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MICROBIOLOGIA

Indice
Microbiologia...................................................................................................................................1 1. Introduzione, esperimenti genetici, struttura, colorazione.........................................................4
Cos' la batteriologia?................................................................................................................................................................4 Quale agente provoca la maggior parte delle malattie infettive?................................................................................................4 Cos' la trasformazione batterica? .............................................................................................................................................4

Esperimenti genetici........................................................................................................................4
Come si dimostr qual'era il materiale genetico?.......................................................................................................................4 Chi dimostro di nuovo la validit dell'esperimento di Griffith?..................................................................................................4 Spiegazione scientifica dell'esperimento di Griffith (coniugazione del DNA)?..........................................................................5 Come si fece l'isolamento del principio trasformante da parte loro?..........................................................................................5 Quale esperimento prov per la prima volta che il principio trasformante era il DNA?.............................................................5 A cosa si riferiva McCarty quando parlava di bolle di sapone?..................................................................................................5 Come si scopr definitivamente che il DNA rappresentava il materiale genetico?......................................................................5 Esperimento di Meselsohn e Stahl?............................................................................................................................................5

Struttura del battere..........................................................................................................................6


Citoplasma e cromosoma del batterio?.......................................................................................................................................6 Parete cellulare?.........................................................................................................................................................................6 Differenza tra gram positivi e negativi rispetto alla parete?.......................................................................................................6 Quali sono i componenti accessori dei batteri?..........................................................................................................................7 Dimensione dei batteri? Hanno dei organelli?............................................................................................................................7 Quali sono i diametri del bacillo?...............................................................................................................................................8 Come si denomina un battere?...................................................................................................................................................8 Bacillus subtilis (slide 8 e 9)?....................................................................................................................................................8 Pseudomonas aeruginosa (slide 10 e 12)?..................................................................................................................................8 Stafilococcus aureus?.................................................................................................................................................................9 Funzione del cell wall?..............................................................................................................................................................9 La forma del battere determinata geneticamente?...................................................................................................................9

Colorazioni progressive e regressive; Gram....................................................................................9


Colorazione Gram? Colorazioni progressive e regressive?........................................................................................................9 Colorazione progressiva?.........................................................................................................................................................10 Esempio di blu di metilene - cos' la meningite?......................................................................................................................10 Cosa sono le colorazioni regressive?........................................................................................................................................10 Perch i poli sono pi colorati?................................................................................................................................................11 Come si differenziano i batteri?................................................................................................................................................11 Cos' il peptidoglicano? ..........................................................................................................................................................12 Quali sono gli altri componenti della parete oltre il peptidoglicano?........................................................................................12 Come si fa la diagnosi della polmonite?...................................................................................................................................12 Quali sono i passi da seguire per colorare con il gram stain?...................................................................................................13 Cos' la colorazione acid-fast stain?.........................................................................................................................................13 Che effetto ha il micobacterium tubercolosis sul macrofago?..................................................................................................13

2. Struttura del peptidoglicano........................................................................................................14


Quali sono le tre grosse epidemie degli ultimi due anni?.........................................................................................................14 Differenza tra epidemia e pandemia?.......................................................................................................................................14

Cosa succede durante una colorazione Gram................................................................................14 Struttura del cell wall: il peptidoglicano........................................................................................15
Funzioni del peptidoglicano?...................................................................................................................................................15 Struttura del peptidoglicano?...................................................................................................................................................15 Cos' il peptide stem?...............................................................................................................................................................16 Quali sono i aminoacidi nel peptide stem e come vengono aggiunti?.......................................................................................16

Molecole e legami aggiuntive al peptidoglicano...........................................................................17


Lipoproteina di Brown e soltasi?..............................................................................................................................................17 Cos' il cross-linking?..............................................................................................................................................................17 Peculiarit del Escherichia Coli?..............................................................................................................................................18 Quali sono le propriet biofisiche del peptidoglicano?.............................................................................................................18

Propriet del peptidoglicano..........................................................................................................18


Qual' l'elasticit del peptidoglicano?......................................................................................................................................18 Qual' la porosit del peptidoglicano?......................................................................................................................................18

Da cosa determinata la forma del peptidoglicano?................................................................................................................18 Quali geni determinano la forma a bacillo?..............................................................................................................................19 Cosa sono il divisoma e l'elongasoma?....................................................................................................................................19 Quali sono le funzioni del peptidoglicano?..............................................................................................................................20

3. Differenza tra divisione in bacilli e cocchi..................................................................................21


Funzioni del'FtsZ e del MreB?.................................................................................................................................................21 Cosa sono il divisoma e l'elongasoma?....................................................................................................................................21

Divisione nei bacilli.......................................................................................................................21


Quale processo in pi hanno i bacilli rispetto ai cocchi?..........................................................................................................21 Come avviene la divisione nei batteri a bacillo?......................................................................................................................22 Come avviene l'allungamento?.................................................................................................................................................22

Divisione nei cocchi.......................................................................................................................22


Come si dividono i cocchi rispetto alla modalit di divisione?.................................................................................................22 In quale specie si trova il MreB?..............................................................................................................................................23

4. Divisione batterica........................................................................................................................24 Sintesi del Peptidoglicano .............................................................................................................24


Come avviene la sintesi del peptidoglicano?............................................................................................................................24 Cos' la flippasi?......................................................................................................................................................................24 Quali enzimi operano l'assemblaggio del peptidoglicano?.......................................................................................................25 Cosa sono i PBP?.....................................................................................................................................................................25 Come sono collegate la trasformazione e la resistenza alla penicillina?...................................................................................25 Rispetto al batterio, dove viene assemblato il peptidoglicano?.................................................................................................26 Quali elementi danno la diversit del peptidoglicano?.............................................................................................................26

Rimodellamento del Peptidoglicano - divisione............................................................................26


A opera di quali enzimi avviene il rimodellamento?................................................................................................................26 Come si nota l'attivit di questi enzimi?...................................................................................................................................26 Quali sono le propriet del peptidoglicano? ............................................................................................................................26 Il peptidoglicano mostra una struttura a rete? ..........................................................................................................................27 Come avviene la divisione nello Stafilocco aureus? ................................................................................................................27 Cos' l'AFM?...........................................................................................................................................................................27 Qual' la differenza nella divisione tra bacilli e cocchi?...........................................................................................................28 Cos' la streptomicina?............................................................................................................................................................28

Penicillin binding proteins (PBP)..................................................................................................28


Come si dividono le PBP?........................................................................................................................................................28 Qual' il ruolo delle PBP nella divisione e allungamento?.......................................................................................................28 Come si moltiplica il bacillo?...................................................................................................................................................29 Come si dividono i cocchi e qual' la differenza nella divisione nei due gruppi?.....................................................................29 Cosa succede se fornisco mattoni fondamentali sbagliati al bacillo? .......................................................................................30 In quali cocchi non siamo sicuri se ci sia un elongasoma?.......................................................................................................30

5. Esperimenti storici........................................................................................................................31 Esperimento di Griffith: la capsula un fattore di virulenza.........................................................31

Lezione 1, 28 settembre 2011

1. Introduzione, esperimenti genetici, struttura, colorazione


Cos' la batteriologia? La batteriologia la materia che dovrebbe insegnare a conoscere i batteri. Perch i batteri sono la causa principale malattie infettive, con i virus, funghi, i parassiti, sia unicellulari che no. Quale agente provoca la maggior parte delle malattie infettive? Tutti gli altri, parassiti e funghi, relativamente causano poche malattie infettive. Malattia infettiva causata da un agente microbico vivo, adesso un'altra discussione se i virus siano vivi o no. I virus e batteri spartiscono tutte le malatie infettive. La schistosomia, per esempio, una malattia parassitaria, causata da un agente eucariotico pluricellulare, colpisce 50'000 persone al mondo, mentre la malaria uccide 2 milionipersone al anno. Le due malattie infettive con specifico agente infettivo che causano pi morti mortalit annuale, sono la malaria (causata da un protozoo) e tubercolosi (tubercolosi o tisi, in sigla TBC, una malattia infettiva causata da micobatteri, in particolare dal Mycobacterium tuberculosis, chiamato anche Bacillo di Koch). Cos' la trasformazione batterica? La trasformazione batterica (o semplicemente, trasformazione) un fenomeno parasessuale tramite il quale i batteri possono scambiarsi materiale genetico. Gli organismi procariotici possono acquisire materiale genetico mediante i processi di coniugazione, trasduzione e, appunto, trasformazione. Nella trasformazione, molecole di DNA provenienti da cellule lisate vengono acquisite dai batteri direttamente dall'ambiente extracellulare.

Esperimenti genetici
Come si dimostr qual'era il materiale genetico? Dimostrazione che il DNA il materiale genetico - Esperimento di Griffith, 1928. Griffith prese due pneumococchi di tipi diversi: uno con il "ceppo" rugoso e uno con il ceppo liscio. Il ceppo era la capsula polisaccaridica. 1. Quelli con il ceppo rugoso, Tipo IIR, non erano virulenti e non uccidevano il topo all'interno la struttura del topo non aveva cambiata. 2. Invece quelli con il ceppo liscio, tipo IIIS, uccidevano il topo una volta iniettati e all'interno del topo morto si trovano batteri virulenti. 3. Fece un'altro esperimento e iniett il tipo IIIS, ma stavolta li uccise al calore: questa volta il topo aveva sopravvisuto, e all'interno non si trovavano i batteri. 4. L'ultimo esperimento lo aveva fatto mescolando i batteri di Tipo IIR e di Tipo IIIS uccisi al calore: il topo moriva e all'interno si trovavano batteri virulenti di tipo IIIS! La conclusione a cui arriv lui e che qualcosa era passato con il ceppo liscio, un principio trasformante come lo chiam lui, una molecola che rende vivo un batterio morto. Chi dimostro di nuovo la validit dell'esperimento di Griffith? Tre scienziati: Oswald Avery, Maclyn McCarty e Colin Munto MacLeod.

Spiegazione scientifica dell'esperimento di Griffith (coniugazione del DNA)? Infatti, il gene capsula (o meglio il frammento cromosomico contenente il gene) della cellula morta entr nella cellula non virulenta e attraverso i processi di ricombinazione e divisione cellulare la infett. Come si fece l'isolamento del principio trasformante da parte loro? Attraverso la trasformazione di pneumococchi mutanti R in tipo S mediante estratto cellulare. Dopo la moltiplicazione del ceppo S, hanno preparato il principio trasformante precipitando la lisi delle cellule e confinandoli in un estratto cellulare. Quando mettevano dentro pneumococchi non virulenti con fattori sierici, questi si trasformavano. Quale esperimento prov per la prima volta che il principio trasformante era il DNA? L'esperimento di Avery, nel 1944. Si e visto che l'attivit trasformante veniva distrutta da una desossiribonucleasi pancreatica (un enzima che degrada specificamente le molecole di DNA), mentre laggiunta di una ribonucleasi pancreatica (che degrada lRNA) e di diversi enzimi proteolitici (che degradano le proteine) non aveva alcun effetto sullattivit trasformante. A cosa si riferiva McCarty quando parlava di bolle di sapone? Si riferiva alla teoria falsa che erano le proteine che codificavano il materiale genetico, e che le persone si rifiutavano a credere che il rappresentante era invece il DNA. Oggi ci vogliono molte prove ben documentate per convincere qualunque persona che lacido desossiribonucleico privo di proteine potrebbe essere dotato di tali propriet biologicamente attive e adesso stiamo tentando di ottenere queste prove. molto divertente fare le bolle di sapone ma pi saggio bucarle prima che qualcun altro cerchi di farlo. Come si scopr definitivamente che il DNA rappresentava il materiale genetico? Hershey e Chase erano due scienziati che nel 1952 nel laboratorio di Cold Spring Harbour, Long Island lavoravano con i batteriofagi per scoprire se il materiale genetico fosse rappresentato dal DNA o le proteine, siccome i batteriofagi contengono solo queste componenti. (Il meccanismo di infezione dei virus non lo racconto qua.) Nella preparazione di batteriofago T2 marcato radioattivamente, hanno diviso i batteriofagi in due gruppi: nel primo gruppo, hanno marcato il DNA del fago con il fosforo 32 radioattivo facendolo crescere in un ambiente ricco di quel elemento. Invece, nel secondo gruppo hanno marcato l'involucro proteico con il zolfo 35. Il risultato fu che dopo che sono state lasciate omogeneizzare brevemente, nel primo gruppo la radioattivit si ritrovata nell'ospite ed era passata alla progenie fagica, mentre nel secondo gruppo la radioattivit si ritrovava nelle ombre fagiche e non passata alla progenie fagica. Arrivarono alla conclusione che il DNA fosse il rappresentante del materiale genetico. Oviamente i scopritori della struttura e modo di replicazione, che hanno fatto il modello sono stati Watson e Crick. Esperimento di Meselsohn e Stahl? L'esperimento di centrifugazione del DNA marcato con 14N o 15N su un gradiente CsCl, cio con l'isotopo pesante dello stesso atomo. Hanno fatto crescere una cultura batterica in un ambiente contenente solo l'isotopo pesante e una in quella contente l'isotopo leggero. Esperimento: Meselson e Stahl fecero crescere per molte generazioni il batterio Escherichia coli contenente il isotopo di azoto pesante, in modo che tutti i filamenti di DNA diventassero "pesanti". Quindi, trasferirono alcune cellule in un mezzo contenente azoto leggero, in modo che i filamenti neosintetizzati fossero "leggeri". 5

