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Università della Calabria

Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra
Corso di Laurea Triennale in Biologia

TESI DI LAUREA

Valutazione dell’antibiotico resistenza in ceppi

di Pseudomonas aeruginosa isolati da matrice
ambientale

Relatore Candidata
Prof.ssa Maria Adele Losso Giulia Assunta Zaffino
Matricola 172393

Anno Accademico 2016-2017

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“Un vincitore è semplicemente un

sognatore che non si è mai arreso”
Nelson Mandela
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INDICE
INTRODUZIONE-------------------------------------------------------------------- 5
Tassonomia --------------------------------------------------------------------------------- 8
CARATTERIZZAZIONE DI PSEUDOMONAS ---------------------------- 10

BIOFILM ---------------------------------------------------------------------------- 12

SISTEMA DI SECREZIONE --------------------------------------------------- 16

Resistenza Antibiotico -------------------------------------------------------------------- 17
Associazione tra Ps. aeruginosa, sistema di secrezione III e antibiotico
resistente------------------------------------------------------------------------------------ 19
La citotossicità di ExoU e i suoi vari effetti ------------------------------------------ 23
Meccanismo di attivazione di ExoU --------------------------------------------------- 24
Epidemiologia clinica di genotipi associati alla secrezione di Pseudomonas
aeruginosa tipo III ------------------------------------------------------------------------ 25
Epidemiologia clinica associata con ExoU e resistenza agli antibiotici --------- 26
CONCLUSIONI -------------------------------------------------------------------- 29

BIBLIOGRAFIA ---------------------------------------------------------------------- i

RINGRAZIAMENTI
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INTRODUZIONE

Il genere Pseudomonas, dal greco pseudo- (ψευδο: falso) e -monas (µονος: singola unità)
comprende un gran numero di batteri di forma bastoncellare (Fig. 1), dritti o lievemente
ricurvi, Gram negativi, di dimensioni comprese tra 0,5-1,0 µm x 1,5-5 µm, dotati di uno o
più flagelli polari che ne consentono la mobilità, privi di rivestimenti esterni e di capsula.
Batteri chemioeterotrofi e alcuni sono in grado di utilizzare anche gli idrocarburi policiclici
aromatici come fonte di carbonio, con metabolismo aerobio, in genere ossidasi positivi e
asporigeni. Crescono rapidamente su appositi terreni di coltura, dove sviluppano colonie
tonde, lisce e con caratteristico odore d’uva. La loro temperatura di crescita varia da 25°C
a 35°C, in quanto si tratta di microrganismi mesofili e psicrotolleranti che sono anche in
grado di replicarsi alle temperature di refrigerazione e di sopravvivere al di sotto degli 0°C.
Non tollerano le alte temperature, anche se alcuni ceppi come Pseudomonas aeruginosa
sono in grado di crescere anche a 42°C, ma non sopravvivono a trattamenti di
pastorizzazione effettuati oltre i 65-70°C per tempi superiori a 15-30 secondi. Sono
microrganismi normodurici, infatti non tollerano pH eccessivamente acidi: non si replicano
a pH inferiori a 5,0 e rallentano moltissimo la loro duplicazione già al di sotto di pH 5,8. I
batteri del genere Pseudomonas sono ubiquitari, infatti, si possono riscontrare in svariati
ambienti quali acqua, suolo, vegetazione, materiale organico in decomposizione e hanno la
capacità di adattarsi anche in ambienti ostili, essendo microrganismi con scarse esigenze
nutrizionali.

Figura 1 - P. aeruginosa al microscopio elettronico

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Questa grande adattabilità è dovuta alla capacità di produrre composti extracellulari, come
per esempio pigmenti diffusibili, che possono portare a molteplici vantaggi. La piocianina,
di colore blu-verde, ha azione antibiotica nei confronti di altri batteri come Staphylococcus
aureus o Escherichia coli, mentre la pioverdina, di colore verde, agisce come sideroforo.
Altri pigmenti comunemente prodotti sono la fluoresceina (colore giallo), la piorubina
(colore rosso-marrone) e la piomelanina (colore nero) (Fig. 2).

Ceppo produttore Ceppo produttore

di piocianina di piorubina

Ceppo produttore
di fluoresceina

Figura 2 - Pigmenti prodotti da ceppi di Pseudomonas aeruginosa

Tra le specie del genere Pseudomonas in grado di produrre tali pigmenti ricordiamo
Pseudomonas fluorescens, P. aeruginosa, P. aureofaciens, P. putida e P. chlororaphis.
Inoltre, la grande capacità di adattamento ai diversi ambienti è data dal fatto che questi
microrganismi sono in grado di formare biofilm, ovvero un’aggregazione di batteri
contraddistinta dalla secrezione di una matrice extracellulare adesiva in cui le cellule
risultano strettamente attaccate l’una all’altra. In questo modo la “comunità” batterica
risulta essere molto resistente, anche nei confronti di antibiotici e all’azione dei fagociti. In
alternativa a fenomeni sessili come il biofilm, Pseudomonas è in grado di muoversi grazie
alla rapida rotazione dei flagelli per mezzo di molteplici meccanismi di movimento come
lo Swarming, in cui le cellule vegetative si differenziano in cellule swarm, lunghe e
iperflagellate, e la rotazione dei flagelli avviene contemporaneamente da parte di molti
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microrganismi. Grazie a questa motilità, indotta dal contatto con superfici aventi
un’appropriata viscosità e composizione, i batteri sono in grado di muoversi su superfici
solide. Altri ceppi si muovono mediante Swimming, dove il meccanismo di movimento è
analogo al precedente, ma è effettuato da ogni singola cellula in modo autonomo. Altri
ancora usano il meccanismo Twiching che prevede la presenza di un pilo di tipo IV che si
protrae nella direzione di movimento e si àncora alla superficie, rendendo possibile la
traslocazione della cellula microbica. Vi sono inoltre meccanismi di movimento che
interessano Pseudomonas che non prevedono l’utilizzo di pili o flagelli, come il Gliding
oppure lo Sliding, che si basa sulla secrezione di agenti surfactanti che riducono l’attrito tra
le cellule e la superficie. Attualmente il genere Pseudomonas riceve grande interesse in
ambito alimentare, perché questi microrganismi sono in grado di alterare fortemente le
caratteristiche organolettiche del prodotto; inoltre vi sono alcune specie patogene per
l’uomo, come P. aeruginosa che può causare infezioni cutanee, infezioni delle vie urinarie
o anche infezioni polmonari, grazie a numerosi fattori di virulenza. È potenzialmente in
grado di infettare qualsiasi distretto corporeo; tuttavia va ricordato che non è in grado di
portare patologie importanti in soggetti immunocompetenti.

P. aeruginosa si trova in ambienti estremamente umidi e talvolta nella microflora normale

dell’intestino e della cute. In ospedale possono risultare importanti fonti di infezione
l’acqua stagnante dei lavandini, le apparecchiature per anestesia o rianimazione e gli
umidificatori. La capacità di utilizzare molecole organiche semplici, come sorgente di
carbonio e di energia, favorisce la moltiplicazione di questi microrganismi in soluzioni che
altrimenti sarebbero incapaci di sostenere una maggiore crescita batterica, come sono per
esempio i blandi antisettici, le soluzioni saline e i saponi. Oltre a ciò, i pazienti possono
incorrere in infezioni sistemiche causate dalla propria flora microbica normale. Per la sua
presenza ubiquitaria, P. aeruginosa può essere isolato in campioni clinici come
contaminante senza che tuttavia vi sia alcuna connessione con malattie. Lo stato di salute
del paziente è importante nel valutare il significato clinico di un isolamento, poiché questo
microorganismo raramente infetta individui sani, non ospedalizzati. P. aeruginosa è,
tuttavia, responsabile di alcune fra le infezioni più gravi e letali che possono colpire gli
individui immunocompromessi. Presenta una resistenza eccezionalmente elevata a molti
antibiotici; in quanto l’introduzione di antibiotici ad ampio spettro, in grado di sopprimere
la concorrenza della restante popolazione microbica, ha fatto si che questo microrganismo
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assurgesse a un ruolo di tale rilievo da risultare uno dei principali agenti delle infezioni
ospedaliere. [1]

