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Allestimento di colture batteriche

SCOPO: Imparare ad allestire e capire la funzione dei vari terreni di coltura


PARTE A: Semina su terreno liquido
NOTE TEORICHE: La semina dei terreni liquidi pu essere effettuata con la pipetta, per trasferire
volumi noti, o con lansa. I terreni liquidi vengono utilizzati per arricchire le colture oppure per
osservare certe propriet dei batteri come ad esempio la loro relazione con lambiente: se sono
aerobi il terreno sar opaco nella parte superiore della provetta, mentre se anaerobio questo
avverr sul fondo. Per capire se la semina avvenuta con successo si noter che il terreno non sar pi
nitido come prima. Per la semina su brodo nutriente abbiamo utilizzato due batteri diversi: Enterobacter e
Stafilococco epidermidis. LEnterobacter un genere di batteri Gram negativi asporigeni ed anaerobi
facoltativi. Sono in grado di utilizzare il lattosio e i citrati, producono quindi la -galattosidasi e la citrasi.
Risultano negativi alla prova del rosso metile e positivi alla prova di Voges-Proskauer, compiono quindi
la fermentazione 2,3-butilenglicole. Sono molto simili alla Klebsiella, ma se ne differenziano per la mobilit
e per la produzione di Ornitina-decarbossilasi. Fanno parte del gruppo dei coliformi.
Sono normalmente presenti nell'intestino dell'uomo, ma in soggetti immunodepressi (tipicamente
ricoverati ospedalieri) manifestano una patogenicit che pu causare infezioni delle vie urinarie.
Lo stafilococco epidermidis un batterio gram positivo appartenente al genere
degli stafilococchi tipicamente presente nella cute. Produce l'enzima catalasi ed coagulasi-negativo;
inoltre fornito di un glicocalice che gli consente di aderire a numerose superfici fra cui le protesi,
i cateteri e la cute stessa. quest'ultima caratteristica a renderlo un nemico temibile della chirurgia che usa
questi strumenti i quali devono essere manipolati dopo aver effettuato un'accurata sterilizzazionedella
zona di intervento. Molto frequente la contaminazione delle protesi d'anca dove spesso prolifera rendendo
necessaria la rimozione del dispositivo contaminato. Presenta spesso resistenza agli antibiotici, quindi
necessario l'antibiogramma per instaurare la terapia adeguata.
MATERIALE: DPI (Occhiali, camice, guanti), Coltura batterica di partenza in piastra, pennarello, provetta,
portaprovette, brodo nutriente in bottiglia di Petri, bunsen, pipetta sterile, ansa, carta da laboratorio.
PROOCEDIENTO:
- Sistemare la postazione di lavoro in modo da poter lavorare in sicurezza
- Indossare i Dispositivi di Protezione Individuale (DPI)
- Prendere un pezzo di carta da laboratorio e posizionarlo sotto il bunsen
- Accendere il bunsen con fiamma ossidante per sterilizzare laria intorno alla fiamma
- Sistemare vicino il bunsen i materiali per il lavoro
- Flambare la provetta, il becco della bottiglia di Petri con dentro il brodo nutriente e il rispettivo
tappo
- Siglare con il pennarello la provetta con il nome del batterio, data, classe e nome delloperatore
- Nota: lavorare sempre vicino in bunsen acceso con fiamma ossidante
- Con la pipetta sterile prelevare una quantit nota di brodo nutriente (circa 7 ml) e versarlo nella
provetta.
- Flambare la provetta e chiuderla con il tappo
- Arroventare lansa
- Prelevare dalla piastra gi seminata una piccola porzione di colonia con lansa
- Aprire il tappo della provetta e flambare il becco della provetta
- Inclinare la provetta e appoggiare lansa in prossimit del terreno liquido
- Raddrizzare la provetta
- Flambare il tappo e richiudere la provetta
- Sterilizzare lansa
- Pulire il piano di lavoro
- Aspettare almeno 24-36 ore e osservare
- Osservare
CONCLUSIONI: il batterio si riprodotto nel terreno liquido. Inoltre notiamo che anaerobio perch tende
ad andare sul fondo della provetta.
