notare che la DNA polimerasi può catalizzare la sintesi di DNA solo
in direzione 5’->3’, ma le due eliche sono di polarità opposta.
La nuova elica che è fatta in direzione 5’->3’ è detta elica leading, l’elica che è
sintetizzata in direzione opposta al movovimeto della DNA polimerasi è detta elica
lagging. Per l’elica leading serve un solo primer di RNA, per l’elica lagging
servono più primer di RNA. L’elica leading è sintetizzata in modo continuo
seguendo la forca replicativi. L’elica lagging invece è sintetizzata in modo
discontinuo, perché la DNA polimerasi allunga il primer di RNA solo fino ad un
certo punto, producendo quelli che vengono detti FRAMMENTI DI OKAZAKI. I
frammenti okazaki vengono poi successivamente uniti grazie all’intervento della
DNA polimerasi I e della DNA ligasi. (praticamente i primer vengono allungati
parzialmente dalla DNA polimerasi III, poi la DNA polimerasi I interviene e
sostituisce i primer di RNA con DNAn per effetto della sua attività esonucleasica
3’->5’).
Replicazione del DNA del fago lambda:
il fago lambda è un fago temperato e ciò significa che, quando esso infetta E.coli
ha la possibilità di attuare o il ciclo litico, che porta alla lisi della cellula, o al ciclo

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lidogenico, uno stadio quiescente in cui il fago non si riproduce. I primo


passaggio dopo l’infezione è la conversione della molecola di DNA lineare in una
di DNA circolare, attraverso l’appaiamento delle sequenze terminali dette
sequenze cos. Nel ciclo lisogenico il DNA circolare attraverso un evento di
crossino over si integra nel DNA del cromosoma batterico. Nel ciclo litico il
meccanismo di replicazione a cerchio rotante produce una molecola di DNA molto
lunga, costituita da copie del cromosoma lambda legate fra di loro unendo testa e
coda di due copie del menoma successive. Questa molecola di DNA costituita da
più copie di menoma del fago in serie è detta CONCATAMERO. Nel cromosoma di
lambda c’è il gene ter, il cui prodotto genico è una DNA endonucleasi, e questa
endonucleasi riconosce la sequenza cos e produce un taglio asimmetrico in
corrispondenza di ciascun sito cos. In questo modo sono prodotti i cromosomi di
lambda provvisti di estremità appiccicose, che verranno poi impaccati nelle teste
del fago assemblate.
Replicazione del DNA eucarotico:
nelle cellule di mammifero sono state identificate 5 diverse DNA polimerasi: alfa,
beta, gamma, delta, epsilon. Alfa beta delta ed ipsilon sono localizzate nel nucleo,
mentre gemma nei mitocondri per la replicazione del menoma mitocondriale.
Alfa e delta servono alla replicazione del DNA nucleare, beta ed ipsilon per la
riparazione.
Nella replicazione eucaristica ci sono più origini di replicazione: il tratto di DNA
compreso fra un’origine di replicazione e le due terminazioni della replicazione
(dove le forche di replicazione adiacenti si fondono) è detta replicone.
Nel lievito Saccharomyces cerevisiae sono state identificate specifiche sequenze
che, quando vengono incluse in una molecola di DNA circolare
extracromosomico, conferiscono e tale molecola la capacità di replicarsi
autonomamente in cellule di lievito. Tali sequenze sono dette ARS, e sono formate
da 4 elementi detti A, B1, B2, B3. l’elemento A svolge un ruolo fondamentale per la
funzionalità delle ARS, mentre gli elementi B determinano con quale frequenza
viene usata una determinata origine di replicazione. L’elemento A insieme
all’elemento B1 o B2 forma il nucleo dell’ARS, e a tale nucleo si lega un
complesso di riconoscimento dell’origine (ORC). L’elemento B3 aumenta la
replicazione attraverso il legame del fattore 1 di legame dell’ARS, detto Abf1p.
Replicazione delle estremità dei cromosomi (telomeri):
quando un cromosoma parentale è replicato, al 5’ nella posizione del telomero
quando verrà eliminato il primer di innesco di RNA si formerà una interruzione
(gap) al 5’, perché la DNA polimerasi non può intervenire per riparare tale gap in
quanto non ci sono primer di innesco.
Se queste interruzioni non venissero via via integrate, ci sarebbero cromosomi
sempre più corti ad ogni ciclo di replicazione. Un enzima chiamato telomerasi,
infatti, mantiene la lunghezza cromosomica aggiungendo ripetizioni telomeriche
in tandem alle estremità cromosomiche. Tale meccanismo non coinvolge la
macchina replicativi. La telomerasi è un enzima fatto sia di proteine che di RNA.
La componente di RNA ha la sequenza di basi complementare all’unità ripetuta
dei telomeri. La telomerasi infatti si lega specificatamente alle estremità
cromosomiche, e poi, usando come stampo il proprio RNA catalizza la sintesi si
sequenze fatte di triplette ripetute, tale enzima è quindi una DNA polimerasi-RNA
dipendente. L’attività della telomerasi è quindi necessaria per le cellule a vitalità
prolungata (cellule immortali), mentre negli altri tipi di cellule il progressivo
accorciamento dei telomeri è il timer vitale che segna il tempo di vita di una

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cellula ( quante divisioni essa possa compiere prima di morire per l’eccessivo
accorciamento dei telomeri).

 Epistasi
L’epistasi è un esempio di interazione fra geni diversi in cui un gene maschera
l’espressione fenotipica di un altro gene. Un gene che maschera l’espressione di
un altro gene è detto epistatico, e un gene che viene mascherato è detto
ipostatico.
EPISTASI RECESSIVA (rapporto 9:3:4): quando topi aguti appartenenti a linee
pure sono incrociati con albini, tutta la progenie F1 è aguti e quando questi aguti
f1 sono incrociati fra loro, la progenie F2 è costituita da 9/16 di topi aguti, 3/16 di
neri e 4/16 di albini. Questo si verifica perché i genitori sono diversi in quanto
hanno un allele dominante C, di un gene che controlla la formazione di qualsiasi
colore (topi neri sono C/- e albini sono c/c) e hanno un allele dominante A di un
gene che determina l’aspetto aguti, che consiste di un bandeggio giallo sui peli
neri (A/- sono aguti e a/a sono non aguti). Fenotipicamente A/- C/- sono aguti, a/a
C/- sono neri, a/a c/c e A/- c/c sono albin, e si avrà un rapporto fenotipico 9 aguti,
3 neri e 4 albini su un 16 individui. Quindi questo esempio dimostra epistasi di c/c
su A/-. In altre parole il pelo bianco viene prodotto nei topi c/c indipendentemente
dal genotipo all’altro locus genico.
EPISTASI DUPLICATA RECESSIVA (rapporto 9:7): il colore del fiore del pisello
odoroso. I 9/16 delle piante f2 a fiori purpurei suggeriscono che i fiori colorati si
manifestino solo quando due alleli dominanti indipendenti sono presenti insieme
e che il colore porpora sia il risultato di una qualche interazione tra loro. Il colore
bianco dei fiori deriverebbe allora dall’omozigosi dell’allele recessivo di uno o di
entrambi i geni. Per cui la coppia all’elica C/c determina la presenza di colore nel
fiore e la coppia P/p determina se il colore sarà porpora. Un’interazione tra due
genitale da dare origine ad un prodotto specifico è una forma di epistasi chiamata
epistasi duplicata recessiva (per azione di geni complementari). Nella via di
sintesi del pigmento porpora, si può ipotizzare che un composto incolore viene
convertito attraverso una serie di passaggi in un prodotto finale purpureo. Ogni
tappa è controllata dal prodotto di un gene. Per spiegare il rapporto alla f2 si può
ipotizzare che il gene C controlli la conversione del composto dalla tappa 1 alla
tappa 2 e che il gene P controlli la conversione del composto dalla tappa 2 alla
tappa finale che darà un prodotto finale porpora. Quindi un’omozigosi recesiva di
uno o dell’altro dei geni C e P o di entrambi determina un blocco nella via di
biosintesi suddetta e l’accumulo del solo pigmento bianco. Vale a dire i genotipi
C/- p/p, c/c P/-, c/c p/p daranno tutti fenotipi bianchi. Le uniche piante con fiori
porpora saranno quelle col genotipo C/- P/-. Si avrà così un rapporto 9 porpora: 7
bianco.

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 Funzione dei centromeri


I centromeri sono le sequenze di DNA localizzate accanto al punto di attacco delle
fibre del fuso mitotico o meiotico. La regione centromerica di ogni cromosoma è
responsabile della precisa segregazione dei cromosomi duplicati nelle cellule
figlie durante la mitosi e la meiosi. Le sequenze centromeriche del lievito
saccharomyces cerevisiae sono chiamate sequenze CEN. Il nucleo centrale della
regione centromerica di ogni cromosoma di lievito consiste di 3 domini (elementi
del DNA centromerico o CDE): CDE 1, CDE 2 e CDE 3. In un modello ipotetico di
struttura del cinetocore di lievito, si è ipotizzato che Cbf1 (primo fattore di legame
al centromero) si lega a CDE1 e un complesso di proteine comprendente cbf3 si
lega a CDE3. la sequenza più lunga di CDE2 può avvolgersi una volta attorno ad
un ottametro di istoni. Forse attraverso una proteina lynker, cbf3 si lega
all’estremità di un microtubulo.

 Funzione della telomerasi e telomeri


Un telomero è indispensabile per la stabilità della lunghezza del cromosoma
durante la replicazione. Le regioni telomeriche sono generalmente
eterocromatiche. In quasi tutti gli organismi studiati, i telomeri occupano una
posizione proprio all’interno della membrana nucleare e sono spesso associati
l’uno all’altro e alla membrana nucleare. Tutti i telomeri in una data specie
presentano una sequenza comune. La maggior parte delle sequenze telomeriche
possono essere suddivise in due tipi:
1. sequenze telomeriche semplici: sono situate all’estremità cromosomica.
Sono la componete funzionale essenziale dei telomeri. Sono sequenze
specie-specifiche e consistono di una serie di semplici sequenze di DNA
ripetute una dopo l’altra (ripetizioni in tandem). In un modello recente, il
DNA telomerico si avvolge all’indietro su se stesso, a formare un T-loop,
l’estremità a singolo filamento invade le sequenze telomeriche a doppio
filamento formando un D-loop (displacement loop).
2. Sequenze associate ai telomeri: sono situate all’interno dei cromosomi, il
loro significato non è ancora noto.
Replicazione delle estremità dei cromosomi (telomeri):
quando un cromosoma parentale è replicato, al 5’ nella posizione del telomero
quando verrà eliminato il primer di innesco di RNA si formerà una interruzione
(gap) al 5’, perché la DNA polimerasi non può intervenire per riparare tale gap in
quanto non ci sono primer di innesco.
Se queste interruzioni non venissero via via integrate, ci sarebbero cromosomi
sempre più corti ad ogni ciclo di replicazione. Un enzima chiamato telomerasi,
infatti, mantiene la lunghezza cromosomica aggiungendo ripetizioni telomeriche
in tandem alle estremità cromosomiche. Tale meccanismo non coinvolge la
macchina replicativi. La telomerasi è un enzima fatto sia di proteine che di RNA.
La componente di RNA ha la sequenza di basi complementare all’unità ripetuta
dei telomeri. La telomerasi infatti si lega specificatamente alle estremità
cromosomiche, e poi, usando come stampo il proprio RNA catalizza la sintesi si
sequenze fatte di triplette ripetute, tale enzima è quindi una DNA polimerasi-RNA
dipendente. L’attività della telomerasi è quindi necessaria per le cellule a vitalità
prolungata (cellule immortali), mentre negli altri tipi di cellule il progressivo

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accorciamento dei telomeri è il timer vitale che segna il tempo di vita di una
cellula ( quante divisioni essa possa compiere prima di morire per l’eccessivo
accorciamento dei telomeri).