Tassonomia

I batteri appartenenti al genere Pseudomonas fanno parte della famiglia delle

Pseudomonaceae, ordine Pseudomonadales e classe γ-Proteobacteria. La complessità e la
grande rilevanza che questo genere ha assunto hanno portato a un continuo riesame dal
punto di vista tassonomico. Inizialmente i batteri venivano classificati secondo uno schema
di catalogazione naturale, proposto da Ferdinand Cohn nel 1872, che si basava
sull’osservazione dei caratteri morfologici delle cellule. Sostanzialmente Cohn aveva
suddiviso i batteri in gruppi che possedevano gli stessi caratteri fenotipici, quali forma e
dimensione della cellula, presenza/assenza di pili o flagelli e loro posizionamento, colore e
morfologia della colonia. Tuttavia questo sistema di classificazione non teneva conto delle
relazioni evolutive dei vari organismi. In seguito, nel 1909, Orla-Jensen propose un
modello che teneva in considerazione le proprietà fisiologiche dei batteri, come le esigenze
nutrizionali, la composizione della parete cellulare, i prodotti di fermentazione, i tipi di
substrato di carbonio e azoto utilizzati, la resistenza osmotica, la crescita in presenza o
meno di ossigeno e così via, senza tenere conto però della patogenicità nei confronti di
uomo, animali e piante. Nel 1923 nella prima edizione del Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology, erano considerate non solo le proprietà morfologiche e
fisiologiche, ma anche la patogenicità dei diversi batteri. All’interno di questo manuale
compariva per la prima volta il nome Pseudomonas, assegnato dal botanico tedesco Walter
Emil Friedrich August Migula nel 1984, quando descrisse il batterio come “cellule dotate
di motilità grazie alla presenza di un flagello a un polo della cellula, solo in taluni casi in
grado di formare spore”. Ovviamente questa era una descrizione troppo breve e inaccurata,
visto che il fatto di essere sporigeno non rispecchia le reali caratteristiche del genere. La
scelta del nome sembra essere ricaduta su Pseudomonas per il semplice fatto che i batteri
in questione assomigliavano ai Monas, microrganismi flagellati dotati di motilità
intrinseca. Inoltre come tipo di specie, Migula propose Pseudomonas pyocyanea, oggi
conosciuta come Pseudomonas aeruginosa. Nel 1926 L.E. den Dooren de Jong pubblicò
una tesi in cui mise in evidenza la capacità di Pseudomonas di decomporre numerose
molecole organiche, alcune anche tossiche per altri microrganismi e organismi superiori. Il
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numero di specie assegnate a Pseudomonas toccò quota 800 verso la metà del secolo e
dalla fine degli anni ‘60 la loro determinazione seguiva i parametri descritti nel Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology da Haynes e Burkholder, dove venivano utilizzate
proprietà fenotipiche come le caratteristiche di crescita delle colonie in terreni agarizzati
e/o caratteristiche nutrizionali. Nel 1960 il microbiologo canadese Roger Yate Stanier
propose una riesamina del genere, che prevedeva saggi fenotipici per determinarne il
profilo nutrizionale. In questo modo sono state definite un certo numero di specie in
funzione della capacità di crescita sui diversi substrati testati e il lavoro è stato esteso
anche ad altri generi. Tra il 1966 e il 1973 vi è stato il completamento di questo lavoro
grazie all’ausilio di numerosi tassonomi come Redfearn, Ballard. Più recentemente la
classificazione mediante caratteri fenotipici è stata sostituita da metodiche molecolari
basate sull’analisi degli acidi nucleici, come ad esempio l’ibridazione DNA/DNA. In molti
casi, grazie a questa tecnica, è stata confermata la classificazione fenotipica, ma in altri non
vi era omologia tra coppie di ceppi molto simili per le loro caratteristiche fenotipiche.
Questa grande eterogeneità genomica all’interno di un taxa è stata in parte osservata anche
per le diverse dimensioni del genoma delle differenti specie del genere, infatti si va da 3,7
Mbp di Pseudomonas strutzeri a 7,1 Mbp di Pseudomonas aeruginosa. Per portare un
miglioramento alla classificazione, nel 1973 è stata messa a punto l’ibridazione
RNA/DNA, tecnica che ha permesso di identificare, in base alle caratteristiche dell’RNA
ribosomiale, 5 diversi gruppi di Pseudomonas: rRNA group I, II, III, IV, V. Attualmente,
la definizione del genere in uso è la seguente: “Il genere Pseudomonas è un’entità
multigenica che può essere suddivisa in cinque gruppi di specie abbastanza distanti, di cui
solo uno può propriamente essere chiamato Pseudomonas”. Per questo motivo, al gruppo I,
detto “Pseudomonas sensu stricto”, appartengono P. aeruginosa, tutte le specie
fluorescenti (P. fluorescens, P. syringae, P. putida) e alcune specie non fluorescenti (P.
alcaligenes, P. pseuodoalcaligenes, P. strutzeri, P. mendocina). Le specie presenti nel
gruppo III sono state suddivise in tre generi differenti, denominati Comamonas,
Acidovorax e Hydrogenophaga, mentre i gruppi IV e V risultano molto distanziati rispetto
agli altri tre [2].
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Figura 3 - P. aeruginosa al MO dopo colorazione di Gram

CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI PSEUDOMONAS

Per identificare e caratterizzare il genere, è richiesta una conoscenza del fenotipo e del
genotipo. Negli ultimi anni hanno preso sempre più piede le tecniche molecolari, grazie
anche all’aumento delle specificità e alla diminuzione dei costi, che hanno portato a una
caratterizzazione genomica. Va considerato inoltre, il fatto che le metodiche di
microbiologia classica non danno sempre informazioni approfondite per quanto riguarda
l’identificazione di specie, di ceppo o eventuali relazioni filogenetiche. Attualmente, per
quanto riguarda il genere Pseudomonas, non vi sono normative specifiche per
l’identificazione molecolare nei prodotti alimentari, ma numerosi enti, come gli Istituti
Zooprofilattici, utilizzano approcci molecolari per monitorare la qualità degli alimenti. Tra
gli approcci molecolari maggiormente utilizzati vi sono l’ibridazione DNA-DNA, nella
quale vengono utilizzate sonde marcate, il sequenziamento di geni specifici housekeeping
o il sequenziamento del 5S e 16S per valutare le caratteristiche dell’RNA. In alternativa
possono essere determinati il profilo proteico mediante SDS-PAGE o il profilo della
composizione lipidica mediante tecnologia MIDI (MIDI Inc., Newark, Delaware – USA),
oppure l’analisi dei siderofori, detta siderotyping, nella quale si effettua
l’isoelettrofocalizzazione dei siderofori. Per quanto riguarda le proteine, in uno studio del
2003 è stata messa a punto la MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-
Time of Flight Mass Spectrometry), tecnica che permette di identificare i ceppi mediante
l’analisi delle proteine ribosomiali. Nel 1996 l’identificazione molecolare di Pseudomonas
è stata effettuata mediante la metodica REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic-
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PCR) che prevedeva l’utilizzo di regioni palindromiche esterne ai geni come primer per la
reazione di PCR. Dalla reazione di PCR si ottenevano, dopo elettroforesi, delle bande che
permettevano di discriminare isolati anche molto simili dal punto di vista filogenetico. Più
recentemente sono stati caratterizzati ceppi di Pseudomonas isolati da alimenti mediante
RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorfism): è stato digerito il genoma dei campioni
presi in esame grazie a una coppia di enzimi di restrizione che hanno generato frammenti
di diverse dimensioni. In base ai polimorfismi presenti nei siti di taglio per gli enzimi di
restrizione, sono stati generati frammenti di diversa grandezza che a seguito di elettroforesi
hanno portato alla formazione di un vero e proprio codice a barre in grado di discriminare i
diversi ceppi. Un’altra tecnica molto interessante per l’identificazione di Pseudomonas è la
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), utilizzata da De Jonghe e colleghi nel
2011, nella quale è stato utilizzato un gel con gradiente denaturante che condiziona la
migrazione dell’acido nucleico in base alla sequenza nucleotidica. Nonostante sia una delle
metodiche largamente più utilizzate, il sequenziamento del gene 16S non porta sempre a
una discriminazione precisa dei ceppi. Per questo motivo, a oggi, è sempre più diffuso il
Multilocus Sequence Typing (MLST) che consente di tipizzare diversi ceppi microbici
attraverso l’analisi di alcuni frammenti di geni costitutivi. La caratterizzazione mediante
questa tecnica risulta oggettiva, affidabile, trasferibile a una vasta gamma di isolati e in
grado di dare informazioni per quanto riguarda la comprensione dell’epidemiologia di
focolai di contaminazione. Solitamente sono utilizzati 6-8 frammenti di geni housekeeping
con dimensioni tra 400 e 600 nucleotidi, dove il numero di frammenti da analizzare
dipende dal grado di discriminazione che si vuole ottenere. In genere si scelgono geni
molto espressi che codificano per proteine con un elevato grado di “codon-bias”, cioè la
probabilità che un dato codone venga utilizzato per codificare un amminoacido rispetto ad
altri codoni che codificano per lo stesso amminoacido. I geni devono, inoltre, essere non
trasferibili per via orizzontale, dotati di un buon potere discriminante, quindi ampiamente
distribuiti nei diversi ceppi del genere preso in esame, e le dimensioni non devono essere
limitate, in modo da contenere la maggiore quantità di informazioni possibile, ma al tempo
stesso non troppo elevate per poter ottimizzare il sequenziamento. Con l’individuazione di
variazioni genetiche nei diversi loci, è possibile definire per ogni locus un allele e la
combinazione degli alleli darà per ogni ceppo un relativo ST (Sequence Type). In questo
modo è possibile determinare le relazioni filogenetiche mediante la creazione di un albero
filogenetico basato sulle sequenze concatenate di tutti i loci genici analizzati per ogni
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ceppo (concatenamero). Ad oggi è disponibile online un database per la tipizzazione

molecolare con MLST [3].