Isolarono il DNA dalle cellule batteriche dopo una e due generazioni e lo centrifugarono per separare le bande di DNA di diversa densit. Meccanismo: Il DNA viene mescolato con la soluzione di CsCl, posto in ultracentrifuga e centrifugato ad altissima velocit per circa 48 ore. La maggiore concentrazione di CsCl al fondo della provetta dovuta alla sedimentazione operata dalla forza centrifuga. Le molecole di DNA si stratificano nelle posizioni in cui la loro densit uguale a quella della soluzione di CsCl. Risultati e conclusione: Sulla base delle densit osservate delle molecole di DNA in ciascuna generazione, Meselson e Stahl conclusero che il modello di replicazione semiconservativa rispecchiava accuratamente il meccanismo di replicazione del DNA.

Struttura del battere


Citoplasma e cromosoma del batterio? La cellula batterica una cellula procariotica. Perch procariotica? Perch non ha la struttura del nucleo della cellula eucariotica. Non ha un nucleo standard. Riconosciuto al di fuori dei batteri. Qunidi, la cellula batterica non ha un nucleo. Il materiale genetico conservato in uno cromosoma. Che si chiama cromosoma, ma non circondato da una membrana nucleare. circa in una zona centrale della cellula batterica, ma non cos ben definita nucleoide, un non-nucleo (ai poli durante la replicazione). All'interno dela cellula batterica c' una grandissima quantit di ribosomi dispersi nel citoplasma. Questo citoplasma circondata da una membrana citoplasmatica abbastanza simile alle membrane citoplasmatiche degli eucarioti, eccetto il fatto che non contiene i steroli (eccezione i micoplasmi, che li incorporano nella membrana). Parete cellulare? Altra cosa veramente importante dei batteri, pi fondamentali, che al di fuori della cellula, dell a membrana citoplasmatica, esiste una struttura che si chiama cell wall parete batterica. Questa una parete rigida, questa parete diversa per tra i gram positivi e gram negativi. Questa parete comunque si trova sia nei gram positivi e gram negativi. costituita da una molecola, che forma un sacco molecolare: una molecola unica che si chiama peptideoglicano o mureina. Altri componenti dei gram positivi sono gli acidi teicoici e lipoteicoici. Differenza tra gram positivi e negativi rispetto alla parete? Il cell wall dei gram positivi e solo costituito da uno spesso strato di peptidoglicano uno dei nostri compiti capire come fatto ill peptideglicano e che ne al momento di replicazione del DNA. Nei gram positivi, abbiamo la componente principale che costituita da peptidoglicano (90%); nei Gram (si riferisce a un ricercatore che si chiama Gram, batteriologo danese che scopr la colorazione dei Gram) negativi non hanno solo una grossa molecola di peptideglicano come qua hanno una parete batterica complessa, formata anche da uno strato di peptidoglicano che distante dalla membrana citoplasmatica.

Esiste anche un periplasma e spazio periplasmico spazio non virtuale, ma reale nel cui ci sono molecole speciali, anche se non strutturato (nei gram negativi molto pi spesso, ma esiste anche nei gram positivi) e all'esterno dello stratterello di peptideglicano esiste un altra membrana molto speciale dei batteri gram negativi che si chiama outer membrane membrana esterna, conaratteristiche particolari che dobbiamo studiare anch'essa.

I gram positivi hanno la membrana e il cell wall, e a volte anche lo spazio periplasmatico in alcuni casi si vede, in alcuni no. Si vede un grosso strato di peptidoglicano, e alcune volte hanno una capsula o uno strato piuttosto poco strutturato esterno (il glicocalice, a seconda di quanto compatto, forma la capsula o lo strato mucoso). Surface layer (SL) strato superficiale. Questo pu delimitare per i gram positivi uno spazio periplasmico. Quali sono i componenti accessori dei batteri? I batteri poi hanno delle strutture aggiuntive: i pili, strutture pi o meno rigide (di solito rigide) e i batteri mobili hanno anche una struttura pi lunga, che ambedue partono dalla membrana citoplasmatica, e costituiscono i flagelli, gli organi locomotori. Rispondono alle sollecitazioni chimiche (chemiotassi, rotazione antioraria ed oraria) o fisiche del protobatterio. Il nostro primo scopo e studiare questi batteri. Dimensione dei batteri? Hanno dei organelli? I batteri sono molto piccoli, a livello del micrometro, 1-2 micrometri. Hanno forme diverse. Cosa bisogna fare per vedere i batteri? La batteriologia nata insieme alla scienza dei coloranti. La 7

grande chimica tedesca dei coloranti, seguita dalla francese, da questi venuta colorazione che si usa in medicina - Gram, Ziehn, Nielsen... Oppure da un altro punto di vista Giemsa, panotica, che si usa in America. Per vederli, colorarli. A seconda del differente materiale, possiamo usare tecniche come il contrasto di base, con il microscopio ottico normale. L'ingrandimento per deve essere di mille volte: 10x di oculare, e 100x di obiettivo. Solo oltre le 600 volte si riesce a vedere un battere. Altrimenti si vedono solo quelli mobili, ma si devono usare accorgimenti particolari. I batteri in sospensione a quota si possono vedere perch si muovono. Si usa un sistema molto particoolare della goccia pendente (?). Il globulo rosso grande 8 micrometri. Un battere 1, massimo 2 micrometri. Se io guardo vicini un globulo rossso e un battere, vedo globulo rosso, ma il battere no aumento l'ingrandimento. Fino a prova contraria batteri da 10 micrometri, si ritrovano in situazioni pi particolari. Di solito da 1 a 4 micrometri. Sono a bastoncello (bacillo) o sferici. Non hanno organelli. Cio non hanno apparato di Golgi. Prima di 10 anni fa si riteneva che non c'era un citoscheletro. Invece molecole molto simili alle citoscheletro ci sono, e hanno delle funzioni particolari. Possono avere flagelli e pili (aka fimbria) e posso avere le capsula. Quali sono i diametri del bacillo? Un bacillo ha un diametro parecchio pi lungo dell'altro. Due diametri, quindi. Vediamo il diametro pi breve e non vediamo il diametro pi lungo. La caratteristica dei batteri sono di questo tipo hanno un diametro pi lungo dell'altro. Questo un bacillo o un battere vero e proprio. Questo differenzia un bacillo da batteri circolari cocchi. Come si denomina un battere? Prendiamo per esempio un bacillo gram positivo, il Bacillus subtilis. Quando si denominano con due parole, la prima una parola che indica il genere ci sono varie specie che poi afferiscono a quel genere. Il nome proprio si chiama subtilis. I batteri si scrivono in corsivo come tutte le classificazione, e genere con maiuscola iniziale. Bacillus subtilis (slide 8 e 9)? Vediamo il nucleoide (DNA). Per vedere, ricordate che vengono colorati: si ha un acetato, in maniera tale da differenziare le strutture. Si vede che un battere senza capsula, ha un cell wall. Un grosso cell wall da gram positivo, la linea nera esterna. Questa linea abbastanza importante la membrana cellulare. Vediamo la presenza del materiale nucleare, al cui esterno vediamo dei puntini che sono i ribosomi. Ingrandimento molto pi alto anche questo signore gram positivo ha uno spazio periplasmico, in cui vediamo che tra la membrana citoplasmatica e cell wall, possiamo notare uno spazio periplasmico, e 3, la struttura grossa, il cell wall peptideglicano. Pseudomonas aeruginosa (slide 10 e 12)? Questo a piccolo ingrandimento un gram-negativo (Pseudomonas aeruginosa). Vediamo questo lieve strato nero che non si vede totalmente il peptidoglicano. Poi la outer membrane, lievemente marcato strato di outer membrane, da cui come vedete aggettono una specie di cespugliato, che non particolare, ma una struttura legata alla outer membrane LPS (complesso lipidcopolisaccaridico) che costituisce il foglietto esterno della membrana esterna. Caratteristica dell'outer membrane, costituita dal lipide A, che si lega a un disaccaride di N-acetilglucosamina fosfato, che a sua volta legato al chetodeossiottonato della porzione polisaccaridica dell'LPS. Il DNA pi chiaro e ribosomi addensati, il tubo, il bacillo e tagliato a 90 rispetto al diametro maggiore. 8

A pi elevato ingrandimento vediamo la membrana citoplasmatico, lo spazio e l'outer membrane. Questi sono i stessi batteri, ma tagliati sull'asse maggiore, addensati uno sull'altro Stafilococcus aureus? Questo invece un cocco gram positivo, dei pi pericolosi. Un cocco gram positivo, insieme al subtilis, uno dei pi esemplificati dei gram positivo, per un cocco sferico. S. aureus. Vediamo la membrana citoplasmatica e il cell wall, e anche qui si nota uno spazio periplasmico. Per la differenza fondamentale la grandezza del cell wall, che evidentemente pi grande. Tutto peptidoglicano. Funzione del cell wall? 1. Rigidit l'interno dell battere a concentrazione molto osmotica pi alta. Se non fosse circondata da wall, il battere scoppierebbe in una soluzione isosmotica (al sangue). Dato che ha maggiore concentrazione, l'acqua penetrerebbe, si gonfierebbe... L'unico modo per ottenere batteri senza cell wall, quello di togliere il cell wall e noi abbiamo nelle nostre lacrime, un enzima che taglia il peptideglicano, si chiama lisozima, che taglia il cell wall e lo distrugge. Per se lo facessimo a un battere isosmotico a quello nostro, scoppierebbe. Dobbiamo metterlo in soluzione di 20% di saccarossio, sopravvive perch non si riempie di acqua. 2. Diventa sferico sferoblastico quando si riempe senza il cell wall. Quindi a forma determinata da peptidoglicano. La forma del battere determinata geneticamente? Ma se io tolgo il peptidoglicano e lo metto in soluzione iperosmolare e prende la forma di cocco, sferoblasto, allora la forma del batterio non determinata geneticamente? La forma determinata geneticamente, a bastoncello. La forma di battere a cocco, determinata geneticamente. Vedremo questo dopo.