 Genetica mendelliana - I° e II° Legge


Mendel incrociò linee pure di pisello, per esempio piante a semi lisci con piante a
semi rugosi, ed ottenne che tutti i semi della progenie f1 ottenuta dagli incroci
reciproci liscio x rugoso erano tutti lisci. Vale a dire, relativamente a questo
carattere i semi erano esattamente simili ad uno solo dei due genitori, piuttosto
che essere una miscela di entrambi i fenotipi parentali. Il fatto che tutti i figli di
genitori appartenenti a linee pure sono simili fra loro viene spesso definito come
principio dell’uniformità alla f1.
successivamente, mendel piantò questi semi e lasciò autofecondare le piante
della f1 per produrre i semi della f2 e ottenne semi lisci e rugosi in un rapporto
3:1. da questi elementi mendel riuscì a capire che la generazione filiale eredita da
ciascun genitore un allele per un determinato carattere: si avrà che un allele
risulterà DOMINANTE sull’ altro allele che definiremo RECESSIVO (il carattere
liscio è dominante su quello rugoso). Gli individui che ereditano un gene con 2
alleli identici vengono definiti OMOZIGOTI, e possono essere omozigoti per l’allele
dominante o omozigoti per l’allele recessivo. Al contrario gli individui che avranno
un gene con una copia dell’allele dominante u una dell’allele recessivo vengono
detti ETEROZIGOTI.
PRINCIPIO DELLA SEGREGAZIONE (prima legge di Mendel): i caratteri recessivi,
mascherati alla f1 di un incrocio tra due linee pure, ricompaiono alla f2 in
proporzioni definite. Questo significa che i due alleli di una coppia genica
segregano uno dall’altro durante la formazione dei gameti. Ogni figlio quindi
riceverà dal genitore solo un allele.
TEST-CROSS: Un modo più usato per accertare il genotipo sconosciuto di un
organismo è quello di effettuare un reincrocio, vale a dire un incrocio fra un
individuo di genotipo ignoto e un individuo omozigote recessivo. Mendel fu il
primo ad effettuare tale test-cross:
Se la pianta con genotipo ignoto è SS, allora produrrà solo gameti S, mentre la
pianta omozigote recessiva ss produrrà solo gameti s: ne risulta che dal loro
incrocio deriveranno solo eterozigoti Ss che manifesteranno il fenotipo
dominante.
Se la pianta con genotipo ignoto è Ss, allora produrrà metà gameti S e metà
gameti s, mentre come prima la pianta omozigote recessiva ss produrrà solo
gameti s: dall’incrocio deriveranno metà piante con genotipo eterozigote Ss
(fenotipo dominante) e metà piante omozigoti recessive ss (fenotipo recessivo).
PRINCIPIO DELL’ASSORTIMENTO INDIPENDENTE (seconda legge di mendel):
stabilisce che i fattori che controllano caratteri diversi si distribuiscono in
maniera indipendente gli uni dagli altri. Questo significa che geni posti su
cromosomi diversi si comportano in modo indipendente durante la formazione dei
gameti.
In un incrocio di diibridi Ss Yy x Ss Yy, si produrrà alla generazione f2 ottenuta da
un incrocio f1 x f1 una progenie che mostrerà il rapporto 9:3:3:1.
In un incrocio di triibridi Ss Yy Cc x Ss Yy Cc, si produrrà alla generazione f2
ottenuta da un incrocio f1 x f1 una progenie che mostrerà il rapporto

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27:9:9:9:3:3:3:1.
Malattie nell’uomo per omozigosi recessiva: albinismo. Per genitori entrambi
eterozigoti per tale carattere si avrà ovviamente un rapporto 3:1.
Malattie nell’uomo per alleli dominanti: acondroplasia, brachidattilia, sindrome di
Marfan.

 Geni procariotici
Un gene procariotico è organizzato nel modo seguente:
NEL CASO DI GENI COSTUTIVI (housekeeping genes) ci sarà una regione del
promotore, una regione codificante ed un terminatore.
Nel caso di GENI INDUCIBILI (non espressi in maniera costitutiva, ma solo in
particolari momenti funzionali in cui l’espressione di tale gene viene INDOTTA da
un fattore inducente) ci sarà una regione promotore, un sito di controllo detto
OPERATORE a cui si può legare o meno un induttore della trascrizione, una
regione codificante e un terminatore.
È importante notare che i geni procariotici (NON QUELLI EUCARIOTICI) sono
organizzati secondo il modello dell’OPERONE: nella regione codificante suddetta
ci saranno più geni la cui espressione produce prodotti correlati dal punto di vista
funzionale, tali geni saranno sotto controllo di un unico promotore e di un’unica
regione di controllo che, nel caso in cui venga attivata da un induttore, darà il via
alla trascrizione di tutti i geni dell’operone.

 Incroci di Morgan
Morgan lavorò sugli incroci di mosche: queasin tutte avevano il fenotipom con
occhi rossi (wild type) mentre poche avevano il fenotipo con occhi bianchi (allele
mutato).
1° incrocio: Morgan incrociò il maschio con occhi b ianchi con una femmina con
occhi rossi e trovò che tutte le mosche alla f1 avevano occhi rossi. Concluse che
il carattere per l’occhio bianco era recessivo. Successivamente lasciò che la
progenie f1 si incrociasse e notò che tutte le mosche a occhi bianchi ottenute
erano maschi. L’eredità di tale carattere era quindi legata ai cromosomi sessuali.
Nello specifico morgan propose che il gene che determina la variante del colore
dell’occhio fosse localizzato sul cromosoma x. La condizione di geni associati
all’x nel maschio è definita EMIZIGOTE, dato che il gene è presente in singola
copia nell’organismo, in quanto manca un corrispettivo allele sul cromosoma y.
Dato che l’allele bianco è recessivo, il maschio con occhi bianchi doveva portare
sul cromosoma x l’allele recessivo per gli occhi bianchi (indicato con w). La
femmina con gli occhi rossi proveniva da un ceppo linea pura, per cui entrambi i
suoi cromosomi x dovevano portare l’allele dominante per gli occhi rossi w+. Le
mosche alla f1 vengono prodotte così: i maschi ricevono dalla madre il loro unico
cromosoma x e quindi hanno l’allele w+ e gli occhi rossi, le femmine ricevono un
allele w recessivo dal padre e un allele dominante w+ dalla madre quindi avranno
anch’esse gli occhi rossi. Alla f2 i maschi che hanno ricevuto dalla madre un
cromosoma x con l’allele recessivo w hanno gli occhi bianchi, quelli che hanno
ricevuto dalla madre un cromosoma x con un allele w+ dominante avranno gli
occhi rossi. La trasmissione di un allele da un genitore maschio attraverso una
figlia femmina a un nipote maschio è definita EREDITà CRISSCROSS.

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2° incrocio: morgan incrociò una femmina con occhi bianchi proveniente da una
linea pura (omozigote per l’allele w recessivo) con un maschio a occhi rossi (con
un x con l’allele w+ dominante). Ottenne che tutte le femmine alla f1 ricevono un x
con w+ dominante dal padre e un x con w recessivo dalla madre, di conseguenza
saranno eterozigoti w+/w e avranno gli occhi rossi. Tutti i maschi alla f1 avevano
gli occhi bianchi, perché ereditavano l’unico cromosoma x con allele w recessivo
dalla madre.

Questi esperimenti servono a dimostrare le caratteristiche di ereditarietà dei


caratteri associati al cromosoma x, che dipendono dalle vie di acquisizione dei
cromosomi sessuali nel maschio e nella femmina.

 In quale tipo di RNA ci possono essere gli introni


mRNA: Gli intoni si trovano di regola negli mRNA eucarioti, per produrre diverse
proteine da un solo trascritto di RNA (meccanismo dello splicing alternativo).
rRNA: Gli introni nei geni per gli rRNA sono stati trovati solo in pochissimi
organismi (autosplicing del protozoo Tetrahymena).
tRNA: Per ragioni non ancora note gli introni si trovano solo nei tRNA per gli
amminoacidi tiroxina, fenilalanina, triptofano, lisina, serina, leucina, isoleucina.

 Integrazione Proteina-Proteina - Sistema dei due ibridi del lievito

Un sistema che consente di isolare geni che codificano proteine che


interagiscono con proteine note è il sistema dei due ibridi di lievito. Affinché il sia
trascritto il gene di lievito GAL1 che metabolizza il galattosio, è necessario che la
proteina regolatrice Gal4p (codificata dal gene GAL4) si leghi ad un elemento del
promotore di GAL1 chiamato sequenza UASg (sequenza di attivazione a monte).
Gal4p ha due domini: un dominio di legame al DNA (BD o DNA binding domain)
che si lega a UASg, e un dominio di attivazione (AD o activation domain), che
facilita il legame della RNA polimerasi al promotore e l’inizio della trascrizione.
Nel sistema dei due ibridi del lievito sono usati due plasmidi di espressione di
lievito. Un tipo di plasmide contiene la sequenza del dominio BD di Gal4p fusa alla
sequenza della proteina x nota. L’altro tipo di plasmide contiene la sequenza del
dominio di attivazione AD di Gal4p fusa a sequenze che codificano proteine
presenti in una banca di cDNA (serie di proteine y). Un ceppo di lievito è co-
trasformato con un plasmide BD e con la banca di plasmidi AD in modo che ogni
trasformante abbia il plasmide BD e uno dei plasmidi della banca AD. Nel menoma
del ceppo di lievito che è co-trasformato c’è un gene reporter, cioè un gene che
codifica un prodotto facilmente analizzabile, a valle di una UASg. Il gene reporter
è il gene di E.Coli lacZ che codifica la beta galattosidasi: le colonie di lievito che
codificano questo gene diventano azzurre in presenza di un substrato incolore x-
gal. Il gene reporter è espresso soltanto quando la proteina ignota y della proteina
di fusione con AD interagisce con la proteina nota x della proteina di fusione BD.
L’interazione tra la proteina x la proteina y avvicina i domini BD e AD di Gal4p che
in questo modo sono in grado di attivare la trascrizione del geni reporter. Se x e y
non interagiscono tra loro, i domini BD e AD di Gal4p sono separati ed il gene
reporter non è trascritto. Quando si ottiene un’interazione, evidenziata
dall’espressione del gene reporter, si può isolare dal lievito il plasmide AD e la
sequenza di cDNA ad esso legata può essere usata per isolare il gene genomico.

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 La genetica dei gruppi sanguigni


Un esempio di alleli multipli di un gene è costituito dal sistema di gruppo
sanguigno ABO dell’uomo. Nel sistema ABO si riscontrano 4 tipi di gruppi
sanguigni, ognuno con diversa specificità antigenica che rendi incompatibili
alcune trasfusioni tra diversi soggetti. La diversa specificità antigenica deriva da
diverse combinazioni all’eliche dei 3 alleli Ia Ib e i, che determinano i quattro
fenotipi A, B, AB e O. le persone omozigoti per l’allele recessivo i sono di tipo O.
sia Ia che Ib sono dominanti su i. Individui di tipo A sono Ia/i o Ia/Ia, quelli di tipo B
per ragionamento analogo possono essere di genotipi Ib/i o Ib/Ib. Gli individui AB
sono di genotipi Ia/Ib e presentano entrambi gli antigeni A e B
CONTEMPORANEAMENTE (fenomeno della CODOMINANZA).