BIOFILM

P.aeruginosa rappresenta uno dei microrganismi tipicamente riscontrabili in quelle patine

microbiche che si vengono a formare sulle superfici spesso in contatto con fluidi
denominate biofilm. Il batterio ha la capacità di aderire a queste tipologie di superfici,
grazie alla secrezione di un polimero dell’acido mannuronico e dell’acido glucuronico,
chiamato esopolisaccaride mucoide (o rivestimento di alginato o glicosalice). Nei ceppi
definiti mucoidi, la produzione dell’esopolisaccaride è ingente e sono proprio questi ceppi
che costituiscono gran parte della patina batterica. Nel biofilm si verranno quindi ad avere
colonie incapsulate in una matrice polisaccaridica, irrorate da canalicoli interstiziali. In tal
modo, si consente un continuo flusso d’acqua, onde permettere un corretto apporto trofico
per la colonia ed un allontanamento di metaboliti eventualmente tossici. Si costituisce così
una perfetta matrice extracellulare protettiva nei confronti di elevata pressione, pulitura
meccanica, disinfettanti ed antibiotici. Liquidi scarsamente dinamici, elevate
concentrazioni di carbonio organico biodisponibile, irregolarità e idrofobicità delle
superfici favoriscono la formazione di questa tipologia di biofilm. La colonizzazione dei
polmoni dei pazienti affetti da fibrosi cistica (CF) di P. aeruginosa è la principale causa di
morbilità e mortalità nelle popolazioni CF. Queste infezioni generalmente persistono
nonostante l'uso di un’aggressiva terapia antimicrobica a lungo termine e sono stati
associati con la formazione di biofilm antibiotico-resistenti, per cui comunità batteriche
formano microcolonie disperse in una matrice EPS idratata. L'importanza relativa della
matrice EPS dipende dal background genetico dei ceppi, condizioni nutrizionali e dalle fasi
di sviluppo del biofilm. È generalmente riconosciuto che l'EPS del biofilm funzioni sia
come scaffold strutturale sia come barriera protettiva per ambienti difficili. Almeno tre
polisaccaridi (Psl, Pel e alginato) sono stati identificati in P. aeruginosa svolgere ruoli
importanti nella manutenzione strutturale e nella resistenza agli antibiotici nei biofilm. La
sintesi dei Polisaccaridi del gene di P. aeruginosa PAO1 è stato identificato nel 2004 da tre
diversi gruppi. Il cluster Psl è costituito da 15 geni co-trascritti (PSLA a pslO, PA2231-
2245) che codificano proteine per sintetizzare Psl, proteina importante per iniziare e
mantenere la struttura del biofilm fornendo interazioni cellula-cellula e cellula-superficie.
È stato inoltre dimostrato che soltanto 11 dei 15 geni psl sono necessari per la sintesi di
biofilm Psl-dipendente. Una delezione da pslA a pslD in P. aeruginosa ceppo PA14
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conduce all'incapacità di produrre il polisaccaride Psl. È stato precedentemente dimostrato

che Psl è ricco di galattosio e esopolisaccaride ricchi di mannosio con relativamente minori
quantità di glucosio e xilosio. Recentemente, è stato dimostrato che Psl contiene una
ripetizione pentasaccaridica costituita da D-mannosio, D-glucosio e L-ramnosio. Inoltre, le
funzioni dei singoli geni PSL come pslA, pslB e pslD, sono state studiate a livelli genetici e
biochimici, rivelando che questi geni sono fondamentali per la formazione di biofilm e la
sintesi di Psl.

Il ruolo di Psl nella formazione di biofilm è stato esaminato a fondo grazie al suo notevole
contributo nella formazione di biofilm in P. aeruginosa. In primo luogo, la
sovrapproduzione del polisaccaride Psl porta a una maggiore superficie cellulare e
adesione intercellulare di P. aeruginosa, suggerendo la sua importanza nell’ adesione, che
è fondamentale per l'inizio e il mantenimento della struttura del biofilm. Successivamente,
utilizzando lectine fluorescente, è stata studiata direttamente la formazione
esopolisaccaride Psl a diversi stadi di sviluppo del biofilm (Fig. 4).

Figura 4 - Schema di sviluppo di biofilm in P. aeruginosa

È stato scoperto che la matrice polisaccaride di Psl sulla superficie cellulare batterica in
una forma elicoidale promuove forti interazioni cellula-cellula batterica; ciò comporta
l'assemblaggio di un biofilm e la sua matrice nella fase iniziale di sviluppo del biofilm.
Successivamente, Psl, si accumula alla periferia delle macro-colonie durante la
maturazione del biofilm. Questo modello di localizzazione fornisce la struttura di supporto
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e consente la successiva dispersione di biofilm. Inoltre, la colorazione di Psl dimostra che

questo può formare una matrice a fibra che ingrana batteri all'interno biofilm.
Recentemente, è stato trovato che la matrice a fibra è formata tramite una strategia di
migrazione T4P-dipendente, un modo simile alla formazione ragnatela.
Indipendentemente, è stato anche dimostrato che P.aeruginosa può depositare percorsi Psl
durante la migrazione su una superficie, che influenza la motilità superficiale delle cellule
successive, che porta all’apertura di biofilm.

Il polisaccaride Pel sintetizzato dai prodotti del gene cluster pel (pelA-F, PA3058-
PA3064), è una matrice extracellulare ricca di glucosio e cellulasi-sensibile. Questo gene è
conservato in altri batteri Gram-negativi. I mutageni sembrano essere carenti nella
formazione di pellicole all'interfaccia aria-liquido in colture permanenti. Pel è anche
necessario per la formazione di biofilm di superficie associata a solidi. È interessante
notare che nel ceppo P. aeruginosa PAK la mutazione pel induce gravi difetti nel processo
di adesione iniziale su superfici solide, suggerendo che Pel può compensare in assenza di
altre adesine quali di tipo IV. Tuttavia, il ruolo preciso del Pel collegato ad altri ceppi P.
aeruginosa necessita di ulteriori indagini. Inoltre, il polisaccaride Pel può servire da
impalcatura di struttura primaria per la comunità di cellule mantenendo le interazioni
cellula-cellula nel biofilm PA14 e gioca un ruolo protettivo migliorando la resistenza agli
antibiotici aminoglicosidici. Si è esaminato ulteriormente il ruolo di Pel nella formazione
di biofilm ed è stato rivelato nella P. aeruginosa PAO1 che Pel potrebbe funzionare
insieme ad altri tipi di EPS attraverso lo sviluppo di biofilm, anche se in un ruolo meno
importante rispetto al Psl.

Una domanda ancora aperta in merito a Pel è la sua composizione biochimica. Sebbene lo
studio originale identifichi Pel come materiale di matrice ricca di glucosio, la sua struttura
e le sue funzionalità non sono stati completamente compresi. Recentemente, il principale
carboidrato della matrice extracellulare di P. aeruginosa PA14 è stato caratterizzato con
glicerofosforilato β- ciclico (1,3) -glucano, sintetizzato da locus ndvB ma non dall’operone
pel. Un'analisi sistematica dei carboidrati extracellulari prodotti da P. aeruginosa PA14 ha
spiegato la struttura di un polisaccaride O- antigene LPS, suggerendo che il locus pel
potrebbe essere coinvolto nella produzione di LPS. Recentemente, studi biochimici hanno
identificato pelF come una glicosiltransferasi citosolica che utilizza UDP-glucosio come
substrato per la sintesi di pel. Inoltre, è stata esaminata l'attività deacetilasica di PelA ed è
emerso che questa funzione è importante per la sua produzione del polisaccaride Pel.
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L'alginato è un esopolisaccaride che viene spesso e principalmente prodotto da isolati

