La replicazione del DNA

○ Arthur Kornberg dimostrò con un esperimento che fosse possibile sintetizzare un

nuovo DNA da delle basi azotate, la DNA polimerasi e un filamento di DNA stampo.

Ciò non permetteva però di comprendere il modello con cui avvenisse la

replicazione.

○ Si ipotizzarono tre modelli di replicazione del DNA:

- Modello conservativo, in cui la molecola originaria viene mantenuta e si

assiste alla sintesi di una nuova molecola.
- Modello semi conservativo, in cui ciascuna molecola di DNA duplicata
contiene un filamento vecchio e uno nuovo.
- Modello dispersivo, in cui ciascuna molecola di DNA duplicata contiene
frammenti di DNA vecchio e DNA neo sintetizzato.

○ Nel 1957 i genetisti Matthew Meselson e Franklin Stahl confermarono che la

replicazione del DNA avvenisse in modo semi conservativo.

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Fecero crescere colonie di E.coli su un substrato del isotopo dell’azoto 𝑁, più
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pesante dell’isotopo 𝑁, rendendo il DNA dei batteri più “pesante”.
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Successivamente spostarono le colonie su un substrato di 𝑁, e dopo la prima
replicazione notarono che il DNA possedeva un peso intermedio, evidenza che i
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filamenti di DNA contenessero sia 𝑁 che 𝑁, e che quindi il modello conservativo
non fosse possibile. Alla seconda replicazione invece il DNA dei batteri era per metà
“pesante” e per metà “leggero”, dimostrando che si erano formati delle molecole di
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DNA contenente solo 𝑁. Di conseguenza l’unico modello che potesse spiegare
questo fenomeno era il modello semi conservativo.

○ La replicazione del DNA avviene in due fasi:

- Rottura dei legami a idrogeno e separazione dei due filamenti del DNA
stampo.
- Sintetizzazione dei nuovi filamenti con l’appaiamento per complementarietà
dei nucleotidi grazie alla DNA polimerasi.

○ I nucleotidi trifosfati si aggiungono al filamento in accrescimento attraverso un

legame fosfodiestere con il gruppo ossidrile -OH al 3’ del nucleotide del filamento in
crescita

I nucleotidi presentano 3 gruppi fosfato, i cui legami rompendosi forniscono l’energia

necessaria alla reazione.

○ Il complesso di replicazione è un insieme di proteine ed enzimi che catalizzano le

reazioni necessarie alla replicazione del DNA
○ All’inizio della replicazione il DNA viene denaturato e le proteine topoisomerasi ne
modificano la struttura.

○ L’enzima DNA elicasi rompe i legami a idrogeno delle basi azotate e separa i due
filamenti.

○ Le proteine SSB si legano ai due filamenti per impedire che essi si riassocino in una
doppia elica.

○ Il complesso di replicazione si lega al DNA in corrispondenza di una determinata

sequenza di basi, chiamata ori.

Il cromosoma dei batteri presenta un’unica sequenza ori mentre i cromosomi degli
eucarioti nei possiedono di molteplici.

○ Rispetto a ogni sequenza ori, il DNA si replica in entrambe le direzione formando due
forcelle di replicazione, ovvero siti in cui il DNA si svolge ed espone le basi azotate.

Entrambi i filamenti del DNA agiscono contemporaneamente da stampo.

Durante la replicazione, il complesso di replicazione è ancorato a strutture nucleari,

mentre il DNA si sposta.

○ Su ciascuno dei due filamenti l’enzima primasi sintetizza un breve filamento di RNA,
detto primer, complementare al filamento stampo, il quale permette alla DNA
polimerasi d'iniziare la replicazione.

○ Le DNA polimerasi lavorano solo in direzione 5’ a 3’. Di conseguenza, essendo i due

filamenti stampo antiparalleli, l’allungamento procede in modi diversi:

- La duplicazione sul filamento con l’estremità 3’ libera in corrispondenza della

forcella, detto filamento veloce, è continua.

- La duplicazione sul filamento con l’estremità 5’ libera in corrispondenza della

forcella, detto filamento lento, è discontinua e procede a ritroso.

Ciò accade perché a mano a mano che la forcella si apre la sua estremità 3’
libera si allontana sempre di più, formando uno spazio vuoto non replicato.

Sul filamento lento la DNA polimerasi si muove a ritroso formando brevi

segmenti discontinui detti frammenti di Okazaki.