 Lyonizzazione
Gli organismi con i cromosomi del sesso hanno un diverso dosaggio genico tra i
due sessi. Vale a dire, vi sono due copie di geni x-linked nelle femmine e una
copia nei maschi. In molti di questi organismi, se l’espressione genica relativa al
cromosoma x non viene equilibrata, si verifica una letalità precoce durante lo
sviluppo. Si viene a mettere così in atto un MECCANISMO DI COMPENSAZIONE
DELLA DOSE: nei mammiferi i nuclei delle cellule somatiche di femmine normali
xx contengono una massa di cromatina fortemente condensata, denominata
corpo di Barr. Secondo la teoria di Lyon:
1. il corpo di Barr è un cromosoma x altamente condensato e per la maggior
parte geneticamente inattivato (lyonizzazione). Rimane così nelle cellule
somatiche femminili un singolo cromosoma x “funzionante”, equivalente
dal punto di vista trascrizionale all’unico x della cellula somatica maschile.
2. il cromosoma x inattivato è scelto a caso fra i cromosomi x di derivazione
materna e paterna, secondo un processo indipendente da cellula a cellula.
Una volta che un cromosoma x materno o paterno è inattivato in una
cellula, tutti i discendenti di quella determinata cellula EREDITANO IL TIPO
DI INATTIVAZIONE).
L’inattivazione dell’x avviene nella donna circa al sedicesimo giorno dopo la
fecondazione. A causa dell’inattivazione dell’x nei mammiferi le femmine
eterozigoti per i caratteri legati all’x sono dei veri e propri mosaici genetici: questo
perché alcune cellule mostrano il fenotipo relativo ad un cromosoma x ed altre
presentano un fenotipo corrispondente all’altro cromosoma x.
Tre tappe sono implicate nell’inattivazione dell’x: il conteggio dei cromosomi, la
scelta di un x da inattivare, l’inattivazione. Vi è una zona su ciascun x denominata
centro di in attivazione dell’x (XIC): queste regioni sono implicate nel conteggio
dei cromosomi x, perché avvenga l’inattivazione devono essere presenti due o più
XIC. La scelta del cromosoma da inattivare viene effettuata a livello dell’elemento
di controllo dell’X (Xce), che si trova nella regione XIC. Un gene chiamato XIST (x
inattive specific transcripts) è pure localizzato nella regione XIC: XIST è espresso
dall’x inattivo e non dall’x attivo. Il gene XIST è essenziale per l’inattivazione dell’x
in quanto viene trascritto in un RNA maturo, poliadenilato, senza cornici di lettura
aperte e perciò non tradotto. Questo RNA viene stabilizzato durante l’inattivazione
dell’x e copre il cromosoma x da inattivare (da cui è stato trascritto) silenziando la
maggior parte dei geni. Alla fine il cromosoma x diventa eterocromatinizzato.

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 Marcatori dei vettori artificiali (marcatori selettivi dominanati)


Un marcatore selettivo dominante è uno degli elementi di un vettore plasmidico di
E.Coli. serve a rendere le cellule di E.Coli che contengono tale plasmide
facilmente identificabili dalle cellule che non lo contengono. Di solito il marcatore
selettivo dominante usuale è un gene che che conferisce resistenza ad un
determinato antibiotico alla cellula di E.coli che ha internalizzato il plasmide in
questione. Di solito si usa il gene ampR per la resistenza all’ampicillina o il gene
tetR per la resistenza alla tetraciclina. Quando i plasmidi recanti geni per la
resistenza agli antibiotici vengono aggiunti ad una popolazione di E.coli priva di
plasmidi, e per tanto sensibili agli antibiotici, le cellule che incorporeranno un
plasmide potranno essere evidenziate facendo crescere le stesse cellule in un
terreno contenente l’antibiotico di ci il plasmide porta il gene per la resistenza.
COSì SOLTANTO I BATTERI CONTENENTI IL PLASMIDE POTRANNO CRESCERE
IN TALE TERRENO.

 Meccanismi di insorgenza della mutazioni geniche (e tipi di


mutazioni)
Una mutazione né un cambiamento di una coppia di basi del DNA (mutazioni
geniche) o un cambiamento in un cromosoma (mutazioni cromosomiche). Se la
mutazione interssa una cellula somatica si avranno ovviamente ripercussioni solo
a livello dell’individuo affetto, altrimenti se la mutazione interessa le cellule
germinali avremo MUTAZIONI NELLA LINEA GERMINALE.
Le mutazioni puntiformi possono essere divise in due categorie: sostituzione di
coppie di basi e inserzioni o delezioni di coppie di basi.
Vi sono due tipi di sostituzioni:
Mutazione per transizione: è una mutazione che sostituisce una coppia di basi
purina-pirimidina con un'altra coppia purina-pirimidina.
Mutazione per transversione: è una mutazione che sostituisce una coppia di basi
purina-pirimidina con una coppia pirimidina-purina.
Le mutazioni per sostituzione possono essere distinte inoltre sulla base degli
effetti che provocano:
Mutazione missenso: mutazione genica nella quale una sostituzione di una coppia
di basi nel DNA provoca un cambiamento nel codone dell’mRNA con il risultato
che nel polipeptide viene inserito un amminoacido differente. Il fenotipo potrà
cambiare o meno a seconda del tipo di amminoacido inserito.
Mutazione nonsenso: il codone dell’mRNA interessato alla sostituzione si
modifica e diventa un codone di stop, e conseguentemente sarà prodotta una
proteina tronca.
Mutazione neutra: il codone dell’mRNA interessato viene cambiato in maniera tale
che specifichi per un amminoacido diverso da quello originale, ma chimicamente
equivalente, e conseguentemente non si avranno ripercussioni sulla funzionalità
della proteina.
Mutazione silente: il codone dell’mRNA viene cambiato, ma specifica cmq LO
STESSO amminoacido originale (più codoni in fatti possono specificare per uno
stesso amminoacido).
Mutazione frameshit: è l’unico tipo di mutazione che si ha per inserzione o
delezione di una coppia di basi, e causa SCIVOLAMENTO DELLA CORNICA DI

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LETTURA, cioè verrà prodotta una proteina con caratteristiche completamente


diverse rispetto a quella originale e spesso non funzionante.
Esistono SOPPRESSORI INTRAGENICI E SOPPRESSORI INTERGENICI, che
possono far revertire al selvatico le mutazioni. I geni che che causano
soppressione di mutazioni in altri geni vengono detti GENI SOPPRESSORI:
ad esempio i geni soppressori delle mutazioni missenso sono geni che codificano
per tRNA mutati che quando incontrano un codone di stop mettono lo stesso un
amminoacido, al posto di bloccare la traduzione. L’amminoacido inserito fa
continuare la traduzione, che così potrà ripristinare almeno in parte la funzionalità
della proteina.
Le mutazioni possono essere spontanee:
mutazioni per sostituzione di una coppia di basi: si verifica quando durante la
replicazione del DNA ci sarà un appaiamento vacillante fra pirimidina-purina tra T
e G e tra C e A,oppure un appaiamento vacillante purina-purina A e G e pirimidina-
pirimidina T e C. tali accoppiamenti errati se non corretti al successivo ciclo di
replicazione daranno luogo ad una transizione, perché le due eliche verranno
divise e fungeranno da stampo partecipando con un nucleotide ERRATO rispetto
all’elica parentale nel punto in cui è avvenuto l’appaiamento errato.
Mutazioni per inserzioni o delezioni: se il DNA che si estrude è dell’elica stampo,
la DNA polimerasi salta la o le basi estruse e ciò causerà una delezione. Se la DNA
polimerasi sintetizza una o più basi che non sono presenti sull’elica stampo, il
nuovo DNA estrude e ci sarà una inserzione. Se tali inserzioni o delezioni
avvengono nella regione codificante di un gene strutturale daranno luogo a
mutazioni frameshit.
Cambiamenti chimici spontanei: depurinazine o deaminazione (la citosina
deaminata produce gracile, la deaminazione della 5-metil-citosina produce timida).
Le mutazioni possono essere indotte:
da radiazioni X e raggi UV (formazione dei dimeri di timida), analoghi delle basi
come il 5 bromo-uracile (che nel suo stato normale si appaia con l’adenina, e
dopo trandizione nel suo stato raro si appaia con la guanina), agenti chimici come
l’acido nitroso (agente deaminante) l’idrossilamina (agente idrossilante) e il
metilmetansulfonato (agente alchilante), agenti intercalanti come la proflavina
l’acridina e il bromuro di etidio.

 Mutazioni cromosomiche
Esistono 4 tipi fondamentali di mutazioni cromosomiche: le delezioni e le
duplicazioni, le inversioni e le traslocazioni. Tutti e 4 i tipi di mutazioni avvengono
per rottura di un cromosoma e se la rottura avviene all’interno di un gene
codificante ci sarà la perdita della funzionalità, inoltre il frammento tronco sarà
privo delle unità telomeriche e potrà essere facilmente degradato.
I cromosomi politecnici sono costituiti da un fascio di cromatidi che derivano da
cicli ripetuti di duplicazione dei cromosomi senza duplicazioni nucleari o cellulari.
DELEZIONE: è la perdita di una parte di un cromosoma. Se la delezione implica la
perdita del centromero, il risultato è un cromosoma acentrico, che viene
generalmente perso durante la meiosi. Effettuando un’analisi cariotipica, si può
notare la delezione perché si osserva un paio di cromosomi omologhi appaiati in
modo sbagliato, con un cromosoma più corto dell’altro. Negli individui eterozigoti
le delezioni hanno come conseguenza delle anse non appaiate visibili alla sinapsi
dei due omologhi alla meiosi. Una delezione dell’allele dominante in un individuo