Colorazioni progressive e regressive; Gram


Colorazione Gram? Colorazioni progressive e regressive? Il dottor Gram (Koch us altre colorazioni) scopr che i batteri, secondo la sua colorazione si potevano dividere in due gruppi gram positivi e i batteri gram negativi (esistono anche i micoplasmi che per la sua struttura non si colorano bene). Che vuol dire? Le colorazioni. Per vedere i batteri abbiamo bisogno delle colorazioni. Le colorazioni dei batteri si distinguono in progressive e regressive. Ma prima di questo dobbiamo fare una serie di cose. Intanto prelevare il materiale. un materiale biologico normale che dobbiamo vedere se ci sono dei batteri. Prendo un campione significativo giallastro o verdastro, addensato questo colore vuol dire che c' in corso una risposta infiammatoria con presenza di granulociti, e lo pongo su un vetrino e gli metto una goccia. L'errore che si fa sempre e mettere troppo materiale, mai troppo poco materiale. Devo distendere questa goccia, distribuirlo sul vetrino portaogetti in maniera tale che diventi un velo. Dopodich devo, questo materiale sempre umido o liquido in alcuni casi, devo seccare. Questo materiale lo espongo all'aria, o a una lampadina a calore in maniera tale che is secchi, che perda tutta l'acqua. Distendere, seccare. Quarto passaggio devo fissarlo, fare in modo che il materiale procariotico o eucariotico, si attacchi in maniera stabile al vetrino portaoggetti. Questa operazione ha anche un altra funzione sterilizza il materiale. Una fiamma normale, non quella azzura del Bulson che si usa che troppo calda. Lo faccio con una fiamma normale, con un accendino.

L'altro modo pasare la fiamma in modo che si scaldi, si fa raffreddare, lo si passa i una seconda volta, e lo si fa raffredare tre volte. Oppure, fissazione senza calore con pocche goccie di metanolo o alcol metilico. A questo punto il materiale finalmente pronto. Non dobbiamo mettere troppo alcol, bastano poche gocceie. Poi aevapora, e il maeriale pronto ad essere precedenti Prelevare Distendere Seccare Fissare.

Colorazione progressiva? La colorazione pi semplice una colorazione progressiva. La colorazione progressiva migliore quella Blu di Metilene. Con blu di metilene guardando dall'alto vedo o bacilli o cocchi blu, con il blu pi intenso, ma poco con blu di metilene che noi usiamo. Quindi il materiale procariotico si colora con un blu pi intenso Oppure altri che usiamo, fucsina diliuita. O cocchi o bacilli rossi. Con questa colorazione non possiamo dire che sono gram positivi o gram negativi. Li coloro fucsina o il blu di metilene e vedo cosa succede. Si colorano un po di pi del materiale eucariotico cellule, globuli rossi e bianchi, fibrina. Queste colorazioni si usano su materiali molto nobili materiale batterico non c' ne, oppure c' ma non tanto. Esempio di blu di metilene - cos' la meningite? un'infezione di meningi, una volta si prendeva in caserma, che facevano radunate ai car, migliaia di giovani ragazzi diciottenni, con condizioni dove poteva scoppiare una epidemia. Esiste la tipologia acuta o grave. una malattia infiammatoria delle membrane che rifvestono l'encefalo (pia madre e aracnoide) e del liquor. La causa pu essere infettiva (da batteri, da virus, da miceti o da parassiti) o anche un agente chimico o fisico. Si divide in meningite a liquor limpido (generalmente virali) e a liquor torbido (generalmente da batteri). Nelle grandi radunate, ne bastava qualcuno che aveva una Neisseria alla quale gli altri non erano immuni, e essendoci una assenza di immunit, si diffondeva, quando arrivava a 30% si poteva definire una epidemia. Adesso succede raramente nelle caserme, ma successo 3-4 anni fa, nei Pub, dove si radunano grandi quantit di fanciulli, non proprio in forza, perch se si beve, si diminuice la capacit di resistenza a questi agenti. Fa si che ci sia questa possibilit di trasmissione. La forma batterica di cui stiamo parlando quella da Neisseria menigitidis o meningococco, interessa soprattutto bambini ed adolescenti, mentre la forma pneumococcica quella pi comune. Quando prendo il liquor, faccio la colorazione di blu di metilene, nel liquor sono poche le cellule anche se c' ne sono (per questo utilizzo il blu di metilene), perch se c' la meningite, i globuli bianchi ci sono, ma se il liquor si colora bene, si contano cocchi a forma di granuli di caffe, che si affacciano per l'asse minore, e si accostano uno all'altro a forma di 8, o come detto prima da grani di caffe. Adesso non vedo se sono gram + o -, ma vedo che ci sono, la loro presenza Cosa sono le colorazioni regressive? Facciamo una prima colorazione, poi aggiungiamo un'altra. Colorazioni regressive, si intendono le colorazioni in cui viene effettuata prima l'aggiunta di un colorante, che agisce sul materiale, epoi viene tolto. Nel caso gram c' un ulteriore caso particolare, perch viene aggiunto un altro materiale che contiene iodio per renderlo ancora pi adeguato, per rendere pi forte la colorazione. Dopo di questo si fa agire un decolorante. Ecco perch si chiama regressiva si fa agire un 10

decolorante. Nel caso del gram, il decolorante l'alcol etilico 95%, oppure come faccio io alcol etilico + acetone, perch agisce in maniera pi veloce. Tutti i materiali che sono sensibili all'alcol etilico perdono il colore. Se noi andiamo a vedere al microscopio materiale procariotico gram negativo non vedimo niente perch il colore stato perso. Per, dato che ci sono batteri che trattengono il primo colorante, e altri che la perdono per decolorante, bisogna differenziarli: si aggiunge un altro colorante, colorante di contrasto, che colora sia il materiale eucariotico, sia i batteri gram negativi. Il colorante originale di contrasto che us gram era bruno bismarck, un colorante marrone, da anni da questa parte si usa la safradina, un colorante rosso. Allora a questo punto i batteri sono o gram positivi o gram negativi. Positivi quando conservano l'originale colorante cristal-violetto. I batteri gram positivi si colorano in violetto. Saranno o bacilli o cocchi gram positivi. Invece quelli che perdono il primo colorante, non sono pi violetti, l perdono dopo il trattamento con il decolorante, alcol etilico, il secondo colorante li colora, si colorano in rosso perche safranina rossa. L'unico problema (meglio dire differenza) del gram, che lo differenzia dalle altre colorazioni, e che dopo la prima colorazione con cristal violetto si aggiunge una soluzione iodio-iodurata. Si combina con il cristal violetto, dando una consistenza e colorazione pi pesante, e soprattutto impedisce poi la decolorazione di gram positivi. 1) Cristal violetto tutto violetto 2) Soluzione iodio-iodurata 3) Decolorazione con alcol gram + violetti, gram non si vedono. Materiale eucariotico non si vede. 4) Safranina gram + violetti, gram rossi, materiale eucariotico rosso, ma colorato di meno. Perch i poli sono pi colorati? Ai poli osserviamo addensamento di colore. I coloranti sono basici, e si legano agli acidi nucleici (DNA). I batteri sono in divisione attiva quasi tutti. Quindi si moltiplicano ogni tanto, per un periodo che pu variare dai 30 minuti all'1 ora, un'ora e mezza. Li vedete addensati sono gi due nuclei, con il materiale genetico pronto per essere separati e regalato alle cellule figlie. Come si differenziano i batteri? I batteri non si differenzano solo per la colorazione, ma anche per forma, e poi anche per raggruppamento. Si tendono a ragrupparsi in due. I cocchi a grappolo (che si dividono secondo vari piani) oppure a catenella (si dividono sempre secondo lo stesso asse, quello minore). A grappolo si chiamno stafilococchi, a catenella streptococchi, che si possono descrivere anche a grani di rosario.

In modo pi completo dal libro: I batteri possono presentare morfologia sferica od ovale (cocchi), cilindrica (bastoncelli), cilindrica ricurva (vibrioni), cilindrica a spirale (spirilli), cilindrica molto allungata (filamenti), ed anche i coccobacilli. I cocchi possono restare isolati o disporsi a coppie (diplococchi), a catenelle (streptococchi), in ammassi (stafilococchi). I bacilli possono anch'essi 11

disporsi a a formare lunghe catene o disporsi a palizzata o a lettere cinesi (corinebatteri). Allora noi abbiamo i gram positivi e gram negativi. Tra i procarioti, ma non tra i batteri esiste un altro regno, dominio che procariotico, oltre ai batteri esistono anche gli archea. Questo stato scoperto relativamente recentemente, met degli anni 70. Lo diremo dopo con le loro relative caratteristiche. Per adesso ci basta sapere che l'albero filogenetico secondo l'analisi delle sequenze dell'rRNA si divide in bacteria, archaea, ed eukarya. Cos' il peptidoglicano? Il nome ci deve dire qualcosa. La parte glicanica costituita da due aminozuccheri (N-acetilglucosammina e acido N-acetilmuramico, uniti da un legame Beta1-4 glucosidico) che si alternano a formare delle lunghe catene. La componente peptidica si lega all'acido muramico con un legame amidico ed formata in sequenza da L-alanina, acido D-glutamico, L-lisina (chiamato anche acido diaminopimelico), D-alanina. Ponti pentaglicinici possono unire due catene peptidiche contigue, come nella parete di Staphylococcus aureus. Soltanto nei batteri gram negativi in posizione 3 presente il acido mes-diaminopimelico, e una D-alanina finale. Una D-alanina viene persa per la reazione di trans-peptidoreazione. Come conosciamo questi aminoacidi? Idrolizziamo il battere e separiamo il peptidoglicano, vediamo le molecole che lo costituiscono. Questo un metodo molto greve, poco analitico, ma serve. Quali sono gli altri componenti della parete oltre il peptidoglicano? Se siamo abbastanza analitici vediamo che attaccata alla membrana citoplasmatica e attraverso il peptidoglicano ci sono altre molecole. Gli acidi lipoteicoici, legati e partono dalla membrana celulare, e gli acidi teicoici. Non sembrano legati alla membrana citoplasmatica, ma sono presenti nella parete cellulare. I gram negativi sono molto pi complicati. Esiste la membrana citoplasmatica, il pi o meno sottile strato di peptidoglicano, E poi c' l'outer membrane. Questa una membrana molto caratteristica dei gram negativi. A differenza della membrana citoplasmatica, la membrana esterna contiene anche polisaccaridi. Si tratta infatti di una membrana asimettrica dove lo strato rivolto verso il peptidoglicano composto da fosfolipidi, mentre quello rivolto verso l'esterno da un complesso lipidico-polisaccaridico (LPS). Poi ci sono parecchie proteine, alcuni dei quali molto importanti, chiamate porine o proteine di membrana. Poi c' attaccata alla membrana esterna, una molecola particolare LPS (in rosso) che ha queste appendici che vedevamo nella prima fotografia Pseudomonas aveva questa sfrangiatura. In pi anche altre, la LPS di Braun, che da un lato all'outer membrane, all'altra legata al peptidoglicano della parete cellulare legano insieme questi due strati. Come si fa la diagnosi della polmonite? Polmonite, la diagnostica della polmonite difficile. Dobbiamo riuscire a ottenere materiale profonde, polmonite infezione daelle vie aeree basse, non confondendolo con il materiale del faringe della bocca. Devo dare istruzioni molto particolari del paziente per ottenere materiale (saliva) significativo, basso. Ci sar un po' di inquinamento da parte dall'orofaringe. A noi interessa la polmonite, il caso pi frequenate e provocato da pneumococchi, che si vedono come delle punte, non schiacciato come i cocchi, e in pi sono gram positivi. Se voglio avere una buona colorazione, devo avere il materiale giusto, colorare bene (un arte), e devo avere gram positivi. Ma se la polmonite viene da fuori vediamo anche gram negativi. Il materiale significativo 12 1) 2) 3) 4)