PARTE B: Semina su terreno solido in piastra per strisciata semplice
NOTE TEORICHE: La semina in piastra la tecnica comunemente utilizzata per separare le cellule di un
inoculo o le colonie batteriche. La semina per strisciata semplice il metodo disolamento pi rapido.
Consiste nel prelevare linoculo con lansa, che successivamente va strisciata con movimenti a zig-zag sulla
Enterobacter e superficie del terreno in piastra. Utilizzeremo come nella parte A due diversi batteri:
Stafilococco epidermidis (vedi note toriche parte A). Utilizzeremo lAgar nutriente, un terreno di coltura
solido (vedi relazione n5), il quale sar allo stato liquidi perch messo precedentemente in un bagno
termostatico.
MATERIALE: DPI (Occhiali, camice, guanti), Coltura batterica di partenza in piastra, pennarello, Piastra di
Petri sterile, Agar nutriente, ansa, bunsen, carta da laboratorio, bagno termostatico.
PROCEDIMENTO:
- Sistemare la postazione di lavoro in modo da poter lavorare in sicurezza
- Indossare i Dispositivi di Protezione Individuale (DPI)
- Prendere un pezzo di carta da laboratorio e posizionarlo sotto il bunsen
- Accendere il bunsen con fiamma ossidante per sterilizzare laria intorno alla fiamma
- Sistemare vicino il bunsen i materiali per il lavoro
- Siglare la piastra dove metteremo il terreno di coltura
- Nota: lavorare sempre vicino il bunsen con fiamma ossidante
- Aprire la bottiglia di Petri contenente lagar nutriente allo stato liquido
- Versare nella piastra sterile circa 20-25 ml di agar nutriente liquido
- Tenere aperta la piastra finch lagar non si solidifica
- Arroventare lansa
- Prelevare una piccola porzione di coltura batterica dalla coltura di partenza
- Appoggiare lansa sul terreno agarizzato e procedere strisciando a zig-zag
- Rovesciare la piastra e lasciarla per 24-48 ore in un termostato a 37C
- Osservare
CONCLUSIONI: Notiamo che il batterio si dispone in colonie sulla striscia creata dallansa, prima molto
vicine e poi iniziano ad essere sempre pi distanti tra loro.
PARTE C: semina in un terreno solido in provetta a becco di clarino/slant/agar slop
NOTE TEORICHE: La tecnica di semina su agar-slope permette di allestire colture generalmente utilizzate
per conservare in laboratorio i ceppi microbici di uso frequente. Va allestito in provetta, in modo da
vendere se i batteri sono mobili. In questo caso si usa un ago da inclusione e lo si fa penetrare nel terreno
solido. Inoltre i batteri si mantengono per 20-30 giorni. Useremo sempre lEnterobacter

MATERIALE: provetta con agar nutriente, coltura batterica in piastra, DPI, ago da batteriologia,
protaprovette, pennarello fino, bunsen, termostato.
PROCEDIMENTO:
- Sistemare la postazione di lavoro in modo da poter lavorare in sicurezza
- Indossare i Dispositivi di Protezione Individuale (DPI)
- Prendere un pezzo di carta da laboratorio e posizionarlo sotto il bunsen
- Accendere il bunsen con fiamma ossidante per sterilizzare laria intorno alla fiamma
- Sistemare vicino il bunsen i materiali per il lavoro
- Siglare la PROVETTA contenete il terreno di coltura
- Nota: lavorare sempre vicino il bunsen con fiamma ossidante
- Arroventare lago
- Aprire la piastra di Petri contenente la coltura batterica
- Prelevare una piccola porzione di coltura
- Chiudere la piastra dopo aver flambato il coperchio
- Togliere il tappo dalla provetta
- Penetrare con lago contenente lEnterobacter per 2-3 cm dentro la provetta (infissione)
- Portare a superficie la punta dellago e procedere strisciando a zig zag sulla superficie del terreno
- Arroventare lago
- Flambare il tappo della provetta e chiudere
- Posizionare la provetta allinterno del termostato a 37C per 24-48 ore
- Osservare
CONCLUSIONI: I batteri si sono riprodotti dove passato lago.