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eterozigote porta alla PSEUDODOMINANZA: il carattere recessivo si esprime


come dominante in mancanza dell’allele dominante.
Delezione di una parte del braccio corto del cromosoma 5: sindrome del cri-du-
chat.
Delezione di una parte del braccio lungo del cromosoma 15: sindrome di Prader-
willy.
DUPLICAZIONE: è una mutazione cromosomica che deriva dal raddoppiamento di
un tratto di un cromosoma. Le duplicazioni possono essere in tandem, a tandem
inversa, a tandem terminale. Le duplicazioni eterozigoti danno origine ad anse
non appaiate e possono essere riconosciute citologicamente. Il carattere Bar
(occhio a barra) della drosophila melanogaster è il risultato di una duplicazione di
un piccolo tratto del cromosoma x: tale duplicazione avviene probabilmente a
causa di un crossino-over ineguale, che si verifica quando i cromosomi omologhi
non si appaiano nel modo corretto.
INVERSIONE: si verfica quando un segmento cromosomico viene exciso, ruotato
di 180 gradi e poi reintegrato nel cromosoma. Si distinguono inversioni
PERICENTRICHE che comprendono il centromero e inversioni PARACANTERICHE
che non comprendono il centromero. Nelle inversioni paracentriche eterozigoti, i
cromosomi omologhi tentano di appaiarsi in modo da raggiungere un
appaiamento tra le basi il più preciso possibile. Data la presenza di un tratto
invertito su un omologo , l’appaiamento dei cromosomi omologhi richiede la
formazione di anse che comprendono i tratti invertiti, chiamate anelli o anse di
inversione: le inversioni in organismi eterozigoti possono quindi essere osservate
analizzando le anse.
La frequenza di crossino over non viene diminuita rispetto alle cellule normali
nelle inversioni eterozigoti, ma i gameti o gli zigoti risultanti dei cromatidi
ricombinanti non sono vitali.
Effetti di un crossing over singolo entro l’anello di inversione di un individuo
eterozigote per un’inversione paracentrica: Durante la prima anafase meiotica i
due centromeri migrano ai poli opposti della cellula. A causa del crossino over tra
i geni dell’anello d’inversione, un cromatidio ricombianante viene stirato
attraverso la cellula quando i due centromeri cominciano a migrare all’anafase,
con formazione di un ponte di centrico (vale a dire un cromosoma con due
centromeri). Man mano che la migrazione procede il ponte di centrico, a causa
della tensione si rompe. L’altro prodotto ricombinante dell’evento di crossino over
è un cromosoma senza centromero (un frammento acentrico) che viene
genralmente perduto. Alla seconda divisione meiotica solo due gameti su 4 sono
vitali ( il gamete con la sequenza di geni normali e quella con l’inversione), gli altri
due non sono normali perché molti geni sono stati deleti. Perciò i soli gameti che
possono dare origine ad una progenie vitale sono quelli che contengono i
cromosomi non coinvolti nel crossino over.
TRASLOCAZIONE: si distinguono traslocazioni intracromosomiche e
intercromosomiche. Le traslocazioni intercromosomiche si distinguono in non-
reciproche e reciproche.
Traslocazione reciproca tra cromosomi 9 e 22: leucemia mieloide cronica-> tale
traslocazione trasforma proto-oncogeni in oncogeni, precisamente l’oncogene c-
abl viene traslocato entro il gene bcr, generando il cosiddetto cromosoma
Philadelphia.
Traslocazione reciproca tra cromosomi 8 e 14: linfoma di Burkitt.
Sindrome dell’x fragile: l’x tende facilmente a rompersi in corrispondenza di un

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sito localizzato sul braccio lungo del cromosoma x. Il cromosoma x fragile è


ereditato come un tipico gene mendeliano: i figli maschi di femmine portatrici
hanno il 50% di possibilità di ricevere un x fragile. Anche le figlie femmine delle
femmine portatrici eterozigoti hanno anch’esse un 50% di possibilità di ereditare
un cromosoma x fragile. Dal punto di vista molecolare: inn un gene chiamato
FMR-1 localizzato in corrispondenza del sito fragile dell’x vi è una sequenza
ripetuta di 3 paia di basi CGG. Gli individui normali hanno 29 ripetizioni di questa
tripletta, mentre l’incidenza della sindrome aumenta con l’aumentare del numero
di triplette (da 200 in su). L’AMPLIFICAZIONE DELLE TRIPLETTE CGG AVVIENE
SOLO NELLE FEMMINE.
Altre malattie da ripetizioni di triplette: distrofia miotonia, atrofia muscolare
spinobulbare, malattia di Huntington.

 Non disgiunzione in Meiosi 1 e Meiosi 2


Una non disgiunzione alla meiosi I produce 4 gameti anormali: 2 gameti con un
cromosoma duplicato e 2 privi di quel cromosoma, quindi una fusione del primo
tipo di gamete con un gamete normale produrrà uno zigote con 3 copie del
cromosoma duplicato (mentre le altre coppie dei cromosomi rimarranno normali),
mentre una fusione del secondo tipo di gamete (in cui manca un cromosoma di
una coppia) darà origine ad uno zigote con una sola copia di quel particolare
cromosoma ( invece di aver una coppia normale di cromosomi) e tutte le altre
coppie cromosomiche normali.
Una non disgiunzione alla meiosi II produce due gameti normali e due anormali:
dei due gameti anormali uno conterrà due cromosomi fratelli (al posto di uno) e
l’altro non conterrà nemmeno una copia di quel determinato cromosoma. In
questo caso, con la fusione del primo tipo di gameti con gameti normali si
avranno zigoti trisomici, con la fusione del secondo tipo di gameti con gameti di
tipo normale si avrà uno zigote che manca completamente di una coppia di un
determinato cromosoma.

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 TRASCRIZIONE
Ad ogni gene sono associate delle sequenze di coppie di basi chiamate elementi
regolatori che sono coinvolti nella regolazione dell’espressione genica. Durante la
trascrizione l’rna viene sintetizzato in direzione 5’->3’. L’elica di dna con polarità
3’->5’ che viene letta viene detta elica stampo, l’elica con polarità 5’->3’ è detta
elica senso. Il nucleotide successivo da inserire nella catena è selezionato
dall’rna polimerasi per la sua capacità di accoppiarsi alla base esposta sull’elica
stampo del dna. A differenza delle dna polimerasi le rna polimerasi possono
iniziare la sintesi delle nuove catene senza bisogno di un primer, ma non hanno la
capacità di correggere gli errori.
INIZIO DELLA TRASCRIZIONE, I PROMOTORI: un gene procariotico può essere
diviso in 3 porzioni:
1. una sequenza a monte del punto di inizio della trascrizione, chiamata
promotore.
2. la regione codificante, la sequenza di dna che viene trascritta in rna.
3. il terminatore a valle della regione codificante.
In molti promotori ci sono due sequenze critiche per l’inizio della trascrizione: la
sequenza consenso a -35 e la regione consenso a -10 (detto pribnow box).
Affinché la trascrizione abbia inizio c’è bisogno che una forma dell’rna polimerasi
detta oloenzima si leghi al promotore. L’oloenzima è formato dal nucleo
enzimatico (core) della rna polimerasi (costituito da quattro polipeptidi 2alfa e
2beta) legato ad un altro polipeptide detto fattore sigma. Il fattore sigma è
essenziale per l’inizio della trascrizione perché serve al riconoscimento delle
regioni -35 e -10.
L’oloenzima dell’rna polimerasi si lega al promotore in due passaggi distinti.
All’inizio si lega in modo lasso alla regione -35 del promotore, mentre il dna è
ancora nella forma a doppia elica. Poi l’rna polimerasi si lega in modo più stretto
al dna, quando questo si svolge per circa 17 bp intorno al box -10, e la
trascrizione inizia in maniera corretta.
ALLUNGAMENTO E TERMINAZIONE DELLA CATENA DI RNA: dopo che sono stati
polimerizzati 8-9 nucleotidi di rna il fattore sigma si distacco dal nucleo
enzimatico e può essere utilizzato in altre reazioni di inizio trascrizione. La fine
della trascrizione nei procarioti è segnalata da elementi di controllo chiamati
sequenze di terminazione. Esistono terminatori rho dipendenti e rho indipendenti:
i terminatori rho indipendenti sono costituiti da sequenze con simmetria bipartita
seguite da una sequenza di A e T che nel trascritto daranno origine ad una serie di
U. Tale struttura a simmetria bipartita crea una struttura a forcina che destabilizza
così la rna polimerasi dall’elica di dna.
I terminatori rho dipendenti sono privi della catena AT tipica dei terminatori rho
indipendenti e molti di essi non possono formare la struttura a forcina. Il fattore
rho è una proteina con due domini: un dominio di legame all’rna, l’altro invece
lega atp. Per terminare la trascrizione, prima rho si lega all’atp, che lo attiva. La
proteina rho attivata si lega alle sequenze di riconoscimento appropriate vicino
all’estremità 3’ del trascritto. Poi rho idrolizza l’atp e si sposta lungo l’rna,
avanzando verso l’rna polimerasi. Quando l’rna polimerasi arriva al terminatore fa
una pausa, rho la raggiunge e rompe i ponti idrogeno tra il dna stampo e l’rna. Di
conseguenza avviene la terminazione.
Poiché solo un tipo di rna polimerasi è presente nei procarioti, tutte le classi di

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geni sono trascritte da essa.

TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI


Negli eucarioti tre diversi rna polimerasi i geni di quattro tipi di rna. La rna
polimerasi 1 localizzata esclusivamente nel nucleolo, catalizza la sintesi di tre rna
che si trovano nei ricorsomi: gli rrna 28s 18s e 5,8s. la rna polimerasi 2 che si
trova solo nel nucleoplasma sintetizza gli rna messaggeri ealcuni piccoli rna
nucleari (sn rna). La rna polimerasi 3 anch’essa localizzata solo nel nucleoplasma,
sintetizza gli rna trasfert che portano gli amminoacidi ai ribosomi, l’rrna 5s, altri
sn rna.
TRASCRIZIONE DEI GENI CHE CODIFICANO PER LE PROTEINE DA PARTE
DELL’RNA POLIMERASI 2.
I promotori dei geni che codificano per proteine contengono elementi di controllo
basali ed elementi di controllo prossimali. Gli elementi basali sono il TATA box in
posizione -25, e un elemento di inizio detto INR che è una sequenza ricca di
pirimidine localizzata in prossimità del punto di inizio trascrizione. Gli elementi di
controllo prossimali sono localizzati più a monte rispetto al TATA box, circ a 50-
200 nucleotidi prima del punto di inizio. Tali elementi sono il CAAT box a -75 e il
GC box a -90.
Per l’inizio della trascrizione è necessario l’intervento di fattori di trascrizione che
si legano agli elementi di controllo.
Prima TF2D si lega al TATA box per formare il complesso di inizio preliminare.
TF2D è un complesso di molte subunità, una delle quali è chiamata proteina
legante TATA (TBP), che riconosce la sequenza TATA, e altre chiamate fattori
associati a TBP (TAF). Il complesso TF2D-TATA box agisce come sito di legame
per TF2B, che poi recluta l’rna polimerasi 2 TF2F, producendo il complesso di
inizio minimo (l’rna polimerasi 2, come tutte le rna polimerasi eucarioti, non è in
grado di riconoscere e legare direttamente gli elementi promotore). Poi, TF2E e
TF2H si legano a produrre il complesso di inizio della trascrizione completo. Il
complesso di inizio è sufficiente per un livello basso di trascrizione. Per un
elevato livello di trascrizione sono necessari altri elementi chiamati attivatori, che
controllano quali promotori siano trascritti attivativamente. Gli attivatori si legano
ad elementi regolatori detti enhancer, sequenze richieste per la massima
trascrizione. Elementi simili agli enhancer che hanno caratteristiche simili tranne
che reprimono invece che attivare la trascrizione di un gene, sono chiamati
silencer. I silencer funzionano quando legati a fattori trsacrizionali chiamati
repressori.

La molecola di mRNA è composta da 3 parti. In posizione terminale 5’ c’è la


sequenza leader o regione non tradotta al 5’ (5’ UTR). La sequenza codificante
dell’ mRNA segue la sequenza leader. La sequenza di coda o sequenza al 3’ non
tradotta (3’ UTR), segue la sequenza codificante. Negli eucarioti il trascritto
primario (il pre-mRNA) per produrre un mRNA maturo deve essere modificato nel
nucleo. Nei procarioti invece il trascritto di RNA funziona direttamente come
messaggero, quindi la sequenza di basi di un gene è colineare con gli
amminoacidi della proteina prodotta. Gli mRNA procarioti sono spesso
policistronici, cioè contengono l’informazione codificante per più geni, mentre gli
mRNA eucarioti sono sempre monocistronici.
Gli mRNA eucarioti posseggono introni (non tradotti) ed esoni (tradotti). Gli esoni
includono le UTR al 5’. Gli introni vengono rimossi durante la maturazione del pre-

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mRNA per dare l’mRNA maturo.