clinici di P. aeruginosa da polmoni di pazienti CF. Il tipico fenotipo mucoide è dovuto alla
sovrapproduzione di questo polisaccaride, che protegge P. aeruginosa in ambienti difficili
mediante una matrice extracellulare in biofilm. Tuttavia, non è assolutamente necessario
durante la formazione di biofilm mucoidi in vitro. L’alginato svolge ruoli importanti nella
stabilità strutturale e la protezione di biofilm: è necessario per la ritenzione idrica e
nutriente nel biofilm. È interessante notare che è stato recentemente scoperto che i ceppi
mucoidi di P. aeruginosa dipendono da Psl per formare i biofilm. L’alginato è stato
identificato avere funzioni di persistenza e evasione immunitaria. La sovrapproduzione di
alginato potrebbe fornire resistenza agli antibiotici nonché fagocitosi. L’alginato ha anche
la capacità di combattere i radicali liberi rilasciati dai neutrofili e attivare i macrofagi in
vitro. Il DNA Extracellulare (Edna) costituisce un altro componente importante della
matrice in biofilm di P. aeruginosa. Edna sembra essere generato dal DNA cromosomico
che funge da interconnessione cellula-cellula tra le componenti del biofilm. La colorazione
del biofilm Edna suggerisce che Edna si trova principalmente in alte concentrazioni delle
microcolonie a forma di fungo. Inoltre, le cellule batteriche sono sottoposte ad autolisi
nelle microcolonie di biofilm, ma non è chiaro se l’autolisi contribuisce allo sviluppo di
Edna di biofilm. Simile ad altri tipi di matrici di biofilm, l’Edna ha anche ruoli poliedrici
nella formazione di biofilm, come contributo a gradienti cationi, rilascio di DNA genomico
e resistenza agli antibiotici. L’Edna agisce anche come fonte di nutrienti per i batteri
durante il digiuno. È stato recentemente dimostrato che P. aeruginosa produce un
deossiribonucleasi extracellulare (PA3909) richiesta per l'utilizzo di Edna come fonte di
nutrienti, amplificando ulteriormente il ruolo di Edna durante la formazione del biofilm.
Inoltre, è stato dimostrato che l’Edna forma fasci con la F-actina liberata da neutrofili
necrotiche in pazienti CF e la presenza di tali fasci potrebbe stimolare lo sviluppo iniziale
di P. aeruginosa. L’Edna può, inoltre, attivare i neutrofili attraverso un meccanismo CpG-
e TLR9 indipendente e servire come un importante componente pro infiammatorio di P.
aeruginosa in biofilm. La regolazione genica è importante per la comprensione della
formazione di biofilm. Generalmente, gli organismi formano un biofilm in risposta a
diversi fattori tra spunti nutrizionali, messaggeri secondari, segnali host-derivati o, in
alcuni casi, a concentrazioni sub-inibitorie di antibiotici. Quando una cellula passa alla
modalità di crescita in biofilm, subisce un cambiamento nel comportamento fenotipico in
cui una vasta gamma di geni è regolata in maniera variabile. La formazione di biofilm è un
processo multicellulare che coinvolge segnali ambientali e una regolazione concertata
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combinando i due segnali ambientali e reti di regolazione. Il biofilm formato da

Pseudomonas è una delle cause principali della gravità e letalità delle infezioni polmonari
croniche che colpiscono i pazienti affetti da fibrosi cistica. La ragione è che i batteri che
crescono immersi nel biofilm risultano protetti dai meccanismi di difesa dell’ospite e più
resistenti, perché difficilmente raggiungibili, ad una ampia varietà di antibiotici. Gli
Pseudomonas, come altri batteri Gram-negativi, hanno sviluppato meccanismi che
permettono a tutta la comunità di coordinare l’espressione dei loro geni attraverso la
secrezione di molecole di lattoni omoserinici (AHL) e il monitoraggio della loro
concentrazione. Questo meccanismo di comunicazione cellulare è chiamato quorum
sensing ed è usato per promuovere o reprimere, in risposta alla densità cellulare, una serie
di geni “utili” al batterio solo se espressi da tutta la comunità. Pseudomonas aeruginosa
porta due sistemi di quorum sensing: i sistemi las e rhl. Il primo consiste in un
sensore/regolatore LasR e in una AHL-sintetasi LasI che sintetizza il 3-oxo-C12-AHL, il
secondo comprende un sensore/regolatore RhlR e una sintetasi RhlI che produce il C4-
AHL. Tra i due sistemi esiste una gerarchia: è il sistema las che tra i suoi obbiettivi ha
anche quello di attivare il sistema rhl. Studi sui geni regolati da questi due sistemi hanno
evidenziato che essi coordinano l’espressione del 6% dei geni totali, inclusi molti geni
codificanti per fattori di virulenza. È stato riportato che mutanti las– di P. aeruginosa
formano biofilm piatti e indifferenziati, mentre i ceppi selvatici formano biofilm con
strutture più complesse. Questa osservazione supporta l’idea che il sistema quorum sensing
giochi un ruolo molto importante negli stadi di maturazione del biofilm e delle sue
architetture e questo lo rende un obbiettivo molto attraente per lo sviluppo di nuovi agenti
antimicrobici. In ogni caso la cascata di eventi controllata dal quorum sensing è sensibile
anche ad altri fattori di regolazione che permettono un ulteriore controllo del sistema non
solo in risposta alla densità cellulare ma anche ad altri stimoli ambientali [4].
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SISTEMI DI SECREZIONE

Resistenza Antibiotico

L'antibiotico resistenza e, in particolare, l'emergenza di ceppi batterici multi-resistenti, è un

problema di altissima rilevanza clinica, che comporta una seria minaccia per la salute
pubblica.

Gli antibiotici a nostra disposizione sono sempre meno efficaci ed è essenziale sviluppare
nuove strategie per utilizzarli al meglio. Sul problema dell'antibiotico resistenza è stata
incentrata la Giornata Mondiale della Salute nel 2011 e l'importanza del tema è stata
sottolineata dallo slogan "no action today, no cure tomorrow", ovvero "se non agiamo oggi
non avremo cure domani", una frase che trasmette l'urgenza di attuare subito un migliore
utilizzo dei farmaci che abbiamo a disposizione, per preservarne l'efficacia. Attualmente,
gli investimenti delle case farmaceutiche sulla ricerca di nuovi target e nuove molecole
antibatteriche non sono sufficienti, e la Food and Drug Administration (FDA) ha lanciato
nel 2012 il Generating Antibiotics Incentives Now (GAIN) Act, che offre incentivi per le
aziende che investano nella ricerca e sviluppo di antibiotici. Molti esperti hanno
sottolineato che il GAIN Act potrà dimostrarsi efficace soltanto se incoraggerà le aziende a
investire nella realizzazione di nuove classi di antibiotici diversi dal punto di vista chimico,
piuttosto che sullo sviluppo di classi già esistenti. La comparsa e la diffusione della
resistenza agli antibiotici comporta sfide impegnative per ricercatori e medici. Oggi l'apice
della crisi è rappresentato dalla resistenza multifarmaco dei patogeni ESKAPE, acronimo
che racchiude Enterococchi, Stafilococco aureo, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter
baumanii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacteriaceae resistenti a cefalosporine,
chinoloni e carbapenemi. Nel caso di alcuni batteri Gram negativi, come A baumanii, è
possibile imbattersi in ceppi resistenti a tutti gli antibiotici attualmente disponibili.

Recentemente, ceppi multi-resistente (MDR) di Pseudomonas aeruginosa sono stati

identificati come una delle principali cause di infezioni nosocomiali. P. aeruginosa è il più
frequente agente patogeno Gram-negativo a provocare la mortalità dei pazienti con
polmonite associata a ventilazione (VAP) in unità di terapia intensiva. Una migliore
comprensione delle patogenesi di P. aeruginosa e la successiva mortalità è stata acquisita
da recenti progressi delle conoscenze in materia di meccanismi di virulenza che portano
alla lesione acuta polmonare, batteriemia e sepsi. In comune con altri batteri patogeni
Gram-negativi, P. aeruginosa possiede un meccanismo di virulenza noto come sistema di
 18

secrezione di tipo III (TTSS). Il TTSS permette l'iniezione di tossine nel citosol di cellule
eucariote bersaglio. La tossina secretoria di tipo III (TTS), ExoU, è stata caratterizzata
come un importante fattore di virulenza nel danno polmonare acuto. L'organizzazione
genomica del gene ExoU, l’attività enzimatica della proteina ExoU e il meccanismo di
morte cellulare indotta dalla traslocazione di ExoU sono stati esaminati. Tra i vari fenotipi
di P. aeruginosa isolati, il fenotipo exoU-positivo è un importante fattore di rischio per gli
esiti clinici. Una correlazione tra le caratteristiche antimicrobiche del batterio e un
genotipo ExoU-positivo è stata riportata anche in recenti studi clinici. Gli isolati di P.
aeruginosa mostrano citotossicità in cellule epiteliali in coltura e causano un alto grado di
danno polmonare acuto in modelli animali di polmonite [5]. Isolati clinici di P. aeruginosa
mostrano diverse varianti genotipiche e fenotipiche che possono influenzare la severità di
un'infezione e il suo esito clinico. P. aeruginosa produce vari esoproduttori, tra cui
esoenzimi S e le sue proteine co-regolate sono candidati per citotossicità e danno
polmonare acuto in pazienti con polmonite P. aeruginosa. Nel 1990, sulla base di
omologia genomico con i suoi omologhi in altri batteri Gram-negativi, esoenzimi S di P.
aeruginosa sono stati identificati come proteine effettrici iniettato in cellule ospiti tramite il
TTSS (Fig. 5) [6].

