Biologia e Genetica

2 marzo 2011 [ 2 ora]

Maria Vittoria
Quindi, cos' possibile fare oggi con le conoscenze del progetto genoma? Lo
studio del trascrittoma, ovvero di tutto ci che viene trascritto dal DNA (RNA
messaggero, RNA transfert, RNA ribosomiali e tutti quei piccoli RNA non
codificanti che abbiamo nominato prima). Lo studio del trascrittoma serve per
vedere quali geni sono espressi in un contesto cellulare piuttosto che un altro, per
esempio quali geni sono espressi nei linfociti normali rispetto ai linfociti di una
leucemia. Confrontando i due trascrittomi si possono valutare le differenze di
espressione genica dovute alla malattia. Questo molto informativo, perch con
le tecnologie post genomiche si pu valutare contemporaneamente l'espressione
di tutti i geni che abbiamo descritto prima, i 25000 geni presenti sul genoma
umano (mentre prima si poteva guardare l'espressione solo di due o tre geni
isolati).
Lo studio del trascrittoma si pu fare perch conosciamo le sequenze di tutti i
geni e quindi anche del DNA che li codifica. Si utilizza un microchip di silicio su
cui, da un apposita ditta, vengono immobilizzate delle sonde complementari
all'RNA di tutti i geni finora sequenziati. Se questo chip fatto in questo modo viene
messo a contatto con l'RNA cellulare totale, che contiene tutti gli RNA di una
determinata popolazione (ad esempio i linfociti T), dai tipi di segnali ottenuti dopo
l'ibridizzazione si riesce a capire quali geni sono espressi, quando sono espressi e
quali sono spenti (in quella popolazione di linfociti T). Se si fa la stessa cosa,
ibridizzando su un altro chip l'RNA totale dei linfociti T di una leucemia, si riesce a
capire la differenza dell'espressione genica fra le due popolazioni analizzate
(attraverso l'uso di programmi bioinformatici che permettono di confrontare
decine di migliaia di geni). E' una tecnica un po' difficile, in sintesi si usano delle
sonde complementari a tutti gli RNA di una cellula, che vengono ibridizzati all'RNA
di una popolazione cellulare e solo gli RNA espressi daranno un determinato
segnale. Da qua si pu arrivare a definire il cosiddetto "profilo di espressione
genica" di tutto il trascrittoma e quindi confrontare, a livello molto complesso ma
completamente informativo, il trascrittoma di due cellule che sono diverse perche
una normale e una neoplastica.
Questa tecnologia, oltre che permettere il confronto dei trascrittomi di cellule
normali e neoplastiche, permette di confrontare il trascrittoma di molti altri tipi
cellulari: cellula in ciclo vs cellula non in ciclo; cellule vitali vs cellule in apoptosi
(quindi studio dei meccanismi che regolano l'apopotosi, fenotipizzando dal punto
di vista molecolare cellule vitali e cellule in apoptosi); cellule non trattate con un
farmaco vs cellule trattate con lo stesso farmaco (quindi studio dei geni di
risposta a molti farmaci - il farmaco attiver o inibir l'espressione di certi geni).
Insomma attraverso questa tecnologia si possono studiare dei processi anche
molto complessi, perch abbiamo la possibilit di monitorare
contemporaneamente l'espressione simultanea di decine di migliaia di geni. E
allo stesso modo possibile monitorare tutte le proteine espresse da una cellula
con lo studio del proteoma.
La diagnostica molecolare una nuova branca della medicina che si basa sulla
diagnosi fatta con metodi molecolari (tali "metodi molecolari" saranno
argomento del corso di Metodologie scientifiche di base del prossimo anno). A
livello generale, la diagnostica molecolare si fa con metodi molecolari,
essenzialmente con il sequenziamento di geni per evidenziare le loro alterazioni.

Esempi di geni sequenziati usualmente per fare i test genetici, ovvero per vedere
se una persona predisposta o no a certi tipi di cancro:
1.
Cancro alla mammella - BRCA1 e BRCA2;
2.
Cancro al colon - MSH1 e MSH2;
3.
Iperlipidemia familiare - RLDL (recettore delle LDL).
1.