Modificazioni al 5’ e al 3’: dopo che l’rna polimerasi 2 ha sintetizzato circa 20-30


nucleotidi del pre-mRNA, l’estremità 5’ è modificata dall’aggiunta di un cappuccio
(cap). la formazione del cap al 5’ comporta l’aggiunta di una 7 metil guanosina al
nucleotide terminale al 5’, con un insolito legame 5’-5’. Inoltre gli zuccheri dei due
nucleotidi successivi vengono modificati da metilazione. Il cappuccio è
necessario per l’attacco del ribosoma all’estremità 5’ dell’mRNA, che rappresenta
la prima fase del processo di traduzione. La maggior parte degli mRNA eucarioti
viene modificata anche all’estremità 3’ dall’aggiunta di una sequenza di circa 50-
250 adenine detta coda di poli A. La coda di poli A è importante per determinare la
stabilità dell’mRNA. L’aggiunta di una coda di poli A in 3’ marca l’estremità 3’
dell’mRNA. Infatti non esiste una sequenza di terminazione nel dna per segnalare
la fine della trascrizione di un gene che codifica per una proteina. Infatti la
trascrizione prosegue in alcuni casi per centinaia o migliaia di nucleotidi
superando un sito detto sito di poliadenilazione. Nella cellule dim mammifero
l’aggiunta del poli A avviene in questo modo:
1. un certo numero di proteine, tra cui CPSF (fattore per la specificità del
taglio e della poliadenilazione), CstF (fattore di stimolazione del taglio) e le
due proteine del fattore di taglio (CF1 e CF2), si legano e tagliano l’mRNA.
2. CPSF e CstF si legano anche tra di loro, producendo un rigonfiamento ad
ansa dell’mRNA, CF1 e CF2 sono legate vicino al sito di taglio. Dopo che
l’mRNA è stato tagliato l’enzima poli A polimerasi (PAP), usando ATP come
substrato, catalizza l’aggiunta di nucleotidi A all’estremità 3’ dell’RNA per
produrre la coda di poli A. durante questo processo PAP si lega a CPSF.
Appena sintetizzata , la coda di poli A viene legata dalla seconda proteina
che lega il poli A (PAB2).

SPLICING: nel pre-mRNA gli introni vengono rimossi e gli esoni uniti in un
processo detto splicing. L’introne comicincia con GU in 5’ finisce con AG in 3’. Il
primo passaggio nel processo di splicing è il taglio in corrispondenza della
giunzione di spling in 5’, che separa l’esone 1 dalla molecola di mRNA che
contiene l’introne e l’esone 2. l’estremità 5’ libera dall’introne si piega su se
stessa formando un occhiello e si unisce ad una adenina, che fa parte di una
sequenza chiamata sequenza del punto di ramificazione (branch-point sequance).
Il punto di ramificazione nell’RNA che produce la struttura a laccio comprende un
legame inconsueto 2’-5’ che si forma tra l’OH 2’ della sequenza del punto di
ramificazione e il fosfato 5’ della guanina all’estremità dell’introne. L’mRNA e
l’introne exciso in modo preciso (ancora nella forma a laccio) vengono prodotti
simultaneamente come risultato di un taglio netto al sito di giunzione 3’ di splicing
e dell’unione delle due sequenze codificanti . l’RNA laccio viene successivamente
trasformato in una molecola lineare per azione di un enzima deramificante e poi
degradato. La maturazione dell’mRNA avviene nel nucleo in complessi specifici
detti complessi di splicing, che sono costituiti dal pre-mRNA legato a piccole
particelle nucleari riboproteiche (snRNP). I passaggi dello splicing sono i
seguenti:
1. l’snRNP U1 si lega al sito di spling 5’ dell’introne.
2. l’ snRNP U2 si lega nel punto di ramificazione.
3. una snRNP U4/U6 e una snRNP U5 si legano agli snRNP U1 e U2 ,
provocando il ripiegamento dell’introne e posizionando le due estremità

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dell’introne una vicino all’altrà.


4. snRNP U4 si dissocia dal complesso e si forma un complesso di spling
attivo.
5. le snRNP nello spliceosoma tagliano l’introne dall’esone 1 in 5’ della
giunzione e l’estremità 5’ libera dell’introne si lega ad un particolare
nucleotide (spesso una A) nel punto di remificazione, così successivamente
l’introne si ripiega a laccio.
6. in seguito, l’introne viene exciso (sempre in struttura a laccio) dal taglio al
3’ e gli esoni 1 e 2 vengono uniti tra loro.

RNA RIBOSOMIALE E RIBOSOMI:


Ribosoma procariotico: dimensione 70s, è formato da due subunità di 50s e
30s.
Ribosoma eucariotico: dimensione 80s, è formato da due subunità di 60s e
40s.
Nei procarioti e negli eucarioti le regioni di DNA che contengono i geni per gli
rRNA costituiscono il DNA ribosomiale.

nei procarioti ciascuna reguine rrn contiene una copia di ciascun rRNA 16s,
23s e 5s, disposti in tale ordine. Ci sono uno o due geni per tRNA nella
sequenza spaziatrice tra la fine del gene per l’ rRNA 5s e l’estremtà terminale 3’
dell’unità trascrizionale.
Le unità trascrizionali degli rRNA vengono trascritte dell’rna polimerasi a
produrre un singolo rRNA precursore, il pre-rna 30s, che contiene la 5’ UTR, le
sequenze di rRNA 16s, 23s e 5s ciascuna separata da sezuqnze spaziatrici, e la
sequenza di coda in 3’. La molecola p30s viene tagliata dall’RNasi 3 che
produce 3 molecole percursori 16s, 23s e 5s. altri enzimi di maturazione libera i
tRNA dalle sequenze spaziatrici.
Negli eucarioti ci sono un gran numero di copie di geni per ognuno dei 4 tipi di
rRNA. I geni per gli rRNA 18s, 5,8s e 28s si trovano generalmente adiacenti
secondo quest’ordine, per formare una serie di geni in tandem detta unità
ripetuta di rDNA. Le unità ripetute di rDNA sono raggruppate nel genoma in
uno o più gruppi detti cluster, e, come risultato dell’attività di trascrizione
intorno ad essi si forma un nucleolo. All’interno del nucleolo vengono
sintetizzati gli rRNA 18s, 5,8s e 28s, che insieme all’ rRNA 5s tascritto da geni
localizzati in altre parti del menoma ed alle proteine ribosomiali formano le
subunità dei ribosomi.
Ogni unità ripetuta di rDNA eucariote è trascritta dall’RNA polimerasi 1 a dare
una molecola di pre- rRNA. Il pre- rRNA contiene le sequenze degli rRNA 18s,
5,8s e 28s le sequenze fiancheggianti e interposti: le sequenze spaziatrici.
Gli spaziatori esterni (ETS) sono localizzati a monte della sequenza 18s e
avalle della sequenza 28s. le sequenze spaziatrici interne (ITS) sono localizzate
ad entrambe le estremità del 5,8s. tra ciascuna delle unità ripetute di rDNA vi
sono sequenze spaziatrici non trascritte (NTS) che non vengono trascritte.
Nel promotore dell’rDNA delle cellule umane ci sono due domini: un elemento
core del promotore sovrapposto al punto di inizio della trascrizione e un
elemento di controllo a monte (upstream control element o UCE). Per la
trascrizione di una unità di rDNA umano, due fattori trascrizionali si legano al
promotore: l’hUBF lega i due elementi chiave del promotore e SL1 si lega al
complesso. SL1 è necessaria affinché la RNA polimerasi 1 riconosca il

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promotore e inizi la trascrizione.


Il primo taglio elimina la ETS in posizione 5’ e produce una sequenza
precursore che contiene ancora tutte e tre le sequenze di rRNA. Un secondo
taglio produce un precursore 20s della molecola 18s e un precursore 32s della
molecola 18s e 5,8s. la rimozione della sequenza ITS genera l’ rRNA 18s dal
precursore 20s. una volta assemblate le due subunità ribosomiali vengono
esportate nel citoplasma dove avviene la sintesi proteica.

LA TRASCRIZIONE DEI GENI DA PARTE DELL’RNA POLIMERASI 3


L’rna polimerasi 3 trascrive i geni per l’rRNA 5s i tRNA e alcuni geni per gli
snRNA. L’ RNA 5s si trova solo nella subunità grande del ribosoma eucariote. I
tRNA servono a portare gli amminoacidi al complesso rna-ribosoma, dove
vengono polimerizzati durante la sintesi proteica.
Ogni molecola di tRna ha una diversa sequenza nucleotidica, ma tutti hanno la
sequenza CCA all’estremità 3’. QUESTA SEQUENZA CCA è AGGIUNTA AL T-RNA
POST TRASCRIZIONALMENTE. Le differenze nella catena nucleotidica spigano la
capacità di un particolare tRNA di legare uno specifico amminoacido. Tutte le
molecole di tRNA sono modificate chimicamente in diversi punti da enzimi che
agiscono postrascrizionalmente.
La sequenza di tutti i tRNA può essere ripiegata in una struttura detta a trifoglio: la
struttura a trifoglio origina dall’appaiamento tra basi complementari in diverse
parti della molecola, che forma 4 strutture a stelo (stem) separate de 4 anse a
singola elica dette loop I, II, III, IV. L’ansa II contiene la tripletta nucleotidica
dell’anticodone, che durante la traduzione si appaia al corrispondente codone
dell’mRNA. Questo appaiamento codone-anticodone è fondamentale per
l’inserimento dell’amminoacido corretto specificato dall’mRNA nella catena
polipeptidica in crescita.
La porzione terminale 3’ che presenta la tripletta CCA è detta braccio accettare,
l’ansa I è detta D-loop perché contiene Diidrouridina, l’ansa II è quella che
contiene l’anticodone, l’ansa III è un’ansa variabile da 3 a 21 amminoacidi, l’ansa
IV è detta psi-loop perché contiene pseudouridina.
La forma a trifoglio viene ripiegata in una struttura più compatta, a forma di L
rovesciata. In questa struttura a L si trova ad una estremità la tripletta CCA dove
si lega l’amminoacido e all’altra estremità si trova l’ansa II che contiene
l’anticodone.
Il promotore dell’rna polimerasi 3 risiede all’interno del gene stesso, e tale
promotore è detto regione di controllo interna (ICR). Per l’inizio della trascrizione
da parte dell’rna polimerasi 3 prima tf3 si lega alla ICR per facilitare il legame
dell’rna polimerasi 3. le ICR dell’rDNA e del tDNA hanno ciascuna due domini
funzionali: i boxA e boxC per l’rDNA 5s e i boxA e boxB per il tDNA. Le ICR
funzionano mediante il legame con i fattori trascrizionali tf3A, tf3B e tf3C.
tf3A inizialmente si lega al boxC della ICR e questo consente il legame di tf3C alla
regione del boxA. tf3B si lega ad altri tf e non al DNA. tf3B posiziona l’rna
polimerasi 3 in modo corretto sul gene.
La terminazione della trascrizione per l’rRNA 5s, sull’elica del rDNA 5s è presente
un gruppo di 4 o più Timine circondato da una sequenza ricca in GC. Nel tDNA
invece viene utilizzato come segnale di terminazione solo una sequenza ricca in T.
La trascrizione dei geni per il tRNA produce precursori con sequenze addizionali
alle estremità che devono essere eliminate per produrre il tRNA maturo.