Figura 5 - Sistema di secrezione di tipo III

Figura 5: Sistema di secrezione di tipo III
 19

TTSSs, sono utilizzati da batteri Gram-negativi più patogeni, tra cui Yersinia, Salmonella,
Shigella, Escherichia coli e P. aeruginosa, e funzionano come siringhe molecolari,
fornendo direttamente tossine nel citosol delle cellule eucariotiche. Le tossine traslocate
modulano il signaling cellulare eucariotica, un processo che causa la malattia [7].

Associazione tra Ps. aeruginosa, sistema di secrezione III e antibiotico

resistenza.

Il ceppo di P.aeruginosa 103 è privo del gene per l’esoenzima S (esoS) che codifica la
tossina 49-kDa, ma possiede il gene per l’esoenzima T (esoT), che codifica la forma di 53-
kDa. Un mutante isogenico esoT è risultato essere citotossico in coltura nelle cellule
epiteliali e ha causato lesioni polmonari acute; pertanto, è stato concluso che ExoT e
ExoS rappresentavano un fattore di virulenza importante per lesioni polmonari. Si è
scoperto che PA103 secerne un'unica proteina sconosciuta, di 74-kDa, la cui produzione
diminuisce quando è presente una mutazione del traspone in exsA, Il gene che codifica
questa proteina è stato clonato ed è stato creato nel PA103 un mutante privo di questa
proteina. Il mutante isogenico privo di proteina 74-kDa non è riuscito a causare danno
polmonare acuto in modelli animali.

La proteina, regolata da ExsA, un attivatore trascrizionale del TTSS di P. aeruginosa, è

stata designata come EsoU. Insieme ad altre tossine TTS, come EsoS e EsoT, EsoU è
secreta attraverso il TTSS e iniettata direttamente nel citosol di cellule eucariote bersaglio.
Isolati clinici con fenotipi citotossici in vitro sono stati trovati avere esoU, mentre isolati
non citotossici erano privi di esoU. Inoltre, isolati clinici citotossici che secernono EsoU
causano gravi e acute lesioni epiteliali in modelli animali di polmonite da P. aeruginosa

Figura 6 - Lesione epiteliale alveolare causata dalla citotossina ExoU di

P. aeruginosa.
 20

(Fig. 6) [8]. È stato ipotizzato che la capacità di P. aeruginosa di causare lesioni polmonari
acute epiteliale e sepsi è fortemente legato alla secrezione di EsoU. Il ceppo P. aeruginosa
PAO1 è stato il primo ceppo il cui genoma è stato completamente sequenziato nel 2001 dal
Pseudomonas Genome Project. Un cluster gene patogeno, il regolatore esoenzima S,
codifica i geni della regolazione, secrezione e traslocazione del TTSS. Nell'esoenzima S
regolatore, cinque operoni (exsD-pscL, exsCBA, pscG-popD, popN-pcrR e pscN-pscU)
codificano TTSS e macchinari di traslocazione. L'operone exsCBA codifica la proteina di
attivazione trascrizionale ExsA, che regola l'espressione dell’esoenzima S e le proteine co-
regolate. Il ceppo PAO1 è privo di esoU, mentre circa il 20% degli isolati clinici possiede
esoU (Fig. 7) [9].

Figura 7 - Organizzazione genomica di PAPI-2 ed exoU

 21

Il gene esoU è stato inizialmente clonato dal ceppo PA103, insieme al suo gene chaperone
spcU. È stata analizzata l'organizzazione genomica di isolato clinico secreto di EsoU PA14
e sono state scoperte due isole genomiche inserzionali, denominate isole di patogenicità
PAPI-1 e PAPI-2 (isola di patogenicità Pseudomonas aeruginosa). La regione PAPI-2 da
10,7 kb, probabilmente derivata dal trasferimento genico orizzontale, si trova nella regione
del tRNA-Lys (PA0976.1) (Fig. 8); Codifica 14 ORF, tra cui esoU, spcU, quattro
trasposasi, un'integrasi, un'acetiltransferasi e sei proteine ipotetiche. Il gene esoU è di
2.074 coppie di base e codifica la proteina di 682 aminoacidi, EsoU. Quattro nucleotidi
all'estremità 3', incluso il codone di stop in esoU, sovrappongono il codone iniziale del
gene spcU, che codifica SpcU (137 aminoacidi). La regione promotrice di esoU ha un
motivo di legame (TXAAAAXA) per l'attivatore trascrizionale, ExsA.

Figura 8 - Analisi filogenetica di EsoU in P.aeruginosa

 22

Quando EsoU è stato identificato come un importante fattore di virulenza, causa lesioni
polmonari acute nel 1997, poco era stato conosciuto circa i suoi meccanismi enzimatici
responsabili della morte delle cellule. L'analisi del dominio conservato di EsoU ha rivelato
un dominio simile a patatin, contenente un motivo di legame del DNA ricco di glicina e un
motivo lipasi con serina e aspartato cataliticamente attivo all'interno della sua sequenza N-
terminale. La patatin, una proteina conservata nelle patate, espone l'attività lipasica e
condivide una struttura catalizzata di tossidi con la fosfolipasi mammiferi A2 (PLA2). I
domini catalitici di EsoU si allineano con quelli di patatin, PLA2 (iPLA2) indipendente dal
calcio e PLA2citosolico (Fig.8). I siti attivi attivati per l'attività EsoU PLA2 sono la serina
142 (S142) e l'aspartato 344 (D344). La mutagenesi nei residui catalitici (EsoUS142A o
EsoUD344A) eliminano la citotossicità di PA103. Gli inibitori di iPLA2 e cPLA2, compresi
il bromoenolo lattone (BEL), il metil arachidonil fluorofosfato (MAFP) e arachidonil
trifluorometil chetone (AACOCF3), hanno ridotto la citotossicità di PA103 in vitro. In
presenza di un estratto di cellule eucariotiche, EsoU ricombinante ha mostrato attività
PLA2 e lisofosfolipasica (lysoPLA) (Fig.9). Queste attività sono inibite da inibitori cPLA2
o iPLA2 [10]. I siti direzionali dei mutanti PA103 privi dell'attività PLA2 sono stati testati
utilizzando un modello animale in PA103, una delle mutazioni EsoUS142A o EsoUD344A
aboliva la virulenza associata a lesioni polmonari e morti acuti.

Figura 9 - Fosfolipasi A2 e lisofolipasi A di EsoU

 23

EsoU mostra l'attività dell'acilidrolasi della serina attraverso una coppia catalitica Ser / Asp
è può essere classificata come membro del gruppo IV PLA2. Una caratteristica principale
delle acilidrolasi della serina, come PLA2, PLA1 e lysoPLA, è la loro capacità di eseguire
reazioni multiple di lipasi. Recentemente, la proteina PLA2 come patatina è stata rilevata in
varie specie batteriche. La presenza di EsoU consente loro di attaccare una cellula
bersaglio per ottenere la nutrizione, aumentando così la loro popolazione. EsoU può
uccidere predatori eucariotici, come l'ameba Acanthamoeba castellanii. L'espressione
intracellulare di EsoU è citotossica nel lievito, suggerendo che i funghi potrebbero essere
uno dei potenziali bersagli. Nell'uomo, P. aeruginosa colpisce le cellule fagocitiche nei
polmoni. In un modello animale di polmonite, EsoU è prodotto durante la fase iniziale
dell'infezione, ritardando l'espressione di esoU per 3 ore aumenta il rilascio di batteri e la
sopravvivenza in topi infetti. La perdita di fagociti mediata da EsoU probabilmente
permette a P. aeruginosa di persistere entro i polmoni, causando immunosoppressione
localizzata e facilitando la superinfezione con batteri meno patogeni. Ciò spiega non solo
perché EsoU sia associato a infezioni polmonari più gravi, ma anche la tendenza della
polmonite acquisita in ospedale a essere polimicrobica.

