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MICROBIOLOGIA

Alcuni organismi sono costituiti da un'unica cellula (unicellulari), altri da più


cellule (pluricellulari). La maggior parte sono unicellulare, sono i cosiddetti
microrganismi. Al microscopio si possono distinguere le diversificazioni
ecologiche, morfologiche e strutturali.
Le cellule hanno anche una loro identità, permessa grazie alla membrana
citoplasmatica. La durata di una specie cellulare è permessa dalla riproduzione
cellulare; sia l'omeostasi che la riproduzione richiedono che del materiale
venga portato dall'esterno all'interno della cellula, attraverso la membrana.
Tutto questo richiede del lavoro, quindi energia: è il cosiddetto METABOLISMO
CELLULARE. E' tramite la duplicazione del materiale genetico che le cellule si
riproducono l'informazione genetica trasmessa alle cellule figlie. Poi,
l'evoluzione è basata sul concetto di mutazione e selezione.

Haeckel, nel 1886, raggruppa il regno di Protisti, in cui inserisce protozoi,


funghi, alghe e batteri. Successivamente, si distinsero gli eucarioti dai
procarioti.
Infine, nel 1990, Woese, Divide i regni in batteri, archea, eucarioti.

Il dominio dei batteri


E' costituito da procarioti, sono singole cellule, hanno peptidoglicano nella
parete cellulare, colonizzano vari ambienti, non sono patogeni, hanno un ruolo
fondamentale nel riciclo dei nutrienti, i cianobatteri producono O2 in seguito a
fotosintesi.

Il dominio degli Archea


Sono procarioti, non hanno peptidoglicano, si distinguono dai batteri per
sequenze ribosomiali caratteristiche e non solo, molti si trovano in ambienti
estremi, non si conoscono specie patogene.

Il dominio degli Eucaria


Animali, piante, lieviti, funghi, alghe unicellulari, protozoi. Sono più grandi delle
cellule procariotiche.

I virus sono acellulari, più piccoli e provocano moltissime malattie.

Composizione elementare delle macromolecole cellulari


S (1%), P (3%), H (8%), O (20%), C(50%), N(14%), proteine (55%), acidi nucleici
(23%), fosfolipidi (11%), polisaccaridi (7%).

A partire dalla superficie della cellula batterica originano flagelli e pili. Questi
sono sintetizzati a partire da macromolecole. Gli organismi fototrofi usano
l'energia come fonte di energia.
Gli organismi chemioorganotrofi traggono energia dalla sostanza organica. I
chemiolitotofi ottengono l'energia a partire da sostanza inorganica.
L'azoto combinato sulla terra viene trasformato in un gas inerte, che può
essere fissato in ammoniaca grazie a dei batteri, detti azotofissatori. Nella
scissione binaria na cellula si accresce fino ad una dimensione critica, e poi si
divide in due nuove cellule.

Ma cos'è la microbiologia?
E' la scienza che studia i microrganismi, che sono semplici nella loro
architettura, e mancano di cellule differenziate e di tessuti.

Membri del mondo microbico:


– Cellule procariotiche → sono prive di un nucleo delimitato da una
membrana.
– Cellule eucariotiche → possiedono un nucleo racchiuso da una
membrana, sono più complesse e più grandi.
Francesco Redi smentì la generazione spontanea per gli organismi.
Egli prese 3 pezzi di carne:
Il primo era aperto, e le mosche vi avevano libero accesso. Il secondo era
ricoperto da un pezzo di carta che impediva l'entrata di mosche. Il terzo era
ricoperto da un pezzo di garza.
Notò che le larve si sviluppavano larve sono quando la garza veniva messa
all'interno del contenitore, e ricoperto di carta.

Nel corso della storia, è stata stabilita una connessione patologia-organismo,


per prima dimostrata da Agostino Bassi Questo ha posto le basi
dell'immunologia.
A partire dalla fine dell'800 sono state sviluppate tecniche microbiologiche che
hanno permesso di comprendere il ruolo dell'immunità e di come si possono
controllare e prevenire le infezioni microbiche.
Robert Koch ipotizza dei postulati (1881):
– Il microrganismo deve essere presente in tutti gli individui malati.
– Il microrganismo deve essere isolato dall'affetto, e se posto in coltura
deve dare origine a una popolazione cellulare omogenea.
– L'inoculo di coltura pura del microrganismo in individui sani può causare
la comparsa della malattia di cui è ritenuto responsabile.
– Il microrganismo deve essere reisolato dall'organismo infettato
sperimentalmente in cui la malattia sia insorta.
Il suo lavoro ha permesso di lavorare con agar, piastre di petri, nutrient broth e
nutrient agar, metodi per isolare i microrganismi.
L'agar è un polisaccaride estratto da alghe rosse, si scioglie oltre i 100° e
rimane solido sotto i 45°.

I microrganismi sono importante nella trasformazione della sostanza organica


(fermentazioni e putrefazioni).
La microbiologia di base si occupa di studiare le caratteristiche dei
microrganismi. Quella applicata studia come i microrganismi sono coinvolti in
processi che riguardano la quotidianità dell'uomo. Le biotecnologie microbiche
usano microrganismi o parti di essi per ottenere prodotti utili (antibiotici,
vaccini...).

L'applicazione dei microrganismi nelle biotecnologie moderne


L'utilizzo del DNA ricombinante, che fa in modo di usare i microrganismi come
piccole cell factory.

Le cellule vivono in natura in associazione con altre cellule, formando una


popolazione. In natura le popolazioni convivono e interagiscono con altre
popolazioni, costituendo le comunità microbiche.
Le caratteristiche dei sistemi viventi
1) Il metabolismo → è un sistema aperto, attraverso la membrana vengono
portata sostanze chimiche, che vengono trasformate.
2) La crescita
3) La differenziazione → come ad esempio la formazione di una spora
4) Comunicazione → basate su sintesi di piccole molecole chimiche
rilasciate, e permettono alla cellula di rispondere ad uno stimolo
ambientale.
5) Il movimento
6) L'evoluzione
7) Funzioni codificanti .> permettono la replicazione del DNA, la traduzione
di proteine. Inoltre, producono energia e ottengono precursori dalle
macromolecole, che servono a far crescere la cellula batterica stessa.

La cellula eucariote
E' più grande e complessa, i cromosomi sono contenuti nel nucleo, separati da
una membrana cellulare. Nel citoplasma ha mitocondri, REL, lisosomi, RER,
Golgi.
La riproduzione avviene per mitosi.
La cellula procariote
Il nucleo non c'è, il materiale genetico sta nel citoplasma, detta nucleoide.
In entrambi i casi, il citoplasma contiene i ribosomi (diversii).
Si duplica per scissione binaria. Non esistono zigosi e meiosi, perchè non ci
sono riproduzioni sessuate.
Riguardano il dominio di batteri e archea.

1985: Scoperto un microrganismo, Epulopishium Fishelsoni, lungo 0.6 mm, e


largo 75 micron, dotato di motilità per mezzo di flagelli batterici che ricoprono
la superficie, con citoplasma con grandi nucleoidi e molti ribosomi; c'è uno
strato esterno che consiste in una membrana involuta, che aumenta la
superficie cellulare, favorendo il trasporto dei nutrienti.
1997: Scoperto Thiomargarita Namibiensis, un batterio sferico con diametro
0.75 mm, che forma catene racchiuse in guaine. C'è un vacuolo ricco di nitrati,
che occupa il 98% della cellula, ed è circondato da uno strato citoplasmatico
pieno di granuli di zolfo.
I procarioti sono costituiti da batteri e archea. La membrana nucleare è tipico
solo degli eucarioti. Il DNA è circolare in batteri e archea.
Un operone policistronico è un insieme di geni strutturali che codificano per
proteine, che vengono trascritti e tradotti a partire da un'unico promotore.
Sono assenti negli eucaria.
Negli Eucaria ci sono 3 tipi di RNA polimerasi, negli archea il numero è
variabile, e nei batteri ce n'è un unico tipo. Quest'ultimo è sensibile
all'antibiotico rifampicina.
La mureina nella parete cellulare è tipica dei batteri. I batteri sono inoltre
sensibili agli antibiotici beta-lattamici.
Il glicerolo di membrana è nella forma D per batteri ed eucaria, con un legame
estere. E' nella forma per gli archea, e va a formare legami etere.
Tutte e tre possiedono i ribosomi, ma sono diversi. Batteri e archea hanno i
ribosomi 70s, mentre gli eucaria hanno gli 80s. I batteri non sono sensibili alla
tossina difterica, ma sono sensibili al cloramfenicolo, alla streptomicina e alla
kanamicina.
Il rRNA di inizio traduzione carica formilmetionina nei batteri, e metionina in
archea ed eucaria.
I batteri e gli archea hanno un metabolismo chemolitotrofo; gli archea
producono metano, i batteri ossidano l'ammonio.
Tutti possono fare la respirazione aerobia, ma batteri e archea possono anche
fare la respirazione anaerobica.
La fotosintesi ossigenica (tipica delle piante), può anche essere svolta dai
cianobatteri. La fotosintesi senza produzione di ossigeno viene fatta da batteri
e archea.
I batteri e gli archea sopravvivono anche oltre gli 80°c. Solo gli archea però
sono in grado di superare i 100°C.

Le dimensioni ridotte dei batteri sono convenienti per lo scambio con


l'ambiente esterno. Hanno un rapporto superficie/volume maggiore. Questo
permette un maggiore tasso di scambio di nutrienti; per questo le cellule
piccole si accrescono più velocemente.
Durante l'accrescimento possono verificarsi delle mutazioni, che aumentano
all'aumentare del numero di riproduzioni. Questo incentiva le possibilità
evolutive. Per questo motivo le cellule più piccole evolvono più velocemente.
E quindi, i procarioti, anche essendo aploidi, possono sfruttare più facilmente
nuovi habitat; hanno un'ampia versatilità metabolica rispetto agli eucarioti.
Detto questo, esiste comunque un limite “minimo” di dimensione per le cellule,
0,2 micron.

Negli eucarioti, gli organismi modello sono Saccaromyces Cereviseae o la


Neurospeda Chrass. Il batterio modello è l'Escherichia Coli, Bacillus Subtilis,
Caulobacter Crescentus...

Forme e dimensioni influenzano la diffusione e l'assorbimento dei nutrienti. La


forma dipende dal peptidoglicano e da una serie di proteine presenti. Abbiamo
la FtsZ nei cocchi, come ad esempio lo Straphilococcus Aureus, senza la quale
non si forma il setto e non ha luogo la divisione cellulare. Si otterranno delle
cellule filamentose. Oppure, nei batteri a bastoncello, la MreB, senza la quale
si ha un aumento del diametro cellulare, fino ad arrivare ad un arrotondamento
della cellula, è presente in Bacillus Subtilis. I vibrioni hanno la Crescentina,
che è responsabile della curvatura della cellula, senza la quale si avrà una
forma dritta.

La cellula procariote è delimitata da una membrana plasmatica, che è interna


rispetto alla parete e al peptidoglicano. Possono esserci poi capsula, pericalice,
pili, flagelli, fimbrie.

Entrambi hanno membrana citoplasmatica, ma nei gram – aldilà c'è del


peptidoglicano sottile, contornato da una membrana esterna. Nei gram + c'è
solo uno strato più spesso di peptidoglicano al di fuori dalla membrana
plasmatica.

Queste due tipologie si correlano col poter trattenere il colorante o meno.


La prima fase è la fissazione delle cellule al calore, poi si copre il vetrino col
cristalvioletto, che colora entrambi i tipi di cellule di viola. Poi, si ricopre con
ioduro, che è mordensante, e facilita la penetrazione del colorante nelle cellule.
In questa fase entrambi i tipi di cellule risulteranno uguali. La fase successiva
riguarda la decolorazione con alcol/acetone. Questo andrà a scindere le
proteine della membrana esterna del gram negativo. Successivamente, si farà
una colorazione di contrasto, con la safranina, che non avrà alcun effetto sui
Gram+, ma colorerà di rosso i Gram-.
La capacità di trattenere il cristalvioletto è favorita dallo spessore dei gram+.
Nei Gram- è molto meno spesso lo strato, quindi viene estratto più facilmente.

Le caratteristiche della membrana plasmatica


Delimita il citoplasma, e fa regolare gli scambi cellula-ambiente. Le cellule
procariotiche usano la membrana come sede di processi metabolici, come
fotosintesi, biosintesi di lipidi, respirazione. Negli eucarioti questo avviene in
organelli specifici. E' essenziale per la trasduzione di segnali.
Entrambe sono costituite da doppio foglietto fosfolipidico, con proteine esterne,
integrali o periferiche, all'interno del citoplasma. Ma le membrane procariotiche
differiscono per il maggior numero e varietà di proteine, visto che quest'ultima
svolge un maggior numero di funzioni. Poi, nella procariotica ci sono steroli;
sono stati individuati degli opanoidi. Nei batteri non ci sono gli steroli, ad
eccezione dei micoplasmi.
La maggior parte dei lipidi nelle membrane sono molecole anfipatiche; la
membrana citoplasmatica è costituita da fosfolipidi, con due code di acidi
grassi e una testa. In ambiente acquoso, tendono a formare un doppio strato
Gli acidi grassi alle code sono perlopiù saturi, ed essi stabiliscono la fluidità di
membrana. Un abbassamento della temperatura aumenta la viscosità dei lipidi,
e quindi solidifica la membrana, uccidendo la cellula.
Gli steroli sono presenti nelle membrane eucariote, che danno rigidità e
struttura.
Le lipoproteine si ancorano alla membrana citoplasmatica, grazie ad un
ancoramento con una coda all'N terminale. Sono presenti sia nei batteri Gram+
che nei Gram-

Le membrane citoplasmatiche degli archea


hanno lipidi unici. La chiralità del glicerolo è
L, il legame tra glicerolo e catena alifatica è
etere. La catena alifatica ha un fosfato
esterificato, col glicerolo in posizione C1. Le
catene laterali alifatiche sono isoprenoidi, il
cui il gruppo alcolico terminale è
condensato all'L glicerolo, attraverso un
legame etere in C2 e C3. Le catene
isoprenoidi sono costituite da più isoprene,
che formano lunghe catene sature, ramificate.
I lipidi degli archea
possono essere
dieteri (fitanile) o
tetraeteri
(difitanile)di
glicerolo. I
tetraeteri formano
membrane
monostrato, che
offrono maggiore
resistenza, che si
trova molto spesso
negli archea
ipertermofili.
Possono formare
strutture cicliche,
sature, a 5 atomi di
carbonio.

I lipidi negli archea


formano un'impalcatura rigida, grazie alla minore capacità di movimento e agli
anelli ciclopentanici. Facendo variare gli anelli ciclopentanici varia anche la
fluidità di membrana.

Le funzioni della membrana


Il doppio strato fosfolipidico fa diffondere acqua, gas... ma non passano ioni,
composti molari e grosse molecole. Questi ultimi, per passare, lo fanno grazie a
sistemi di trasporto mediati da proteine, sia passivi che attivi.
Nei procarioti è poi una delle sedi di trasformazione di energia (respirazione
aerobia/anaerobia e fotosintesi), si genera la forza proton-motrice, che viene
utilizzata per sintetizzare ATP e alimentare altri processi che richiedono
energia, come i movimenti flagellari.
E' anche coinvolta nella trasduzione del segnale: si percepiscono gli stimoli
fisico/chimico, vengono trasmessi all'interno e vengono cambiate le espressioni
di geni. Le proteine coinvolte hanno domini sia extracellulari che intracellulari.
E' anche sede di sintesi di fosfolipidi, alcuni passaggi del lipopolisaccaride, del
peptidoglicano.

La produzione di peptide antimicrobico è un sistema di difesa diffuso, hanno


proprietà antimicrobiche. Sono efficaci contro virus, funghi, batteri... Può essere
sintetizzato in batteri ed eucarioti, tramite sintesi proteica ribosomiale, e da
batteri e funghi con sintesi proteica non ribosomiale.
Può uccidere direttamente il microrganismo (battericida); interagisce con la
membrana citoplasmatica, portandola alla distruzione.
Oppure, può modulare il sistema immunitario dell'ospite, stimolando la risposta
TLR o la chemotassi.
La composizione amminoacidica, l'anfipacità e le dimensioni consentono il
legame e l'inserimento nel doppio foglietto della membrana con formazione di
pori che la destabilizzano. Possono interagire con bersagli intracellulari.
C'è un particolare gruppo, di batteriocine, prodotto da gram+, che hanno un
ampio spettro d'azione, o da gram- con spettro d'azione ridotto. L'attività è
diretta contro recettori sulle membrane, su cui svolgono l'azione letale. Vi sono
3 classi:
Classe 1 → antibiotici. Hanno l'alantionina, necessitano di modificazioni post
traduzionali per essere attivi. Ad esempio, la lisina.
Classe 2 → piccoli lipidi, non soggetti a modificazioni post traduzionali.
Classe 3 → batteriolisine, peptidi maggiori a cui appartengono l'enterolisina A.
Le batteriocine sono polipeptidi prodotti da batteri gram+ e gram-, mediante
sintesi ribosomiale. Hanno attività batteriostatica o battericida.
Possono essere prodotte senza modificaz. Post traduzionali, con, o con colicine.
Possono interferire formando pori nella membrana, modificandone la
permeabilità, interferendo la sintesi della parete cellulare, bloccando processi
cellulari (trascrizione-traduzione) all'interno del citoplasma.