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 Operone LAC - E. Coli


Struttura dell’operone lac:

(promotore lacI) (lacI) -terminatore- (promotore lac+) (lac O+) (lacZ) (lacY) (lacA) -terminatore-

lacZ codifica per la beta-galattosidasi: opera la scissione del lattosio in glucosio e


galattosio e isomerizza il lattosio ad allo lattosio.
lacY codifica per la lattosio permeasi.
lacA codifica per la transacetilasi.
lacO è l’operatore cis-dominante.
lacI è il gene repressore lac.

La proteina repressore è codificata da lacI in maniera costitutiva, ma la sua


capacità di legarsi all’operatore viene compromessa in presenza dell’induttore. La
proteina repressore è un tetrametro. Il repressore si lega all’operatore lacO,
cosicché l’rna polimerasi può legarsi al promotore dell’operatore, ma non può
iniziare la trascrizione dei geni strutturali, esercitando così un controllo negativo.
Quando e.coli cresce in presenza di lattosio MA NON DI GLUCOSIO, parte del
lattosio viene convertito ad allo lattosio dalla beta-galattosidasi, il quale legandosi
a proteine repressore legate all’operatore, opera un cambiamento allosterico a
livello della proteina repressore che così si stacca dall’operatore: in assenza del
repressore l’rna polimerasi è capace di legarsi al promotore e iniziare la sintesi
dei geni lac Z, Y, A. mutazioni del gene lacO determinano che la proteina
repressore non riconosca più l’operatore, per cui i geni lacZ, Y e A possono
essere trascritti in maniera costitutiva.
REGOLAZIONE POSITIVA DELL’OPERONE LAC: avviene se nel terreno di coltura
è il lattosio è l’unica fonte di carbonio e non è presente anche il glucosio. Una
proteina cap (catabolite activator protein) si lega al cAMP a formare il complesso
CAP-cAMP. La proteina CAP è un dimero formato da 2 polipeptidi identici.
Successivamente il complesso CAP-cAMP si lega ad un sito specifico del DNA,
chiamato sito di legame del CAP, posto a monte del sito promotore. Ciò causa la
piegatura del DNA facilitando l’interazione proteina-proteina tra il dominio
attivatore del CAP e i siti bersaglio sull’rna polimerasi che porta all’attivazione
della trascrizione. In presenza di glucosio + galattosio è utilizzato preferibilmente
il glucosio per un fenomeno detto repressione da catabolita.
Questo avviene perché la presenza di glucosio mantiene basso il livello
intracellulare di cAMP. Quindi la quantità di complesso CAP-cAMP è insufficiente
per permettere alla polimerasi di legarsi al promotore dell’operone lac e la
trascrizione è significativamente abbassata ANCHE SE IL REPRESSORE VIENE
RIMOSSO DALL’OPERATORE PER LA PRESENZA DI ALLOLATTOSIO. In altre
parole l’rna polimerasi non può legarsi al promotore senza l’aiuto del complesso
CAP-cAMP. La repressione da catabolita agisce sull’adenilato ciclasi, che in e.coli
viene attivata dalla forma fosforilata di un enzima chiamato IIIglu. Quando il
glucosio è trasportato attraverso la membrana cellulare all’interno della cellula,
scatena una serie di eventi tra cui la desfoforilazione di IIIglu, per cui l’adenilato
ciclasi viene inattivata e non viene prodotto nuovo cAMP. Questo, in aggiunta alla
degradazione del cAMP ad opera della fosfodiesterasi riduce il livello di cAMP
nella cellula.

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 Organizzazione del genoma virale


A seconda del virus, il materiale genetico può essere dna a doppio filamento, dna
a singolo filamento, rna a doppio filamento, rna a singolo filamento, sia circolari
che lineari.
FAGI T-PARI: sono i batteriofagi t2 t4 e t6. tali fagi virulenti hanno struttura simile
e contengono un singolo cromosoma di dna lineare a doppio filamento circondato
da un involucro proteico. In una popolazione di cromosomi di fagi t pari le
sequenze nucleotidiche del dna sono permutazioni circolari l’una dell’altra. In
altre parole ogni cromosoma contiene lo stesso numero e la stessa sequenza di
nucleotidi, ma per ogni molecola il punto di partenza è un diverso nucleotide della
sequenza. È stato anche dimostrato che ogni molecola lineare di dna di t2 e t4 ha
la stessa sequenza nucleotidica alle due estremità della molecola: tale fattore è
detto ridondanza terminale.
Fago virulento fi 174: possiede un singolo cromosoma di 5386 nucelotidi, il
cromosoma non è a doppia elica ma a singola elica ed è resistente alla digestione
con esonucleasi.
Batteriofagi lambda: il cromosoma di lambda è costituito da dna lineare a doppia
elica con alle due estremità della molecola segmenti di 12 nucleotidi a singolo
filamento complementari tra loro. Quando un fago lambda infetta una cellula il
cromosoma lineare si converta in circolare e le sue estremità appiccicose si
legano.

 PCR
1. denaturare il dna da doppia elica a singola elica incubandolo a 94-95 °C.
raffreddare per permettere l’appaiamento dei primer tra 37 e 65°C,a seconda
del grado di omologia fra le sequenze delle basi dei primer e le sequenze
del dna. I due primer sono disegnati in modo che si appaino sui filamenti
opposti del dna stampo alle estremità delle sequenze da amplificare.
2. estendere il primer mediante dna polimerasi a 70-75°C. per questo è usata
la dna polimerasi di un batterio termofilo detto termus acquaticus, che si
chiama TAQ POLIMERASI.
3. ripetere il ciclo di riscaldamento per denaturare il dna a singole eliche e
quello di raffreddamento er associare di nuovo i primer.
4. ripetere l’estensione dei primer con la taq polimerasi.
Usando la pcr la quantità di nuovo dna prodotta è aumentata in modo geometrico.

 Penetranza – Espressività

La presenza con cui un gene dominante o omozigote recessivo si manifesta negli


individui in una popolazione si definisce PENETRANZA del gene. La penetranza
dipende sia dal genotipo sia dall’ambiente. Molti geni mostrano penetranza
completa: le coppie all’eliche degli esperimenti di mendel e gli alleli del sistema di
gruppo sanguigno ABO dell’uomo ne sono esempi. L’ESPRESSIVITà è il grado in
cui un gene o un genotipo penetrante è espresso fenotipicamente in un individuo

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 Polimeria (caratteri quantitativi, es. delle cariossidi del grano)


GENETICA QUANTITATIVA

Nella genetica classica,basata sulle leggi di Mendel, sono stati esaminati dei
caratteri che presentano una correlazione semplice tra il genotipo e il
fenotipo;questi caratteri sono osservabili dal fenotipo e da questo si può risalire
al genotipo.Talvolta un fenotipo può essere il risultato dell’interazione di diversi
genotipi ma si tratta comunque di una relazione semplice tra i geni ed il
carattere.Tali caratteri possono essere descritti qualitativamente e vengono detti
caratteri qualitativi.Possono anche essere chiamati caratteri discontinui perché
presentano pochi fenotipi distinti.Ma la maggior parte dei caratteri non mostra una
relazione così semplice tra genotipo e fenotipo.Spesso presentano una
distribuzione continua dei fenotipi e per questo vengono chiamati caratteri
continui.Dato che questi fenotipi sono misurabili quantitativamente, tali caratteri
sono anche detti caratteri quantitativi.Fenotipi multipli possono manifestarsi, per
esempio quando il carattere è influenzato da più loci.Maggiore è il numero dei loci
che controllano un carattere,molto più grande sarà il numero dei genotipi.Questi
caratteri prendono il nome di caratteri poligenici.Una variabilità dei fenotipi
dipende anche da fattori ambientali. L’ambiente può incidere su individui che
hanno uno stesso genotipo,producendo una gamma di fenotipi.Questo fenomeno
è detto norma di reazione. Quindi,quando un particolare carattere,nelle sua
manifestazione fenotipica,è influenzato sia da genotipi multipli che da fattori
ambientali,viene detto multifattoriale.
La lunghezza della spiga del mais è un tipo di eredità quantitativa. Emerson ed
East incrociarono tra loro due linee pure di piante che avevano un’altezza media
rispettivamente di 16 e 6 cm.Anche nell’ambito delle linee pure gli individui non
presentano caratteristiche identiche ma c’è una certa variabilità,verosimilmente
dovuta a fattori ambientali.Le piante della generazione F1 avevano una lunghezza
media di 12 cm;nella F2 la lunghezza media era la stessa,cioè 12 cm,ma la
variabilità tra le altezze delle spighe era molto più ampia;questo portò a ipotizzare
che tale carattere fosse controllato da più di una gene.Questa ipotesi è detta
ipotesi poligenica dell’eredità quantitativa ed è stata sostenuta da molti
esperimenti.Un carattere quantitativo che è stato studiato è il colore della
cariosside di grano.Furono incrociate linee pure con cariossidi rosse e linee pure
con cariossidi bianche.La F1 presentava piante che avevano le cariossidi di un
colore intermedio fra il rosso e il bianco.Le piante F1 furono autofecondate e
diedero origine alla progenie F2:questo mostrò un rapporto insolito 1:4:6:4:1 tra le
diverse sfumature del rosso (rosso scuro,rosso brillante,rosso medio e rosso
chiaro) e bianco.Questi risultati portarono ad ipotizzare che i loci coinvolti nella
produzione di pigmento fossero due chiamati C ed R. Secondo questa ipotesi,gli
alleli dominanti portavano a produrre ciascuno una certa dose di pigmento mentre
gli alleli recessivi si esprimevano con l’assenza di pigmento. Così i genotipi
CCRR,i cui 4 alleli producevano tutti pigmento,manifestavano fenotipo rosso
scuro;CcRR o CCRr,con tre alleli che producevano pigmento davano fenotipo
rosso brillante;e così via,fino al genotipo ccrr che non producendo alcun tipo di
pigmento davano fenotipo bianco.Questo è un esempio di carattere influenzato da
più coppie all’eliche ad effetto additivo,che vengono chiamati poligeni.
Anche il colore della pelle nel mulatto è un carattere codificato da più geni:in un
incrocio bianco-negro i bambini F1 avranno lo stesso colore della pelle

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intermedio;la F2 presenterà una maggiore variabilità di colore,dovuta al fatto che


diverse coppie all’eliche,con effetto additivo,contribuiscano alla pigmentazione
della pelle.Questo fenomeno,in cui il fenotipo è il risultato dell’espressione sia
degli alleli dominanti che di quelli recessivi è detto polimeria.
La differenza tra dominanza incompleta e polimeria è che nella dominanza
incompleta,l’allele dominante non riesce ad esprimersi del tutto in un
eterozigote.Il fenotipo sarà intermedio,ma sarà un solo tipo di intermedio,non
avremo altre gradazioni.Nel caso della polimeria,gli alleli di ciascuno dei geni
coinvolti si esprimono entrambi,ma il recessivo in misura minore;in base alle
combinazioni all’eliche che possiamo trovare nei poligoni avremo tantissime
gradazioni fenotipiche.
La pleiotropia è il fenomeno opposto alla polimeria:nella polimeria,un carattere è
controllato da più geni;nella pleiotropia,ogni gene è responsabile di più
caratteri:in questo caso,caratteri controllati dagli stessi geni,sono detti correlati,in
quanto spesso si presentano assieme nello stesso individuo (ad esempio, capelli
chiari ed occhi azzurri).

 Possibilità o meno del crossing-over (frequenza di


ricombinazione)
Quanto più due geni sono vicini su un cromosoma tanto meno è probabile il
crossing –over (si abbassa la frequenza di ricombinazione che è funzione della
distanza in unità di mappa, o centiMorgan).