se c' presenza di globuli baianchi. Se ho una grande quantit di cellule epiteliali, se gi a 10-10, si vedono grandi celuloni, vuol dire che il materiale non buono, ed orofaringeo. Quali sono i passi da seguire per colorare con il gram stain? 1. Distendere il materiale (smear): sospendiamo parte del materiale in una goccia d'acqua su un vetrino da microscopio e lo distendiamo fino a che non ha una forma leggermente a soldino. Possiamo aspettare che si asciughi all'aria e applicare calore. 2. Applicare la colorazione primaria cristal-violetto, 30 sec a 1 minuto. 3. Applicare l'agente fissante la soluzione iodio-iodurata, 30 sec a 1 minuto 4. Pulirlo (rinse) con l'acqua per rimuovere lo iodio in eccesso 5. Decolorante lasciamo gocce di alcool 95% nel vetrino per 5 sec 6. Pulirlo con l'acqua (rinse) 7. Secondo colorante (colorante di contrasto o counterstain): applicare la safranina, 30 sec 8. Pulire, asciugare ed osservare Cos' la colorazione acid-fast stain? Alcuni tipi di bacilli contengono nelle loro pareti cellulari acidi grassi di lunghezza di catena notevole che danno luogo a una superficie molto "mucosa". Per lo spessore e composizione di questa parete, questi organismi si colorano anch'essi gram-positivi. Per sono molto difficili da colorare, ma una volta colorati, sono difficili da decolorare, anche in presenza di alcol contenente acido minerale (es. HCl). Quindi, sono detti di essere "colorati fissi (colorfast) nella presenza di acido" o "Acid-fast". Batteri Acid-Fast sono trovati maggiormente nel genere Mycobacterium (per esempio i tubercolari) e anche nel genere Nocardia. 1. Distendere lo smear 2. Applicare il colorante primario rosso, da fucsina basica. Si usano le colorazioni ZiehlNeeln che contiene meno fenolo del Kinyoun quindi, per far penetrare il colorante, dobbiamo scaldare il vetrino durante la colorazione per consiglio utilizzare questo che meglio, anche se ci mette 5 minuti. Ci vuole il calore nel ziehl nielsen. Per una volta penetrato non esce pi. Oppure si usa il colorante Kinyoun (contiene fenolo, fa penetrare pi facilmente il colorante nel bacilo tubercolare). 3. Lavare con acqua per rimuovere la colorazione in eccesso 4. Decolorante il punto cruciale, costituito da 97% di alcol etilico, e acido cloridrico 3%. Acid fast stain. Quelli che non sono acid-fast (colorfast), perdono il colore. Adesso si deve usare il contrasto, usato in blu di metilene. 5. Lavare con acqua 6. Blu di metilene, counterstain. Si colorano in blu quelli che hanno perso il colore. 7. Lavare, asciugare, osservare Che effetto ha il micobacterium tubercolosis sul macrofago? In un macrofago il micobacterium tubercolosis, si moltiplica anche al di dentro del macrofago, quindi si chiamano intracellulari facoltativi, ma non sono solo facoltativi, si moltiplicano la.

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Lezione 2, 30 settembre 2011

2. Struttura del peptidoglicano


Quali sono le tre grosse epidemie degli ultimi due anni? Negli ultimi due anni, il mondo stato colpito da tre grosse epidemie: 1. Il colera ad Haiti (in seguito al terremoto, portato da soldati pakistani) 2. L'epidemia dell'Escherichia Coli in Germania (O 104: H4) 3. L'influenza da H1N1 prima in Messico e poi negli USA Il colera una malattia batterica (scatenata dal battere Vibrio Cholerae scoperto da Koch) caratterizzata da una fortissima diarrea (detta diarrea osmotica) con perdite di 13-18 l di liquidi al giorno. chiaro che se questi 13-18 l non vengono, in qualche modo, reintegrati, il soggetto che li ha persi muore per ipovolemia e shock. Per quanto riguarda l'epidemia dell'Escherichia Coli, anch'essa caratterizzata da diarrea, il problema stato che ha portato alla produzione della tossina di Shiga, causa, in molti soggetti, della sindrome emolitico-uremica, che comporta emolisi di globuli rossi ed insufficienza renale, aumento dell'azotemia con effetti anche sul SNC. In genere colpisce pi i bambini. L'influenza da H1N1 poteva essere una vera e propria pandemia (dato che l'H1N1 si trasmette per via respiratoria). Fortunatamente, da un lato gli USA sono stati in grado di contenere il fenomeno con molta efficacia, dall'altro il virus in questione non presentava l'aggressivit di quella sua variante che, nel 1918, era stata la causa scatenante dell'influenza spagnola. Differenza tra epidemia e pandemia? Epidemia: aumento improvviso di casi incidenti nel tempo e/o nello spazio (caso incidente= numero di casi/ popolazione) Pandemia: ondata di casi che coinvolge tutto il mondo

Cosa succede durante una colorazione Gram


Possiamo dire che la fase determinante di una colorazione GRAM la fase regressiva, ovvero la fase di decolorazione. Nell'immagine raffigurato un GRAM +, nello specifico un Bacillus Subtilis (che il pi studiato di questa categoria) subito dopo la fase di decolorazione con etanolo. possibile notare una lieve perdita di materiale colorato con cristalvioletto da parte del battere; inoltre, si possono apprezzare delle precipitazioni all'interno della cellula che, per, mantiene la sua integrit. Se si analizzano le concentrazioni delle proteine e dei lipidi nel GRAM +, dopo la reazione, si vede che la differenza tra le cellule di controllo e quelle decolorate relativamente bassa (una certa perdita c', ma davvero minima).

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Molto diversa la situazione per quel che riguarda i GRAM che si trovano in questa stessa fase. Nell'immagine di fianco si pu vedere cosa succede ad un E.Coli (GRAM ) quando viene trattato con etanolo. evidente il rigonfiamento della outer membrane (che, in questo processo, la parte maggiormente colpita) mentre rimangono quasi del tutto integre la membrana interna e il cell wall. Occasionalmente possibile osservare la presenza di piccoli fori a livello della mureina e della membrana plasmatica che determinano la fuoriuscita del complesso cristalvioletto -TPt e di alcuni componenti cellulari. Di particolare interesse, inoltre, il fatto che il contenuto della cellula non si limita a precipitare (cosa che accade nei GRAM +) ma soggetto ad una vera e propria ripartizione in masse separate. In sostanza la membrana esterna viene lesa dal trattamento con etanolo (che, ricordiamo, un ottimo solvente per i lipidi) e questo provoca una grande perdita di materiale da parte del battere. In questo caso, la cellula trattata presenter una perdita di proteine di circa il 30% rispetto alla cellula controllo, mentre, per quel che riguarda i lipidi, la perdita sar quasi totale.

Struttura del cell wall: il peptidoglicano


Funzioni del peptidoglicano? E' importantissimo conoscere a fondo il peptidoglicano poich: una delle strutture fondamentali della cellula batterica (gli unici batteri che non ne sono provvisti sono i Mycoplasmi); va infatti a costituire la parete cellulare (cell wall) il bersaglio di tossicit selettiva degli antibiotici (che in questo modo lasciano illesi gli eucarioti e gli archea che ne sono privi); quindi possibile neutralizzare un battere bloccando la sintesi del peptidoglicano. Ad esempio la penicillina, scoperta da Fleming, interferisce con la sintesi del peptidoglicano portando alla lesione specifica delle cellule batteriche e non di quelle eucariotiche. la principale funzione del peptidoglicano di conservare e preservare l'integrit e il funzionamento della cellula controllandone il turgore. contribuisce al mantenimento della forma della cellula batterica: qualsiasi cellulla che ha perso sia artificialmente sia naturalmente il cell wall diventa pi o meno sferica e va anche incontro a lisi, a causa del gradiente osmotico, a meno che non venga localizzata in una specifica soluzione concentrata. il peptidoglicano serve anche come impalcatura per l'ancoraggio dei componenti di un altro rivestimento cellulare, come proteine ed acidi teicoci. altamente coinvolto nei seguenti processi: crescita e divisione della cellula.

Struttura del peptidoglicano? Il peptidoglicano una lunghissima catena polimerica, le cui unit strutturali sono due carboidrati azotati: l'N-acetil-glucosamina e l'acido N-acetil-muramico (lat: murus - parete; specifico del cell wall). Queste due monomeri sono uniti mediante un legame glicosidico beta 1,4, mentre l'acido N-acetil-muramico connesso all'N-acetil-glucosammina successiva mediante un legame glicosidico beta 1,6.

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Dalla presenza di N-acetil-glucosamina anidrata, in posizione 1,6 viene determinata la lunghezza del peptidoglicano. Quando, infatti, questa sua componente si presenta nella forma anidrata, ne blocca la crescita. Cos' il peptide stem? Quasi sempre, all'acido N-acetil-muramico attaccato un peptide (che sostituisce il gruppo lattico dell'acido muramico), che prende il nome di peptide stem. Quello nella figura il peptidoglicano dell'E.Coli (che viene usato come modello dei GRAM mentre per i GRAM + si usa il bacillus subtilis); il peptide stem attaccato all'acido N-acetilmuramico del Coli costituito da: L-Alanina D-Glutammato Acido Meso-diaminopimelico D-Alanina

Il peptide nascente, in realt, presenta due alanine finali e ne perde una quando si unisce all'acido. Insomma, il fattore fondamentale del peptidoglicano, il muramil-tetrapeptide. Batteri differenti presentano peptidoglicani diversi tra loro proprio per i differenti peptidi che si possono legare all'acido N-acetil-muramico e questa caratteristica permise a Kandler e Schleifer di attuare una classificazione dei vari batteri. Quali sono i aminoacidi nel peptide stem e come vengono aggiunti? 1. Il primo aminoacido aggiunto dalla MurC ligasi; nella maggior parte dei batteri questo aminoacido l'alanina (solo raramente possibile trovarne altri tipo la glicina) 2. Il secondo aminoacido sempre il glutammato ed aggiunto dalla MurD ligasi 3. Il terzo aminoacido, che presenta la massima variabilit da battere a battere, aggiunto dall'enzima MurE ligasi ed generalmente un acido diaminico (fortemente basico); nello specifico, nei GRAM l'acido meso diaminopimelico e nei GRAM + la lisina. 4. Il quarto aminoacido un dipeptide (quindi si pu parlare di posizione 4 e 5) formato dall'enzima Ddl e incorporato al peptide dalla MurF ligasi; il pi delle volte si tratta di un dipeptide di D-Alanina , unito mediante attacco diretto, non uno alla volta. Variazioni degli aminoacidi in posizione 4 e 5 possono comportare resistenza agli antibiotici da parte dei batteri che ne sono caratterizzati. 16

Molecole e legami aggiuntive al peptidoglicano


Lipoproteina di Brown e soltasi? Lo stem il punto di ancoraggio di proteine eventuali al peptidoglicano. Nei gram di solito la lipoproteina di brown che fa parte del cell wall, e lega la outer membrane al peptidoglicano, attaccato al gruppo carbossilico dell'acido diaminopimelico dello stem. Nei gram + si attaccano altre sostanze. Il legame catalizzato da un enzima chiamato sortasi. La sortasi (nello Stafilococcus aureus) una transpeptidasi che attacca proteine di superficie alla parete cellulare. Agisce come proteasi e transpeptidasi, ed un gruppo di enzimi procariotici che catalizza l'assemblaggio di pilini in pili, e l'ancoraggio di pili alla parete cellulare. Cos' il cross-linking? Un'ulteriore distinzione tra i peptidoglicani, oltre che alla sua costituzione, possibile farla grazie ai legami interpeptidici che si creano tra i vari strati degli stessi, fenomeno che prende il nome di Cross Linking. In mancanza di tali legami, il peptidoglicano non presenterebbe quella rigidit che lo caratterizza, ma sarebbe lasso e inconsistente.