BRCA 1 e 2 sono geni che sono stati trovati alterati in alcune forme familiari di
cancro alla mammella - esistono tanti tipi di cancro alla mammella, dal momento
che la causa principale di morte per le donne, un tipo di tumore molto
studiato. E' importante individuare quelle persone che hanno una predisposizione
genetica alla malattia, al fine di introdurle in un programma di controllo molto
stretto che permetta di fare una diagnosi precoce (che per le malattie tumorali
essenziale per una buona prognosi). Alcune famiglie hanno questa mutazione, in
particolare l'alterazione della sequenza di questi geni alla base di
manifestazione di tumore alla mammella, tumore all'ovaio, tumore bilaterale alla
mammella. Nelle famiglie in cui c' una frequenza molto alta di questi tumori( per
esempio ci sono pi di due parenti di primo grado affetti) si consiglia di fare un
test genetico, che consiste nel prelievo di DNA da cellule, ad esempio del sangue,
per fare un sequenziale nei punti di BRCA 1 e 2 ed eventualmente evidenziare una
mutazione. Se questi geni risultano mutati, la persona verr inserita in un
programma di controllo molto pi stretto di quello abituale. Questi tumori si
presentano anche molto precocemente in donne al di sotto dei 40 perch c' una
forte predisposizione genetica; se una donna, dopo i 40 anni, per la prevenzione
del carcinoma alla mammella deve fare la mammografia una volta all'anno, le
persone che hanno questa mutazione devono fare mammografie ogni 6 mesi,
risonanza magnetica ogni 3 mesi ecografie...insomma, un programma di
prevenzione molto molto pi stretto.
- Ehi, c' anche il cancro alla mammella maschile eh, BRCA 2! Molto pi raro
perch noi donne siamo sempre pi sfigate. Il programma di prevenzione pi stretto finalizzato ad evidenziare precocemente
un tumore nei primi stradi, quindi asportarlo e applicare le strategie terapeutiche
del caso. Queste sono le linee guida di Modena. Per in America, ad esempio,
viene consigliato a chi risulta mutato per i geni BRCA 1 e 2 di asportare entrambe
le mammelle anche se sane, a volte di asportare anche le ovaie. Si tratta di una
strategia molto radicale.
In questo caso il gene un gene che combatte il cancro e la sua mutazione lo
disattiva, perci eventualmente andrebbe riattivato, ma in questo momento non
ancora possibile farlo. Questa una mutazione germinale, che stata ereditata
dalla madre o dal padre e predispone tutto l'organismo al cancro - in questo caso
al cancro alla mammella - ma la mutazione ovviamente presente in tutte le
cellule. Ci possono essere anche mutazioni somatiche che insorgono a causa di
agenti esterni. Le cause delle mutazioni nel DNA sono essenzialmente:
esposizione ai cancerogeni ambientali ( sostanze chimiche, radiazioni ionizzanti
come raggi x e raggi uv)
sistemi intrinseci alla cellula, per esempio la DNA polimerasi e i sistemi di riparo
del DNA.
Tutte le volte che la DNA polimerasi trascrive il DNA durante la fase S del ciclo
cellulare, fa degli errori che dovrebbero essere corretti dal sistemi di riparo del
DNA. Tuttavia anche questi sistemi non sono pienamente efficienti, quindi a ogni
replicazione si pu formare una serie di mutazioni che se non vengono corrette
possono trasformare la cellula.
I sistemi di riparo del DNA, quando cercano di correggere le mutazioni, possono
sbagliare e causare la formazione delle cosiddette " traslocazioni" . La
traslocazione uno scambio di un pezzo di DNA da un cromosoma ad un altro. Ci

sono dei siti nel DNA, chiamati "siti fragili", in cui avvengono delle rotture del
filamento del DNA (si sta ancora indagando sule perch avvengano queste rotture
cromosomiche); se si rompono due cromosomi contemporaneamente, pu
succedere che i sistemi di riparo li riattacchino scambiando i pezzi, saldando i
pezzi nel cromosoma sbagliato. Lo scambio tra i due cromosomi non indolore,
perch le traslocazioni causano lo spostamento di alcuni geni che vanno ad
essere sotto la regolazione di promotori diversi da quelli fisiologici.
2.

Un altro test genetico eseguito a Modena riguarda questi i geni MSH 1 e MSH 2,
che predispongono per il carcinoma del colon, dell'utero e dell'uretra. Se questi
due geni risultano alterati, si introduce la persona in un progetto di screening
molto accurato, che prevede colonscopie molto ravvicinate, tac, uteroscopie nelle
femmine, sempre allo scopo di fare diagnosi precoce.

3.