Le polimixine sono antibiotici lipopeptidici a sintesi non ribosomiale, battericidi.


Agiscono con infezioni da gram-. Agiscono su membrana esterna e su
membrana citoplasmatica. Vengono usate con ceppi molto resistenti. Agiscono
come detergenti cationici, interagiscono con i fosfolipidi di membrana.
aumentano la permeabilità cellulare della membrana, e ne alterano l'integrità
osmotica, alterando l'equilibrio elettro-osmotico. In seguito alla perdita di ioni si
depolarizza la membrana, e si avrà la lisi della cellula.
Meccanismi di resistenza da parte dei batteri
• Alterazione della membrana esterna nei gram-
• Riduzione della carica negativa del lipopolisaccaride, riducendo l'affinità
per l'antibiotico, con mutazione nei geni che regolano la frequenza di
alcune modifiche del lipide A.
• Inibizione della sintesi del lipopolisaccaride.

La daptomicina è un lipopeptide ciclico, a sintesi non ribosomiale, attiva contro


i gram+. Può inibire le funzionalità di membrana, in presenza di ioni calcio si
lega alla membrana plasmatica, dove inserisce la coda, oligomerizza, e forma
pori, con conseguente depolarizzazione di membrana, con perdita di ioni K, e
quindi morte cellulare.
La resistenza può essere dovuta all'accumulo di mutazioni di geni che
determinano un cambiamento delle cariche elettriche di superficie, da negative
a positive, impediscono il legame tra antibiotico e cellula bersaglio.

I polieni sono in grado di formare grossi complessi con gli steroli di membrana,
che causa un aumento della permeabilità di membrana, un'alterazione di
gradiente protonico e conseguente uscita di ioni K. Vengono usati nel caso di
infezioni fungine; con effetto fungistatico per gli ioni K o fungicida per
alterazione dell'atp sintasi di membrana. Un esempio è l'anfotericina B, molto
tossica perchè reagisce anche con le cellule dell'ospite.
I batteri non avendo steroli non sono sensibili ai polieni, ad eccezione dei
micoplasmi.
Meccanismi di resistenza
• Rari, quando presenti, basati su alterazioni della composizione lipidica di
membrana, e quindi ridotta affinità col farmaco.
I micoplasmi sono sensibili alle penicilline?
Cos’è la parete cellulare, com’è composta?
Descrivi le differenze tra le pareti di batteri e archea.
Descrivi una classe di antibiotici in grado di inibire la sintesi della parete
cellulare, parlando del meccanismo d’azione e del meccanismo di
resistenza.

Biogenesi della membrana esterna


E’ un complesso molto complesso; lipopolisaccaridi, proteine e lipoproteine
sono sintetizzate nel citoplasma, ma poi devono attraversare sia membrana
citoplasmatica che periplasma, senza alcuna fonte di energia.
Le proteine della membrana esterna sono sintetizzate nel citoplasma, e
possiedono una sequenza segnale all’N-terminale, che le indirizza alla
traslocazione attraverso la membrana interna.
I sistemi responsabili della traslocazione delle proteine attraverso la membrana
plasmatica sono 2:
1) Il traslocone Sec: trasporta proteine che non hanno ancora assunto la
struttura terziaria definiriva.
2) Il sistema Tat: trasloca proteine già correttamente ripiegate.

Trasporto delle proteine della membrana esterna (OMP)


Vengono tutte trasportate da un traslocone Sec; dopo essere state trasportate
dalla membrana interna, quelle dirette alla membrana esterna devono prima
attraversare lo spazio periplasmatico. Questo passaggio è facilitato da
specifiche ciaperonine (proteine che aiutano altre proteine ad assumere e ad
assumere una corretta conformazione tridimensionale). Le 2 più importanti
sono Skp, che interagisce con le proteine della membrana esterna. L’altra
ciaperonina è la SurA, che serve per il corretto ripiegamento delle proteine
della membrana esterna.
L’inserzione delle proteine della
membrana esterna in
quest’ultima è poco nota, in
E Coli, L’OMP viene sintetizzata nel
citoplasma, viene rilasciata nel periplasma. La
sequenza segnale al C terminale viene riconosciuta da
BamA, e il corretto ripiegamento avviene grazie alla SurA.
L’oligomerizzazione avviene dopo che la proteina si è inserita sulla
membrana esterna stessa.

Ma la membrana esterna è costituita anche da lipoproteine, che


sono prodotte nel citoplasma
come pro-lipoproteine.
Hanno una sequenza
segnale all’N-terminale che le indirizza verso il traslocone Sec.
In E. Coli Questo trasporto è mediato da cinque proteine, denominate Lol CDE,
localizzato sulla membrana citoplasmatica. Prende in carico le lipoproteine che
hanno superato la membrana interna, e grazie all’energia dell’idrolisi dell’ATP
le indirizza a LolA, che ha una cavità idrofobica che lega la porzione lipidica
della lipoproteina, formando un complesso solubile che può attraversare il
periplasma. Questo complesso interagisce con LolB, che è un recettore sulla
membrana esterna, ed è responsabile dell’inserimento della lipoproteina sulla
membrana esterna stessa. La modificazione lipidica all’N-terminale e la
rimozione della sequenza segnale avvengono nel periplasma, ad opera di un
residuo di cisteina. Le lipoproteine possono essere associate alla membrana
interna (citoplasmatica) o esterna. Lol trasporta verso quella esterna le
lipoproteine che non possiedono un residuo di aspartico nella posizione +2
nella proteina matura.
Le lipoproteina che hanno un residuo aspartico in posizione +2 rimangono
ancorate invece alla membrana citoplasmatica.

L’altro componente fondamentale è il lipopolisaccaride nei Gram-, costituito da


lipide A, cor saccaridico e antigene O. La biosintesi avviene in parte nel
citoplasma e in parte nella parte interna della membrana citoplasmatica. La
porzione lipide-A-core è sintetizzata separatamente, dalle unità
polisaccaridiche che costituiscono l’antigene O. Questi zuccheri sono
assemblati sul trasportatore pactoprenolo. La porzione lipide-A-Core è
trasportata separatamente, mediante una proteina detta Msba, che appartiene
alla famiglia dei trasportatori ABC, che richiedono energia sotto forma di idrolisi
dell’ATP.
Le subunità dell’antigene O sono polimerizzate grazie alla Wzy, e legate alla
porzione lipide A core ancorata sul lato periplasmatico della membrana
citoplasmatica, per andare a formare il lipopolisaccaride completo. Non è chiaro
come il lipopolisaccaride arrivi alla membrana esterna, ma in E. Coli sono state
individuate 7 proteine, dette Lpt, che partecipano al trasporto, e costituiscono
un complesso proteico che connette la membrana citoplasmatica all’esterna.
Nella membrana citoplasmatica c’è un complesso di 4 Lpt, che è designato al
trasporto delle lipoproteine attraverso il periplasma (si pensa). LptA connette le
due membrane. Sulla membrana esterna ci sono le due Lpt che ricevono la
proteina e procederebbero ad inserirla sulla membrana esterna.

Strutture
esterne dei
procarioti
Oltre alla
membrana
plasmatica e alla parete,
possono avere altre strutture; importanti per aderire a superfici, cellule ospiti e
proteggerlo dalla fagocitosi da parte di macrofagi. Si tratta di strato S, capsula
e polisaccaridi extracellulari.
Lo strato S è presente sia in Gram+ che Gram- che Archea. Si formano per
autoassemblaggio di subunità proteiche sulla superficie cellulare; costituiscono
un reticolo cristallino, e sono associati, mediante legami non covalenti, a
differenti strutture. In Gram+ e archea è legato a peptidoglicano e
pseudomureina. In Gram – è legato a lipopolisaccaridi della membrana esterna.
Negli Archea è l’unico componimento esterno, ed è strettamente legato alla
membrana citoplasmatica.
E’ costituito da proteine insolubili in acqua, contiene acido glutammico,
aspartico, lisina e amminoacidi idrofobi. Queste vengono sintetizzate nel
citoplasma, e portate col traslocone Sec. Sono legate a glicani costituiti da
grandi quantità di zuccheri; queste proteine sono quindi dette GLICOSILATE.
Lo strato S può fungere da barriera protettiva, può aumentare l’adesione
cellulare, può aumentare la rigidità cellulare, e può proteggere i batteri nei
confronti dei meccanismi di difesa che l’ospite mette in atto per cercare di
neutralizzarli.

Molti batteri sono in grado di secernere polisaccaridi che aderiscono alla


superficie cellulare, formando uno strato mucoso detto glicocalice. Quando
questo strato è ben strutturato e adeso viene denominato capsula. Quando
invece forma area di materiale diffuso non organizzato, viene detto strato
mucoso o EPS (eso poli saccaride).
La capsula si può visualizzare al microscopio con l’inchiostro di china, che non
penetra nella cellula, ma si deposita all’esterno. La sua presenza conferisce una
morfologia liscia e un aspetto lucido. Mutanti che non sono in grado di
sintetizzare la capsula formano delle colonie dette rugose.
Può essere colorata anche la nigrosina, colorante acido che forma un deposito
colorato intorno alle cellule; la capsula non lo assorbe, quindi si formano 2
regioni colorate:
- L’ambiente in cui si trovano le cellule
- Il corpo del batterio stesso.
- La capsula rimane chiara.
La capsula è composta da polisaccaridi omo/eteropolimerici, che possono
contenere peptidi o amminozuccheri. I monosaccaridi si legano tra di loro
tramite legami glicosidici. Quelle polisaccaridiche sono molto idratate.
Le funzioni sono varie, proteggono le cellule batteriche da antimicrobici e
fagocitosi, fanno inoltre aderire i batteri ad altre superfici o altri batteri. Questo
può aiutare a portare alla formazione di biofilm.
Le

membrane che costituiscono l’involucro dei procarioti hanno la funzione di


barriera al flusso di macromolecole, dall’interno all’esterno della cellula e
viceversa. Le funzioni delle membrane dipendono dalle proteine, prodotte nel
citoplasma e poi ancorate nella membrana citoplasmatica, oppure trasferite
tramite il periplasma sulla membrana esterna. Il principale sistema che
permette questo è la secrezione dipendente da Sec.
Molti batteri secernono proteine nell’ambiente (come ad esempio le tossine).
L’informazione che indirizza una proteina verso la sua collocazione finale è
contenuta nella sequenza amminoacidica (segnale).
La secrezione di una proteina richiede energia, che può essere fornita
dall’idrolisi dell’ATP o dalla forza proton-motrice.

La secrezione dipendente da Sec serve a trasportare e ad inserire le proteine


sulla membrana citoplasmatica. Si divide in un complesso Transmembrana,
detto traslocone Sec, un motore che ne fornisce l’energia sul versante
citoplasmatico, e un sistema citoplasmatico che riconosce la proteina che deve
essere trasportata. Tutte le proteine vengono trasportate come precursori pre-
proteine, che hanno all’estremità N terminale una sequenza segnale
(nell’immagine è il filo rosso). E’ caratterizzata da una regione centrale
idrofoba, all’N terminale c’è una porzione idrofila basica, e al C terminale c’è
una porzione leggermente polare.
Quando la sequenza segnale viene prodotta, la proteina SecB (ciaperonina),
lega la proteina nascente, e ne rallenta il processo di ripiegamento.
Il complesso transmembrana (quadratoni verdi), è un eterotrimero, costituito
da proteina integrali di membrana (SecYEG), c’è un canale. L’energia è fornita
dall’idrolisi dell’ATP e viene trasferita al complesso SecYEG dalla SecA (ATPasi
associata alla membrana citoplasmatica).
Quando la proteina esce dal canale di SecYEG, la sequenza segnale all’N-
terminale viene rimossa dalla peptidasi. La proteina può iniziare a ripiegarsi se
la destinazione è il periplasma, oppure introdursi in un altro sistema di
trasporto se è destinata alla membrana esterna o all’ambiente extracellulare.
I diversi sistemi che indirizzano le proteine alla loro localizzazione finale
SISTEMA SRP (signal recognition particle), diffuso in eu e procarioti. Nell’E. Coli
è composto da un complesso ribonucleoproteico, formato dalla proteina Fth,
dall’RNA 4.5S, e dal recettore del complesso SRP (proteina FtsY).
Le proteine indirizzate alla membrana citoplasmatica hanno una sequenza
amminoacidica idrofobica all’N-terminale, riconosciuta dall’SRP appena
sintetizzata ed esposta all’esterno del ribosoma.
Il legame SRP-sequenza segnale è importante per indirizzare la proteina alla
membrana. Data l’affinità del recettore FtsY per SecY, il ribosoma e la proteina
nascente sono indirizzate al traslocone Sec.
E’ un processo co-traduzionale, avviene mentre è in corso la sintesi della
proteina stessa.

Nei Gram-, le proteine secrete, oltre a dover attraversare la membrana


citoplasmatica, devono superare pure quella esterna. Sono noti 4 tipi di sistemi
di trasporto. Prendono tutti in carico le proteine dopo che hanno superato la
membrana citoplasmatica, tramite il traslocone Sec.
1) Sistema di secrezione di tipo II: studiato in molti batteri patogeni.
Viene sfruttato per secernere proteasi, tossine, e assemblare i pili.
Possono servire 12/15 proteine; c’è un poro di secrezione nella
membrana esterna. Sono molto specifici, sono dedicati al
trasporto di un solo substrato. Prende in carico le proteine
trasportate nel periplasma già
maturate e correttamente
ripiegate.
I substrati di sistema
attraversano la membrana
attraverso il traslocone Sec; una volta
nel periplasma viene rimossa la
sequenza segnale, e le proteine
vengono ripiegate da
ciaperonine, che aiutano ad
assumere la corretta struttura
tridimensionale.
b) la proteina ripiegata viene indirizzata alle proteine coinvolte
nell’apparato di secrezione, dette Gsp.

2) Sistema di secrezione a due partner (TPS): riguarda i Gram -,


proteine trasportate proteasi, tossine, adesine, invasine.
E’ costituito da una sola proteina di trasporto, che
funge da canale nella membrana esterna, e da uno
specifico elemento nella proteina trasportata.
E’ tramite le proteine di
membrana a botte che il substrato
viene escreto all’esterno
della cellula. Le proteine
trasportate hanno un
dominio TPS all’N-terminale. E’
importante per il
riconoscimento della
specifica proteina canale, e per il
ripiegamento stesso della proteina.
Le proteine vengono
trasportate attraverso la
membrana citoplasmatica attraverso il sistema Sec, nel periplasma la
sequenza segnale viene eliminata. Vengono trasportati 2 tipi di proteine:
- TPSb (canale) -> si inserisce nella membrana esterna
- TPSa (secreta all’esterno della cellula) -> si associa nel periplasma con la
TPSb, e poi è trasportata all’esterno da essa attraverso il canale. Poi
potrà rimanere adesa alla superficie o essere escreta all’esterno.

1) Sistema dell’autotrasporto: riguarda i Gram-. LE


proteine che costituiscono gli
autotrasportatori sono sintetizzate nel
citoplasma, come precursori con 3
diversi domini: sequenza all’N
terminale verso la membrana plasmatica, il dominio interno
funzionale specifico, e il dominio C- terminale che rappresenta
il canale di autotrasporto.
La pre-proteina viene sintetizzata nel
citoplasma, attraversa la membrana citoplasmatica con
traslocone Sec, nel periplasma viene rimossa la sequenza segnale
all’N-terminale. Attraverso il canale costituito dal C-terminale sulla
membrana esterna passerà la
proteina. Essa potrà rimanere
associata alla membrana o essere rilasciata nell’ambiente (tramite delle
proteasi). E’ un sistema che non richiede energia.