Nei batteri GRAM il cross linkage avviene direttamente tra gli aminoacidi 3 e 4 (a, E.Coli), mentre nei GRAM+ il legame lo si ha tramite un ponte interpeptidico (b, Staphilococcus Aureus, il ponte costituito da 5 glicine, sempre tra 3 e 4). Nei Corynebacterium, che fanno parte degli actinobacteria, il legame non tra gli aminoacidi 3 e 4, ma tra gli aminoacidi 2 e 4 (c, corynebacterium poinsettiae; appare anche chiaro come ad essere diversa sia proprio la struttura del peptide stem, che ha una glicina in poizione 1 e un omoserina in posizione 3). Nella loro abbondanza, non tutti i peptidi stem legano tra di loro ed proprio per questo che utile utilizzare tale parametro per attuare una differenziazione tra i batteri: quanti pi legami interpeptidici si creano all'interno del peptidoglicano, tanto pi questo sar rigido. Al peptidoglicano spesso sono associate altre strutture: Nei GRAM vi una lipoproteina, la lipoproteina di Brown, che, prendendo attacco sul peptide stem, ancora il peptidoglicano alla membrana esterna Nei GRAM +, si identificano acidi teicoici. 17

Dopo 150 anni dalla scoperta dei batteri, nonostante la struttura del peptidoglicano sia conosciuta in maniera molto approfondita, ancora da chiarire il meccanismo attraverso cui questa si organizza in modo da raggiungere la sua conformazione finale. Peculiarit del Escherichia Coli? Per i Coli si sa che il peptidoglicano meno cross linked che in altri batteri, quindi vi una minor quantit di legami interpeptidici e di conseguenza i peptidi stem presentano tutte e due le DAla finali (si tratta quindi di pentapeptidi). Altra peculiarit dei Coli la presenza di poche N-acetilglucosamine anidrate, il che comporta una maggiore lunghezza del peptidoglicano rispetto ad altre cellule batteriche. In generale, comunque, nei GRAM (b) il peptidoglicano uno straterello interposto tra la membrana citoplasmatica e la membrana esterna, molto pi sottile rispetto al peptidoglicano dei GRAM+ (a). Nel Coli lo spessore del peptidoglicano in media di 6,35 nm, mentre nello Pseudomonas Aeruginosa di circa 2,41 nm (entrambi GRAM). Nei GRAM+ la struttura al microscopio elettronico si presenta decisamente non omogenea; si distinguono, per la diversa densit, una inner wall zone ed una outer wall zone. La somma di queste due zone non mai inferiore ai 40 nm. Quali sono le propriet biofisiche del peptidoglicano? Il peptidoglicano determina la forma e la resistenza osmotica del battere con specifiche propriet biofisiche. Da una parte i sacculi hanno la capacit di sopportare il turgore della cellula fino a 25 atmosfere presenti nei gram +, dall'altra i sacculi non sono rigidi ma flessibili. Quindi questo permette un'espansione reversibile sotto pressione e hanno dei pori che permettono la diffusione di grandi molecole come proteine. Poich il peptidoglicano circonda completamente la membrana citoplasmatica il sacculo ha la stessa grandezza e forma delle cellule batteriche.

Propriet del peptidoglicano


Qual' l'elasticit del peptidoglicano? Studiare l'elasticit dei sacculi di peptidoglicano non affatto facile; si devono valutare i limiti di piegatura/rottura. A noi basta sapere che sono dotati di una notevole elasticit. Qual' la porosit del peptidoglicano? I batteri hanno la necessit sia di assorbire delle molecole dall'ambiente in cui crescono (per svolgere i loro due compiti principali: la riproduzione e la costruzione delle proprie membrane) sia di espellere materiale. A tal fine, il peptidoglicano munito di pori di 2,06 nm per quel che riguarda i GRAM e di 2,12 nm nei GRAM+. Quindi molecole fino a 2 nm dovrebbero poter passare tranquillamente, ma questo avviene solo in teoria, poich durante il passaggio si crea una certa frizione. In generale, proteine tubulari neutre dal peso di 22-24 kDa possono sempre attraversare un peptidoglicano (anche quando questo non soggetto ad alcuna pressione/distensione). Quando il peptidoglicano stirato, invece, il limite si alza fino a 50 kDa. Da cosa determinata la forma del peptidoglicano? Noi siamo in grado di vedere il sacculus di peptidoglicano vuoto, senza il battere al suo interno. Questa possibilit ci ha permesso di determinare il fatto che la forma del battere determinata dal cell wall: nel caso del bacillo, ad esempio, quando il peptidoglicano svuotato mantiene sempre la 18

stessa forma, mentre il battere assume una conformazione globulare. La struttura del peptidoglicano determinata geneticamente. Vi sono dei geni che sono determinanti per la morfologia a bacillo o quella a cocco e molti di questi sono adibiti alla produzione e al rimodellamento del peptidoglicano. Gli enzimi preposti a tale compito prendono il nome di Penicillin Binding Proteins (PBP) e sono: la transglicosilasi, che allunga la catena di glicano; il meccanismo attraverso cui avviene questo fenomeno non affatto semplice, poich questo enzima non si limita ad unire tra loro l'N-acetil-glucosamina all'acido N-acetil-muramico, ma aggiunge, in contemporanea, anche i muropeptidi (ovver qualsiasi peptide associato al cell wall). la transeptidasi, che catalizza, invece, le reazioni attraverso cui avviene il cross linking.

Nei GRAM+ possibile individuare anche i geni per la sintesi degli acidi teicoici, che sono importanti per la loro parete. Avendo una carica negativi, questi acidi rendono negativa la parete dei gram positivi. Quali geni determinano la forma a bacillo? I geni maggiormente atti ad indirizzare la struttura del battere verso la forma a bacillo sono : MreB MreC MreD RodA

MreB di fatto codifica per una proteina che l'omologa strutturale di una proteina del citoscheletro degli eucarioti, l'actina. La moltiplicazione di un battere , dunque, legata anche alla sua capacit di produrre un peptidoglicano di una determinata forma e di dividerlo. Questo significa che la riproduzione della parete cellulare strettamente correlata alla riproduzione genica. Il peptidoglicano, specialmente nei batteri con alta attivit riproduttiva, non per niente una struttura statica, poich deve farsi e disfarsi di continuo. In alcuni batteri a bacillo, il peptidoglicano neosintetizzato (appena dopo la replicazione) si organizza lungo l'asse maggiore, mentre in altri si confina ai poli come nel corinae bacterium. Cosa sono il divisoma e l'elongasoma? Gia si accennato alle proteine MreB che sono omologhe strutturali dell'actina e promuovono la crescita della cellula a forma di bacillo. Oltre a queste abbiamo anche le proteine FtsZ, similtubuliniche, molecole fondamentali per la divisione della cellula e per la separazione dei cromatidi. Le FtsZ si organizzano in una struttura che prende il nome di divisoma e si stringe ad anello attorno al setto divisorio del battere. Sono proteine strutturali, che, tradotti dal gene ftsZ, vengono assemblati per formare un anello (anello Z) nel futuro sito dove si former il setto di separazione della cellula. Le MreB si aggregano, invece, per formare l'elongasoma, che avvolge il corpo del battere seguendo un percorso elicoidale per permetterne la crescita in senso longitudinale. essenziale che queste due strutture siano posizionate correttamente affinch la separazione e la successiva crescita avvengano nel modo corretto. Il gene FtsZ presente in tutti i batteri e gli archea (eccezion fatta per pochi di questi ultimi). Manca, invece, nei batteri che non hanno il cell wall. FtsZ ha due domini GDP (guanosin difosfato) che viene, chiaramente, consumata durante la polimerizzazione di questa tubulina. 19

Queste proteine riescono a svolgere il proprio compito grazie ad una stretta collaborazione con le PBP (transglicosilasi e transpeptidasi). Quali sono le funzioni del peptidoglicano? In conclusione, si pu dire che le funzioni del peptidoglicano sono quattro: resistenza alla pressione osmotica forma cellulare divisione cellulare zattera per lancoraggio di polimeri di superficie (lipoproteine di Brown per i gram-negativi, acidi teicoici per i gram-positivi, capsula).

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Lezione 3, 05 ottobre 2011

3. Differenza tra divisione in bacilli e cocchi


Funzioni del'FtsZ e del MreB? Abbiamo detto che il battere cresce, si divide e si allunga. Alla base di questo ci sono due tipi di proteine che sono omologhe alle proteine del citoscheletro degli eucarioti: proteina FtsZ: un proteina tubulina like, similtubulinica, cio somiglia alla tubulina nelle cellule eucariotiche, ed organizza il setto. una GTPasi tradotta dal gene FtsZ che forma una struttura ad anello, chiamato anello Z, utilizzato come zattera per l'assemblaggio degli altri componenti del divisoma. Fa parte della famiglia delle proteine Fts. proteina dell'allungamento MreB: l'omologa dell'actina degli eucarioti. In assenza di questa proteina i batteri conservano la forma sferica.

Cosa sono il divisoma e l'elongasoma? FtsZ assieme ad altre proteine costituisce il macchinario del setto chiamato divisoma. L'assemblaggio del divisoma inizia con il posizionamento dell'anello di FtsZ al centro della cellula, stabilizzato da FtsA (una proteina simile all'actina) e ZipA. Successivamente vengono reclutate altre proteine Fts che formano diversi subassemblaggi. MreB invece contribuisce nella costituzione del macchinario dell'allungamento, l'elongasoma. Il gene fu identificato in E.coli come quel gene che permette di mantenere la forma a bastoncello della cellula, infatti MreB e omologhi sono presenti nei bastoncelli ma mancano nei cocchi. I 2 macchinari collaborano tra loro.

Divisione nei bacilli


Quale processo in pi hanno i bacilli rispetto ai cocchi? Questi batteri a differenza dei cocchi veri e propri utilizzano sia il macchinario di divisione che di allungamento.Gli esempi pi classici di bacilli sono l'Escherichia coli (bacillo gram-negativo), che presenta la membrana plasmatica, il peptidoglicano e la outer membrane, e il Bacillus subtilis (gram-positivo), avente la membrana cellulare e peptidoglicano. Questi 2 batteri hanno macchinari molto simili ma con nomi diversi. Essi utilizzano 2 differenti modi di divisione. Nella fase di allungamento il nuovo cell wall inserito in maniera diffusa sulle pareti laterali, invece in un momento differente viene allungato solo in corrispondenza del setto di divisione. Qui avviene il bivio tra le 2 modalit di divisione: i bastoncelli gram-positivi (B. subtilis) sintetizzano il setto tra le 2 cellule figlie e poi si dividono grazie a delle autolisine che erodono il rivestimento di mureina; i bastoncelli gram-negativi (E.coli) 21

si dividono per costrizione degli strati del cell wall (analogamente ai cocchi). Come avviene la divisione nei batteri a bacillo? Per prima cosa il disco di FTSZ si pone al centro. Per far si che si ponga al centro intervengono 2 componenti importanti: Il componente Min proteins. Queste sono tre proteine, codificate tutte dall'operone MinCDE, che cooperano per formare un sistema oscillatorio autogestito. MinD un'ATPasi che interagisce con MinC per formare un inibitore di FtsZ associato alla membrana. L'attivit di MinE restringe il complesso MinCD ai poli della cellula permettendo che la divisione cellulare avvenga al centro della cellula. MinCD oscilla tra i poli della cellula circa ogni minuto. Le min proteins inibiscono la formazione dell'anello Z in regioni prive di DNA ossia ai poli della cellula (la delezione di queste proteine provoca la formazione dell'anello Z nei poli e la produzione di minicellule prive di DNA) L'altra componente il nucleoid occlusion: tendenza dell'anelloZ di formarsi in regioni prive di DNA (inibizione della formazione di FtsZ dovuta alla presenza del nucleoide, mediata dalle proteine Noc e SlmA).

Inoltre vi il problema della replicazione del cromosoma. I 2 cromosomi infatti si devono staccare ed in seguito portarsi al centro delle 2 nuove cellule. Anche questo fenomeno dovuto a FtsZ. Come avviene l'allungamento? Invece per quanto riguarda l'allungamento la proteina che svolge un ruolo molto importante e che omologa a quella citoscheletrica presente negli eucarioti prende il nome di MreB (murein cluster). Essa viene codificata da un operone che codifica per MreB, MreC, MreD. In molti batteri interviene anche un'altra proteina che prende il nome di RodA . Entrambi i macchinari nello svolgere la loro attivit spendono energia. Quindi ambedue hanno alla base una attivit ATPasica o GTPasica. Esse legano l'ATP o il GTP e lo idrolizzano perch hanno bisogno dell'energia immagazzinata nell'ATP e nel GTP. MreB consuma energia legandosi al guanosin fosfato e producendo dei filamenti che si auto-organizzano.