I frammenti di Okazaki sono sintetizzati allo stesso modo del filamento veloce
ma ogni frammento, essendo discontinuo rispetto il segmento precedente,
necessita di un proprio primer.
 ○ La DNA polimerasi sostituisce l’RNA con il DNA e la DNA ligasi unisce i vari
frammenti producendo un filamento lento continuo.

○ Al termine della replicazione il DNA negli eucarioti viene riavvolto dalle proteine istoni
a riformare il nucleosoma.

○ Nel DNA lineare degli eucarioti dopo la rimozione del primer terminale non è più
possibile sintetizzare il DNA che lo sostituisca perché non è presente un’estremità 3’
da prolungare. Pertanto i due nuovi cromosomi presentano entrambi ad ambo le
estremità un segmento di DNA a filamento singolo.

Queste estremità sono costituite da sequenze ripetitive chiamate telomeri.

Nella maggior parte delle cellule l’estremità dei telomeri a filamento singolo viene
rimossa accorciando il cromosoma.

Nelle cellule staminali e nelle cellule tumorali le telomerasi usano un filamento di

RNA stampo per estendere il telomero ed evitare l’accorciamento del cromosoma.

○ Il DNA durante la duplicazione è soggetto ad alterazioni che possono essere riparate

grazie a tre meccanismi di riparazione:

- Correzione di bozze: correzione degli errori a mano a mano che la DNA

polimerasi li compie.
- Riparazione delle anomalie di appaiamento: esaminazione del DNA subito
dopo che si è duplicato e correzione degli appaiamenti sbagliati.
- Riparazione per escissione: rimozione delle basi anomale e sostituzione di
esse.

Dal DNA alle proteine

○ Gli studi di Beadle e Tatum sulle mutazioni della muffa del pane Neurospora crassa
dimostrarono la relazione fra geni ed enzimi, per la quale ogni gene specifica un
particolare enzima.

Ulteriori studi dimostrarono la correlazione tra geni e polipeptidi in generale: il gene è

un tratto del DNA che fornisce le informazioni con cui la cellula può sintetizzare una
catena polipeptidica e formare le proteine.

○ Francis Crick nel 1958 formulò il dogma centrale della biologia molecolare per cui
l’informazione genetica passa dal DNA, all’RNA e alle proteine tramite l’mRNA e
tRNA.

I retrovirus sono in grado di effettuare la sintesi del DNA a partire dall’RNA.

 ○ L’RNA è un polinucleotide simile al DNA, ma differisce da esso per tre caratteristiche:
- È a unico filamento;
- Contiene lo zucchero ribosio;
- Ha l’uracile al posto della timina.

○ Da un filamento di DNA si forma per complementarietà una molecola di RNA,

chiamata mRNA, la quale spostandosi nel citoplasma nei ribosomi funge da stampo
per la sintesi delle proteine.

Il processo di formazione dell’mRNA è chiamato trascrizione.

○ Il tRNA si lega al mRNA nei ribosomi e traduce l’informazione genetica dell’DNA

sintetizzando la catena polipeptidica attraverso il processo di traduzione.

○ Esistono tre tipi di RNA:

- mRNA o RNA messaggero, che porta una copia delle informazioni di un tratto
di DNA ai ribosomi;
- tRNA o RNA transfer, che porta gli amminoacidi ai ribosomi e li colloca nella
corretta posizione grazie alla sua struttura 3D;
- rRNA o RNA ribosomiale, che entra a far parte dei ribosomi e permette la
sintesi proteica.

La trascrizione

○ La trascrizione è suddivisa in tre stadi: inizio, allungamento e terminazione.

○ Durante la trascrizione solo uno dei due filamenti di un gene funge da stampo.

○ Ogni gene presenta un promotore formato da una sequenza di riconoscimento e dal

TATA box, al quale si lega l’RNA polimerasi per iniziare la trascrizione.

I promotori specificano da dove far partire la trascrizione, quale dei due filamenti di
DNA trascrivere e in quale direzione procedere.

○ L’RNA polimerasi negli eucarioti, a differenza degli procarioti, necessita che varie
proteine, chiamate fattori di trascrizione, si leghino al TATA box per iniziare la
trascrizione.

L’insieme di queste proteine è chiamato complesso di trascrizione.

○ Dopo che l’RNA polimerasi si è legata al DNA, inizia l’allungamento dell’RNA, il quale
procede in direzione 5’ a 3’ formando un filamento antiparallelo e complementare al
DNA.