2) Sistema di secrezione per la via Chaperon/Usciere:


riguarda i Gram -, è dedicata alla secrezione e all’assemblaggio
di strutture sulla superficie, come i pili. Il passaggio
attraverso la membrana esterna richiede una ciaperonina
periplasmatica,(PapD) e una proteina di membrana esterna (PapC).
Le varie subunità che costituiscono il pili passano
attraverso la membrana plasmatica col
sistema Sec, subiscono il taglio della
sequenza segnale all’N-terminale, e
interagiscono nel periplasma con la PApD, che è responsabile
del corretto ripiegamento. Il legame tra PapD e proteina
(pilina) stabilizza la subunità del pilus, mascherandone le
componenti idrofobiche, e indirizza
il complesso ciaperonina-pilina alla
proteina usciere (PapC), posta sulla
membrana esterna. L’interazione tra queste fa sì che
avvenga la dissociazione della ciaperonina
dal pilus, lasciando esposte le regioni
idrofobiche che ne consentono l’incorporazione nella struttura nascente
all’esterno della cellula. Anche questa via non richiede energia esterna.

Non tutte le proteine però sfruttano il traslocone Sec, l’altro metodo è il Tat, che
trasporta proteine già correttamente ripiegate attraverso la membrana
plasmatica. Si conserva in mitocondri e cloroplasti delle piante, batteri, archea.
Ma come sono riconosciute queste proteine? Esse possiedono una sequenza
segnale all’N-terminale, caratterizzata da tre domini. Un dominio all’N-
terminale con amminoacidi carichi positivamente, un dominio centrale
idrofobico, e un dominio al C-terminale. Le differenze tra Tat e Sec:
- Tutte le proteine traslocate col sistema Tat contengono una sequenza
consenso serina treonina, arginina, leucina, fenilalanina.
- Il dominio centrale delle Tat è meno idrofobico.
- Il peptide segnale delle Tat è più lungo (38 residui contro i 24 di Sec).
La natura dei substrati trasportati è molto differente.
Ma com’è costituito il trasporto Tat in E.
Coli?
E’ composto da TatA, B, C. TatC è la più
grande, ed entrambe le estremità C ed N
terminali sporgono ai due versanti della
membrana citoplasmatica. E’ importante per il legame col peptide
segnale della proteina che deve essere trasportata.
TatB ha un solo dominio transmembrana, seguito
da due regioni ad alfa elita anfipatiche nel lato
interno della membrana. Le sue interazioni
dipendono da TatC.
TatA è la più abbondante, è simile a TatC
strutturalmente. E’ il canale attraverso il
quale la proteina viene trasportata.
La pre-proteina nascente dal ribosoma ha una sequenza segnale Tat-
dipendente, e quindi sarà ripiegata correttamente nel citoplasma, grazie a
particolari ciaperonine e cofattori. LA proteina ripiegata è mandata al
complesso TatABC. L’energia necessaria è fornita dalla forza proton-motrice. La
sequenza segnale della proteina viene rimossa da
peptidasi nel periplasma.

Il sistema di secrezione ABC


Hanno una proteina in grado di legare e idrolizzare
ATP. Questo fornisce l’energia ai vari tipi di trasporto.
Si può trovare in batteri, archea, eucaria. Le proteine
attraversano la membrana interna ed esterna, senza passare
per lo spazio periplasmatico. E’ composto da una proteina
all’interno della membrana citoplasmatica, ABC, una che si
estende per il versante periplasmatico, MFP, e una
associata alla membrana esterna, OMP. Questo
permette un passaggio diretto del substrato
all’ambiente extracellulare.

Sistema di secrezione di tipo III per Yersinia:diffuso in


gram-, patogeni di animali e piante. Le proteine che devono
essere secrete da questo sistema vengono trasportate
direttamente dal citoplasma di sintesi al citoplasma delle cellule
bersaglio. L’apparato è costituito da 20 proteine.
Ma come vengono riconosciute le proteine trasportate? Attraverso
una struttura secondaria assunta all’N-terminale dalle proteine che
sono secrete.
Intervengono anche ciaperonine che assicurano la secrezione
delle proteine effettrici. Solo quando il batterio entra in contatto
con la cellula eucariote, si avvia il processo di sintesi delle cellule
effettrici, nel citoplasma delle cellule bersaglio.
Il meccanismo d’azione prevede che i componenti dell’apparato di
secrezione siano Syc, mentre Yop siano le proteine secrete.
Queste hanno una sequenza di riconoscimento all’N-terminale
che le indirizza. Le proteine passano attraverso il canale
costituito da Syc. A canale aperto, le proteine attraversano il
canale, dove le proteine B e D formano un
canale nella cellula
eucariote.

Sistema di secrezione di tipo IV: riguarda Gram+ e


Gram-, può traslocare materiale
genico, proteine infettive. Vengono
traslocati direttamente nella cellula bersaglio, è coinvolto in
trasferimento genico orizzontale e l’infezione di
cellule bersaglio. E’ costituito da
almeno 12 proteine, che costituiscono
un canale che attraversa l’involucro
batterico, e tramite il quale sono trasportate le
macromolecole. Gli studi sono stati fatti in Agrobacterium tumefaciens, nella
traslocazione del T-DNA; è una porzione di un plasmide, che una volta trasferito
ad una pianta induce tumori.
In basso, gli enzimi producono l’energia deputata al trasporto. In azzurro, più
sopra, ci sono le componenti del canale transmembrana, e sopra, in rosa, ci
sono le componenti che stabiliscono il pilus. In verde, le due 1, sono deputate
alla degradazione locale del peptidoglicano.

Sistema di Secrezione di tipo VI: Riguarda i Gram-, inietta


proteine effettrici in batteri ed eucarioti bersaglio. E’
composto da 13 proteine, e riguarda l’interazione tra
varie cellule batteriche (biofilm, infezioni
polimicrobiche…). La piastra basale si forma nella
membrana plasmatica, si estende nel periplasma e
si associa alla membrana esterna. La contrazione
della guaina ha come conseguenza l’estensione del tubo
interno, fino a penetrare la membrana plasmatica
della cellula ospite, dove iniettare delle molecole
effettrici.

Descrivi i due meccanismi attraverso i quali le proteine prodotte nel


citoplasma attraversano la membrana citoplasmatica.
Descrivi la struttura e le funzioni del sistema a due partner ecc.

Movimenti dei microrganismi


Sono meccanismi che permettono di muoversi nuotando, contraendosi,
strisciando, galleggiando, grazie a flagelli, pili, appendici o strutture interne
come proteine del citoscheletro, vescicole interne e magnetosomi. Utilizzano
principi sensoriali per controllare le situazioni circostanti ambientali.
I flagelli sono filamenti proteici cavi, lughi 10-15
micron. Fungono da organi propulsori grazie ad un
movimento rotatorio. Possono essere osservati al microscopio ottico dopo
trattamenti che ne permettono un aumentare del diametro
(colorazione di Lifeson).
La velocità di rotazione è diversa in base al batterio
considerato.

Il flagello è costituito da 3 strutture proteiche:


1) Corpo basale: ancora il flagello alla cellula; è il
motore flagellare, ha una serie di anelli in una struttura
cilindrica cava. Nei gram – ci sono anello L, P, MS, C, dall’alto
verso il basso.
L’anello C è il rotore del motore flagellare, è
formato da subunità di proteine FLG, M, N.
La componente non rotante, lo statore, è costituito da proteine
MotA e MotB.
Nei Gram + si hanno solo 2 anelli.
2) Uncino: è flessibile, è un manicotto che avvolge il filamento, e collega il
corpo basale al filamento
3) Filamento: struttura semi-rigida tubulare, costituito esclusivamente
dalla proteina flagellina.

Il filamento può ruotare in senso orario o anti-orario. Nei monotrichi va in avanti


quando ruota in senso anti-orario, e indietro quando ruota in senso orario.

Nei peritrici e lofotrici, la rotazione in senso antiorario causa un avanzamento


della cellula, fa riunire in fasci compatti i flagelli, generando una forza
propulsiva.
La rotazione in senso orario causa l’apertura dei fasci, capovolgimenti casuali
del batterio.
Il movimento è un lavoro, richiede energia, che viene presa dalla forza proton-
motrice. Viene trasmessa dall’anello MS all’anello C al bastoncello, all’uncino e
al filamento flagellare. Una proteina del rotore FLIm interagische con CHEy, che
ha un ruolo chiave nel modificare il senso di rotazione del flagello, in risposta
ad un determinato stimolo ambientale.

La motilità permette di spostarsi verso ambienti più favorevoli, o di allontanarsi


da ambienti ostili.

In assenza di gradiente chimico, il batterio si muove alternando brevi corse a


capriole (casuale).
In presenza di gradiente chimico di sostanze attraenti o repellenti, la cellula
valuta il segnale e lo trasduce in modo da alterare l’alternanza dei movimenti
elementari. In questo caso verrà mandato un segnale al rotore del flagello, che
favorisce il gradiente, non sono favorite le capriole. Se la cellula nota una
diminuzione della sost. Attraente, la probabilità di fare una capriola aumenta.

La sintesi del flagello


E’ complessa, sono coinvolti più di 60 geni, e proteine che ne regolano
l’espressione. I geni sono organizzati in una cascata di regolazione, costituita
da 3 classi di operoni:
1) Classe I
2) Classe II
3) Classe III
Un operone è costituito da un gruppo di geni responsabili dello stesso processo,
trascritti tutti insieme o non trascritti.
I geni che appartengono agli operoni di classe ! sono trascritti, e solo adesso
inizia quello della classe II e della classe III.
Le proteine che compongono la classe I formano un complesso che funge da
attivatore trascrizionale (proteina che promuove l’espressione dei geni della
classe II). I geni della classe II codificano i geni che vanno a comporre poi il
corpo basale e l’uncino, e proteine che vanno ad attivare la trascrizione degli
operoni espressi nell’ultima fase (classe III). I geni contenuti nella classe III
codificano le proteine che costituiscono il filamento, il motore flagellare e
proteine coinvolte nella trasduzione del segnale nella chemiotassi.
Il corpo basale e l’uncino costituiscono un sistema di secrezione di tipo III. I
geni della classe III sono trascritti dopo che si sono formati il corpo basale e
l’uncino. La sintesi del filamento flagellare avviene tramite traslocazione
attraverso il canale flagello, delle subunità di flagellina, che si assemblano nella
corretta posizione, nell’estremità apicale del filamento.

Le spirochete sono batteri mobili, a forma di bastoncello elicoidale, e hanno dei


flagelli che sono chiamati peri-plasmatici o filamenti assiali, perché sono simili
a quelli batterici, ma invece che sporgere all’esterno della cellula sono inclusi
nello spazio periplasmico, compreso tra il peptidoglicano e la membrana
esterna nei gram-. Vanno da un polo a quello opposto della cellula. E’ costituito
da corpo basale, uncino e filamenti flagellare. Mancano gli anelli L e P. La
rotazione dei filamenti flagellari induce rotazione e deformazione della cellula,
che inducono i batteri a muoversi nei fluidi. Ci sono spirochete rigide e meno
rigide. I motori flagellari ruotano in direzione opposta: quello anteriore in senso
antiorario, e quello posteriore in senso orario. Il contemporaneo cambiamento
dei due motori alle due estremità cambierebbe la direzione, mentre la
mutazione di rotazione ad uno solo dei due motori causerebbe l’arresto del
movimento o la curvatura della cellula.

Gli archea e il flagello


Ha una struttura discoidale nella membrana citoplasmatica, un uncino e un
filamento costituito da flagelline diverse. I filamenti sono più sottili di quelli
batterici, e le subunità di flagellina si assemblano alla base invece che
all’apice. Si aggiungono glicani alla estremità ammino-terminale della
flagellina. Questo richiede energia, fornita dall’idrolisi dell’ATP.

I pili e le fimbrie sono corte appendici filiformi. Sono coinvolte nell’adesione ad


altre strutture/batteri, interazioni tra cellule, secrezione, formazione di biofilm,
coniugazione (attraverso il pilus sessuale), movimento, recettori di batteriofagi.

Assemblaggio dei pili di tipo 4


Sono strutture sottili e flessibili, con diametro 5-9 nm e lunghezza 1-4 nm. Sono
importanti nella formazione di aggregati cellulari e biofilm. Si distinguono in
fimbrie e pili. Ogni pilo è costituito da pilina (elicoidale) e un’altra proteina.
Avviene in una piattaforma molecolare nella membrana citoplasmatica;
collaborano PilB e PilT.
1) Sintesi di pilina, sintetizzata nel citoplasma come pre-pilina.
2) Essa viene traslocata attraverso la membrana citoplasmatica verso il
citoplasma.
3) La regione all’N terminale forma una lunga elica idrofobica, mentre la
regione C-terminale è globulare, e si estende nel citoplasma.
4) L’ATPasi subisce modificazione, tramite PilB, che aggiunge monomeri di
pilina, e spinge il pilus verso l’alto causando un vuoto che viene riempito
da pilina.
5) Un’altra ATPasi PilT causa la rimozione dei monomeri di pilina,
determinando la ritrazione del pilo.
Nei batteri Gram- è importante anche la proteina PQ, che forma un canale nella
membrana esterna della cellula batterica, per permettere il passaggio del pilo.
PilT è antiagonista rispetto a PilB, perché causa la rimozione di monomeri di
pilina, e quindi retrazione. Questo costituisce il movimento contrattile che
alcuni batteri come lo Pseudomonas possiedono; possono muoversi a scatto su
superfici, mediante cicli di estensione e retrazione del pilo (il batterio striscia).
La cellula procariotica ha alta funzionalità dei processi che si svolgono
all’interno. L’insieme tra membrana citoplasmatica e tutte le componenti
interne è definito protoplasto. Nel citoplasma, la composizione è basata su
70/80% acqua, proteine,
grassi, proteine, acidi
nucleici, vitamine. Il
DNA è associato a
proteine, e addensato
nel citoplasma in una
zona detta nucleoide.
Oltre al nucleoide ci
sono anche molecole
di DNA accessorio, i
plasmidi. E i ribosomi,
che assieme all’RNA
sono deputati alla
sintesi di proteine.

GRANULI DI RISERVA
Sono detti corpi di inclusione. L’accumulo implica l’aumento della pressione
osmotica, e queste inclusioni sono circondate da uno strato di lipidi (fosfolipidi).
Spesso all’interno ci sono glicogeno, amido, poli-beta-idrossibutirrato
(specifico per batteri), osservabili al microscopio in contrasto di fase, appaiono
sferici, luminosi e rifrangenti. Altri batteri accumulano cere.
Il beta-idrossi-butirrato è composto da monomeri base.

I polifosfati sono detti granuli di volutina, rappresentano una riserva di fosfato


inorganico usato per sintetizzare ATP o acidi nucleici. Appaiono come zone
dense al microscopio elettronico. Nei cianobatteri si accumula l’azoto
inorganico, sotto forma di cianoficina, costituita da un polimero con residui di
acido aspartico e arginina.

Le vescicole gassose caratterizzano archea e batteri acquatici. Nei


cianobatteri servono ad ottenere l’intensità luminosa adeguata, mentre i
batteri aerobi le sfruttano per muoversi più in superficie rispetto all’acqua, per
poter cogliere l’ossigeno. Queste sono strutture cilindriche cave, chiuse, piene
di gas, e costituite da proteine.

I carbossisomi sono presenti nei cianobatteri, sono dei microcompartimenti


cellulari che contengono enzimi funzionalmente correlati. Contengono l’enzima
rubisco, che è necessario per fissare l’anidride carbonica in glucosio, e l’enzima
anidrasi carbonica, che aumenta la fissazione del carbonio.
Gli enterosomi sono sempre microcompartimenti cellulari, più piccoli dei
carbossisomi, sono stati isolati da batteri enterici, che possono colonizzare
l’apparato gastro-intestinale, come la salmonella. Non contengono la rubisco,
bensì enzimi come etanolammina e propandiolo. La loro presenza è legata a
quella del substrato.
I magnetosomi sono particelle che permettono ai magnetobatteri di orientarsi
lungo il campo magnetico terrestre. Servono a navigare geomagneticamente
negli habitat. Sono costituiti da un monostrato fosfolipidico, che riveste cristalli
di magnetite. Formano catenelle lungo l’interno della cellula; il numero e la
disposizione varia da specie a specie. Viene sostenuto da proteine del
citoscheletro batterico.

I batteri fotosintetici non hanno cloroplasti, il processo fotosintetico deve


avvenire all’interno di membrane interne complesse. Si specializzano qui
strutture dette clorosomi, che contengono i pigmenti fotosintetici che
catturano la luce e permettono la fotosintesi.

Nei batteri rossi sulfurei ci sono membrane interne collegate alla membrana
citoplasmatica; questo è sede del processo fotosintetico.

Nei cianobatteri non ci sono i cloroplasti; il processo avviene all’interno delle


membrane tilacoidali, che contengono clorofilla e proteine.

Alcuni batteri sono capaci di differenziare, formando la spora, e quindi


diventando resistenti a situazioni ambientali sfavorevoli.