La terza sigla significa recettore dell'LDL. Le LDL sono quelle lipoproteine che
trasportano il colesterolo al fegato. LDL - R il recettore delle lipoproteine sul
fegato, il recettore quella molecola che si lega a un determinato ligando. Il
ligando sono le LDL. Se gli epatociti hanno il recettore per le LDL, esse vengono
internalizzate tramite un meccanismo che si chiama endocitosi mediata da
recettore, il colesterolo viene de-esterificato e utilizzato dal fegato ( che uno
degli organi che principalmente deposita il colesterolo). Se invece abbiamo una
mutazione del recettore delle LDL , l'LDL non si riescono a legare,non possono
venire internalizzate, rimangono nel sangue e di conseguenza aumenta tantissimo
il livello di colesterolo nel sangue, dando origine a una malattia genetica che si
chiama Ipercolesterolemia famigliare. E' una malattia a trasmissione dominante,
quindi basta che uno solo dei due alleli sia malato che si manifesta un fenotipo. Le
persone affette hanno valori di colesterolo altissimi (valore normale di colesterolo
al massimo 200 mg/dl di sangue), dai 600 a 1000 nei casi pi gravi. Questo
comporta che il colesterolo si depositi nelle arterie, formi le placche
aterosclerotiche, le quali predispongono al restringimento dei vasi, anche cardiaci
e cerebrali, quindi al rischio di infarto o ictus. Quindi anche in questo caso sapere
se si ha la mutazione molto importante, perch si pu agire con la terapia
farmacologica che abbassa i livelli di colesterolo agendo sugli enzimi della sintesi
del colesterolo (anche con lo stile di vita e la dieta, ma se uno ha
l'ipercolesterolemia famigliare pu bere tutti i danacol che vuole che non succede
niente - pu farsi venire la dissenteria con due litri di danacol che non
sufficiente) .
Come vedete molto importante la diagnosi molecolare al fine di fare una
diagnosi completa della malattia e una prevenzione degli effetti pi dannosi della
malattia.
Da molti anni ormai, ma i risultati faticano ad arrivare, c' la possibilit di fare la
terapia genica, ovvero una terapia che consente di correggere un difetto
genetico. Facciamo un esempio: la distrofia muscolare di Duchamp, malattia in cui
c' un difetto genico nella distrofina, che essendo mutata causa la malattia. I
terapisti genici hanno pensato di introdurre nelle cellule dove c' la distrofina
mutata un gene che codifica per la distrofina sana, in modo da correggere il
difetto genetico facendo esprimere a quella cellula la distrofina sana. Questo vuol
dire manipolare geneticamente le cellule, ovvero far esprimere a una cellula un
gene che non fa parte del proprio DNA. Come si fa? Questo gene viene preso
dall'esterno ( gene esogeno umano) con metodiche biotecnologiche e si inserisce
in un vettore virale, ovvero un virus (per esempio un retrovirus, il virus dell'HIV)
che viene modificato in laboratorio in modo da non essere pi patogeno. Si usano
i virus perch essi si sono evoluti in modo da sapere entrare molto efficacemente

all'interno di una cellula. Quindi, si usano i virus di cui la cellula umana ha i