Divisione nei cocchi


Nei cocchi veri e propri come lo S. Aureus non vi l'allungamento ma solo il processo di divisione. Questi sintetizzano nuovo cell wall all'equatore che sufficiente a guidare la divisione dei cocchi. In questo modo si generano i 2 nuovi poli delle cellule figlie. Come si dividono i cocchi rispetto alla modalit di divisione? Questo per ci che accade nei cocchi veri e propri. Infatti esistono 2 tipi di cocchi che si comportano in maniera differente: 1. I cocchi veri e propri come lo Stafilococcus aureus 2. Gli ovococchi. Osservandoli al microscopio ci si accorge che non sono come i veri cocchi poich presentano un diametro lievemente pi esteso. In alcuni ovococchi si trovano degli omologhi di MreB e quindi si suppone che vi sia un lieve allungamento dei diametri dovuto ad un macchinario simile all'elongasoma. Vi sono dei batteri per che non crescono cos. Il pi noto il genere corynebacterium, tra cui presente il corynebacterium diphtheriae della difterite. Questo per non viene usato per gli 22

esperimenti perch pericoloso. Viene utilizzato quindi un battere sempre appartenente a questo genere, il bacterium glutammicum (importante per la microbiologia generale ma non per quella medica) il quale si visto che cresce ai poli.

In quale specie si trova il MreB? Il setto uguale per tutti, lo troviamo nei cocchi, nei bacilli e nei batteri che si allungano ai poli. MreB si trova fondamentalmente nei bacilli e in qualche ovococco. Quello che succede ai poli nei corynebatteri non certo. L'allungamento dei corynebatteri non avviene per deposizione di una parete batterica lungo l'asse maggiore ma avviene ai 2 poli. Lo studio di queste strutture avviene in batteri che non interessano la microbiologia medica. L'MreB viene studiato in un batterio termofilo che vive a temperature molto elevate, negli Archea termofili, che non sono dei batteri, e alcuni batteri sono stati trovati nei geyser.

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Lezione 4, 07 settembre 2011

4. Divisione batterica
Sintesi del Peptidoglicano
Come avviene la sintesi del peptidoglicano? Sintesi: Dopo essere sintetizzato dal MurABCDEF nel citoplasma, l'UDP-MurNAcpentapeptide poi trasferito all'undecaprenil fosfato dal MraY, generando il lipide I. Successivamente, MurG sintetizza il lipide II aggiungendo GlcNAc (dal UDP-GlcNAc) al lipide I. Il Lipide II traslocato attraverso la membrana interna (IM) da una flippasi ignota. Sul versante periplasmico del IM, glicosiltransferasi (PGT) assemblano ed allungano le catene glicaniche, e le transpeptidasi (Tps) effettuano il cross-linking delle loro catene peptidiche (linee tratteggiate). DD-carbossipeptidasi (Cps) rimuovono il D-Ala terminale dal pentapeptide stem dal peptidoglicano maturo. Il Peptidoglicano viene prodotto nel suo mattone fondamentale a livello del citoplasma in due passaggi. Innanzitutto viene sintetizzato un Muramil-pentapeptide che viene subito legato ad un lipide, l'Undecaprenil fosfato, attraverso il consumo di UDP in una reazione catalizzata dall'enzima MraY. In questo modo viene prodotto il Lipide I che resta attaccato all'interno della membrana cellulare. Nel secondo passaggio viene consumato un altro UDP e, per azione dell'enzima MurG, si aggiunge anche il secondo zucchero, l'N-Acetil-Glucosammina, dando luogo al Lipide II. L'Undecaprenile serve a far s che il mattone fondamentale, che costituito da N-AcetilGlucosammina - Acetil- Muramico pentapeptide, viaggi gi legato alla membrana cellulare e che la possa poi attraversare. Cos' la flippasi? Nel passaggio successivo il Lipide II viene trasportato in qualche modo all'esterno della membrana cellulare. Come si vede nell'immagine, in questo passaggio c' un punto interrogativo 24

perch non stato ancora trovato con certezza qual' l'enzima che opera questo trasferimento, perci stato genericamente chiamato Flippasi. Quali enzimi operano l'assemblaggio del peptidoglicano? Ci ritroviamo cos all'esterno della membrana cellulare del batterio, dove avviene l'assemblaggio del peptidoglicano attraverso due tipi di enzimi fondamentali. Il primo la Transglicosilasi che unisce tra loro i vari mattoni al livello degli zuccheri (N-acetil-muramico e N- acetil-glucosamina) e quindi allunga sempre pi questo strand a cui sono legati i penta peptidi. Il secondo enzima la Transpeptidasi, che lega i filamenti gli uni agli altri con un legame tra penta peptidi di filamenti diversi. Cosa sono i PBP? Questi due gruppi di enzimi variano da batterio a batterio, e talvolta anche all'interno dello stesso batterio, e sono quelli che vengono chiamati Penicillin Binding Protein, proteine che legano la penicillina. Il nome deriva dal fatto che furono identificati con un esperimento molto semplice che consisteva nel fare un elettroforesi di un preparato di sintesi di peptidoglicano in presenza di penicillina marcata con isotopo radioattivo. Naturalmente le proteine andavano a separarsi nel campo elettrico in un tampone basico a seconda del proprio punto isoelettrico, permettendo cos agli sperimentatori di notare che batteri diversi avevano bande diverse di proteine, all'epoca rilevate ponendo una pellicola radiografica sull'elettroforesi, registrando gli isotopi. Diversi batteri hanno numeri di bande diversi che si pongono anche a punti isoelettrici diversi. Questo discorso vale soprattutto per le Transpeptidasi, anche se va considerato che spesso lo stesso enzima ha un dominio transpeptidasico e uno transglicosidasico. Come sono collegate la trasformazione e la resistenza alla penicillina? Un batterio che studiamo molto in laboratorio lo Streptococcus Pneumoniae, che ha una capacit di trasformazione elevatissima, tanto vero che stato il batterio fondamentale per lo studio del premio nobel assegnato a Fleming, Chain e Florey negli anni quaranta. (*The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1945 was awarded jointly to Sir Alexander Fleming, Ernst Boris Chain and Sir Howard Walter Florey "for the discovery of penicillin and its curative effect in various infectious diseases". ndr) Questa trasformazione non si applica solo alla capsula, ma anche alle PBP. Ci che accade che lo S. Pneumoniae esprime proteine non proprie, che derivano dall'acquisizione del DNA di un altro Streptococcus Pneumoniae. In questo modo si viene a formare una sorta di mosaico di proteine. Ad esempio un certo Streptococcus Pneumoniae ha una PBP3 diversa in qualche aminoacido rispetto alla PBP3 di un altro. Poich hanno capacit di trasformazione, uno assume il DNA dell'altro, ed ovviamente anche quello codificante per la parte differente della PBP3. Poich lo Streptococcus Pneumoniae non solo trasformabile ma anche capace di ricombinazione omologa, pu ricombinare il proprio PBP3 diventando resistente alla Penicillina, in quanto non pi in grado di legarla. Risultano evidenti i risvolti pratici nella clinica, nella somministrazione di antibiotici ai pazienti. Prima era un assioma il fatto che gli pneumococchi fossero sensibili alla Penicillina g, quella di Flemming, e pertanto le polmoniti venivano curate con la penicillina; e lo stesso discorso vale per lo Streptococcus Pyogenes che provoca faringite (unico batterio a provocarla). Poi per in Sudafrica isolarono, circa quindici anni fa, dei Pneumococchi resistenti alla penicillina, in quanto aventi delle PBP che non legano pi le penicilline. Ecco perch noi studiamo il peptidoglicano. 25

Rispetto al batterio, dove viene assemblato il peptidoglicano? Quindi abbiamo scoperto che in realt il peptidoglicano viene assemblato al di fuori della membrana cellulare da enzimi prodotti per dal batterio, che hanno quindi un legame con la membrana cellulare. In alcuni casi stata anche identificata la Flippasi, ad esempio MurJ nel Coli, ma non abbiamo ancora certezze. Quali elementi danno la diversit del peptidoglicano? Il peptidoglicano diverso da batterio a batterio: per il mattone fondamentale; per via del legame tra un pentapeptide e l'altro; per il numero dei legami tra pentapeptidi; gli amminoacidi dei peptidi.

Mescolando insieme questi tre elementi troviamo gi una notevole variabilit.

Rimodellamento del Peptidoglicano - divisione


A opera di quali enzimi avviene il rimodellamento? La struttura base che costituisce il peptidoglicano l'abbiamo appena vista, quindi dopo polimerizzazione con la Glicosil Transferasi, viene quindi rimodellato dalle Idrolasi: muramidasi, glucosaminidasi e endopeptidasi, che intervengono quindi allungando o accorciando gli strands. Come si nota l'attivit di questi enzimi? L'intervento di questi enzimi che rimodellano il peptidoglicano si pu notare marcando i mattoni fondamentali nel tempo, cio quando il batterio non dormiente ma in metabolismo attivo a velocit non alta (teniamo presente che abbiamo batteri in cui il tempo di moltiplicazione lungo, ad esempio quello della tubercolosi ha un tempo di 12 ore, ed altri come l'E. Coli che hanno solo mezz'ora di tempo di moltiplicazione, che si prestano meglio a questi studi). Inoltre vanno considerati i fattori ambientali: in acqua un batterio non si moltiplica perch ha bisogno di aminoacidi e di una sorgente di energia come uno zucchero. Per cui a seconda di dove si trova il batterio cambiano anche i suoi tempi di moltiplicazione e rimodellamento. Quali sono le propriet del peptidoglicano? resistenza osmotica; forma; intervento nella divisione. La struttura del peptidoglicano diversa tra batteri gram negativi, bacilli gram negativi, bacilli gram positivi, gli ovococchi gram positivi e i cocchi veri. Per esempio ogni mattone ha il suo peptide e possono essere orientati nello stesso senso o in sensi diversi, quindi la topologia di attacco dei peptidi importantissima. Figura di un ovococco, gram positivo. Non patogeno. Interessante perch ha un unico peptidoglicano, anche se si possono distinguere due zone differenti con il microscopio elettronico, una interna e una esterna.