La citotossicità di EsoU e i suoi vari effetti

I ceppi di P. aeruginosa non citotossici trasformati con pUCP19 esoUspcU, un plasmide

che trasporta esoU e spcU, risultano citotossici in cellule epiteliali coltivate in vitro e letali
in un modello di polmonite. I mutanti isogenici, generati dalla secrezione di EsoU, EsoS o
EsoT, sono stati valutati per i loro contributi relativi alla patogenesi in un modello di
polmonite acuta nei topi. In questo studio, le misurazioni della mortalità, la persistenza
batterica nei polmoni e la diffusione dei batteri hanno indicato che la secrezione di EsoU
ha il maggior impatto sulla virulenza, ma che la secrezione di EsoS ha un effetto moderato
e EsoT ha un effetto minore. La traslocazione di EsoU induce la morte cellulare
distruggendo le membrane cellulari attraverso l'attività PLA2. EsoU potrebbe anche
contribuire all'induzione di una risposta infiammatoria mediata da eicosanoidi negli
organismi ospitanti, in quanto le cellule epiteliali delle vie aeree esposte a P. aeruginosa
sovrappongono la prostaglandina E2 in maniera esente da EsoU. È stato, inoltre, riportato
un effetto deleterio sul metabolismo del fosfolipide, in concomitanza con l'attivazione di
caspasi, in un modello dipendente da EsoU. Un altro studio ha riportato che lo stress
ossidativo indotto dall'acido arachidonico potrebbe causare danni alle cellule nel corso di
 24

un'infezione da P. aeruginosa che produce EsoU, in quanto la morte delle cellule

endoteliali nelle infezioni citotossiche PA103 è significativamente attenuata dall’alfa-
tocoferolo. EsoU potrebbe, anche, contribuire alla patogenesi della lesione polmonare in
quanto induce un'attività pro coagulante dipendente dal fattore tissutale nelle cellule
epiteliali delle vie aeree, iperpermeabilità vascolare, attivazione piastrinica e formazione di
trombi durante la polmonite da P. aeruginosa e la sepsi [11].

Meccanismo di attivazione di EsoU

Le tossine TTS usano un meccanismo unico per attivare le loro attività enzimatiche.
Queste tossine sono inizialmente prodotte nel citosol batterico come forme inattive e,
immediatamente dopo essere state iniettate nel citosol di una cellula eucariotica bersaglio
dall'apparato di secrezione batterica, sono attivate da specifici cofattori di cellule
eucariotici. Ad esempio, l'attività ADP-ribosiltransferasi di EsoS viene attivata dal fattore
proteico eucariotico FAS (fattore che attiva l'esoenzima S), membro della famiglia di
proteine 14-3-3 [12]. Al contrario, l’adenilato ciclasi EsoY di P.aeruginosa richiede un
fattore delle cellule eucariotiche sconosciuto per la sua attivazione. L'attività PLA2 di EsoU
scinde i fosfolipidi della membrana plasmatica e provoca la rapida lisi di cellule
eucariotiche bersaglio. Simile a EsoS ed EsoY, EsoU richiede cofattori di cellule eucarioti
per la sua attivazione, mentre in vitro i test PLA2 con EsoU ricombinante richiedono
l'aggiunta di lisati delle cellule eucariotiche. Il dominio PLA2, simile a patatina, si trova
nella regione N-terminale di EsoU; la regione C-terminale, che include una sequenza
corrispondente a un dominio DUF885 conservato, è molto importante per il processo di
attivazione e la localizzazione della membrana della proteina. Nel 2006, Sato e colleghi
[13] hanno riportato che la 𝐶𝑢2+ , 𝑍𝑛2+ -superossido dismutasi (SOD1) era un cofattore
per l’attivazione di PLA2 di EsoU. Nello stesso tempo, tuttavia, era stato anche riportato
che EsoU localizzata nella membrana plasmatica, dove subisce modificazioni mediante
l'aggiunta di due molecole di ubiquitina alla lisina 178. Cinque residui C-terminali (679-
683) controllano la localizzazione della membrana e l’ubiquitazione. Il sito-diretto di spin-
labeling attraverso la spettroscopia a risonanza paramagnetica ha evidenziato l'aggiunta di
modifiche conformazionali indotte da SOD1 in EsoU. L'attività di PLA2 di EsoU è stata
dimostrata usando il lievito ubiquitinato SOD1 e altre proteine di mammiferi ubiquitinate.
Pertanto, sembra che SOD1 ubiquitinato funzioni come donatore di ubiquitina e che
l'ubiquitinazione di EsoU C-terminale attivi l'attività PLA2 di EsoU. La struttura
cristallografica tridimensionale di EsoU combinata con il suo cognome chaperone SpcU è
 25

stato recentemente chiarito da due gruppi di ricerca (Figura 10) [14]. In uno di questi studi,
il dominio C-terminale del legante nella membrana di EsoU ha mostrato specificità per il
fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PI4,5P2); l'ubiquitinazione di EsoU ha determinato la sua
co-localizzazione con marcatori endosomali. Il dominio che lega l’ubiquitina è stato
mappato nel C-terminale a quattro eliche in EsoU, con PI4,5P2 rafforzando sinergicamente
l’aumento dell'attività PLA2 di EsoU tramite un meccanismo connesso con l’ubiquitina. La
proteina Rickettsia prowazekii RP534, omologa di EsoU, possiede attività PLA2 e attività
di lisoPLA e attività PLA1 in assenza di qualsiasi cofattore eucariotico. Un confronto
strutturale tra EsoU e la proteina RP534 contribuirebbe a chiarire il meccanismo
ubiquitina-associato nell'attivazione di EsoU. La ricerca sui meccanismi dell'attivazione di
EsoU ha fornito nuove conoscenze su come i batteri manipolano la segnalazione nelle
cellule eucariotiche per facilitare la loro crescita e la loro patogenesi.

Figura 10 - Cristallografia di EsoU in Pseudomonas aeruginosa.

Epidemiologia clinica di genotipi associati alla secrezione di Pseudomonas

aeruginosa tipo III

Studi iniziali su TTSS in P. aeruginosa hanno rivelato un'associazione tra un fenotipo

citotossico o invasivo e il genotipo di un ceppo. PAO1 invasivo e il ceppo citotossico
PA103, che hanno rispettivamente i genotipo 𝑒𝑠𝑜𝑆 + 𝑒𝑠𝑜𝑇 + 𝑒𝑠𝑜𝑈 − 𝑒𝑠𝑜𝑆 − 𝑒
𝑒𝑠𝑜𝑆 − 𝑒𝑠𝑜𝑇 + 𝑒𝑠𝑜𝑈 + . Questa variazione genetica nei geni tossici TTS implica la presenza
di simili variazioni genotipiche e fenotipiche tra isolati clinici e ambientali. Di
conseguenza, sono stati analizzati isolati del tratto respiratorio o delle colture di sangue di
 26

108 pazienti e il rischio relativo di mortalità è risultato sei volte maggiore quando si è
verificata l'esposizione di EsoS, EsoT, EsoU o PcrV. La prevalenza del fenotipo TTS-
positivo è risultata significativamente più alta nei pazienti con infezione acuta rispetto ai
pazienti con fibrosi cistica (CF) con infezione cronica. Quando Schulert e colleghi [15]
analizzarono i profili di virulenza di 35 P. aeruginosa isolati da pazienti con polmonite
acquisita in ospedale utilizzando un saggio citotossico di morte cellulare, un test di
apoptosi e un modello di polmonite di topo, trovarono che una maggiore virulenza era
associata alla secrezione di EsoU ma non alla secrezione di EsoS o EsoY. Questi studi
suggeriscono che TTSS è presente in quasi tutti gli isolati clinici e ambientali di P.
aeruginosa. La secrezione di EsoU può essere usata come marcatore per ceppi altamente
virulenti e potrebbe avere qualche associazione con scarso risultato clinico. Sembra che gli
isolati provenienti da pazienti affetti da malattie acute siano genotipicamente diversi da
quelli di pazienti CF con infezione cronica. Altri ricercatori hanno riportato la presenza di
diversi genotipi P. aeruginosa in isolati da pazienti CF. Il genotipo di 𝑒𝑠𝑜𝑆 + 𝑒𝑠𝑜𝑈 − è
associato all'infezione cronica nei pazienti CF, mentre il genotipo 𝑒𝑠𝑜𝑆 − 𝑒𝑠𝑜𝑈 + è associato
a ceppi batterici isolati dal sangue [16].

Epidemiologia clinica associata con EsoU e resistenza agli antibiotici.