recettori, che portano un gene umano (in questo caso la distrofina) all'interno del
genoma del virus. Il virus modificato geneticamente viene messo a contatto con
la cellula malata che integrer il virus, cio far in modo che questo virus vada a
far parte in modo permanente del suo genoma. Praticamente il genoma umano
prende dentro il genoma del virus, facendo in modo che il genoma del virus venga
espresso all'interno della cellula. Purtroppo, per la distrofia muscolare ci sono solo
fasi di sperimentazione - la distrofina un gene molto lungo e difficile da
introdurre. Ci sono stati per dei trial di terapia genica che hanno avuto successo.
Ad esempio un trial che si basava sul fatto di poter correggere una grave
immunodeficienza che si chiama SCID (lei ha pronunciato "SKID", su internet ho
trovato scritto "SCID" riferito all'immunodeficienza causata dalla mutazione
dell'adenosina deaminasi
http://it.wikipedia.org/wiki/Deficit_di_adenosina_deaminasi) per cui il sistema
immunitario debilitato cos debilitato che i pazienti sono esposti a tutte le
infezioni, anche i virus che sulle persone non affette non hanno effetto, per loro
possono essere letali. Un tipo di immunodeficienza causato da un gene mutato
che l' adenosina deaminasi (ADA): quando ADA poco prodotta per effetto di
questa mutazione, muoiono tutti i linfociti T. Si pensato di correggere questo
difetto genetico introducendo la versione normale di ADA nei linfociti T di questi
pazienti. Cos stato fatto: dopo aver trasferito in un bambino di 4 anni l' ADA
normale con un vettore virale, si avuta la restaurazione del fenotipo normale e il
bambino guarito, ha cominciato a produrre l'ADA normale e non ha pi
l'immunodeficienza. Cos sono stati curati molti altri bambini con la stessa
malattia e si sta cercando di applicare lo stesso metodo ad altre malattie
genetiche, ma con successi alterni. Anche perch , alla fine degli anni '90, la
terapia genica ha avuto un blocco forzato a causa di un trial clinico, finalizzato a
curare un altro tipo di immunodeficienza, che ha provocato l'insorgenza di
leucemia in 3 pazienti su 10. Dopo questo episodio ci sono stati vari anni di fermo
per cercare di individuare dei vettori virali sicuri, affinch non causino altre
patologie per - cos si dice - mutazione inserzionale.
Che cosa deve fare il medico del terzo millennio?
Per prima cosa, prevenzione e cura del cancro attraverso una targeted
therapy, ovvero una terapia mirata. Le chemioterapie antitumorali attuali sono
terapie a largo spettro, che fanno uso di chemioterapici che colpiscono sia le
cellule tumorali che le cellule sani. Gli effetti collaterali della chemioterapia sono
molto pesanti, come la mielotossicit, tossicit del midollo osseo, diminuzione
della conta dei bianchi fino a esporre il paziente al rischio di infezioni. Quindi c'
una necessit spietata di terapie mirate. Le terapie mirate sono terapie in grado
di bersagliare esclusivamente le cellule del cancro. Il presupposto per l'efficacia di
un farmaco che sia specifico. La prima targeted therapy efficace messa a punto
quella che utilizza un farmaco che si chiama Imatinib, utilizzato contro una
proteina di fusione che si forma nella leucemia mieloide cronica. Questo tipo di
leucemia dovuto a una traslocazione tra il cromosoma 9 e il cromosoma 22, che
causa la formazione di un gene di fusione; la proteina di fusione che codificata
da questo gene di fusione leucemogena (e la causa della leucemia). Perci se si
inibisce l'attivit di questa proteina, teoricamente si inibisce la leucemia e si cura
il paziente. E' stata trovata una molecola - l'Imatinib - che si lega in modo
specifico a questa proteina e impedisce che la proteina vada a causare la
leucemia. Questo accade nei malati, perch solo nei malati c' questa proteina.
L'Imatinib stato messo a punto 10 anni fa e i pazienti non hanno ancora avuto
ricadute, quando prima la leucemia mieloide cronica era incurabile, dopo 3 o 4
anni di fase cronica peggiorava, andava in fase acuta e il paziente moriva. Quindi
questo stato un grosso avanzamento, dovuto alla messa a punto di una terapia

che va a bersagliare solamente le cellule leucemiche lasciando intatte le cellule

normali. Per mettere a punto queste terapie bisogna conoscere le lesioni
genetiche specifiche di ogni tipo di cancro, perch se no impossibile
bersagliarle. E' questa l'enorme mole di studio di base, che anche il mio
laboratorio sta facendo, finalizzata a caratterizzare, ad esempio, le molecole
espresse in modo specifico dalle cellule leucemiche, che possono servire come
bersaglio per le nuove terapie.
In secondo luogo, un medico del terzo millennio deve occuparsi dell'AIDS, che
ancora una malattia praticamente incurabile, e di malattie degenerative del
cervello ancora praticamente incurabili come il Parkinson e l'Alzheimer.
Quindi il medico deve conoscere, deve stare al passo con i progressi della
biologia e della genetica, perch compito del medico quello di trasferire ai
malati e alle loro famiglie l'ottimismo che genera uno scenario in continua
trasformazione, deve impegnarsi a rendere immediatamente fruibili tutti gli
interventi di provata efficacia, ma deve anche vigilare sulla correttezza delle
informazioni trasmesse.
(momento polemico)
Io adesso vi dico: se andate a chiedere al medico di base X come funziona
l'Imatinib, il suo meccanismo d'azione, non sa neanche cos' una terapia mirata
(!). Voi non dovete diventare fotocopie di questi medici, dovete essere
consapevoli e informati, in modo da consigliare la terapia pi efficace in quel
momento disponibile.