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Il peptidoglicano mostra una struttura a rete? Sembrerebbe una struttura logica, con gli strands di N-Acetil-glucosammina posizionati sia di lato che lungo l'asse posto a 90 gradi del batterio, e quindi i vari legami transpeptidasici. Pare invece che le cose non stiano cos. Figura di un bacillo, gram positivo. Vediamo i tagli che si fanno con dei particolari coltelli microscopici, per studiare la struttura del peptidoglicano. Bisogna riuscire a scolpire la superficie, o tagliarla direttamente a novanta gradi. Importante la metodica di microscopia elettronica utilizzata. Questa la metodica classica, con cui vediamo il cell wall, la inner e l'outer membrane. Se usiamo una metodica molto pi moderna allora vediamo una struttura parecchio diversa: si evidenzia lo spazio periplasmatico Il peptidoglicano si mostra con una struttura ad alta densit verso lo spazio periplasmatico e ad una a bassa densit verso l'esterno. Proprio questo il modello pi accreditato finora dell'impalcatura del peptidoglicano sia dal punto di vista biochimico che microscopico. Ricordiamoci che il batterio per dividersi deve anche costruire un secondo peptidoglicano al livello del setto. I gram negativi devono costruire outer membrane, peptidoglicano e membrana cellulare. Come avviene la divisione nello Stafilocco aureus? C' un primary wall e un secondary wall (questi non sono assolutamente nomi ufficiali il secondary cell wall presente solo nelle piante), e nell'ambito di questo si formano strutture strane che vennero chiamate murosomi (che secondo lui sarebbero vescicole prodotte da idrolasi che poi idrolizzano il peptidoglicano e separano le cellule), che inducono da un lato e dall'altro l'inizio della formazione del setto. Quando inizia a formarsi il setto divisorio, vengono a costituirsi altre strutture anch'esse poco note ma visibili, che formano lo Splitting System. Quindi nel caso dei cocchi veri abbiamo l'intervento di queste strutture particolari, mentre nello steso tempo la membrana cellulare costruisce un secondo strato di peptidoglicano, che assolutamente necessario per far s che quando poi lo splitting system divide le due cellule ci sia peptidoglicano in entrambe. [Altra foto lavoro recente struttura normale del cell wall dello Stafilocco Aureus] In questa immagine fatta con un microscopio molto particolare che si chiama Atomic Force Microscope, vedete il cocco che si divide: il setto che avanza lungo tutta la circonferenza del cocco e i murosomi che intervengono. La superficie dello stafilococco non si presenta liscia, quindi il peptidoglicano non totalmente omogeneo. Cos' l'AFM? Il microscopio a forza atomica (spesso abbreviato in AFM, dall'inglese Atomic Force Microscope) un potentissimo microscopio a scansione di sonda (SPM) che fornisce un'immagine bidimensionale di un campione, producendo un reale profilo tridimensionale della superficie. I campioni analizzati da un AFM non richiedono nessun trattamento speciale (metallizzazione e grafitizzazione) che potrebbe modificare o distruggere irrimediabilmente il campione. L'AFM non va ad attraversare la cellula ma ne vede la superficie, viaggia lungo l'asse della cellula come fosse quasi una tac. 27

Qual' la differenza nella divisione tra bacilli e cocchi? Nei Bacilli gram positivi e negativi Coli, i pi studiati, il cell wall si deporta al setto nella giunzione e poi viene sintetizzato nell'allungamento. Nel caso dei bacilli sia gram positivi che gram negativi che si dividono e si allungano riscontriamo sia l'anello di FtsZ sia la spirale (deposizione lungo tutta la membrana cellulare) di MreB. Nei cocchi veri, abbiamo visto che il peptidoglicano nuovo invece depositato solo a livello del setto perch non c' un allungamento. Nello Stafilococcus Aureus, che non si allunga, non si individua MreB. Cos' la streptomicina? Esistono batteri che hanno anche ramificazioni che producono sostanze che possono essere letali per altri batteri. Ad esempio mentre il primo antibiotico, la penicillina, fu scoperto in una muffa, il secondo, la streptomicina, fu scoperto proprio in un batterio (La streptomicina un antibiotico battericida, il primo ad essere scoperto di una famiglia chiamata amminoglicosidi, uno dei primi rimedi contro la tubercolosi. Viene ottenuto dagli attinobatteri, ndr). A tal proposito non possiamo non citare una gloria nostrana, l'igienista sardo Brotzu, che da colture riusc ad individuare un fungo che produceva un principio attivo efficace contro i batteri gram- negativi. Si trattava del "cefalosporium", che in seguito avrebbe portato alla scoperta londinese di una nuova classe di antibiotici, le cefalosporine.

Penicillin binding proteins (PBP)


Come si dividono le PBP? Le Penicilline Binding Protein si dividono in basso o alto peso molecolare (low high molecular weight binding protein), e ne esistono almeno 10 tipi diversi nei batteri finora studiati. Sono TUTTE associate alla membrana, come anche tutti gli altri enzimi coinvolti nella formazione del peptidoglicano, che per tanto un processo geneticamente controllato in cui la membrana cellulare stessa si occupa topologicamente della produzione del peptidoglicano. La classifica delle PBP nel Coli: High Molecular Weight di classe A, che sono tutte transglicosilasi - transpeptidasi o solo transglicosilasi; HMW di classe B che sono tutte transpeptidasi; Low Molecular Weight che sono carbossipeptidasi, endopeptidasi, o enzimi contenenti ambeude i domini.

Qual' il ruolo delle PBP nella divisione e allungamento? Le PBP intervengono nella formazione sia del divisoma sia dell'elungasoma, in collaborazione con le strutture principali: 28

Il divisoma viene organizzato da FtsZ; l'elungasoma viene organizzato da MreB.

Per, come dicevamo, nei macchinari del setto, intervengono anche le PBP, perch se si produce nuovo peptidoglicano non possono non esserci. Quindi FtsZ a livello del setto e MreB lungo tutto il bacillo organizzano un piccolo artigianato di produzione di peptidoglicano, in cui reclutano anche PBP. PBP coinvolte nel divisoma del Coli al setto FtsZ recluta 4 PBP: la 1a o 1b, 3, la 4 e la 6. PBP coinvolte nell'elongasoma del Coli MreB recluta 4 PBP: 1a o 1b, la 2, la 4 e la 6.

Come si moltiplica il bacillo? Quando arriva l'input della moltiplicazione si posiziona FtsZ che recluta le altre molecole ZipA, FtsA, ZapA, e quindi si ha l'assemblaggio del vero e proprio divisoma e la cellula pu dividersi. A questo punto sia ha una costituzione, la cellula cio pi stretta che nelle altre parti e quindi si ha la divisione vera e propria. Intervangono le PBP 2, 3 e 5 (tutte transpeptidasi) e poi la 1a o 1b che la transglicosilasi. In mancanza di FtsZ avremo quindi un batterio lunghissimo che non riesce a dividersi. Se mancano altri enzimi o molecole tra quelli citati, avremo la costrizione ma comunque non la divisione. Per l'allungamento invece c' bisogno di questa struttura elicoidale MreB (infatti i batteri knock out per questo gene non crescono). Quello che fondamentale la differenza tra divisoma ed elongasoma nel reclutare rispettivamente PBP3 e PBP2. Esiste anche una temporizzazione: l'attacco delle molecole sequenziale e il fatto che la sequenza sia giusta assicura la corretta formazione del macchinario e quindi della divisione. Come si dividono i cocchi e qual' la differenza nella divisione nei due gruppi? Cocchi si devono dividere in due gruppi: cocchi veri e propri (come lo stafilococcus aureus); ovococchi (come gli streptococchi e gli enterococchi)

Mentre nei cocchi veri il peptidoglicano viene assemblato al livello del setto, nella divisione negli ovococchi si vede che c' del peptidoglicano allungato, il che lascia supporre la presenza di una produzione laterale. Per il resto il macchinario di divisione di un Ovococco praticamente uguale. I nomi sono diversi ma le proteine sono omologhe a quelle dei bacilli e il funzionamento anche. C' sia il divisoma che l'elongasoma.

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Cosa succede se fornisco mattoni fondamentali sbagliati al bacillo? I batteri si moltiplicano ma mantengono la loro forma. Se vogliamo possiamo trasformare un bacillo in un cocco, distruggendogli il peptidoglicano, ma non appena gli restituiamo i mattoni necessari per costruirlo, lui si ritrasforma in un bacillo. La forma del batterio quindi determinata geneticamente. Domanda: E se gli fornisco i mattoni fondamentali sbagliati? Risposta: Il batterio sar in grado di tagliarli per ottenere gli aminoacidi necessari alla costruzione del proprio peptidoglicano. In quali cocchi non siamo sicuri se ci sia un elongasoma? L'elongasoma evidente negli Enterococchi ma non negli Streptococchi, per i quali non abbiamo ancora avuto conferme in laboratorio.

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Lezione 05, 12 ottobre 2011

5. Esperimenti storici
Esperimento di Griffith: la capsula un fattore di virulenza
Come fanno i S. pneumoniae a sviluppare resistenza contro la penicillina? I topi sono molto sensibili allo Streptococcus pneumoniae, che un ovococco che causa le polmoniti globali acute. una malattia molo grave che prima dell'antibiotico uccideva l'80% dei malati. Colpisce persone immunosoppresse oppure che hanno comorbilit molto complesse. Per via del trasferimento genico, lo streptococco capace di riassortire i geni delle PBP che ha ed in grado di produrre PBP non sue che non sono buoni recettori della penicillina. Ecco perch abbiamo pneumococchi resistenti alla penicillina. Questi oltre ad avere il cell wall hanno anche una capsula. Esistono una novantina di tipi antigenici di capsula. Si tratta di una struttura polisaccaridica. Non nemmeno antigenica, cio non induce il riconoscimento. La struttura impedisce una delle difese innate dell'organismo del mammifero. Vuol dire che la capsula se non ci sono anticorpi contro la capsula stessa non viene fagocitata dai macrofagi. Non si ha l'opsonizzaizione mediata da anticorpi. Sappiamo che che ne sono 90 tipi antigenici. Griffith ne conosceva solo 4. Qual' l'importanza dell'esperimento di Griffith? L'esperimento di Frederick Griffith del 1928 fu uno dei primi esperimenti a suggerire che i batteri sono in grado trasferire informazioni genetiche attraverso un processo noto come trasformazione. Egli era a conoscenza del fatto che i topolini erano molto sensibili allo pneumococco (streptococcus pneumoniae), un batterio che la causa principali delle polmoniti globali acute (in epoca preantibiotica aveva l80% della letalit, oggi circa 15-30%). Lo pneumococco possiede oltre al cell wall anche una capsula polisaccaridica (difficile da opsonizzare), presente su alcuni ceppi. Nellesperimento furono utilizzati due ceppi batterici: Ceppo S (smooth, aspetto liscio conferito dalla presenza della capsula) Ceppo R (rough, aspetto rugoso causato dallassenza della capsula a causa di una mutazione)

Griffith osserv che iniettando nel topino il ceppo S ne causava la morte; al contrario uniniezione del cappo R non aveva effetti letali sul topino. Se lo pneumococco S veniva ucciso sottoponendolo a shock termico e iniettato nel topino, questo (in accordo con le previsioni) viveva. Infine fu somministrata al topino una soluzione contenente sia batteri lisci resi blandi al calore sia batteri rugosi, e inaspettatamente si osservato che il topino moriva. Griffith ipotizz quindi la presenza di una sostanza contenente linformazione genetica (che chiam principio trasformante) che dal batterio morto si trasferiva in quello vivo permettendo la sintesi della capsula polisaccaridica e di conseguenza linsorgere della malattia.

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Come avvenne in dettaglio la trasformazione? Griffit ha usato batteri che avevano perso capsula di ceppo 3, che vuol dire che sono riconosciuti da un anticorpo specifico per il ceppo 3. Ha usato i batteri rugosi di ceppo 3 e li ha uniti con quelli lisci morti di ceppo 1. La capsula alla fine era di tipo 1. Mescolando il bollito di tipo 1 e i rugosi di tipo 3 dopo generazioni si continua a generare capsule di tipo 1. Questo ha agitato tutti, perch non si sapeva quali erano le molecole che contenevano l'informazione genetica. Cosa poteva essere? Proteine, acidi nucleici, glucidi e lipidi. Nessuno pensava che una molecola da tre atomi poteva contenere l'informazione genetica. Molecole piccole era abbastanza improbabile che fossero la sede dell'informazione. Molecole ripetute invece s. Qual' il significato della curva a S? Se inietto una capsula di tipo 1 nei topi la inietto almeno in 6 topi, questo perch in biologia vige il concetto di curva a S. Se inietto uno pneumococco capsulato al primo e poi aumento la dose esponenzialmente negli altri, succede che si forma una curva a S: in alcuni casi il tasso di mortalit 0, poi la curva sale in modo logaritmico. Arrivati ad un certo momento muoiono sempre tutti. A questo punto il tasso di mortalit del 100%. questa curva risponde ad una distribuzione gaussiana. In ogni punto ci sono i controlli. Questo fenomeno detto trasformazione. Il soggetto che d la trasformazione il DNA. In un ceppo di pneumococco che in genere competente per la trasformazione la percentuale di cellule che viene trasformata proporzionale alla quantit di DNA che presente nel liquido di coltura. Chi concluse e spieg l'esperimento di Griffith? Avery, McLeod e McCarty.