Solo in alcuni casi le cellule specializzate tornano a cellule staminali.

Le endospore sono forme cellulari quiescenti diverse


dalle cellule da cui originano. Sono molto disidratate, e
quindi difficili da evidenziare con delle normali colorazioni.
Risulta però efficace la metodica Schaeffer-Fulton, che è
differenziale e colora le endospore in modo specifico,
differenziandole dalle cellule vegetative da cui originano.
Si aggiunge il colorante primario (verde malachite), ad alte
temperature, in modo tale che il colorante entri sia in
cellule che spore. A questo stadio, entrambe risultano
verdi.
Si fa poi un lavaggio con acqua, che allontana il colorante
dalle cellule vegetative, mentre le spore lo mantengono.
Le cellule appariranno incolori, e le spore verdi. Infine si fa
una clorazione di contrasto con la safranina, che evidenzia le cellule di
rosso e le spore rimangono verdi.

Le spore servono alla diffusione e alla sopravvivenza della specie in condizioni


ambientali sfavorevoli. Negli eucarioti possono derivare o dalla riproduzione
sessuale, mediante la fusione di gameti, o dalla riproduzione asessuale. In
entrambi i casi vengono rilasciate nell’ambiente, dove possono germinare e
dare nuova prole. Si tratta quindi di uno scopo RIPRODUTTIVO.
Nei procarioti si distinguono le esospore, prodotte all’esterno, ed endospore,
riprodotte all’interno della cellula.
ESOSPORE:
- Formate dalla divisione cellulare delle ife aeree degli attinomiceti
- Differenziamento morfologico di cellule vegetative nei corpi fruttiferi dei
mixobatteri
- Hanno un significato biologico come quello delle spore eucariotiche.
ENDOSPORE:
- Sono resistenti a diversi agenti chimici e fisici
- E’ una forma di sopravvivenza
- Possono recepire segnali chimici esterni, e in seguito germinare, dando
origine ad una cellula vegetativa in grado di riprodursi.
- Batteri sporificanti -> genere Bacillus e Clostridium

La sporulazione impiega 8/10 ore, la germinazione 10/15 minuti. La


sporulazione inizia con una divisione asimmetrica (scissione binaria) di una
cellula vegetativa, che dà origine a 2 tipi di cellule diverse (cellula madre e pre-
spora), queste sono diverse perché la cellula madre è terminale, e alla fine del
processo liserà, rilasciando la spora matura (costituita dalla prespora). Tra le
due c’è un setto di divisione. Il cromosoma in queste due deriva da un ciclo di
replicazione del DNA avvenuto prima della divisione asimmetrica.
Questa fase inizia quando il numero di cellule presenti è molto elevato: le
cellule hanno carenza di nutrimenti e molte sostanze di scarto; per questo
motivo viene bloccata la replicazione del DNA.
Poi avviene l’inglobamento della prespora nella cellula madre: il peptidoglicano
nella parte centrale del setto assimmetrico è degradato. Per questo il
compartimento della prespora si gonfia all’interno della cellula madre, e la
membrana plasmatica della cellula madre si invagina, inglobandola
completamente. Viene sintetizzata la corteccia (forma di peptidoglicano)
intorno alla prespora.
Inizia a sintetizzarsi anche l’acido dipicolinico, che verrà trasportato nella
prespora, dove si accumulerà sotto forma di sale di calcio (dipicolinato di
calcio), che ha il ruolo di stabilizzare gli acidi nucleici e contribuisce a rendere
la spora più termoresistente e a disidratarla.
Si esprimono nella prespora geni che codificano proteine acide piccole SASP,
che interagiscono col cromosoma della prespora, e lo proteggono dalle
radiazioni ultraviolette. Queste potrebbero causare mutazioni nella molecola di
DNA.
Poi, si costituisce il rivestimento esterno, detto tunica sporale. Essa è
responsabile dell’aspetto rinfrangente al microscopio ottico, e rende le spore
resistenza ad enzimi, agenti chimici tossici (etanolo, cloroformio).
Il peptidoglicano è costituito da NAG legato, tramite legame glicosidico, a NAM. Per
azione di enzimi specifici, nel peptidoglicano della spora troviamo NAG + lattame del
NAM.

Le endospore mature mantengono attivi meccanismi di percezione di


segnali esterni. E’ attraverso questo che possono rispondere alle situazioni
ambientali favorevoli / sfavorevoli. Oltre alla tunica, alcune possono
presentare un’ulteriore involucro esterno detto esosporio. Il passaggio da
spora a cellula si
divide in
germinazione
rapida,
caratterizzata in cambiamenti:
- Reidratazione del core citoplasmatico
- Degradazione della
corteccia, tunica e proteine
che avvolgono il DNA.
- Aumento del citoplasma,
rifornimento di
macromolecole, utili
alla fase successiva,
l’esocrescita.

Gli insetti possono essere


infettati da microrganismi e
virus. Questi hanno una
specificità di spettro; non
uccidono tutti gli insetti, e non
sono tossici per i vertebrati. Per questo possono
costituire un modo per controllare biologicamente delle specie di insetti che infestano
e danneggiano le coltivazioni.
Bacillus Thuringiensis, con la sua proteina CRy, rappresenta il 90% di questa quota di
mercato di insetticidi biologici. E’ gram+ sporigeno, può crescere su sostanza organica
derivata da organismi morti. Ci sono vari ceppi, con flagelli diversi, specifici nei
confronti di lepidotteri ecc. Quando termina la sporificazione non si libera solo
l’endospora matura, ma anche la proteina Cry.
Dal 1996, sono state ottenute piante transgeniche in grado di sintetizzare la proteina
Cry, note come piante Bt (mais, patate, cotone, ecc.), quindi in grado di resistere alle
infestazioni da piralide.
Meccanismo d’azione della tossina prodotta da Bacillus Thuringiensis
I cristalli di questa proteina si producono accanto alla spora, e sono costituiti da
protossina inattiva, o cristallo parasporale. Quando viene ingerito dalla larva, i succhi
intestinali dissolvono i cristalli, la protossina viene idrolizzata da proteasi intestinali,
generando il principio attivo. La tossina matura diffonde attraverso la parete
intestinale della larva, si lega a recettori sulla membrana plasmatica, e si inserisce
nella membrana per formare dei pori, rendendo le cellule permeabili al flusso di ioni e
protoni. L’afflusso di acqua che accompagna ioni all’interno delle cellule le porta a
gonfiarsi, lisarsi e morire. Questo causa anche la paralisi dei muscoli intestinali e
dell’apparato buccale, impedendo la nutrizione della larva, che muore.
Le forme vegetative ottenute dalla germinazione delle spore possono accedere
all’emolinfa delle larve, attraverso l’epitelio danneggiato, e moltiplicandovisi, portando
ad una batteriamia, che porta alla morte della larva in 1-3 giorni.
I geni che codificano queste protossine sono localizzati sui plasmidi, che sono
trasferibili da un ceppo batterico ad un altro.

Altri differenziamenti batterici:


1) Il Caulobacter Crescentus lo troviamo negli ambienti acquatici, è
caratterizzato da dimorfismo, rappresentato da forma mobile dotata di flagello,
non capace di dividersi, e da una forma immobile che aderisce al substrato
mediante un peduncolo, ed è in grado di riprodursi.
La forma mobile è un agente di dispersione, dopo 15 minuti di nuoto inizia a
perdere flagello e pili, e diventa una cellula peduncolata che si attacca a
superfici solide, mediante la secrezione di polisaccaride e sostanze adesive. Si
crea nello stesso punto in cui si è staccato il flagello. La cellula peduncolata si
divide, formando una cellula flagellata mobile, che si stacca. Ricomincia il ciclo.
Ad ogni fase deve esserci un controllo. Si distinguono 3 fasi, una di pre-sintesi
G1, in cui si perdono pili e si forma il flagello. Una fase S di sintesi del DNA, in
cui si forma il peduncolo. Una fase di post-sintesi G2 che coincide con la
replicazione cellulare.

2) I mixobatteri si trovano nel suolo, sono Gram -. Le loro cellule si muovono in


sciami che strisciano su superfici, secernono enzimi idrolitici che uccidono altre
cellule incontrate durante questo movimento. Quando i nutrienti scarseggiano,
le singole cellule cambiano il modo di muoversi, diventano sociali, si
raggruppano e si dispongono l’una sull’altra, formando il cosiddetto corpo
fruttifero, costituito da circa 100'000 cellule. Quando la sua formazione è
completa, una parte delle cellule all’interno dello stesso muoiono, rilasciando
sostanze utilizzate per la crescita delle cellule sopravvissute. Queste si
differenzieranno in mixospore resistenti, che con condizioni ambientali potranno
germinare. I corpi fruttiferi sono caratteristici delle specie che li producono.

3) Gli streptomiceti sono batteri del suolo, Gram+, importanti perché produttori
di molti antibiotici. La colonia ha struttura complessa, è considerato organismo
multicellulare. Si forma dalla germinazione di una spora, da cui originano ife che
ramificandosi penetrano nel terreno di coltura, formando il micelio
vegetativo/substrato. Le ife si allungano apicalmente, e si ramificano
lateralmente formando una fitta rete. Quando si è raggiunta una certa
dimensione, si formano delle ife che si protraggono verso l’alto (dette ife aeree);
alcune ife del micelio substrato lisano per dare nutrimento alle ife aeree. La
sporulazione avviene nelle ife aeree, per la simultanea formazione di setti, che
generano catene di compartimenti da cui si formano le spore mature. Il micelio
aereo diventa grigio quando sporulano.

Una colonia di streptomiceti è composta da due tipi di tessuti: il micelio areo si


differenzia, forma le spore (fase propagativa). Le ife del micelio substrato
assicurano nutrimenti alle ife soprastanti.
La produzione di antibiotici coincide con la produzione di spore e micelio aereo;
il metabolismo si divide in:
1) Metabolismo primario: si producono i metaboliti primari necessari per la
crescita.
2) Metabolismo secondario: il batterio si differenzia, con formazione di ife aeree
e spore, sintetizzando metaboliti secondari non essenziali per la crescita
vegetativa (antibiotici, pigmenti colorati…).

La scissione binaria
Per formare due cellule figlie uguali devono essere duplicate tutte le macromolecole,
che andranno poi a costituire i componenti cellulari. Conoscere la composizione
chimica ci consente di sapere quali sono le “necessità” di quest’ultima.
Nella seconda fase, la cellula si allunga, si replica il DNA. Si forma poi il setto di
divisione cellulare, dove avviene la separazione delle due cellule. Poi si formano nuova
membrana e parete, e si separano le due cellule figlie. Quelle ottenute rappresentano
una “generazione”, che è definita come il tempo che la cellula madre ci mette a
riprodurre le due cellule figlie. La cellula madre, una volta divisa, perde la sua identità.
Gli elementi chimici presenti quando una cellula è disidratata dovranno essere gli
stessi che vanno a costituire il terreno su cui far crescere i procarioti. Il terreno è una
miscela omogenea ed equilibrata di composti.
I MACRONUTRIENTI

La forma chimica con cui viene aggiunto C alla cellula:


glucosio, zuccheri semplici,
amminoacidi, estratto di lievito,

peptone.

L’O2 è l’accettore finale di elettroni nella respirazione aerobia. Le

principali fonti sono

composti

organici, anidride carbonica, acqua, Sali inorganici.


Il Fe è essenziale perché è un cofattore di molti enzimi; è componente di citocromi e di
altre ferro proteine. Vengono aggiunti come Sali di ferro…
Il Ca è un cofattore per alcuni enzimi, è importante per formare il sale di calcio
dipicolinato, che è importante nelle endospore. Viene aggiunto sotto forma di cloruro
di calcio.
I MICRONUTRIENTI
Sono elementi in tracce.
Sono essenziali.

Fonte di energia e di carbonio


 Autotrofi: usano la CO2 come fonte di
carbonio
 Eterotrofi: usano la sostanza come fonte di carbonio
 Fototrofi: usano la luce come fonte di energia
 Chemiotrofi: usano l’ossidazione di composti organici e inorganici come fonte di
energia.
L’ammoniaca può essere usata come
fonte di ammoniaca,
per trasformarla poi
in ammonio. Altri
sono in grado di trasformare N2
in ammoniaca
(fissazione, fatta da
azoto fissatori).
Il fosforo è in
nucleotidi, acidi
nucleici, fosfolipidi. Si
trova sotto forma di
fosfati, che possono
essere assimilati direttamente. Lo
zolfo viene assimilato
tramite amminoacidi cisteina e
metionina. E’ disponibile come solfuro (direttamente utilizzato) o solfato (che deve
essere ridotto a solfuro).
Altri elementi necessari:
Mg stabilizza membrane cellulari,
ribosomi e acidi nucleici.
Il Ca è coinvolto nella stabilità della
membrana cellulare batterica.
Na è importante per gli organismi
che crescono solo in ambienti ad
elevate concentrazioni saline
(alofili). Il Fe è essenziale nella
respirazione cellulare.

I
siderofori solubilizzano il Fe allo stato +3, e lo rendono
disponibile alle cellule. L’idrosammato viene secreto all’esterno della
cellula, dove lega il Fe +3, diventando idrosammato ferrico che
rientra nella cellula e rilascia nel citoplasma lo ione ferro.
L’idrosammato esce nuovamente per catturare un altro ione
e portarlo dentro.

Avere siderofori efficienti rende i microrganismi in grado di


sopravvivere laddove il Fe è presente in quantità limitate.

Permeabilità delle membrane citoplasmatica ad alcune molecole

E’ essenziale per mantenere l’integrità della cellula. Deve essere selettivamente


permeabile.
Si valuta la velocità di diffusione,
facilitata per le molecole piccole
apolari. Le molecole polari e pesanti
non passeranno.

Si valuta anche la direzionalità del


trasporto. Se la concentrazione
dentro e fuori dalla cellula si avrà un
trasporto da dove c’è maggiore
concentrazione a dove ce n’è di
meno (trasporto secondo gradiente).
Può anche avvenire contro gradiente, ma fornendo energia al sistema per compiere un
lavoro.

Sistemi di trasporto nei procarioti


TRASPORTI PASSIVI
Diffusione semplice: è passiva, avviene secondo gradiente, non serve energia.

Diffusione facilitata: avviene secondo gradiente. Necessita di proteine canale/poro che


permettono il passaggio di ioni. Può avvenire attraverso aquaporine o permeasi, che
legano la molecola e la trasportano con sé. Aumenta il flusso della sostanza stessa.
E’ classificata come UNIPORTO.

Le ultime 3 avvengono
contro gradiente di
concentrazione (da dove è meno concentrata a
dove è più concentrata).

Quando la proteina trasportatrice è satura, la velocità di passaggio


non aumenta ulteriormente.
Con la diffusione semplice è costante nel tempo, aumenta mano a mano che
aumenta la differenza di concentrazione di soluto.

TRASPORTI
ATTIVI
Nel trasporto primario il passaggio del
soluto è accoppiato all’idrolisi dell’ATP. E’
frequente, è rappresentato dal sistema ABC.
Una proteina periplasmatica lega la
sostanza da trasportare, una proteina fa da
canale attraverso il quale passa, e una proteina sul lato interno della membrana
citoplasmatica, responsabile dell’idrolisi dell’ATP, e che fornisce l’energia necessaria.
Trasporta a.a, zucchero maltosio, molecole inorganiche...

Nel trasporto secondario la cellula usa energia


potenziale di gradiente elettrochimico per trasportare
molecole attraverso la membrana, anche contro
gradiente.
Intervengono proteine di membrana che riconoscono le
molecole all’esterno, e le fanno passare. Fungono da
enzimi, hanno specificità di substrato.
Permette di accumulare dentro molecole poco concentrate
all’esterno. Il soluto può essere cotrasportato con
lo ione che trasferisce l’energia per il processo
(simporto), o in direzione opposta (antiporto).

La Traslocazione di gruppo trasporta e modifica la


molecola trasportata. E’ usata con numerosi zuccheri,
fosforilati nel loro passaggio attraverso la membrana. Necessita di altre
proteine nel citoplasma della cellula. Un esempio sono le fosfotransferasi. C’è un
trasferimento a cascata tra le varie proteine di un gruppo fosfato.
PEP trasferisce un gruppo fosfato a E1, che fosforilata lo cede ad Hpr, che lo cede a
E2A, che lo cede a E2B, che lo cede a E2C, che riconosce il glucosio all’esterno, lo
trasloca all’interno, e durante questo gli cede il gruppo fosfato, modificandolo. Le
proteine E sono specifiche per il glucosio.
Coltura mista  popolazioni microbiche nell’ambiente, negli animali, piante, uomo.
Coltura pure  popolazioni di cellule derivate tutte dalla divisione di un’unica cellula.
Le colonie sono tutte di un unico tipo.