L’RNA polimerasi non ha bisogno di un primer.

 ○ Dopo aver raggiunto il sito di terminazione, l’RNA polimerasi si stacca dal DNA
terminando il processo di trascrizione.

○ L’RNA appena formato, chiamato trascitto primario, necessita di un processo di

maturazione per essere tradotto.

○ I codoni sono sequenze specifiche di tre nucleotidi lungo l'mRNA che codificano
ognuno un particolare amminoacido durante la sintesi proteica.

L’insieme dei codoni costituisce il codice genetico.

Il codone AUG, oltre a codificare la metionina, è anche il codone d'inizio, mentre i

codoni UAA, UAG e UGA sono i codoni di stop: quando si raggiunge uno di questi
codoni, la traduzione si interrompe e il polipeptide si stacca.

Il codice genetico ha due caratteristiche:

- È degenerato, ovvero ridondante, data la presenza di 64 codoni per solo 20

amminoacidi.
- È universale per la maggior parte degli esseri viventi.

La traduzione

○ Il tRNA è una molecola di RNA che mette in relazione l’informazione contenuta nei
codoni dell’mRNA con gli amminoacidi delle proteine.

- Si “carica” di un amminoacido;
- Si associa alle molecole di mRNA;
- Interagisce con i ribosomi.

A ogni amminoacido corrisponde almeno un tipo specifico di tRNA.

All’estremità 3’ di ogni tRNA è presente il sito di attacco dell’amminoacido, costituito
dalla tripletta CCA, al quale si lega l’amminoacido specifico in modo covalente.

Verso la metà della sequenza del tRNA è presente un’altra tripletta di basi, chiamata
anticodone, che costituisce il sito di appaiamento con il codone del mRNA.

○ Gli enzimi amminocil-tRNA-sintetasi caricano ciascun tRNA con l’amminoacido

corrispondente.

A ogni amminocil-tRNA-sintetasi corrisponde una determinata proteina e una

determinata molecola di tRNA.

○ L’energia contenuta nel legame covalente tra un amminoacido e il tRNA è la stessa

che è necessaria per formare la catena polipeptidica.
○ I ribosomi sono strutture costituite da rRNA e proteine che mettono in comunicazione
l’mRNA e il tRNA.

I ribosomi non sono specifici per la sintesi di un solo polipeptide.

Ogni ribosoma è costituito da due unità, una maggiore e una minore, le quali si
uniscono solo durante la traduzione.

Sull’unità maggiore sono presenti tre siti di legame per i tRNA:

- Nel sito A (amminoacidico) l’anticodone del tRNA carico si lega all’mRNA;

- Nel sito P (peptidico) il tRNA cede il proprio amminoacido alla catena
polipeptidica in crescita;
- Nel sito E (exit) il tRNA scarico fuoriesce dal ribosoma e ritorna nel
citoplasma.

○ La traduzione è composta da tre fasi: l’inizio, l’allungamento e la terminazione.

○ All’inizio della traduzione l’mRNA, il tRNA carico con la metionina e la subunità

minore di un ribosoma si legano per costituire il complesso d'inizio, grazie alle
proteine fattori d'inizio.

In seguito al complesso si lega anche la subunità maggiore.

○ Durante l’allungamento i tRNA carichi percorrono i tre siti:

- Il tRNA carico entra nel sito A e lega il proprio anticodone al codone

dell’mRNA;
- Il tRNA entra nel sito P dove cede il proprio amminoacido, il quale forma con
la catena polipeptidica un legame peptidico;
- Il tRNA del sito P si sposta nel sito E per poi staccarsi e ritornare nel
citoplasma. Il ribosoma avanza quindi di un codone, cosicché la catena
polipeptidica si possa trovare nel sito P.

○ L’allungamento è aiutato dalle proteine fattori di allungamento.

○ La terminazione avviene quando uno dei tre codoni di stop entra nel sito A: a esso si
lega un fattore di rilascio che fa avvenire l’idrolisi tra la catena polipeptidica e il tRNA
nel sito P. Il ciclo si blocca e il polipeptide si stacca dal ribosoma.

○ Le catene polipeptidiche possono dirigersi verso un organulo o il reticolo

endoplasmatico e a volte sono indirizzate da una sequenza segnale.

○ La maggioranza dei polipeptidi devono essere modificati dopo la traduzione per poter
diventare proteine funzionali.