 Prioni
Il prione si trova sulla membrana di tutte le cellule del sistema nervoso ed ha
funzioni recettoriali: PRPsc (prione dello scrapie -> patologico), PRPc (prione
normale). I due tipi di prione sono uguali tranne che per il fatto che:
1. il PRPc è sensibile alle protein kinasi mentre il PRPsc no.
2. il PRPc ha struttura ad alfa-elica, il PRPsc a beta-foglietto.
I prioni sono organizzati in fibrille e sostanze amiloidi. Le malattie da
degenerazioni amiloidi sono fisiologiche col progredire dell’età, perché sui
neuroni le proteine vanno incontro ad usura, e devono essere sostituite attraverso
il PROTEIN TRAFFIC: endocitosi delle proteine di membrana , degradazione da
parte delle protein kinas, risintesi ed esocitosi per riesposizione sulla membrana.
Se il prione diventa da alfa elica a beta foglietto non potrà più essere degradato
dalle protein kinasi e si accumulerà all’interna della cellula dopo endocitosi: verrà
così bloccato il protein traffic.
MECCANISMO DI TRASMISSIONE DEI PRIONI: entra in gioco un virus endogeno
che fa cambiare la conformazione da alfa a beta. L’inattivazione temporanea delle
cellule dendritiche follicolari ritarda la neuroinvasione da prioni. Appare chiaro
che le cellule dendritiche follicolari sono i vettori attraverso i quali i prioni si
trasmettono.

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 Proteina p53
Il gene soppressore di tumori p53 codifica per la proteina p53. mutazioni in
entrambi gli alleli per p53 sono coinvolte in circa il 50% dei cancri umani. Il gene
p53 si trova sul cromosoma 17. individui che ereditano una copia mutata del gene
p53 sviluppano la sindrome di Li-Fraumeni. La proteina selvatica p53, in caso di
danni al DNA, si lega al dna e funge da fattore trascrizionale. Tra i molti geni ai
quali si lega c’è il gene WAF1 che codifica per la proteina p21. la proteina p21 si
lega al complesso cdk-ciclina e blocca la cellula in fase g1. se il danneggiamento
del dna è troppo esteso e non può essere riparato la cellula muore per apoptosi.
Le cellule con alleli p53 mutati non bloccano il ciclo cellulare in seguito a
danneggiamento del dna proprio per la mancanza di proteine p53 e non si
instaura apoptosi. Il fatto che le cellule con dna danneggiato procedano nel ciclo
cellulare porta all’accumulo nelle cellule di danni genetici e all’aumento della
probabilità di insorgenza di neoplasie.

 Qual'è la cromatina che può essere trascritta?


L’eucromatina non è addensata e quindi è trascrizionalemte attiva, mentre
l’eterocromatina è addensata ed è composto pressoché totalmente da sequenze
ripetute ed è trascrizionalemte inattiva.

 Qual'è la frequenza massima di ricombinazione?


50%

 Qual'è la sequenza di Shine-Dalgarno?


Il codone d’inizio AUG da solo non è sufficiente come segnale di legame del
ribosoma all’mRNA, ma è richiesta una sequenza a monte (al 5’ della sequenza
leader dell’mRNA) del codone di inizio AUG. Esiste infatti una regione posta a
circa 8-12 nucleotidi a monte del codone di inizio, ricca in purine denominata
SEQUENZA DI SHINE-DALGARNO (AGGAGG) che è complementare ad una
sequenza ricca in pirimidine posta al 3’ terminale della subunità 16s: in tal modo il
ribosoma può posizionarsi correttamente sull’ mRNA.

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 Quali fattori intervengono nel processo di allungamento della


traduzione?
Fase dell’allungamento: all’inizio l’anticodone dell’fMet-tRNA è unito mediante
legami H al codone d’inizio AUG nel sito peptidilico del ribosoma. Il codone
successivo dell’mRNA si trova nel sito A. poi l’amminoacil-tRNA appropriato si
lega al codone esposto nel sito A ribosomiale. Tale amminoacil-tRNA viene
trasportato al ribosoma legato al fattore di allungamento EF-tu e ad un GTP.
Quando l’amminoacil-tRNA viene legato al sito A, viene idrolizzato il GTP il fattore
EF-tu viene rilasciato insieme al GDP. L’EF-tu viene rilasciato legato al GDP, e poi
viene riciclato per altri eventi di allungamento. Dapprima un secondo fattore di
allungamento, detto EF-ts si lega ad EF-tu sposta il GDP che è stato idrolizzato,in
seguito il GTP si lega al complesso EF-tu-EF-Ts per generare un complesso EF-tu-
GTP con rilascio simultaneo di EF-ts. Un amminoacil-tRNA si lega al complesso
EF-tu-GTP e quest’ultimo complesso può allora legarsi al sito A del ribosoma. La
peptidil-transferasi è coinvolta nel processo di allungamento della catena
peptidica in crescita nella traduzione. In particolare è responsabile della
formazione del legame peptidico fra la formil-metionina (o un qualunque altro
amminoacido) presente nel sito P del ribosoma (ovviamente dopo rottura del
legame tra l’amminoacido e il suo tRNA presente nel sito P) e il nuovo
amminoacido portato dal nuovo tRNA nel sito A. dalle ultime ricerche appare che
la subunità 23s del ribosoma è quella responsabile di tale attivita peptil-
transferasica. Una volta formato il legame peptidico, sul sito P rimane un tRNA
privo del proprioamminoacido (tRNA scarico), mentre il tRNA sul sito A (dettto
peptidil-tRNA) è attaccato ai primi due amminoacidi della catena polipeptidica.

 Schaffold proteico
È la struttura proteica su cui avviene il superavvolgimento del DNA.

 Segregazione
Il principio della segregazione di mendel afferma che: i caratteri recessivi,
mascherati alla f1 di un incrocio fra due linee pure, ricompaiono alla f2 in
proporzioni definite. Questo significa che i due membri di una coppia all’elica
segregano (si separano) l’uno dall’altro durante la formazione dei gameti. La
segregazione dei geni quindi va di pari passo con la segregazione delle paia di
cromosomi omologhi all’anafase 1 della meiosi.

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 Senquenze palindromiche
Le seuquenze palindromiche si trovano nei terminatori rho indipendenti, che sono
costituiti appunto da sequenze con simmetria bipartita seguite da una sequenza di
A e T che nel trascritto daranno origine ad una serie di U. Tale struttura a
simmetria bipartita crea una struttura a forcina che destabilizza così la rna
polimerasi dall’elica di dna. Inoltre si trovano nei cromosomi dei battriofegi t pari
che hanno ridondanza terminale.

 Sito cos del concatamero (struttura, posizione e funzioni)


il fago lambda è un fago temperato e ciò significa che, quando esso infetta E.coli
ha la possibilità di attuare o il ciclo litico, che porta alla lisi della cellula, o al ciclo
lidogenico, uno stadio quiescente in cui il fago non si riproduce. I primo
passaggio dopo l’infezione è la conversione della molecola di DNA lineare in una
di DNA circolare, attraverso l’appaiamento delle sequenze terminali dette
sequenze cos. Nel ciclo lisogenico il DNA circolare attraverso un evento di
crossino over si integra nel DNA del cromosoma batterico. Nel ciclo litico il
meccanismo di replicazione a cerchio rotante produce una molecola di DNA molto
lunga, costituita da copie del cromosoma lambda legate fra di loro unendo testa e
coda di due copie del menoma successive. Questa molecola di DNA costituita da
più copie di menoma del fago in serie è detta CONCATAMERO. Nel cromosoma di
lambda c’è il gene ter, il cui prodotto genico è una DNA endonucleasi, e questa
endonucleasi riconosce la sequenza cos e produce un taglio asimmetrico in
corrispondenza di ciascun sito cos. In questo modo sono prodotti i cromosomi di
lambda provvisti di estremità appiccicose, che verranno poi impaccati nelle teste
del fago assemblate.

 STR - VNTR - RFLP – SNP


Per la mappatura del menoma umano sono usati 4 tipi principali di marcatori di
dna:
1. RFLP: (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms). Sono polimorfismi di
lunghezza di frammenti di dna prodotti per taglio con enzimi di restrizione.
Un RFLP deriva da una mutazione a carico di una coppia di basi che
determina la perdita o l’acquisto di un sito di restrizione. Considerando le
varie fasi del metodo di rilevamento di un RFLP, si isola dna gnomico, che
viene digerito con un enzima di restrizione, e i frammenti che sono generati
dal taglio enzimatico sono separati per elettroforesi su gel e trasferiti
mediante Southern blotting su una membrana. Il filtro viene ibridato con
dna marcato, derivato da una regione cromosomica che mostra
polimorfismo. Per autoradiografia gli omozigoti mostrano una singola
banda di ibridazione, gli eterozigoti due.
2. VNTR: (variable number of tandem repeats). È chiamato anche minisatellite.
Come suggerisce il nome, i VNTR contengono un numero di sequenze
ripetute in tandem, il numero delle quali varia a seconda dell’allele del
VNTR. Gli alleli VNTR possono essere distinti per digestione con enzimi di

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restrizione che riconoscono i siti che fiancheggiano il VNTR, separando i


frammenti prodotti per elettroforesi su gel, facendo un classico
esperimento di southern blotting e ibridando con un frammento marcato di
dna che contiene copie della sequenza ripetuta nel VNTR. La sonda per il
tipo di VNTR unici è detta sonda monolocus, mentre la sonda dei VNTR
ripetuti è detta sonda multiloci.
3. STR: (short tandem repeats). Sono dette anche sequenze microsatelliti. Le
STR contengono un numero variabile di sequenze ripetute in tandem, e, in
loci specifici, tendono a essere molto polimorfiche. Nel caso delle STR la
ripetizione è breve. Gli alleli delle STR possono essere tipizzati per
ibridazione o mediante PCR.
4. SNP: (single nucleotide polymorphisms). Sono polimorfismi di singoli
nucleotidi nella sequenza del menoma. Se la variante meno comune ha una
fraquenza nella popolazione umana di almeno 1%, la posizione del genoma
di quella base è definita come un sito che contiene un SNP. Gli alleli d un
SNP possono essere facilmente tipizzati mediante analisidi ibridazione con
oligonucleotidi. Secondo questo metodo, di sintetizza un corto
oligonucleotide che è complementare all’allele comune al locus SNP.
L’oligonucleotide è mescolato con il dna da analizzare e viene fatta
un’ibridazione ad alta stringenza, cioè in condizioni che favoriscono
soltanto l’appaiamento perfetto tra sonda (l’oligonucleotide) e il dna
bersaglio. Si ha ibridazione solo se il dna bersaglio porta lo stesso allele
dell’oligonucleotide. Nelle stesse condizioni di alta stringenza
l’oligonucleotide non ibriderà con un dna bersaglio che ha un’unica coppia
di basi cambiata, cioè un SNP. Questo rappresenta un altro esempio
dell’ibridazione definita ASO: allele-specific oligonucleotide.