La colonia è l’insieme di cellule derivanti dalla divisione di una o più cellule (UFC, unità
formanti colonie), forma, colore e dimensioni dipendono dall’organismo. Una colonia
contiene 10^6-10^7 cellule.

Identificazione
 Aspetto colonie
 Caratteri microscopici (morfologia, aspetti tintoriali)
 Caratteri biochimici (fermentazione zuccheri, produzione di prodotti
metabolici peculiari, presenza/assenza di enzimi).
 Caratteri antigenici
MORFOLOGIA DELLE COLONIE

I terreni sono importanti per isolare e identificare i microrganismi, per testare la


sensibilità degli antibiotici (antibiogramma), per l’analisi delle acque e degli alimenti,
per le applicazioni in microbiologia industriale.

Tutti i terreni contengono C, H, O, N, P, S, oligoelementi (Fe, Ca, Co, Cu, Mn..).


Terreni selettivi  favoriscono la crescita di particolari microrganismi, a scapito di altri.
Si aggiunge qualche agente selettivo (Sali biliari, coloranti, antibiotici, NaCl…) Ad
esempio il Sabouraud, che contiene molto glucosio e pH 5.
Terreni differenziali  Evidenziano particolari caratteristiche biologiche, mediante
l’aggiunta di particolari composto (indicatori di pH…) Ad esempio l’agar-sangue, che
distingue gli streptococchi emolitici da altri batteri.
Terreni di arricchimento  sono modificati con l’aggiunta di componenti che
favoriscono dati microrganismi.

La crescita
cellulare
Molti microrganismi si duplicano per
scissione binaria. Altri per crescita

filamentosa,
gemmazione (lieviti), o scissione multipla e
frammentazione (cianobatteri).
Nella crescita

filamentosa
un’esospora germina, si accresce, dà origine al micelio vegetativo e ad un’ifa aerea, Il
micelio vegetativo rimane cenocitico (unico citoplasma indiviso), mentre l’ifa aerea si
moltiplica molte volte, dando origine ad esospore, che poi ripeteranno a loro volta il
ciclo.

Nella gemmazione, dalla cellula madre si originano sulla superficie più


cellule figlie, che una volta cresciute si accrescono e si staccano dalla
madre. La cellula madre mantiene la sua identità.

Nella scissione multipla una cellula aumenta di dimensione, si divide


molte volte, e origina le cellule figlie, dette beociti, che vengono
liberate quando si apre l’involucro, rappresentato dalla cellula madre.

Nella frammentazione colonie filamentose si frammentano in


corrispondenza di cellule specializzate necridi, e producono più filamenti diversi, detti
ormogoni. Ciascuno di questi darà origine ad una nuova colonia, simile alla colonia
madre.
Per misurare la numerosità e la massa cellulare di una colonia si possono usare
metodi diretti o indiretti. Questo
viene espresso in concentrazioni
su volume definito (ml).
 Metodi diretti  Conta
microscopia, conta
vitale in piastra,
determinazione del
numero più probabile di
cellule.
 Metodi indiretti 
Determinazione dei
parametri di tipo
chimico-fisico, correlati
con lo sviluppo
microbico.
Per determinare la
concentrazione cellulare si può ricorrere al conteggio diretto al microscopio
(batteri del latte). Non permette di distinguere cellule vive da cellule morte.
Il conteggio vitale, invece, lo permette. E’ usato per valutare la carica
microbica in alimenti…
Per determinare la massa cellulare si misura la torbidità della coltura; si usa lo
spettrofotometro. Maggiore è la torbidità, maggiori sono le cellule presenti. La
torbidità è data dalle cellule che riflettono e disperdono la luce. Quanto
maggiore è questa concentrazione, maggiore sarà la luce dispersa. Si può
misurare la quantità di luce dispersa col nefelometro, o si può misurare la luce
non dispersa, che attraversano il campione, col colorimetro o spettrofotometro.
La luce incidente viene fatta passare in una sospensione in una cuvetta; una
fotocellula misura la luce emessa dal campione, quindi che ha attraversato il
campione. Nel colorimetro, il raggio di luce si origina facendo passare la luce
attraverso un filtro colorato. Nello spettrofotometro, invece, la luca viene
diffratta
attraverso
un prisma,
e si può

selezionare una lunghezza d’onda precisa. Si utilizzano coi microrganismi


lunghezze d’onda che vanno dai 540 ai 660 nm.
Si definisce TRASMITTANZA il rapporto tra l’intensità del raggio passato
attraverso la sospensione e il raggio incidente. Ie/Ii
E’ inversamente proporzionale all’ASSORBANZA o densità ottica: logIi/Ie
Per determinare il peso secco, le cellule vengono separate dal terreno di coltura
con centrifugazione, e poi vengono pesate. Il campione viene poi essiccato in
un forno. Viene utilizzato per misurare la crescita dei funghi; non distingue
cellule vive da cellule morte.

Per fare la conta totale al microscopio si ricorre a camere di Burker; vetrini


incisi da un reticolo. Sono noti i quadrati e i volumi dei quadrati. Per avere un
conteggio adeguato bisogna avere una concentrazione cellulare adeguata, se
le dimensioni delle cellule sono medie, e non c’è motilità.
Ci sono 5 quadrati grandi. In un quadratone ci sono 25 quadratini.
Numero totale batteri in 1 mm^2: numero batteri per quadrato x 25.
Numero totale batteri in mm^3: numero batteri per quadrato x 25 x 50.
Numero totale batteri in 1 cm^3: numero batteri per quadrato x 25 x 50 x 1000

Il conteggio vitale rappresenta la concentrazione di


cellule vive in una coltura. Quindi in grado di
accrescersi e formare una colonia. Ogni colonia
è originata da una singola cellula, presente sul campione seminato
sul terreno. Si contano in UFC. Si seminano le piastre, si
incubano. E’ però necessario fare una diluizione
seriale della coltura di partenza, per evitare che le piastre si affollino.
Come diluente si può usare la soluzione
fisiologica o il terreno di coltura.
 Le colonie contabili vanno a 20 a 200.
 Per ottenere la concentrazione della
coltura di partenza: numero di colonie
osservate sulla piastra / volume
seminato x diluizione.
UFC/ml

Metodo delle membrane filtranti


(diretto), si usa in campioni
liquidi con un
numero molto basso
di microrganismi.
Consiste nel filtrare
un volume noto,
attraverso un una
membrana
filtrante di
acetato di
nitrocellulosa. Il
filtro viene poi
depositato su una
superficie di un terreno
agarizzato, la piastra
viene incubata a 37°C, e il numero di colonie ottenuto è riferito all’unità di
volume del liquido filtrato.
La beuta è collegata ad una pompa a vuoto.
Si possono anche usare dei coloranti (come il DAPI, che si lega agli acidi
nucleici), per evidenziare e determinare la carica batterica direttamente sul
sito. E’ utile perché solo il 2% della flora in un suolo è coltivabile in laboratorio.

Oppure si usa il FISH utilizzato in microbiologia ambientale. Si utilizzano


oligonucleotidi fluorescenti (piccoli frammenti di DNA), complementari a regioni
specifiche dell’RNA ribosomiale, e penetrano nella cellula batterica. Una volta
che entrano, si legano in regioni specifiche. In questo modo le cellule sono
visualizzate al microscopio epifluorescente. Permette di visualizzare anche
batteri non coltivabili in laboratorio.

Nel microscopio a fluorescenza, per campioni ambientali, si possono usare


coloranti per determinare cellule vive e cellule morte. Il verde entra nel
citoplasma, e determina le cellule morte. Il rosso non riesce ad attraversare le
membrane integre, e determina le cellule vive.

Ad ogni generazione il numero di cellule raddoppia. Il tempo necessario per


raddoppiare il numero di cellule è detto tempo di generazione. Questo può
variare in base alle condizioni ambientali di crescita.
Quindi, per ottenere
4x10^6 cellule a partire
da 10^3 cellule, sono
necessarie 12 generazioni.

Il tempo di generazione è costante laddove la cellula si duplica.

Il grafico su scala lineare a sinistra non è


utile per ottenere informazioni sulla
velocità di crescita. Per fare questo
viene usato il grafico a destra; la
pendenza della retta equivale alla
velocità di crescita della popolazione
batterica.

Questo permette anche da stimare il tempo di


generazione, e quindi la velocità di crescita.
E’ un grafico semi-logaritmico.
La cellula qui si duplica ogni 60 minuti; quindi il tempo di generazione è di 60
minuti.
Velocità di crescita: 1/60.

ESERCIZI SULLA CRESCITA BATTERICA


 Su un terreno solido ho piastrato 0,1 ml della diluizione 5x10^-7 e ho
contato 35 colonie. Qual è la concentrazione cellulare della coltura di
partenza?
Il numero di colonie va moltiplicato per il reciproco del fattore di
diluizione. Si deve moltiplicare per 10 per poter esprimere gli UFC per ml.
Visto che si inoculano 0,1 ml.
C= 35 x 5x10^7 x 10 = 1,75 x 10^10 CFU/ml

 Quante cellule sono presenti in un terreno di coltura inoculato con 10^2


cellule di un batterio con tempo di generazione di 30 minuti, e incubato
per 16 ore a 37°C?
.n=16/0,5=32
N=10^2 x 2^32

 Avete seminato un’aliquota da 0,1 ml su 3 piastre, e avete contato per


ognuna 186, 194 e 196 colonie. Sapete che sono state eseguite 3
diluizioni successive, ciascuna da 10^-2, e che sono stati seminati 0,1 ml
dell’ultima diluizione eseguita. Qual è la concentrazione cellulare della
coltura di partenza?
n. colonie x reciproco diluizione x 10
(186 + 194 + 196)/3 = 192 (media n. colonie)
C= 192 x 10^6 x 10 = 1,92 x 10^9 CFU/ml

 Da una coltura batterica sono state eseguite le seguenti diluizioni:


1) 0,1 ml coltura + 9,9 ml di slz fisiologica
2) 1 ml di coltura + 9 ml di slz fisiologica
3) 0,5 ml di coltura + 2 ml di slz fisiologica
4) 3 ml di coltura + 6 ml di slz fisiologica
Seminando 0,1 ml dell’ultima diluizione su una piastra sono state contate
128 colonie. Qual è il titolo (la concentrazione cellulare) della coltura di
partenza?
1) Nella 1, il volume totale è 10 ml.
Si prende il volume totale / volume di coltura prelevato. 10 ml / 0,1 ml.
Diluizione 1:100.
2) Volume totale pari a 10 ml. Si fa 10 ml/1 ml. Diluizione 1:10.
3) Volume totale pari a 2,5 ml. Si fa 2,5/0,5. Diluizione 1:5.
4) Volume totale pari a 9ml. Si fa 9/3. Diluizione 1:3.
Per calcolare il fattore di diluizione finale, si moltiplicano i fattori di
diluizione da 1) a 4). Quindi 100x10x5x3 = 15'000 = 1,5 x 10^4.
Si moltiplica il n. di colonie x fattore di diluizione x 10.
128 x 1,5 x 10^4 x 10 = 1,92 x 10^7 CFU.

 E. Coli, in terreno massimo, ha un tempo di generazione di 25 minuti. Al


tempo zero la concentrazione cellulare è di 2x10^7 CFU/ml. Quante
generazioni deve fare per raggiungere la concentrazione cellulare di
1,3x10^9 CFU/ml?
Per passare da un valore all’altro, sono necessarie quindi 6 generazioni.

 Avete eseguito delle


diluizioni successive di una
coltura di S. Cerevisieae in fase
stazionaria. Avete piastrato 1
ml delle diluizioni 10^-5 e 10^-6, e dopo aver incubato le piastre a 28 °C
per 24 ore, contate 260 colonie per la diluizione 10^-5 e 24 colonie per la
diluizione 10^-6. Quante cellule per ml sono presenti nella coltura di
partenza?
Piastra 1: 260 x 10^5 = 1,6 x 10^7 CFU/ml
Piastra 2: 24 x 10^6 = 2,4 x 10^7 CFU/ml
Media tra le due: (2,6x10^7 + 2,4x10^7)/2 = 2,5x10^7 CFU/ml

 Qual è il numero di cellule ottenute se si incuba per 20 ore un terreno di


coltura con 10^2 cellule di un microrganismo che ha un tempo di
generazione di 60 minuti?
Il tempo si esprime sempre in h!!
.n= 20/1h =20
N= No x 2^n = 10^2 x 2^20

 Avete inoculato in 100 ml di terreno a base di triptone ed estratto di


lievito 2x10^5 cellule di E. Coli, provenienti da una coltura in fase
esponenziale. Dopo 3 ore di incubazione a 37 °C avete 10^6 cellule/ml.
Calcolate il tempo di generazione.

 Calcolare il fattore di diluizione necessario per passare da una


coltura con concentrazione 5x10^9 CFU/ml a una coltura con
concentrazione di 2.5x10^4 CFU/ml.
5x10^9 / 2.5 x10^4 = 2x10^5

 La concentrazione cellulare di una coltura è 1.8 x 10^8 CFU/ml.


Disegna lo schema di diluizioni per ottenere 36 colonie su piastra.
Volume finale di dlz 5 ml.

Per sapere quante cellule si


ottengono, valuta la diluizione. Se inizialmente
ci sono 1,8x10^8 cellule e si
diluisce 1:100, se ne avranno
1,8x10^6 e così via.
Per sapere come fare l’ultima
diluizione e ottenere 36
colonie, si fa 180:36, che fa
5. 180 perché nella piastra
3 si hanno 180 colonie.
Perciò l’ultima diluizione da
fare sarà 1:5.

 La

concentrazione di
una coltura è 1.5 x 10^7 CFU/ml,
disegna lo schema di diluizioni per
ottenere 75 colonie su piastra
(volume di diluizione 2 ml).

La crescita microbica
Si può studiare in un sistema chiuso (o batch), dove un numero limitato di cellule viene
inoculato in beuta con terreno adatto. La crescita causa una diminuzione di nutrienti e
un accumulo di sostanze di rifiuto. Se si misurano le cellule presenti e si riportano su
un grafico, si ottiene la curva di crescita.
La fase lag o di latenza è la fase
in cui non aumentano le cellule,
perché appena inoculate devono
adattarsi alle nuove condizioni.
Oppure, quando perché le cellule
sono mantenute a 4 °C. E’
minima quando il terreno ha
37°C.
Durante la fase esponenziale, il
numero di cellule aumenta alla
massima velocità per quella
specie batterica, a quella
temperatura, in quel terreno.
Alcune proprietà delle cellule si
modificano. Si osserva una diminuzione di nutrienti e un accumulo di sostanze di
scarto.
La fase stazionaria è quella in cui il numero di cellule non aumenta nel tempo, perché
le cellule raggiungono un equilibrio tra vive/morte, o perché smettono di dividersi.
Quando l’O2 si riduce, mancano i nutrimenti, c’è tanta densità cellulare, accumulo di
scarto, le cellule perdono dimensioni e sono più durature.
All’inizio della fase stazionaria parte il processo di sporificazione, vengono prodotti
antibiotici.
Successivamente c’è la fase di morte, diminuiscono le cellule nel tempo. Esse lisano.

Quando una popolazione batterica cresce in un terreno


minimo che contiene 2 diverse fonti organiche di
carbonio, la curva è quella a sinistra. LE cellule usano
prima la fonte di carbonio più facilmente metabolizzabile,
in questo caso il glucosio. Una volta finito, usano l’altra, il
lattosio. E’ detto fenomeno di DIAUXIA (crescita
diauxica).
La fase stazionaria è dovuta al fatto che le cellule devono
sintetizzare gli enzimi necessari per utilizzare il lattosio. I
batteri competono per i vari nutrimenti presenti; una
crescita rapida è un vantaggio riproduttivo.
Ma per la cellula è energeticamente più vantaggioso
usare la fonte di carbonio più semplice, e sfruttare l’altra
fonte solo quando è assente la prima.
La curva a destra misura il livello dell’attività enzimatica
della beta galattosidati, che scinde il lattosio in glucosio e
galattosio. Il suo livello aumenta durante la fase di stasi,
e quando utilizza il lattosio quando fonte principale; finchè utilizza il glucosio non viene
sintetizzato.

La crescita in coltura continua


E’ un sistema aperto in cui il terreno fresco è continuamente aggiunto ad un tasso
costante, mentre il terreno vecchio è eliminato.
Per mantenere una coltura sempre nella fase esponenziale è necessaria. Le
apparecchiature che consentono questo sono i chemostati e i turbidostati.
Il chemostato contiene
V di coltura costante, N cellule
costante.
Si mantiene un’agitazione per
permettere una diffusione di
terreno e gas. Si possono
tenere controllati anche
pH, temperatura, O2.
Il tasso di crescita è
determinato dalla velocità di
flusso di terreno fresco.