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Esperimento di Avery, McLeod e McCarty informazione genica nel DNA


Come fecero Avery, McLeod e McCarty a verificare l'ipotesi di Griffith? Quando Oswald Avery lesse i risultati di Griffith insieme a Colin McLeod e Maclyn McCarty cominci una serie di esperimenti usando una provetta al posto del topo. Usarono detergente per lisare le cellule S uccise dal calore e quindi usarono il lisato per gli esperimenti di trasformazione. La provetta funzionava bene mostrando che il lisato delle cellule S uccise poteva cambiare R in S. Il principio trasformante era qualcosa nel lisato. Avery, Mac Leod e McCarty testarono ciascun componente del lisato per lattivit trasformante. Dapprima incubarono il lisato delle cellule S uccise con un enzima, SIII, che rosicchia completamente la parete di zucchero. Testarono quindi la capacit trasformante dei lisati privi di parete cos ottenuti. Questi lisati mantenevano la capacit trasformante. Poi incubarono gli estratti S privi di parete con enzimi proteolitici, la tripsina e la chimotripsina, e testarono questo lisato per la capacit trasformante. Ancora questi lisati senza proteine mantenevano la capacit trasformante, si dedusse quindi che il principio trasformante non era una proteina. Mentre stavano testando e purificando il lisato, il DNA precipit in alcool, Avery, Mac Leod e McCarty furono i primi ad isolare gli acidi nucleici da Pneumococcus. Dal momento che il principio trasformante non era lo zucchero e non era una proteina, sospettarono che potessero essere uno degli acidi nucleici. Dissolsero il precipitato in acqua (esperimento in laboratorio) e testarono la capacit trasformante della soluzione. Per primo distrussero RNA usando un enzima RNasi e questa soluzione manteneva la capacit trasformante, quindi lRNA non poteva essere il principio trasformante. Restava nella provetta DNA puro, e come test finale incubarono la soluzione con un enzima DNasi e testarono questa soluzione per la capacit trasformante: la soluzione era incapace di trasformare. I tre scienziati conclusero che il DNA era il principio trasformante e pubblicarono i risultati nel 1944. Sintesi: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Estratti purificati di ceppi S per caratterizzare il principio che transforma. Il materiale era resistente alle proteasi; non containeva lipidi o carboidrati. Se il DNA nell' estratto viene distrutto, si perde il principio che trasforma. Il DNA purificato isolato dagli estratti dei ceppi S transforma i ceppi R. Avery sugger che il DNA era il materiale genetico. Questa stata la prima prova sperimentale che il DNA il materiale genetico

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Esperimento di Luria e Delbruck teoria costitutiva


Salvatore Luria (medico ebreo torinese) e Max Delbruck (fisico teorico ebreo tedesco) focalizzarono lattenzione sulle mutazioni, ideando il famoso test di fluttuazione. Lesperimento consiste nellosservare la reazione di ceppi di E.Coli a contatto con dei fagi, e capire se la capacit di resistenza al virus venisse ereditata geneticamente oppure no (tramite ad esempio mutazione del recettore per il fago). In altre parole: il fago a indurre la resistenza a se stesso su E.Coli oppure no? Se la resistenza non fosse causata da componenti genetiche ed ereditabili, ogni piastra avrebbe dovuto contenere allincirca lo stesso numero di colonie resistenti; se invece il virus selezionava batteri gi resistenti, la distribuzione degli individui sopravvissuti all'infezione sarebbe dovuto risultare diseguale, con valori "fluttuanti" da una coltura all'altra. I risultati confermarono la seconda ipotesi. I due studiosi inserirono in delle piastre con del terreno di coltura solido (agar + zucchero + brodo di carne) una certa quantit di fagi e aggiunsero E.Coli (i batteri sono normalmente sensibili al fago). 1. Nel primo esperimento gli E.Coli moltiplicati in una fiasca sono stati aggiunti in uguali quantit sulle piastre contenenti terreno di coltura e fagi. Risultato: diverse piastre presentavano colonie di batteri resistenti al fago, tuttavia applicando la formula della varianza sul numero dei batteri mutanti resistenti (per capire se la loro mutazione fosse dovuta al caso o fosse sistematica) scoprirono che non cera nulla di anomalo, quindi casuale. 2. Nel secondo esperimento invece suddivisero i batteri in 50 provette (e non in una fiasca unica) e una volta moltiplicati li inserirono sulle piastre. Questa volta il calcolo della varianza effettuato sui batteri mutanti resistenti nelle varie colonie produsse risultati anomali (ovvero il valore della varianza era di molto differente rispetto alla media). Spiegazione di Luria e Delbruck: i batteri resistenti sono mutanti che derivano da mutazioni spontanee verificatesi durante la loro crescita, pertanto ogni coltura avr un numero altamente variabile di mutanti (dal momento che nel secondo esperimento la crescita avviene in maniera indipendente in 50 provette diverse; questo significa che se in una provetta la mutazione avviene al tempo x avremo un determinato numero di batteri mutanti, se invece la mutazione avviene al tempo x+1 avremo un numero di mutanti minore).

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Essi ipotizzarono inoltre che la mutazione

avvenisse a livello del gene che codifica per il recettore del fago, ed effettivamente proprio cos. [figura 3.4]

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Circa 15 anni dopo lesperimento stato riproposto [figura 3.2] utilizzando questa volta la streptomicina (antibiotico isolato nel 1944) al posto del fago. Lantibiotico ha effetti letali su E.Coli ma come nel precedente caso il batterio pu sviluppare resistenza. In particolare: 1. Venne coltivato E.Coli in una fiasca contenente terreno liquido e poi inserito su delle piastre contenenti terreno di coltura solido e streptomicina. Risultato: nessuna crescita di colonie. 2. Venne coltivato E.Coli in una fiasca contenente terreno liquido e streptomicina, e poi inserito su delle piastre contenenti terreno di coltura solido e streptomicina. Risultato: in alcuni casi ritroviamo colonie in crescita. Il test di fluttuazione dimostr anche in questo caso che le mutazioni che portano alla resistenza alla streptomicina non sono dovute allantibiotico, bens la streptomicina agisce come elemento selezionatore dei batteri resistenti. ESPERIMENTO DI LEDERBERG Joshua Lederberg faceva parte di un gruppo di ricerca che studiava i batteri mutanti, in particolare isolava batteri auxotrofi* per un determinato fattore. Condusse numerosissimi esperimenti inziando la ricerca su questi batteri inserendoli in un terreno minimo, costituito da una sorgente di azoto (ammonio), da un saccaride semplice (glucosio) e da un tampone che mantiene stabili i livelli di pH.

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Accadde che in un terreno semplicissimo di questo tipo

determinati batteri non crescessero (perch privi di un elemento fondamentale per la loro crescita). Lederberg inizi allora ad introdurre questi elementi (ad esempio amminoacidi) e in quel caso scopr che una colonia non cresceva a causa di un deficit di istidina. Fece questo esperimento per tutti gli amminoacidi, le vitamine e una quantit enorme di altri fattori riuscendo a isolare diverse popolazioni di batteri auxotrofi. Successivamente invent la tecnica della piastratura delle repliche (replica plating) per dimostrare la spontaneit di tali replicazioni. [figura 3.22] Attraverso questa tecnica si possono ottenere un numero variabile di capsule Petri contenenti un terreno di coltura solido su cui sono fatte crescere colonie batteriche: le colonie hanno su tutte le piastre la stessa disposizione spaziale. In questo modo si hanno tante piastre cloni, tutte identiche tra loro. Si parte da una capsula iniziale (la piastra primaria) non selettiva contenente il terreno e un certo numero di colonie cellulari che devono essere studiate; sulla piastra viene appoggiato delicatamente un disco coperto da uno strato di velluto sterile, una membrana di nitrocellulosa o un filtro di carta, in modo da farvi aderire qualche cellula per ciascuna colonia. Il panno o filtro viene poi premuto su altre piastre sterili (le piastre secondarie, selettive ad esempio per un determinato amminoacido): in questo modo le cellule si depositano sul terreno e, dopo il periodo di incubazione, genereranno colonie cos come erano disposte nella piastra primaria.

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Se alcune colonie delle piastre secondarie non crescono, grazie alla piastratura possibile andare a recuperare quella colonia sulla piastra primaria e verificare se quei batteri erano gi mutanti oppure no (nella piastra primaria assente qualsiasi agente selettivo).

Questo divenne un sistema standard per produrre mutanti. Si prendeva infatti un mutageno (ad esempio raggi UV) e lo si esponeva su una coltura. Risultato: maggioranza di batteri morti, minoranza di batteri vivi, e pochi batteri mutanti. Come isolarli? Questi batteri venivano coltivati e poi seminati in un terreno minimo contenente penicillina, in questo modo i batteri vivi che erano sopravvissuti al mutageno morivano e restavano soltanto i mutanti. A questo punto con la tecnica del replica plating venivano presi i batteri e piastrati su varie piastre selettive per vari fattori, e troveremo il mutante auxotrofo per il fattore che ci interessa. (Nobel per la medicina nel 1958 a 33 anni) Grazie a questa tecnica Lederberg si trov di fronte a due ceppi mutanti speculari: - Ceppo A: auxotrofo per metionina e biotina, prototrofo per treonina, leucina e timina. - Ceppo B: prototrofo per metionina e biotina, auxotrofo per treonina, leucina e timina. Avendo a disposizione questi due ceppi gli venne la curiosit di metterli insieme e vedere cosa succedeva. Seminarono sia il ceppo A sia il ceppo B in un terreno minimo e come previsto le due colonie non crescevano (perch auxotrofe). Seminarono poi sempre in un terreno minimo i due ceppi insieme e sorprendentemente cera crescita di colonie.

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Applicarono una membrana semipermeabile per verificare se lo scambio di informazioni tra i due ceppi era dovuto a un transito di molecole oppure a un contatto vero e proprio tra i batteri. I risultati dimostrarono la seconda ipotesi [fenomeno della Coniugazione*]. *La coniugazione batterica un processo con il quale una cellula batterica trasferisce porzioni di DNA ad un'altra tramite un contatto cellula-cellula. Il fenomeno pu cos portare al verificarsi di ricombinazione genetica nei batteri. I segmenti di materiale genico trasferibile, che si trovano liberi nel citoplasma del batterio, sono detti plasmidi: sono di forma circolare e capaci di replicarsi in modo indipendente dal cromosoma batterico.

ESPERIMENTO DI MONOD E JACOB

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Jacques Monod e Francois Jacob, biologi francesi, durante loccupazione nazista si divertirono a studiare le curve di crescita dei batteri seminati in terreni contenenti vari tipi di zuccheri. Fu il primo a studiare tali curve in terreni contenenti non uno bens combinazioni di due saccaridi. Nei casi a e b tutto normale. Nel caso c si intravede una piccola gobbetta nella curva. Nei casi d, e ed f evidente lanomalia della curva di crescita, curva che chiamarono diauxia. Essi supposero e dimostrarono che la prima curva era legata al consumo di un saccaride e la seconda legata al consumo dellaltro. Il problema sta nellintervallo tra il consumo dei due zuccheri. In questo periodo di tempo si ha il passaggio da una via metabolica ad unaltra. Resta da capire se il passaggio alla nuova via metabolica qualcosa di costitutivo o meno, ovvero se gli enzimi del batterio sono costitutivi o inducibili. Fine della lezione, ha lasciato appeso questultimo concetto. Ho fatto un p di ricerche (wiki dice poco a riguardo), in ogni caso gli enzimi non sono costitutivi. Esempio: una volta finito il glucosio il batterio spende energia per produrre gli enzimi che gli serviranno poi per metabolizzare lo xylosio. Gli enzimi della seconda via metabolica sono quindi inducibili e non costituvi, e quellintervallo di circa unora serve al batterio per sintetizzarli. Lintervallo fu chiamato da Jacob periodo di Induzione.

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