 Superavvolgimento del DNA


Cinque tipi di istoni sono associati al dna eucariote: h1, h2a, h2b, h3 e h4. le
proteine non istoniche sono tutte le proteine associate al dna tranne gli istoni.
Molte proteine non istoniche sono proteine acide con una netta carica negativa e
si legano nella cromatina probabilmente agli istoni carichi positivamente. Tra
queste proteine non istoniche c’è la proteina HMG, che si legano generalmente al
solco minore del dna incurvandolo. Il ripiegamento del dna è una tappa
fondamentale nella formazione di strutture di ordine superiore della cromatina. Gli
istoni svolgono un ruolo cruciale nell’impacchettamento della cromatina.
Il primo livello di impacchettamento implica l’avvolgimento del dna attorno ad un
nucleo di istoni, con formazione della struttura detta nucleosoma. Gli istoni h2a,
h2b, h3 e h4 si organizzano in un ottametro attorno a cui si avvolge il dna per un
giro e ¾. I singoli nucleosomi sono connessi da filamenti di dna linker e da
molecole di istone h1. le strutture così risultanti possono essere osservate come
fibre di cromatina da 10 nm. I nucleosomi possono associarsi fra loro a formare
una fibra da 30 nm. Il livello successivo di spiralizzazione prevede la formazione
di domini ad ansa. I domini ad ansa si estendono formando un angolo con l’asse
principale del cromosoma , e sono ancorati ad un’intelaiatura strutturale
filamentosa all’interno della membrana nucleare detta matrice nucleare. Le
sequenze di dna associate alle proteine nella matrice sono definite MAR.

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 Test basati sull'analisi RFLP


Una mutazione associata ad una malattia genetica può causare la perdita o
l’acquisizione di un sito di restrizione nel gene o in una regione fiancheggiante. In
pratica, nel menoma umano e in quello di altri eucarioti, si possono trovare mappe
di restrizione diverse in individui diversi in relazione alle stesse regioni
cromosomiche. I profili di restrizione diversi producono quelli che sono chiamati
RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms), cioè polimorfismi di
lunghezza dei frammenti di dna ottenuti per taglio con enzimi di restrizione. Un
RFLP può essere visto come presenza di frammenti di restrizione di diversa
lunghezza sul gel di poliacrilammide dopo elettroforesi. Una mappa di restrizione
è indipendente dalla funzione genica, quindi un RFLP si può ritrovare anche se il
cambiamento nella sequenza di dna responsabile non dà luogo ad un fenotipo
distinguibile. Inoltre, siccome si analizza direttamente il dna, entrambi i tipi
parentali sono visti negli eterozigoti e si possono facilmente identificare i
portatori.

 Test-cross (reincrocio)
Un modo più usato per accertare il genotipo sconosciuto di un organismo è quello
di effettuare un reincrocio, vale a dire un incrocio fra un individuo di genotipo
ignoto e un individuo omozigote recessivo. Mendel fu il primo ad effettuare tale
test-cross:
Se la pianta con genotipo ignoto è SS, allora produrrà solo gameti S, mentre la
pianta omozigote recessiva ss produrrà solo gameti s: ne risulta che dal loro
incrocio deriveranno solo eterozigoti Ss che manifesteranno il fenotipo
dominante.
Se la pianta con genotipo ignoto è Ss, allora produrrà metà gameti S e metà
gameti s, mentre come prima la pianta omozigote recessiva ss produrrà solo
gameti s: dall’incrocio deriveranno metà piante con genotipo eterozigote Ss
(fenotipo dominante) e metà piante omozigoti recessive ss (fenotipo recessivo).

 Vettori di clonazione (plasmidi,cosmidi e differenze)


Diversi tipi di vettori vengono usati per clonare il dna. Ogni tipo è diverso per le
proprietà molecolari e per la dimensione massima del dna che può essere clonata
usandolo.
VETTORI DI CLONAZIONE PLASMIDICI: i plasmidi batterici sono elementi circolari
extracromosomici che si replicano autonomamente all’interno delle cellule. I
vettori di clonazione plasmidici sono tutti derivati da plasmidi trovati in natura che
sono stati ingegnerizzati in modo da avere le caratteristiche che facilitano la
clonazione dei geni. Un vettore plasmidico di e.coli deve avere 3 caratteristiche:
1) una sequenza di origine ori, necessaria affinché il plasmide si replichi in
e.coli.
2) un marcatore selettivo dominante, che, mediante la sua espressione, renda
le cellule di e coli che contengono il plasmide facilmente identificabili dalle
altre cellule che non lo contengono. Il marcatore selettivo dominante usuale
è un gene che conferisce un fenotipo di resistenza all’ospite e coli, per

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esempio il gene ampR per la resistenza all’ampicillina o gene tetR per la


resistenza alla tetraciclina. Si possono individuare perciò le cellule che
hanno incorporato il plasmide da quelle che non lo hanno incorporato
facendo crescere colonie di e coli su un terreno addizionato con quel
particolare antibiotico la cui resistenza è permessa dal plasmide
internalizzato: le cellule che resisteranno saranno quelle che hanno
internalizzato il plasmide.
3) Siti unici di taglio per enzimi di restrizione – siti presenti una sola colta nel
vettore – per l’inserzione delle sequenze di dna da clonare. La clonazione
richiede il taglio del plasmide ad uno dei siti unici con l’enzima di
restrizione appropriato e l’inserimento in quel punto di un frammento di dna
esogeno che sia stato tagliato con lo stesso enzima di restrizione, affinché
entrambi i frammenti abbiano le estremità appiccicose complementari.
Il vettore di clonazione plasmidico pUC19, ha le seguenti caratteristiche che lo
rendono utile per la clonazione di dna in e coli:
1) Ha un alto numero di copie.
2) Ha il marcatore selettivo ampR.
3) Contiene molti siti unici di restrizione raccolti in una regione, chiamata
polylinker o sito di clonazione multiplo. Il polylinker è inserito all’interno del
gene per la b-galattosidasi di e coli (lacZ). L’inserzione è stata fatta in modo
tale che di produca b-galattosidasi funzionale solo quando pUC19 viene
introdotto in una cellula mutatane lacZ-, che fa beta-galattosidasi non
funzionale. Inoltre quando un pezzo di dna viene introdotto nel polylinker, il
codice di lettura per la b-galattosidasi viene interrotto e non può essere
prodotta b-galattosidasi funzionale in e coli. Al terreno di coltura delle
cellule si aggiunge il composto chimico x-gal, per verificare che se una
colonia produce b-galattosidasi risulterà bianca, altrimenti risulterà blu:
ovviamente le colonie bianche NON avranno internalizzato il plasmide
pUC19, quelle blu si.
La trasformazione (introduzione del dna esogeno plasmidico all’interno del
menoma batterico) si attua mediante taglio con LO STESSO ENZIMA DI
RESTRIZIONE sia del vettore plasmidico che del dna cellulare, poi tramite una
tecnica detta ELETTROPORAZIONE si dà uno shock elettrico alla cellula che
temporaneamente disorganizza la membrana e permette l’ingresso di dna
esogeno. Il dna esogeno e quello endogeno POSSONO (non devono) a questo
punto ricombinare. Per verificarlo si usa il saggio bianco-blu dell’x-al esposto
prima. I vettori di clonazione plasmidici permettono di clonare efficacemente in e
coli frammenti di dna esogeno di massimo 5-10 kb.

Vettori di clonazione basati sul batteriofago lambda: i vetori di clonazione basati


sul batteriofago lambda sono stati manipolati in modo che sia possibile il ciclo
litico, ma non quello lisogenico. Il vettore lambda ha un cromosoma in cui
esistono un braccio destro e uno sinistro, che contengono tutti i geni essenziali
per il ciclo litico. Fra i due bracci si trova n frammento di dna non essenziale per il
ciclo litico. Le giunzioni fra il frammento centrale non indispensabile e i due
bracci hanno ciascuna un sito di taglio per un enzima di restrizione, in questo
caso ecoR1. Prima il vettore lambda veiene tagliato, in questo caso con ecoR1,
per separare e purificare i due bracci dal frammento non indispensabile centrale.
Successivamente si taglia il dna da clonare con lo stesso enzima di restrizione
per generare i frammenti da inserire. I frammenti di dna estraneo vengono poi

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mescolati con i frammenti di dna di lambda e i pezzi vengono legati dalla dna
ligasi. Il dna ligato viene mescolato in vitro con le diverse parti proteiche del fago
lambda, dando come risultato l’inserzione del dna nella teste del fago e la
produzione di particelle virali complete: questo processo è detto packaging
(impacchettamento). La teste del fago può accogliere frammenti di dna di
dimensioni comprese fra 37 e 52 kb. Con le particelle fagiche una volta ssemblate
si infetta una coltura di e coli: soltato quei fagi in cui tra i bracci destro e sinistro
si sia inserito dna estraneo sono in grado di replicarsi, perché solo in questo caso
sono presenti sono presenti tutti i geni necessari per la riproduzione del fago. In
questo modo , ciascun frammento di dna viene clonato per i ripetuti turni di lisi ed
infezione a cui va incontro ciascuno dei fagi funzionali originali. Ad un certo
punto, la coltura diventa trasparente perché tutti i batteri sono stati lisati e si è
prodotta una popolazione di progenie di fagi lambda contenenti le molecole di dna
ricombinante.

VETTORI DI CLONAZIONE COSMIDICI: frammenti di dna di circa 45 kb possono


essere clonati in vettori chiamati cosmici. I cosmici non si trovano in natura, ma
sono stati costruiti combinando caratteristiche dei plasmidi e dei fagi lambda. Un
cosmide ha una sequenza ori per permettere la sua replicazione in e coli, un
marcatore selettivo dominante come ampR e siti di restrizione unici per
l’inserzione e la clonazione di frammenti di dna. Inoltre, i cosmidi hanno un sito
cos derivato dal fago lambda. I siti cos dei cosmidi permettono
l’impacchettamento di dna in una particella lambda, che facilita l’introduzione di
molecole grandi di dna nelle cellule batteriche. Quando un frammento di dna di
32-47 kb viene clonato in tale cosmide, la molecola ricombinante ha la giusta
dimensione per venire impaccata in una testa di fago. Il fago viene poiusato per
introdurre la molecola di dna ricombinante in una cellula ospite di e coli, dove si
replica come un plasmide.

VETTORI NAVETTA: sono vettori che possiedono due o più organismi diversi
come ospiti.

CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO (YAC): sono vettori di clonazione che


permettono di produrre cromosomi artificiali e di clonarli in cellule di lievito. Gli
YAC sono vettori lineari con le seguenti caratteristiche:
1) Un telomero di lievito (TEL) a ciascuna estremità.
2) Una sequenza centromerica di lievito (CEN).
3) Un marcatore selettivo su ciascun braccio per visualizzare il plasmide in
lievito (ad esempio TRP1 ed URA3, che danno rispettivamente indipendenza
nutrizionale da triptofano ed gracile quando inseriti in ceppi mutati difettivi
trp1 e ura3).
4) Una sequenza di origine di replicazione ARS, che permette al vettore di
replicarsi autonomamente in una cellula di lievito.
5) Siti di restrizione unici da usare per inserire dna esogeno.
Tali vettori vengono utilizzati per clonare frammenti di dna fino a 500 kb. I cloni
YAC vengono costruiti legando pezzi di dna ad alto peso molecolare a bracci di
YAC generati tagliando nel sito di clonazione con un enzima di restrizione. I cloni
vengono poi introdotti in lievito per trasformazione. Selezionando sia per TRP1
che per URA3 ci si assicura che il clone abbia sia il braccio destro che il bracco
sinistro del vettore YAC.

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CROMOSOMI ARTIFICIALI BATTERICI (BAC): vengono usati per clonare grandi


frammenti di dna fino a 200 kb in e coli. I BAC sono vettori che contengono
l’origine di replicazione di un plasmide naturale detto fattore F, un sito di
clonazione multiplo, un marcatore selezionabile e spesso alcune altre
caratteristiche.

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