Nel turbidostato, il 1°
recipiente contiene
terreno fresco, nel
contenitore al centro viene
effettuata la crescita
batterica, in quello a
destra si raccoglie il
terreno vecchio. Ha una
fotocellula che misura la
torbidità, e quindi la
velocità di flusso nella
beuta di coltivazione fa
mantenere un livello
predeterminato di densità
cellulare. Si tratta di un
sistema di controllo interno.

Effetti della TEMPERATURA sulla crescita batterica


Raggiunti valori troppo elevati, portano alla
denaturazione delle proteine e al collasso della
membrana citoplasmatica, portando alla morte. Valori
troppo bassi di temperatura, invece, interferiscono
con la fluidità delle membrane e quindi
sopprimono la replicazione.
Si identificano temperatura minima, ottimale e massima
di crescita.
Gli

estremofili crescono a temperature molto elevate (100°C) o molto basse (-10°C).


Gli psicrofili devono mantenere integre e fluide le membrane, per creare un
gradiente protonico e trasportare le sostanze. Gli psicrotolleranti sono in grado di
crescere a 0°C, ma hanno temperature ottimali comprese tra i 20°C e 40°C.
Gli psicrofili producono enzimi che funzionano bene a basse temperature. Questi
enzimi hanno una maggiore quantità di alfa-eliche e meno beta-foglietto. Inoltre hanno
più a.a polari, e meno a.a idrofobici. Un sistema di lipidi non saturati o a catena corta
rende le membrane degli psicrofili maggiormente flessibili a basse temperature. Ne
sono un esempio le alghe della neve, le spore di Chlamydomonas nivalis, lo psicrofilo
marino Colwellia psychrerythraea (presenta membana con acidi grassi polinsaturi, che
resistono al congelamento, sono composti di poliestere, soluti protettivi e normali
enzimi alterati).
I termofili hanno stabilità al calore legata all’aumento dei legami ionici tra cariche
negative/positive, e dal forte compattamento delle porzioni interne, altamente
idrofobiche delle proteine. E’ anche importante l’attività delle ciaperonine. Nei
metanogeni termofili (archea in grado di produrre metano), c’è un’alta concentrazione
di 2,3difosfoglicerano di potassio ciclico, che previene danni chimici. Altri termofili
producono una forma di DNA topoisomerasi detta DNA girasi inversa.
Il principale adattamento alle alte temperature include un’alta produzione di lipidi
saturi.
Enzimi che funzionano ad alte temperature hanno permesso anche all’uomo di
sfruttarli, come la polimerasi della PCR. Microrganismi termofili sono Thermus
Aquaticus, Streptococcus Thermophilus e Lactobacillus bulgaricus.
Gli ipertermofili non hanno acidi grassi nelle loro membrane: hanno idrocarburi C40. Si
tratta di fitano legato a glicerolo, mediante legame etere; è un singolo strato. I due
generi ai protoni risulta alta, rispetto agli ioni. Gli archea ipertermofili sono perlopiù
anaerobi e chemiolitotrofi. Si ossida H2 o S, associato a riduzione di S, So4-, CO2, NO3,
presenti sulla superficie vulcanica.

Effetti del pH sulla crescita batterica


- Neutrofili  pH 5-9
- Acidofili  pH >2
- Basofili  <10
In un sistema di crescita chiuso, il pH può variare in seguito all’espulsione di sostanze
di scarto, che abbassano il pH. Per questo sono necessarie le soluzioni tampone, come
i tamponi fosfato NaH2PO4. Il pH intracellulare, però, deve essere mantenuto intorno
alla neutralità.
Effetti della disponibilità d’acqua (acqua libera) sulla crescita batterica
L’acqua disponibile dipende dalla concentrazione di
soluti nella cellula stessa. Ogni substrato deve
presentare una fase acquosa, che funge da solvente.
L’acqua libera è la quota d’acqua del substrato che i
microrganismi possono usare per il metabolismo.
- Xerofilo: basse concentraz. Di acqua
- Alofilo: alte concentraz. Saline
- Osmofilo: alte concentraz. Di zuccheri
La concentrazione è più
elevata nel citoplasma, quindi per osmosi
l’acqua all’esterno entrerà nel citoplasma.

Effetto dell’ossigeno sulla crescita batterica


Questi intermedi vanno a formare i ROS
(forme reattive dell’ossigeno), che si
formano durante il metabolismo
aerobio. Se la cellula non riesce a
neutralizzarli si potrebbero
ossidare le macromolecole e portare a necrosi.

Vengono neutralizzati da
particolari enzimi:
- Aerobi obbligati (Bacillus) superossido reduttasi e catalasi
- Aerobi facoltativi (Escherichia)
- Microaerofili (Lactobacillus) superossido dismutasi
- Anaerobi obbligati (clostridium)
- Anaerobi aerotolleranti superossido dismutasi o complessi di ioni manganese,
c’è perossidasi

Test della catalasi


La catalasi è posseduta dagli aerobi obbligati. Serve a trasformare il perossido
di idrogeno. Serve ad identificare un batterio. Si effettua su un vetrino, su cui si
pone una goccia di H2O2, con un’ansa si pongono sopra i microrganismi. Se si
formano delle bolle (costituite da O2), si tratta di un batterio catalasi positivo.
H2=2 + H2O2  2 H2O + O2

Crescita di microrganismi microaerofili


Per la crescita di anerobi è possibile utilizzare terreni speciali contenenti agenti
riducenti, come il tioglicollato o la cisteina. L’O2 può inoltre essere rimosso con
pompe a vuoto, e sostituito con altri gas quali N e CO2. Viene usata una giara
per anaerobiosi, con la busta GasPak, che libera idrogeno e anidride carbonica.

Crescita di anaerobi obbligati


Per farli crescere servono delle camere di lavoro anaerobie, e un incubatore.
L’anaerobiosi è mantenuta grazie ad una pompa a vuoto e spurghi di azoto.
L’ossigeno rimasto viene poi eliminato tramite un catalizzatore al palladio e
idrogeno. L’ossigeno reagisce con l’idrogeno formando acqua, poi assorbita per
mezzo di un essicante.

Controllo della crescita microbica


Ci sono microrganismi malevoli, che possono essere patogeni o deteriorare
alimenti. Per questo è importante controllare la crescita microbica, per
controllarla o inibirla. Tutti gli utensili devono essere sterili (assenza assoluta di
organismi vivi, virus e spore).
Resistenza al controllo microbico
E’ importante poter disporre di metodi che ci permettano di uccidere o inibire la
crescita di
microrganismi. Per
ucciderli si usa la
sterilizzazione, in cui
vengono
eliminate
anche
spore
e

virus.
Per inibire la crescita, si
può fare la
decontaminazione di
oggetti e
superfici, o la
disinfezione, che colpisce
direttamente i
microrganismi, sebbene
non li elimini tutti.

Il calore può essere secco (incenerimento,


forni di essicazione) o umido (autoclavi,
pastorizzazione, acqua calda). Questo porta alla sterilizzazione.
Le radiazioni possono essere non ionizzanti, con cui si parla di disinfezione, o
ionizzanti, con cui si parla di sterilizzazione.
Antisepsi: composti chimici applicati sulla superficie del corpo, usati per inibire
la crescita batterica.
I composti chimici chemioterapici vengono somministrati all’individuo
(antibiotici).

La cinetica di estinzione di una


popolazione ha un andamento
esponenziale/logaritmico. Prevede un
decremento esponenziale dei
microrganismi in funzione del tempo di
esposizione alla temperatura di 121°C.
Il TEMPO di RIDUZIONE DECIMALE D è il
tempo necessario per ridurre di 10 volte
la popolazione microbica, ad una
determinata temperatura. E’
inversamente proporzionale alla
temperatura.

In questo caso, il tempo di riduzione


decimale D è 1 minuto di esposizione.

A causa della resistenza di alcune cellule al


trattamento utilizzato, il tasso di morte si può ridurre. L’efficacia è determinata
da dimensioni della popolazione, composizione,
durata di esposizione.

IL VALORE Z è definito come la variazione di


temperatura da applicare, per avere una variazione
di 10 volte del valore di D (ovvero l’aumento di T
che determina un’accelerazione di 10 volte della
velocità di distruzione termina della popolazione).
Sterilizzazione con calore umido in autoclave (118-121°C per 20-30 minuti)
 Terreni di coltura
 Soluzioni non termolabili (slz fisiologica)
 Materiale di Pyrex
 E’ l’unica che è in grado di risolvere il problema di eliminare le
endospore.
Sterilizzazione con calore secco in stufa (250°C per 4 ore)
 Beute, cilindri, pipette in vetro Pyrex
 Materiale in acciaio (contenitori per pipette)

Ciclo di sterilizzazione in autoclave


La temperatura dell’oggetto
deve essere raggiunta e
mantenuta per almeno
per 15 minuti, per
garantire la sterilità. La
temperatura dell’oggetto
aumenta più lentamente
rispetto alla temperatura
dell’autoclave.

La pastorizzazione è un
processo che riduce la popolazione
batterica di alimenti che non possono essere sottoposti a
temperature troppo alte, per via della conseguente perdita di proprietà
organolettiche. Previene Mycobatteri, salmonella, E.Coli, previene la crescita di
batteri responsabili del deterioramento dei cibi.

Nel latte si può fare in 2 modi:


1) Riscaldando a 63°C per 30 min (metodo originario)
2) Riscaldando a 72°C per 15 secondi, e raffreddando rapidamente
(pastorizz. Rapida).

La filtrazione si usa con filtrazioni termolabili (slz di antibiotici, vitamine). E’


un metodo meccanico che separa le cellule microbiche dalla slz. Il filtro ha
pochi piccoli, che lasciano passare solo i liquidi e i gas. In base alla dimensione
della fauna bisogna scegliere un filtro adeguato.
 A spessore: costituiti da strati fibrosi di carta o di lana di vetro. Spesso
sono utilizzati come pre-filtri, per rimuovere le particelle più grandi. Si
usano per sterilizzare l’aria in processi industriali.
 Membrane filtranti: costituite da acetato o nitrato di cellulosa. Servono a
filtrare slz di antibiotici, vitamine in lab. Le dimensioni dei pori vanno da
0,2-0,4 micrometri. Vengono anche usate con grandi quantità di liquido.
 Filtri tipo nucleopore, prodotti trattando un sottile strato di policarbonato
con radiazioni nucleari e un composto chimico corrosivo.
 Filtri HEPA: utilizzati per sterilizzare l’aria delle cappe biologiche (a flusso
laminare). Dell’aria sterile fluisce in modo verticale. Previene la
contaminazione dell’operatore e dell’ambiente. La pressione dell’aria è
negativa, percui non fuoriesce. Prima che l’aria venga rimossa passa
anche in uscita attraverso un filtro HEPA.

Per il controllo della crescita possono anche essere usati composti


chimici.
In particolare, sono antisettici i composti poco tossici che possono essere
impiegati per mani o ferite.
I disinfettanti provocano la morte dell’organismo in questione, ma sono nocivi
anche per organismi superiori, percui vengono usati in oggetti inanimati, dove
non può avvenire il trattamento con calore.
L’effetto dipende dal tipo di sostanza, dalla concentrazione, dal tempo di
applicazione e dalla temperatura.
I fenoli e derivati denaturano le proteine e disciolgono i lipidi delle membrane
biologiche; risultano tossici per le cellule umane.
Gli alogeni sono fortemente ossidanti, meno irritanti per le cellule umane. Tra
questi c’è il cloro e lo iodio.
Gli alcoli vengono usati sia per superfici che antisettici. Dissolvono i lipidi delle
membrane e denaturano le proteine.
I tensioattivi (composti quaternari dell’ammonio) vengono usati per tutti.
Le aldeidi sterilizzano rapidamente strumenti ospedalieri.
Gas come ossido di etilene vengono utilizzati per sterilizzare oggetti di
laboratorio.

L’efficacia
di
un agente

antimicrobico è influenzata da
diversi fattori:
 Dimensione iniziale della popolazione microbica.
 Composizione della popolazione.
 Concentrazione dell’agente microbico.
 Durata dell’esposizione dell’agente microbico.
 Temperatura.
 Condizioni ambientali (pH, materiale organico…)
Quando si deve scegliere l’antimicrobico bisogna tener conto di questi
parametri.

Sterilizzazioni che danneggiano il DNA


- Radiazioni ionizzanti (raggi X, gamma…): producono radicali tossici,
idrossilici, idruro, che reagiscono con proteine e DNA. Utilizzati in prodotti
alimentari, farmaci.
- Radiazioni non-ionizzanti (UV): producono dimeri di timina, che bloccano
la replicazione, rompendo il DNA. Utilizzati in ambienti, cappe per
patogeni, materiale plastico monouso.
o Microonde, radiazioni UV, raggi X e raggi gamme controllano la crescita
microbica. Le fonti di raggi X e gamma sono nuclidi radioattivi, come il
Co60 e il Cs137. Ma sono legate a costi e rischi, percui sono limitati
all’utilizzo industriale. Unità di misura: dose di radiazione assorbita; si
misura in rad o gray. 1 gray= 100 rad.

Sterilizzazione mediante l’impiego di gas


Viene usato per sterilizzare materiale plastico monouso, che impiegano
apparecchiature che emettono gas come l’ossido di etilene. Esso è considerato
tossico perché altera i processi di ionizzazione delle proteine. E’ economico e
semplica da usare, ma deve essere esposto per 4h a 55°C.

Agenti chimici
Vengono usati in disinfezione e antisepsi. Hanno proprietà che uccidono i
microrganismi; i principali meccanismi d’azione sono:
1) Denaturazione delle proteine con combinazione dei gruppi sulfidrici
(ioni di metalli pesanti) e gruppi polari (formaldeide, glutaraldeide, ossido
di etilene, propiolattone)
2) Ossidazione di gruppi sulfidrici (perossidi, permanganato, cloro,
iodio)
3) Alterazione delle membrane, per solubilizzare dei lipidi (alcoli, fenoli,
Sali di ammonio quaternario)
Requisiti di un prodotto disinfettante: ampio spettro d’azione, assenza di colore,
odore, sapore, atossici per l’operatore e per l’alimento, compatibili coi
materiali, attivi a varie temperature, stabili alle concentrazioni usate, di facile
utilizzo, con attività in presenza di molecole organiche e capacità di
penetrazione in materiali porosi.
-
Il test per valutare l’efficacia del disinfettante è detto test del coefficiente
fenolico. Consiste nel preparare due serie di provette, contenenti brodocoltura,
una diluita col disinfettante e l’altra fenolo. Poi vengono inoculate con batteri e
incubate. Da queste provette vengono fatte sottocolture, usando prelievi ogni 5
minuti, incubati per più giorni.
Le diluizioni più elevate ancora in grado di uccidere i batteri dopo
un’esposizione di 10 minuti vengono usate per calcolare il coefficiente fenolico.
E’ espresso come il rapporto tra la diluizione appropriata del disinfettante
saggiato e la diluizione del fenolo. Coefficienti maggiori di 1 indicano
un’efficacia superiore a quella del fenolo.
Antibiotici e chemioterapici sono molecole organiche, che sono selettive e
inibiscono/uccidono cellule batteriche, senza danneggiare l’ospite. Gli
antibiotici si ottengono dal metabolismo secondario di batteri e funghi. I
chemioterapici si ottengono per sintesi.
GLI ANTIBIOTICI
Sono selettivi. Il 70% è prodotto da attinomiceti filamentosi. I produttori di
antibiotici sono resistenti a questi ultimi.
Lo spettro d’azione è l’insieme delle speci batteriche verso cui l’antibiotico è
efficace. Può essere ristretto, ampio o esteso. Un ceppo batterico è
considerato:
- Sensibile quando la quantità più piccola di AB per ucciderlo è inferiore a 1
mg/ml.
- Resistente quando la quantità più piccola di AB necessaria è superiore a
50mg/l.
- Moderatamente resistente quando la quantità più piccola di AB
necessaria ha valori intermedi.
Specie microbiche che non rientrano nello spettro d’azione sono dette
naturalmente insensibili. Ceppi sensibili ad un antibiotico possono diventarci
resistenti (resistenza acquisita).