Un altro importante argomento nella biologia di P. aeruginosa recentemente emerso è

l'associazione della resistenza agli antibiotici con genotipi di virulenza TTSS. Mitov e
colleghi [17] hanno analizzato i profili antimicrobici di resistenza e genotipi di 202 isolati
da pazienti CF (n = 42) e pazienti non CF (n = 160). Gli autori hanno scoperto che le
prevalenze di esoS ed esoU erano rispettivamente 62,4 e 30,2% e che l'esoU era più diffuso
tra MDR e 40,2% rispetto al 17,7%. Garey e colleghi [18] hanno riferito che il 97,5% degli
isolati di sangue isolava geni esoS o esoU e che l'esoS era il più prevalente (70,5%; n =
86). La prevalenza di esoU era del 25,4% (n = 31), e questi isolati erano significativamente
più probabili per essere resistenti a più antibiotici, tra cui cefemi, carbapenemi,
fluorochinoloni e gentamicina. In accordo con questo, un'analisi di 45 isolati clinici ha
rilevato che gli isolati 𝑒𝑠𝑜𝑈 + erano più probabili resistenti ai fluorochinolone degli isolati
di 𝑒𝑠𝑜𝑆 + (92% rispetto al 61%, P <0,05). Questi isolati avevano una mutazione nel gene
gyrA e presentavano un fenotipo di sovraespressione della pompa di efflusso. Agnello e
Wong-Beringer [19] hanno esaminato la relazione tra il genotipo effettivo TTSS e
meccanismi di resistenza al fluorochinolone in 270 isolati respiratorie e hanno rilevato che
 27

una maggiore percentuale di ceppi 𝑒𝑠𝑜𝑈 + era resistente al fluorochinolone rispetto ai ceppi
𝑒𝑠𝑜𝑆 + (63% verso 49%) nonostante la loro prevalenza più bassa (38% 𝑒𝑠𝑜𝑈 + rispetto al
56% 𝑒𝑠𝑜𝑆 + ). Di importanza epidemiologica, Tran e colleghi [20] hanno mostrato che 20
isolati recuperati dall’importazione di gamberi crudi congelati venduti nel porto degli Stati
Uniti i geni TTS tossina e resistenti al chinolone con mutazioni in gyrA. Questi risultati
indicano la coevoluzione delle caratteristiche di resistenza e virulenza che favoriscono un
genotipo più virulento in un ambiente clinico ricco di chinolone.

Sono stati condotti diversi studi in cui sono state osservate associazioni tra la virulenza di
TTSS-associata e lo scarso risultato clinico per i pazienti con infezione da P. aeruginosa.
Un'analisi dei genotipi TTS e fenotipi di isolati colti da 35 pazienti ventilati
meccanicamente con P. aeruginosa-VAP confermato con il broncoscopio, hanno mostrato
una correlazione tra il fenotipo TTS, in particolare il fenotipo EsoU e la gravità/durezza
della polmonite. Più recentemente, El-Solh e colleghi [21] hanno effettuato un'analisi
retrospettiva di 85 casi di batteriemia da P. aeruginosa. I pazienti con isolati TTSS-positivi
hanno sviluppato uno shock settico con un'elevata probabilità di morte più frequentemente
dei pazienti con isolati TTSS-negativi. Gli autori hanno scoperto che nessuno dei pazienti
TTSS-positivi sopravvissuti ai primi 30 giorni di infezione aveva, in isolamento P.
aeruginosa con il fenotipo EsoU. Una maggiore frequenza di resistenza agli antibiotici è
stata rilevata negli isolati TTSS-positivi. Jabalameli e colleghi [22] hanno analizzato
genotipi TTSS e resistenza antimicrobica in 96 isolati raccolti da infezioni da ferite da
pazienti con ustioni. Più del 90% degli isolati erano MDR e il 64,5% di essi presentava
esoU mentre il 29% esoS. Sullivan e colleghi [23] hanno recentemente riportato la loro
analisi della resistenza antimicrobica e della virulenza TTSS in isolati da P. aeruginosa da
pazienti adulti ospedalizzati con sindromi respiratorie. Gli autori hanno studiato 218
pazienti adulti consecutivi le cui colture respiratorie erano positivi per P. aeruginosa e
riportarono che i ceppi resistenti ai fluorochinoloni e quelli MDR avevano maggiori
probabilità di causare polmonite rispetto alla bronchite o alla colonizzazione. La
combinazione di resistenza al fluorochinolone e il gene che codifica l'effettore di TTSS
EsoU in P. aeruginosa era il più precoce per lo sviluppo della polmonite. Ulteriori indagini
suggeriscono che il fenotipo resistente al fluorochinolone e il genotipo 𝑒𝑠𝑜𝑈 + di P.
aeruginosa potrebbero causare scarsi risultati clinici nei pazienti con polmonite di
P.aeruginosa. Anche se non esiste una chiara spiegazione genetica e una associazione
meno convincente tra la virulenza e la resistenza agli antibiotici associati a EsoU, non c'è
 28

dubbio che i ceppi batterici che posseggano sia caratteristiche di virulenti e MDR siano più
pericolose, soprattutto per i pazienti immunocompromessi. Pertanto, migliori metodi di
genotipizzazione o fenotipizzazione (o entrambi) per l'analisi delle tossine TTS di isolati
clinici migliorerebbero la nostra comprensione di questa zona [24].

Potenziali strategie terapeutiche contro la citotossicità derivata da EsoU

Diverse strategie sperimentali profilattiche o terapeutiche contro gli effetti citotossici della
TTS EsoU sono stati riportati nell'ultimo decennio. P. aeruginosa V-antigene PcrV, un
omologo di Yersinia V-antigene LcrV, contribuisce alla traslocazione della tossina TTS.
Nelle strategie profilattiche, l'immunizzazione attiva contro PcrV assicura la sopravvivenza
dei topi sfidati e diminuisce l'infiammazione polmonare e le lesioni. La vaccinazione con
DNA contenente pIRES-toxAm-pcrV è stata proposta come potenziale immunoterapia.
Nell'immunizzazione passiva, l'anticorpo policlonale di coniglio anti-PcrV e l'anticorpo
monoclonale murino anti-PcrV e mAb166 inibiscono la traslocazione della tossina TTS.
Per l'uso clinico, il mAb166 è stato umanizzato e il frammento di legame IgG antigene
(Fab '), KB001, è attualmente in uso negli studi clinici di fase II per il trattamento del VAP
in Francia e della polmonite cronica nei pazienti CF negli Stati Uniti. Gli esperimenti in
vitro hanno dimostrato che specifici inibitori contro iPLA2, come BEL, AACOCF3 e
MAFP, riducono la citotossicità di EsoU. Alcuni ricercatori hanno riferito che piccole
molecole, come pseudolipasi A e arilsulfonamide, inibiscono specificamente l'attività di
fosfolipasi di EsoU. Di più dettagli sui meccanismi di attivazione di EsoU sono stati
recentemente riportati; tuttavia, c'è più potenziale nell'uso di piccoli prodotti chimici per la
prevenzione di lesioni polmonari acute indotte da P. aeruginosa [25].
 29

CONCLUSIONI

Le ricerche descritte in questa tesi riguardano due importanti aspetti dell'infezione da P.

aeruginosa: la regolazione del gene batterico dopo il rilevamento dell’ospite e i
meccanismi di resistenza batterica agli antibiotici. I batteri del genere Pseudomonas, in
particolare quelli appartenenti a Pseudomonas aeruginosa, sono microrganismi dotati di
intrinseche e molteplici capacità di resistere all’azione degli antibiotici. Durante terapie che
antibiotiche, si selezionano ceppi resistenti che possono colonizzare il sito trattato, anche
grazie alla rimozione delle altre specie microbiche competitive maggiormente sensibili.
Uno dei meccanismi principali che fornisce antibiotico-resistenza a P. aeruginosa è senza
dubbio la capacità di mutare i geni che sintetizzano le porine. Queste particolari proteine
costituiscono i canali presenti nella membrana esterna, attraverso i quali gli antibiotici
penetrano nella cellula batterica. Se i canali subiscono alterazioni che riducono il flusso
afferente nel citoplasma o che comunque creano ingombro sterico, ecco che il
microrganismo acquisisce resistenza a svariate classi di antibiotici. Analoghe difficoltà
degli antibiotici di penetrare nel batterio si manifestano in ceppi costituenti biofilm o che
comunque sono incapsulati da uno spesso strato di esopolisaccaride mucoide. P.
aeruginosa è, inoltre, capace di indurre la produzione di molte β-lattamasi e quindi di
idrolizzare altrettanti antibiotici con anello β-lattamico come penicilline, cefalosporine e
carbapenemi. Altri significativi meccanismi difensivi operati dal batterio possono essere:
alterazione del bersaglio ribosomiale degli aminoglicosidi, alterazione della DNA girasi
bersaglio dei fluorochinoloni, alterazione delle proteine di legame degli antibiotici β-
lattamici, idrolisi enzimatica mediante acetilazione, adenilazione o fosforilazione di
aminoglicosidi, idrolisi enzimatica mediante acetiltransferasi del cloramfenicolo. La
resistenza agli antibiotici riguarda la sopravvivenza batterica a fronte di reagenti chimici
anziché del sistema immunitario ospitante. Ciò non significa necessariamente che tutte le
battaglie in corso tra i batteri e gli antibiotici sono nuovi esempi di selezione naturale, che
fungono da parte delle competizioni batteriche inter- o intra-specie. Tali sostanze
chimiche, possono essere impiegate dall’uomo per monitorare e controllare le malattie
infettive, in questa circostanza i meccanismi di difesa acquisiti dai batteri diventano
alquanto problematici. In sostituzione della sopravvivenza in una varietà di nicchie
ambientali, P.aeruginosa ha diminuito la permeabilità della membrana esterna rispetto a
quella di altre specie batteriche con ambienti permissivi relativamente più ristretti. La
 30