Un antibiotico battericida uccide i batteri sensibili. La torbidità può rimanere


costante, ma le colonie diminuiranno. Molti battericidi sono batteriolitici; questo
trattamento porta alla diminuzione sia di torbidità che di numero di cellule.
L’attività batteriostatica/battericida dipende da: specie considerata,
concentrazione dell’antibiotico, stato fisiologico del microrganismo, tempo di
contatto.
Anche un batteriostatico, se esposto per più tempo, può portare alla morte dei
microrganismi
La curva blu rappresenta una normale crescita
batterica. Aggiungendo l’antibiotico nel punto
indicato dalla freccia possiamo stabilire se è
batteriostatico (le cellule non aumentano,
rimangono costanti), o battericida (le cellule
muoiono, non si sviluppano le colonie).
Invece che contare le colonie UFC si può anche
verificare la massa, con la densità ottica. L’andamento del grafico sarà lo
stesso.

Ma come si allestisce e interpreta un antibiogramma?


Serve a determinare la sensibilità agli antibiotici, e guidare nella scelta
dell’antibiotico in seguito ad un’infezione. I risultati stabiliscono se l’antibiotico
è efficace in vitro. I break points classificano la categoria di appartenenza del
microrganismo.
Si usano 2 metodi:
- Test di Kirby Bauer, diffusione in
agar: i dischetti devono essere
almeno 2 cm lontani dal bordo e
2,4 cm l’uno dall’altro.
L’antibiotico diffonderà nel terreno
durante l’incubazione, formando un
gradiente di concentrazione
decrescente, radialmente dal
dischetto.
Il microrganismo crescerà
formando una patina uniforme, che
non si osserverà intorno ai dischetti
con antibiotico efficace. Si formerà
il cosiddetto alone di inibizione,
che avrà un certo diametro. Questo
valore si misurerà e confronterà coi
valori standard; in base a questo si
classificherà il microrganismo
come sensibile, intermedio o
resistente. E’ conveniente come
metodo, perché sulla stessa piastra
si possono testare più antibiotici. E’
però una stima semi-quantitativa,
perché sono vari i fattori che interagiscono: V di diffusione
dell’antibiotico, V di crescita del microrganismo, T di incubazione,
Per questo deve essere eseguito in condizioni
standardizzate, devono esserci 10^7 colonie sulla
piastra, il tipo di terreno, la T di incubazione.

- Diluizione in brodo MIC: permette di


determinare la minima concentrazione
inibente di un antibiotico, su una
popolazione batterica. Si esprime in
microgrammo di antibiotico/ml di coltura
batterica.
In ogni provetta contentente coltura, si
inserisce una quantità crescente di
antibiotico. In tutte sono inoculate la stessa
quantità di cellule.
A partire dalla provetta a sinistra verso
destra, c’è una diminuizione della torbidità della coltura.
La MIC è la quantità di antibiotico presente nella prima provetta limpida.
In questo disegno sarebbe la quarta provetta.
La crescita viene valutata visivamente.

Ma perché un antibiotico uccide una cellula batterica? Perché bersaglia


parti di una cellula batterica, elencati qui.

Molti interferiscono con la sintesi delle proteine. Dei chemioterapici


interferiscono col metabolismo dell’acido folico, essenziale per la cellula
batterica.
Gli antibiotici suddivisi in base al bersaglio
Certe molecole interferiscono con la membrana plasmatica degli eucariotici.

Principali antibiotici suddivisi in base al bersaglio


Criteri di classificazione degli agenti biologici:
1) Infettività: capacità di un microrganismo di penetrare e moltiplicarsi nell’ospite.
2) Patogenicità: capacità di un microrganismo di produrre malattia in seguito
all’infezione.
3) Trasmissibilità/spettro d’ospite: capacità di essere trasmesso da un soggetto
portatore o malato ad un soggetto non infetti, presenza di vettori e standards
igienici.
4) Neutralizzabilità: disponibilità di efficaci terapie o misure profilattiche attive o
passive, per prevenire la malattia, con misure di sanità pubblica.

Classificazione del gruppo di rischio in base al rischio di infezione


- Gruppo di rischio 1: basso rischio (E. Coli, B. Subtilis)
- Gruppo di rischio 2: patogeni che possono causare la malattia all’uomo, ma non
sono rischiose per gli operatori (Clostridium tetani, Enterovirus).
- Gruppo di rischio 3: patogeni che causano patologie e sono un rischio per i
lavoratori. Esistono misure profilattiche (micobacterium tubercolosis, Yersdinia
Pestis).
- Gruppo di rischio 4: Rischiosi per l’uomo, i lavoratori e comunità. Non esistono
misure profilattiche (Virus Ebola)

I laboratori biologici si dividono in:


BLS1 (livello sicurezza biologica 1), rischio individuale basso, rischio collettivo basso
BSL2 coinvolge agenti biologici di moderato rischio. Rischio individuale moderato, e
rischio collettivo basso. Hanno una bassa probabilità di trasferirsi nella comunità.
BSL3 il rischio individuale è elevato, il rischio collettivo è moderato. Hanno una
moderata probabilità di propagarsi in comunità, sono disponibili misure profilattiche
efficaci. Questi laboratori sono separati, hanno doppia porta d’ingresso, un flusso
d’aria direzionale all’interno del laboratorio.
BSL4 rischio individuale elevato e rischio collettivo elevato. Causano gravi malattie,
sono un rischio per gli operatori, hanno elevato rischio di propagazione nella comunità,
non ci sono efficaci misure preventive o terapie.

Perchè studiare il metabolismo?


Per classificare i batteri, per le applicazioni pratiche di fermentazioni, e per
possibili sviluppi nel campo del biorisanamento. Conoscendo le fonti di C usate
da un batterio o fungo possiamo pensare che sia in grado di degradare una
sostanza inquinante.
Non esiste una sostanza naturale che i microrganismi non possono
metabolizzare. Li trasformano in diverse forme di energia metabolica (ATP e
potere riducente), coinvolte nella reazioni redox che
generano la forza proton-motrice, fanno assimilare la
CO2 ecc.
I microrganismi trasformano le molecole
dell’ambiente nei 13 precursori metabolici essenziali
per la biosintesi di tutte le macromolecole.
La diversità metabolica è la capacità dei
microrganismi di usare un ampio spettro di fonti
di energia e C (ossidazione anaerobia
dell’ammonio con produzione di azoto molecolare,
ossidazione anaerobia del metano ad opera
degli archeametanogeni).

La cellula vivente mantiene


l’omeostasi, compie il movimento,
differenziamento, accrescimento e
riproduzione. L’energia la ricava dal sistema
esterno, e la trasferisce al sistema interno,
dove viene utilizzata. L’energia chimica si trova sotto forma di energia chimica
ATP, GTP, o potere riducente piridin e flavin nucleotidi ridotti. Il potenziale di
riduzione misura la forza di un agente riducente a cedere elettroni; si misura in
Volt. Vengono rappresentati questi valori nella cosiddetta torre di elettroni. Il
composto più in alto dona gli elettroni a quella in basso; maggiore è il delta
maggiore è l’energia rilasciata.

Il trasferimento di elettroni e protoni da un donatore ad un accettore avviene


attraverso i trasportatori di elettroni intermedi.
1) DIFFUSIBILI LIBERI (NAD+ O NADP+) trasportatori di idrogeno. Accettano
atomi di idrogeno dal substrato in reazioni catalizzate dalla deidrogenasi;
passano dalla forma ossidata alla forma ridotta e rilasciano elettroni e
protoni ad altri substrati, in reazioni successive.
COENZIMI (NAD, NADP, FAD). Il NAD partecipa a molte ossidoriduzioni;
accetta atomi di H rilasciati dal substrato, in reazioni catalizzate da
deidrogenasi; passa dalla forma ossidata a quella ridotta, e rilascia
elettroni e protoni ad altri substrati in altre reazioni.
2) TRASPORTATORI DI ELETTRONI LEGATI A PROTEINE DI MEMBRANA
a. NADH deidrogenasi trasferiscono idrogeno da NADH a
flavoproteine
b. Flavoproteine legate al coenzima FMN che si riduce/ossida,
accettando/donando H.
c. Proteine ferro-zolfo, contengono 2/4/8 atomi di ferro.
d. Citocromi, associate a un gruppo eme che contiene ferro allo stato
atomico, 2+ o 3+. I citocromi sono caratteristici per ogni
organismo, e hanno spettri di assorbimento della luce caratteristici;
variano per potenziale di ossidoriduzione o peso atomico.
e. Chinoni o coenzimi Q (ubichinone), non proteici. L’ubichinone è
in gram – e mitocondri di eucarioti. Il menachinone è presente nei
gram +. I chinoni accettano elettroni e li donano a molecole
trasportatrici, in base alla molecola che funge da accettore finale.
Sono collocati in modo ordinato sulla membrana citoplasmatica o in
mitocondri e cloroplasti. Portano ad un gradiente protonico
transmembrana. Costituiscono la catena di trasporto degli elettroni.

Meccanismi per ottenere ATP a partire da ADP e P:


1) Fosforilazione a livello di substrato. I legami
tra fosfato e sostanza organica acquistano
energia; avvengono durante le fermentazioni,
nel ciclo di Krebs, quando la gliceraldeide 3-P
forma acido 1,3-fosfoglicerico.

2) Fosforilazione a livello di membrana: può essere sintetizzato ATP con


l’ATP sintasi, che sfrutta la forza proton-motrice (FPM), un gradiente
protonico transmembrana generato da una serie di reazioni di
ossidoriduzione. Se la forza proton motrice è generata da energia
luminosa, si parla di FOTOFOSFORILAZIONE. Se sono reazioni di
ossidoriduzione tra composti chimici si parla di FOTOFOSFORILAZIONE
OSSIDATIVA.
Sono più efficienti della fosforilazione a livello del substrato.

Catena di trasporto degli elettroni nei batteri chemioeterotrofi

Catena di trasporto di
elettroni in E. Coli
Nello stesso batterio possono attivarsi trasportatori di elettroni diversi, in base
al donatore e alle condizioni di crescita. Oltre alle NADH ci sono altre
deidrogenasi.
La reazione iniziale di trasferimento di elettroni li porta, attraverso il blocco
delle deidrogenasi iniziali, dai substrati ai pool di chinoni, che poi li portano alle
ossidasi terminali.

ATP sintasi in E. Coli

La

fermentazione è
anaerobia, è
l’ossidazione parziale di sostanza
organica,
in cui gli elettroni sono trasferiti
a un’altra molecola organica più ossidata.
Non richiede ossigeno o altri eccettori. L’energia libera rilasciata
è utilizzata per produrre energia metabolica ATP, solo mediante fosforilazione
del substrato, non essendo presente la catena di trasporto di elettroni. Il NADH
prodotto si riossida, riducendo un’altra molecola organica, che verrà eliminata
come prodotto di scarto. Il NAD ossidato si usa per ossidare un’altra molecola
di substrato, e produrre un altro ATP.
Molte fermentazioni hanno il piruvato come intermedio chiave. La successiva
riduzione finale è diversificata nelle varie fermentazioni, e dipendono dal
microrganismo coinvolto (lattica, acido-mista, aceton-butanolica, propionica,
alcolica, 2,3-butandiolica, butirrica…).
Anche le cellule muscolari producono acido lattico in assenza di ossigeno.

Nella respirazione i substrati vengono ossidati, e gli elettroni sono indirizzati


alla catena di trasporto degli elettroni nella membrana citoplasmatica. Al
termine della catena si trova l’accettore finale di elettroni, una molecola
organica ossidata (O2 ecc). Permette di produrre energia metabolica sotto
forma di ATP maggiore.
La diversità metabolica è dovuta alla varietà di donatori di elettroni che i
procarioti possono usare.
Anche dalle capacità metaboliche del microrganismo, e dalla disponibilità
nell’ambiente di donatori e accettori di elettroni. Esistono microrganismi capaci
di eseguire tutti i tipi di metabolismo, e di effettuare un unico tipo di
metabolismo energetico.

Nella respirazione aerobia, una molecola di glucosio si ossida a CO2, H2O e 38


ATP finali netti.
Nella fermentazione si ottengono 2 ATP finali netti. Mancano ciclo di Krebs e
catena di trasporto di elettroni. In altre fermentazioni la resa può essere di 3 o
4 ATP.
3 vie di conversione degli zuccheri in piruvato:
La glicolisi è usata da procarioti ed eucarioti, ossida il glucosio a piruvato. Si
rompe il legame covalente. Si tratta di reazioni di riarrangiamento, si
consumano 2 ATP. Da una molecola di glucosio si formano 2 piruvato, con 2 ATP
e 2 NADH.

La via del chetogluconato/Entner Doudoroff,


sostituisce la glicolisi in cerci Gram- e Archea.
Complessivamente, si producono a partire da 1 glucosio 2 piruvato, 1
ATP, 1 NADPH e 1 NADH.

Non serve sapere le strutture nel dettaglio!


Via dei pentoso fosfati: vengono generati NADPH, usati come potere
riducente nei processi di biosintesi nella cellula. In E. Coli, Streptomiceti e lieviti
è attivo, ma prevalgono glicolisi. Si parte da 3 molecole di glucosio 6 fosfato +
6 molecole di NAD+ + 3H20  2 molecole di fruttosio-6-fosfato + 1 piruvato +
3 CO2 + 6 NAPH + 6 H+.

LA FERMENTAZIONE LATTICA
Vengono usati i batteri lattici omofermentanti (fermentazione omolattica), ed
eterofermentanti (fermentazione eterolattica, con produzione di acido lattico,
CO2 ed etanolo). Per gli yogurt si usano i bifidobatteri, che conducono una
fermentazione differente.
OMOLATTICA

Viene effettuata da Lactobacillus casei e pentosus, Streptococcus Faecalis.


Usano la glicolisi per produrre 2 molecole di acido piruvico, 2 ATP e 2 NADH.
Poi, il piruvato viene ridotto a lattato tramite lattato deidrogenasi. E’ chiave
l’enzima fruttosio-1,5-difosfato aldolasi.

ETEROLATTICA
La fanno i batteri lattici eterofermentanti, mancano dell’enzima fruttosio-1,6-
difosfato aldolasi, non possono quindi usare la glicolisi. Usano la via del
pentoso fosfato in alternativa. Questi microrganismi sono Lactobacillus
pentoaceticus, Leuconostoc Mesenteroides.
Il bilancio netto è, a partire da 1 glucosio  1 lattato + 1 etanolo
+ 1ATP + 1CO2
Si possono ottenere quantità di ATP molto limitate con entrambe le
modalità.

FERMENTAZIONE DEI
BIFIDOBATTERI
Usano la via del fruttosio-6-fosfato, con
produzione di piruvato che può essere ridotto
a lattico tramite la lattato-deidrogenasi. In
alternativa può essere scisso in acido formico
e acetil-fosfato, a sua volta trasformato
in acido acetico, con produzione di ATP.
Mancano dell’enzima fruttosio-1,6-difosfato
aldolasi.
Glucosio  acido lattico, acido acetico, ATP
Sono importanti la fruttosio-6-P-
fosfochetolasi e la xilulosio-5-P-
fosfochetolasi.

I batteri lattici sono gram+, non sono sporigeni, hanno un DNA a basso
contenuto di GC, le cellule sono a forma di bastoncino/cocco, fanno la
fermentazione. Sono microaerofili e producono ATP solo per fosforilazione a
livello del substrato; hanno richieste nutrizionali molto complesse.
Streptococcus: cocchi omofermentanti, possono essere patogeni per l’uomo,
producendo emolisine. Si trova in latte, formaggi, yogurt insieme a L.
Bulgaricus. Sono seminati su agar sangue, producono un alone dovuto alla lisi
dei globuli rossi (di tipo beta). Altri ceppi producono un alone verdastro (di tipo
alfa), in seguito ad ossidazione del ferro dell’emoglobina.
Lo Streptococcus Pyogenes è un patogeno umano, può causare febbri
reumatiche.
Lo Streptococcus Mutans aderisce alla superficie dei denti, dove produce degli
acidi che causano carie.
I Lattobacilli sono a bastoncelli, sono presenti nelle mucosa animali, piante,
acque reflue, cibo in fermentazione.
Lactobacillus acidofilus è omofermentante, vive in ambienti acidi e con/senza
ossigeno. E’ abbondante nel tratto gastrointestinale umano e animale, bocca e
vagina. Dà protezione da patogeni e nutrizionale, favorisce l’assimilazione di
sostanze nutrienti e produce enzimi che favoriscono la biodisponibilità di
vitamine K e B del calcio. E’ impiegato nelle fermentazioni di prodotti lattiero-
caseari.
Leuconostoc: sono cocchi eterofermentanti, alcuni producono destrano
(addensante) se coltivati su saccarosio, altri producono polimeri polisaccaridici
del fruttosio, i levani (additivi), che hanno impieghi farmaceutici e industriali.
I bifidobacterium sono bastoncelli biforcati o ramificati, Gram+, immobili,
asporigeni, anaerobi. Crescono a pH 6,5/7, e a 35-39°C. Presenti nel tratto
gastrointestinale, in alimenti e nelle acque reflue. Nell’intestino adulto
alloggiano le specie Adolescentis e Catenulatum. Producono metaboliti
benefici.

Il Saccharomyces cerevisieae è un lievito anaerobio facoltativo. In assenza di


ossigeno e a pH leggermente acido effettua fermentazione alcolica.

La fermentazione alcolica può essere alterata modificando le condizioni


ambientali. Ad esempio, se si aggiunge il bisolfito di sodio complessa, fa
precipitare l’acetaldeide, rendendo possibile la via alternativa di riduzione, con
produzione finale di glicerolo-3-fosfato. Questo viene messo in pratica

industrialmente.

Lo Zymomonas è
avvantaggiato rispetto al

Saccharomyces,
perché è più tollerante all’etanolo. Inoltre ha l’enzima piruvato decarbossilasi,
la cui presenza è molto rara nei batteri. La fermentazione alcolica avviene
attraverso la via del pentoso-fosfato. Il piruvato subisce una decarbossilazione
non ossidativa ad acetaldeide, che viene poi ridotta a etanolo. Il bilancio netto
è: 1 glucosio  2 etanolo + 1 ATP + 2 CO2.

I batteri enterici come E. Coli, Salmonella e Shigella, in anaerobiosi efettuano la


fermentazione acido-mista (prodotti: miscela di acidi organici, acido lattico, acido
acetico, acido formico e acido succinico, etanolo, CO2, H2…).
Altri enterobatteri come Enterobacter e Serratia in anaerobiosi effettuano la
fermentazione 2,3 butandiolica. I prodotti sono il 2,3 butandiolo, l’etanolo, acidi
organici, CO2, H2…
In questo caso non si acidifica il terreno di coltura.

L’enzima piruvato formiato liasi CoA dipendente trasforma l’acido piruvico derivante
da glicolisi in acetil-CoA e acido formico. Poi, l’enzima formiato idrogenoliasi scinde
l’acido formico in CO2 e H2. Dall’acido piruvico si formano anche acido lattico (per
riduzione diretta) e acido succinico (per carbossilazione riduttiva).

Prodotti finali della fermentazione acido-mista: acido acetico, acido lattico,


acido succinico, acido formico (H2 + CO2), etanolo.
Fermentazione 2,3-butandiolica
Fatta da Enterobacter e Serratia. I prodotti sono 2,3-
butandiolo, acido formico ed etanolo, attraverso la
reazione di due molecole di piruvato, derivato dalla
glicolisi.

Nei batteri che fanno fermentazione


acido-mista l’enzima formiato idrogenoliasi
scinde il formiato in CO2 e H2. Questo
avviene anche nei batteri che fanno
fermentazione 2,3 butandiolica, ma in minor
parte. In questi, la CO2 prodotta proviene
prevalentemente dalla decarbossilazione
dell’acetolattato, che portano alla formazione
di 2,3 butandiolo.
E’ possibile distinguere i due tipi di batteri in base alla provenienza diversa delle due
CO2. Questo viene tenuto sotto controllo
tramite la misura del pH e la formazione
di gas. Se il pH è acido ma non si verifica
gas, si tratta di decarbossilazione di
acetolattato, quindi è 2,3 butandiolica.
Se il pH è acido e si verifica gas, si tratta
di un’acido-mista.

Le enterobatteriacee sono divise in 42


generi. Si sviluppano kit basati su saggi
di fermentazione, test sulla capacità di usare substrati organici come
fonte di carbonio, valutazione di specifiche attività
enzimatiche.

Alla famiglia delle enterobatteriacee appartengono:

Escherichia bastoncelli gram -, ci sono 5 specie, hanno flagelli peritrichi,


chemioeterotrofi aerobi o anaerobi facoltativi. In assenza di ossigeno e presenza di
nitrato avviene la respirazione anaerobia, riducendo il nitrito in nitrato. In assenza di
accettori di elettroni esterni avviene la fermentazione acido-mista.

Escherichia Coli è ospite naturale


dell’intestino umano e animale a
sangue caldo, contribuisce alla
produzione di vitamine. Sono
raggruppati in 8 categorie in base a
tratti fenotipici, tipo di malattia e
specifici fattori di virulenza.

Shigella sono batteri immobili, chemioeterotrofi aerobi o anaerobi facoltativi, sempre


patogeni per l’uomo e i primati, Causano la shigellosi, una forma di dissenteria. E’
trasmessa attraverso il cibo contaminato o per disseminazione oro-fecale.

Salmonella: sono bastoncelli mobili con flagelli peritrichi, anaerobi facoltativi capaci
di fermentazione acido-mista e, in presenza di nitriti, di respirazione anaerobia. Sono
patogene per l’uomo, causano gastroenteriti, febbre tifoide, setticemie. Vengono
caratterizzati tramite antigeni di superfici: antigene O (della parete), antigene H
(flagellare), antigene Vi (capsulare). Ci sono due specie, Enterica e Bongori.

Proteus: batteri mobili con flagelli peritrichi, crescono ad aloni concentrici su piastra
di terreno solido. Si conoscono 4 specie, Vulgaris, Mirabilis, Myxofaciens e Penneri.
In amiente liquido forma un corto bastoncino con un nucleoide, e flagelli peritriche
(cellule swimmer). In ambiente solido si formano cellule più lunghe, con più nucleoidi e
flagelli più numerosi (cellule swarmer). La formazione di aloni è dovuta all’alternanza
delle due forme.

Enterobacter: ci sono 12 specie. Possono provocare batteremie, infezioni di ferite e


urinarie.
Klebsiella può trovarsi in superfici o mucose animali. La specie Pneumoniae è presente
come commensale sulle mucose orofaringee umane, ma in soggetti deboli può
causare polmoniti.

La fermentazione propionica
E’ fatta dai proponibacterium: gram+, non sporigeni e mesofili. Vengono usati come
colture starter nella produzioni di formaggi tipo Emmental. Da 3 molecole di lattato, si
ottiene 1 CO2, 3/5 ATP, 2 proprionato, 1 acetato.

La fermentazione butirrica
Viene fatta dai clostridi (clostridium tetanii, clostridium botulinum).
I clostridi sono bastoncelli Gram+, sporigeni, anaerobi obbligati. Producono energia
per fosforilazione a livello del substrato. Si trovano sia in superfici che nel tratto
gastrointestinale, alcune specie come tetani, botulinum, perfringens e difficile sono
patogene per l’uomo. Fermentano molte sostanze organiche, con produzione di alcoli,
acido butirrico e succinico, CO2, H2SO4 (putrefazione). Hanno la capacità di degradare
la cellulosa, mediante un complesso enzimatico extracellulare, il cellulosoma.
Clostridium acetobutylicum produce acetone, butanolo ed etanolo da amido di patata
e mais.
Clostridium tetani è responsabile del tetano; la tossina tetanica penetra tramite i
neuroni periferici, e risale al SNC, dove interagisce con gangliosidi sulla superficie
cellulare dei neuroni del midollo spinale. Questo blocca il rilascio di neurotrasmettitori
a livello presinaprico, inducendo contrazioni spastiche permanenti.
Nel SNC accede agli interneuroni inibitori, e viene rilasciata nel loro endosoma nel
citosol. Interrompono il circuito dello stimolo, mediante il rilascio di neurotrasmettitori
inibitori, glicina o acido aminobutirrico GAPA. Questi inibiscono il rilascio di acetilcolina
da parte dei motoneuroni e bloccano la contrazioni muscolare. La tossina agisce sulle
proteine SNARE, impedisce la fusione delle vescicole contenenti il GABA o la glicina
con la membrana presinaptica. Il blocco termina la continuazione dello stimolo
contrattile del muscolo con conseguente paralisi spastica.

Clostridium botulinum causa il botulino. La tossina botulinica viene internalizzata dalle


cellule dell’epitelio gastrico, e da qui raggiunge alla barriera epiteliale, dove può
raggiungere il circolo sanguigno. Qui raggiunge e interagisce con recettori sui neuroni
periferici, e blocca l’attività delle terminazioni nervose periferiche, causando paralisi
flaccida.
In assenza di tossina, il motoneurone presinaptico
rilascia il neurotrasmettitore (acetilcolina), mediante un
meccanismo che comporta la fusione sulla membrana
cellulare di vescicole contenenti l’acetilcolina. Questo
coinvolge le SNARE, che mediano la fusione delle vescicole con la
membrana presinaprica, e il rilascio del neurotrasmettitore, con
conseguente propagazione dello stimolo e contrazione muscolare.

Quando c’è la tossina, viene


internalizzata dai motoneuroni
terminali, dove la subunità A
viene liberata nel citosol. Qui
impedisce la maturazione di
vescicole presinaptiche,
contenenti il
neurotrasmettitore
acetilcolina, mediante la proteolisi
delle proteine del complesso
SNARE. Ha come effetto il mancato
rilascio di acetilcolina e la mancata contrazione muscolare.
Quindi, paralisi flaccida.

I clostridi sono responsabili anche di processi di putrefazione


(decomposizione aerobia delle proteine). Su substrati
proteici i clostridi attuano la fermentazione degli
amminoacidi o reazione di STICKLAND a coppie, dove
un a.a funge da donatore di elettroni, subendo
un’ossidazione, e l’altro da accettore. I prodotti sono
NH3, CO2 e un acido carbossilico con un atomo di C
in meno rispetto all’a.a che viene ossidato.
La fermentazione acetica avviene in aerobiosi, con consumo di O2.
Ci sono 2 metodi per la produzione industriale di aceto:
1) Fermentazione lenta: Grossi barili contengono truciolato di faggio, che
supportano i batteri acetici. Sotto è presente una grata; il vino viene inoculato
dall’alto, che attraversa i trucioli, dove viene acetificato. E’ una reazione
esoergonica, quindi c’è un sistema di raffreddamento.
2) Fermentazione in immersione: utilizza veri e propri fermentatori, aerati e agitati.
La t è intorno ai 30°C, e vengono controllare flusso d’aria, concentrazione di
alcol e acidità. Una volta raggiunta la concentrazione di acido acetico finale, i
batteri sono filtrati via e l’aceto viene recuperato e conservato.

BATTERI ACETICI
Gluconobacter oxidans è subossidante, perché ossida l’etanolo ad acido acetico
attraverso il piruvato dei pentoso fosfati. Manca la succinato deidrogenasi,
Acetobacter aceti è superossidante, usato industrialmente, ossida l’etanolo ad acido
acetico e poi anche a CO2 e H2O. L’ossidazione dell’etanolo avviene con 2 reazioni
ossidative, catalizzate da 2 enzimi: alcol deidrogenasi e aldeide deidrogenasi. Nel
primo passaggio, l’etanolo è ossidato in acetaldeide idrata, e poi si produce acido
acetico. I due enzimi sono correlati alla catena respiratoria, alla quale trasferiscono
elettroni.

RESPIRAZIONE
E’ un processo metabolico in cui un donatore di elettroni è ossidato, attraverso una
serie di reazione. Al termine, gli elettroni sottratti sono ceduti all’O2 o ad un’altra
molecola organica/inorganica (ossidante).
L’energia liberata è trasformata in forza proton-motrice, e usata per produrre ATP. E’
caratteristica dei chemiorganotrofi e chemiolitotrofi. Ha una resa energetica maggiore
della fermentazione.
3 tappe:
1) Ox di glucosio e formazione di 2 gruppi acetile.
2) I gruppi acetile sono degradati a CO2, con rilascio di protoni ed elettroni,
immagazzinati in NADH, NADPH, FADH2.
3) Protoni ed elettroni sono trasferiti lungo la catena di trasporto, e ceduti all’O2
accettore finale.

E’ un ciclo aperto, necessita di un continuo apporto di ossalacetato, assicurato dalle


reazioni anaplerotiche. Una di queste è la carbossilazione del piruvato, catalizzata
dalla piruvato carbossilasi(piruvato+CO2=ossalacetato). In altri casi, l’ossalacetato è
prodotto attraverso l’ossidazione di succinato e malato, attraverso il ciclo dell’acido
gliossilico.

Alcuni batteri fanno la respirazione anaerobia. Possibili accettori di elettroni sono i


nitrati, i solfati, lo zolfo elementare, gli ossidi ferrici, lo ione manganato, molecole
organiche (fumarato). L’ATP prodotto dipende dalla differenza di potenziale ossido-
riduttivo tra il donatore e l’accettore finale di elettroni.

Respirazioni anaerobie
DENITRIFICAZIONE anaerobia del nitrato
L’accettore finale è il nitrato, solo alcuni batteri sono in grado di farlo.
Da nitrato a nitrito: Straphylococcus, Vibrio, Escherichia, Bacillus, Enterobacter
Da nitrato ad azoto molecolare: Pseudomonas, Paracoccus Denitrificans
Il nitrato è convertito in vari prodotti, via via più ridotti.

Pseudomonas è in grado di ridurre nitrato in azoto molecolare. La NADH deidrogenasi


cede 1 H alla flavoproteina. Vengono espulsi 2 protoni all’esterno, e 2 elettroni
vengono trasferiti ad una FE-S proteina e ad un chinone. Il chinone necessita di H,
recupera due protoni dal citoplasma che poi espellerà all’esterno, mentre i due
elettroni sono trasferiti al citocromo B, che li trasferisce al nitrato, che tramite nitrato
riduttasi lo riduce in nitrito. Questo, con la nitrito riduttasi viene ridotto ad ossido
nitrico. Poi, attraverso la ossido nitrico riduttasi, viene ridotto ad ossido nitroso.
Questo, tramite l’ossido nitroso riduttasi viene ridotto ad azoto molecolare. NO3- /
NO2- / NO / N2
SOLFATO come accettore finale di elettroni
Batteri solfato riduttori: suoli, sedimenti anossici marini, intestino umano e animale.
Rilevati anche in depositi di olio combustibile, dove producendo acido sulfidrico creano
le condizioni per la biocorrosione e l’inacidimento di olio e gas.
Ad es il Desulfovibrio  usa come fonte di energia gli acidi organici, alcoli, H.
Sottraggono gli elettroni tramite idrogenasi. Gli elettroni percorrono una catena di
trasporto che lega le idrogenasi a specifiche reduttasi terminali, responsabili della
riduzione del solfato ad acido sulfidrico.

Ione ferrico come accettore finale di elettroni in anaerobiosi.


Donatori di elettroni: composti organici, H2, ammonio, ossidi ferrici

La

METANOGENESI
Avviene in assenza di O2, e
l’accettore finale di elettroni è la
CO2.
In quali habitat vivono? Sedimenti
anossici, paludi, acquitrini, risaie,
discariche umide, intestino crasso
dell’uomo. In ambienti anossici ricchi di H2, CO2, acetato e altri substrati carboniosi gli
archea metanogeni producono metano. Vengono coinvolti coenzimi insoliti.

H e CO2 sono il substrato di batteri acetogeni che producono acetato. Questo viene
sfruttato dai metanogeno come donatore di elettroni, per ridurre l’anidride carbonica a
metano.
Il destino di acidi a corta catena e alcoli è diventare il substrato di batteri sintrofici, che
li fermentano, con produzione di acetato, idrogeno e CO2.

Da imparare.

I batteri eterotrofi, oltre al carbonio,


possono sfruttare altre sostanze.
L’importante è che il substrato
venga trasformato in uno degli
intermedi del metabolismo centrale (glicolisi, ciclo acidi carbossilici,
pentosi).

I microrganismi
possono
metabolizzare carboidrati
diversi dal glucosio. In base a
questo varierà il pacchetto di
enzimi sfruttati.

L’utilizzo del lattosio

Il glucosio-1-fosfato entrerà
poi nel metabolismo
centrale.
L’utilizzo del maltosio

METILOTROFIA  si ottiene energia da


composti a singolo atomo di carbonio, in
presenza di ossigeno.
I metofili sono microrganismi che ossidano metano
e altri composti C1.
Possono essere:
1) METANOTROFI quando ossidano direttamente il metano. Sono aerobi.
Usano O2 sia come reagente per le reazioni di ox del metano, che come
accettore finale di elettroni.
Metano  metanolo  formaldeide  ac. Formico  anidride carbonica
L’enzima chiave è la metano monossigenasi, che catalizza l’introduzione di un
atomo di ossigeno nel metano, riducendo l’altro atomo di ox ad acqua, con gli
elettroni derivanti da un donatore (citoctomo c o NADH).
2) METILOTROFI quando non possono ossidare direttamente il metano, e utilizzano
metanolo, formiato o CO2.

La formaldeide prodotta durante l’ox del metano e dei suoi derivati può essere

ossidata ad acido formico e poi a CO2, assimilata direttamente come fonte di carbonio.

La via della serina è meno efficiente.