minore permeabilità della membrana significa una minore efficienza nel trasporto
attraverso la membrana batterica, che porta non solo meno importazione di antibiotici, ma
anche meno alimentazione e minore possibilità di sopravvivenza. Un altro importante
fattore che influenza l’adattabilità di P.aeruginosa è senza dubbio la capacità del
microrganismo di “percepire” lo stato e la densità della popolazione dell’intero biofilm
(processo chiamato quorum sensing). Il fenomeno avviene mediante l’espressione di due
sistemi las e rhl. Un’analoga interconnessione sembrerebbe avere luogo con la produzione
di pigmenti fluorescenti diffusibili come pioverdina. Mediante il quorum sensing,
P.aeruginosa può coordinare nell’intera popolazione la riproduzione cellulare, la
secrezione dell’esopolisaccaride mucoide e l’espressione degli altri fattori di virulenza,
portando a numerosi benefici collettivi della popolazione microbica stessa. La presenza del
batterio in acque potabili messe in vendita, in bottiglie o contenitori similari, è ritenuta
indice di errata procedura di confezionamento. Come gruppo microbico dominante della
matrice, infatti, è in grado di raggiugere un’elevata e potenzialmente pericolosa
concentrazione in un periodo di tempo relativamente breve. Tenendo presente quanto
esposto sono individuabili in ambiente nosocomiale siti critici quali lavandini, recipienti
urine, disinfettanti, tubazione per la ventilazione forzata, vari tipologie di cateteri e di
strumentazione per la dialisi oltre che per l’endoscopia, dove P.aeruginosa può facilmente
creare biofilm. Inoltre, Pseudomonas aeruginosa utilizza un sistema di secrezione di tipo
III per iniettare le tossine EsoS, EsoT, EsoU e EsoY nel citosol delle cellule eucariotiche
bersaglio. Questo sistema è regolato dall’esoenzima S e include l'attivatore trascrizionale
ExsA. Delle quattro tossine, EsoU è caratterizzato come il principale fattore di virulenza
responsabile per lesioni epiteliali alveolari nei pazienti con polmonite da P. aeruginosa. I
ceppi virulenti di P. aeruginosa possiedono il gene esoU, mentre i ceppi non virulenti
mancano di questo particolare gene. Il meccanismo di virulenza per il genotipo esoU si
basa sulla presenza di un cluster gene patogeno (PAPI-2) che codifica esoU e il suo
chaperone, spcU. La tossina EsoU ha un dominio fosfolipasi simile a patatina nel suo N-
terminale, espone l'attività di fosfolipasi A2 e richiede un fattore di cellule eucariotico per
l'attivazione. Il C-terminale di EsoU ha un meccanismo di ubiquitinazione di attivazione.
Ciò probabilmente induce un cambiamento strutturale nei siti attivi enzimatici necessari
per l'attività di fosfolipasi A2. Negli isolati clinici di P. aeruginosa, il genoma di 𝑒𝑠𝑜𝑈 + è
correlato a un fenotipo di resistenza al fluorochinolone. Inoltre, sono stati osservati scarsi
risultati clinici nei pazienti con polmonite causati da isolati resistenti all'𝑒𝑠𝑜𝑈 + -
fluorochinolone. Pertanto, esiste il potenziale per migliorare i risultati clinici nei pazienti
 31

con P. aeruginosa individuando ceppi resistenti a farmaci-antivirali e antimicrobici

mediante l'esodo-genotipizzazione o la fenotipizzazione della proteina EsoU o entrambi.
Definire morfologia e fisiologia di P. aeruginosa, oltre che caratterizzarne le nicchie
ecologiche occupate in siti naturali e in ambienti condivisi con la specie umana, è
fondamentale per poter comprendere a fondo le motivazioni che consentono l’ubiquitaria
presenza di questo microrganismo ambientale. Determinarne la virulenza, oltre che le
patologie provocate e i correlati meccanismi di patogenesi ha, invece, permesso di
percepire l’estremo rischio per la salute di alcune particolari fasce di popolazione. Infine,
valutare la risposta di P. aeruginosa nei confronti delle sostanze antibiotiche, ha consentito
di confermare l’estrema difficoltà riscontrata nel trattare patologie correlate con questa
diffusissima specie microbica.
 i

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 iii

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Immun. 2007;75:1089–1098.
 iv

RINGRAZIAMENTI
Sono passati ben 3 anni dall’inizio di questa nuova avventura universitaria e ritengo
doveroso ricordare e ringraziare le persone che mi sono state accanto e che mi hanno
permesso di crescere non solo a livello professionale ma anche a livello personale.
Desidero innanzitutto ringraziare la Professoressa Maria Adele Losso per avermi dato
l’opportunità di sviluppare questa tesi, per la fiducia fin da subito dimostrata nei miei
confronti e per avermi seguito durante lo svolgimento di questo lavoro.
Ringrazio i miei amici e colleghi dell’Università, per tutti i momenti passati insieme e per
aver reso piacevole anche le giornate più dure ed interminabili. In particolare, la mia
collega Beatrice che durante il mio percorso di studio è stata sempre vicina a me, con la
sua gentilezza e simpatia mi ha aiutato a trascorrere insieme questo percorso universitario.
Alle mie coinquiline Antonietta e Cosimina, che, in un modo o nell’altro hanno condiviso
con me questi anni di gioie e sacrifici. A te Cosimina che mi hai aiutata in molte occasioni
e che hai sopportato tutte le mie ansie pre-esami e tutte le mie paure, senza mai mancare di
essermi vicino, neanche quando diventavo insopportabile per le preoccupazioni che mi
affliggevano. Sei stata sempre disponibile con me, non mi hai lasciata mai sola,
preoccupandoti sempre, spero che continui a farlo.
Non posso non ricordare l’intera mia famiglia, mio padre e mia madre che mi hanno
permesso di continuare gli studi appoggiandomi sempre; ed incoraggiandomi che c’è
l’avrei potuta fare, nonostante gli ostacoli che ci sono stati, alla fine tutti i sacrifici sono
stati ripagati. Non mi avete fatto mancare mai nulla, in particolare grazie papà per essere
stato sempre disponibile con me. Grazie per tutte le volte che, con enorme pazienza, hai
lasciato tutto per accompagnarmi a sostenere qualche esame e con altrettanta pazienza mi
attendevi in quelle giornate interminabili, che in parte venivano rallegrate quando alla fine
l’esame era andato bene e tu eri contentissimo per me. Alla mia mammina che si
preoccupava sempre per me, preparandomi ogni domenica qualcosa da portare
all’università. Mamma e papà senza il cui costante supporto, dimostrandomi
principalmente nei momenti di difficoltà, non sarei mai riuscito a completare i miei studi
universitari, né tanto meno a raggiungere questo ulteriore traguardo.
A mio fratello Francesco, che anche se qualche volta litighiamo, nonostante la lontananza
mi è stato vicino, dicendomi sempre di studiare e di andare avanti perché se uno sa
aspettare le soddisfazioni arrivano, so che ci sei sempre e che con te posso sempre
confidarmi. Grazie perché sai essere scontroso, ma anche premuroso e anche se non me lo
dimostri sempre mi vuoi bene.
A tutti i miei parenti, i nonni per la continua vicinanza e l’affettuoso supporto morale
fornitomi durante questi anni di università e che non mi hanno fatto mancare mai il loro
incoraggiamento.
Ai miei angeli custodi, a cui ho sempre creduto e grazie ai quali ho ottenuto la forza per
andare avanti e per superare i momenti difficili che durante questo percorso si sono
presentati.
Ringrazio il mio ex fidanzato Cristian che anche se ora ha deciso di non stare al mio
fianco, ritengo doveroso farlo lo stesso, in quanto durante questi tre anni di università mi è
 v

stato vicino e mi ha aiutato molto sia moralmente che anche a livello dello studio, mi ha
fatto capire tante cose e mi ha sempre detto che c’è l’avrei fatta, ringrazio inoltre la sua
famiglia e in particolare Ivan per la loro disponibilità, per l’incoraggiamento e per l’affetto
che sempre mi hanno manifestato.
Tutte le persone citate in questa pagina hanno svolto un ruolo fondamentale nella stesura di
questa tesi, ma desidero precisare che ogni errore o imprecisione è imputabile soltanto a
me.