PARTE D: semina di colture batteriche in terreno semisolido per infissione
NOTE TEORICHE: la semina per infissione si esegue mediante un ago e permette di verificare la capacit di
mobilit di un batterio. Useremo il terreno CTSA (Vera Cystine Tryptic Semisolid Agar), formato da
tripeptone 20 g/L, L-cistina 0.25 g/L, NaCl 5g/L, Agar 2.5 g/L, Solfato di sodio 0.5 g/L, rosso fenolo
(indicatore di pH) 0.017 g/L. Se il batterio non mobile si potr osservare la striscia lasciata dallago, in caso
contrario oltre a quella si osserver che intorno alla striscia provocata dalla penetrazione dellago saranno
visibili i batteri intorno ad essa. Utilizzeremo una piastra con allinterno lEnterobacter
MATERIALI: provetta contenente CTSA, bunsen, carta da laboratorio, DPI, termostato, ago da batteriologia,
piastra contenente una coltura di Enterobacter.
PROCEDIMENTO:
- Sistemare la postazione di lavoro in modo da poter lavorare in sicurezza
- Indossare i Dispositivi di Protezione Individuale (DPI)
- Prendere un pezzo di carta da laboratorio e posizionarlo sotto il bunsen
- Accendere il bunsen con fiamma ossidante per sterilizzare laria intorno alla fiamma
- Sistemare vicino il bunsen i materiali per il lavoro
- Siglare la PROVETTA contenente il terreno di coltura
- Nota: lavorare sempre vicino il bunsen con fiamma ossidante
- Arroventare lago
- Aprire la piastra di Petri contenente la coltura batterica
- Prelevare una piccola porzione di coltura
- Chiudere la piastra dopo aver flambato il coperchio
- Togliere il tappo dalla provetta
- Penetrare verticalmente nella provetta con lago.
- Arroventare lago
- Flambare il tappo della provetta
- Posizionare la provetta nel termostato a 37C, aspettare 24-48 ore
- Osservare
CONCLUSIONI: I batteri sono mobili dato che intorno alla striscia causata dalla penetrazione dellago si
notano delle parti pi opache.
PARTE E: semina in un terreno solido in piastra per triplice ansata
NOTE TEORICHE: La semina per triplice ansata avviene in terreno solido e ha lo scopo di dividere i batteri in
modo da dividere le colonie di batteri. Utilizzeremo questa volta due terreni due terreni agarizzati diversi:
Agar Mac Conkey (un terreno differenziale) e MSA (manitolo salt agar). Il Mac Conkey composto da 17g/L
di peptone, polipeptide 7 g/L, lattosio 10 g/L, rosso neutro 0.03 g/L (rileva pH: incolore a pH neutro, rosso a
pH acido), NaCl 5 g/L, Sali biliari 1.5 g/L, Agar 13.5 g/L, cristalvioletto 0.01 g/L. Il terreno MSA un
contenente peptone 10 g/L, estratto di carne 19 g/L, NaCl 75 g/L, Manitolo 14 g/L, Agar 15 g/L, rosso fenolo
0.025 g/L. il suo pH di circa 7.4. A pH acido diventa giallo. Come batterio abbiamo utilizzato lEscherichia
coli, una delle specie principali di batteri che vivono nella parte inferiore dell'intestino di animali a sangue
caldo (uccelli e mammiferi, incluso l'uomo), e che sono necessari per la digestione corretta del cibo
MATERIALI: DPI, carta da laboratorio, bunsen, piastra di Petri contenente MSA o Agar Mac Conkey, carta da
laboratorio, piastra di Petri contenenteil batterio Escerichia coli.
PROCEDIMENTO:
- Sistemare la postazione di lavoro in modo da poter lavorare in sicurezza
- Indossare i Dispositivi di Protezione Individuale (DPI)
- Prendere un pezzo di carta da laboratorio e posizionarlo sotto il bunsen
- Accendere il bunsen con fiamma ossidante per sterilizzare laria intorno alla fiamma
- Sistemare vicino il bunsen i materiali per il lavoro
- Siglare la piastra contenente il terreno di coltura
- Nota: lavorare sempre vicino il bunsen con fiamma ossidante
- Arroventare lansa
- Aprire la piastra di Petri contenente la coltura batterica
- Prelevare una piccola porzione di coltura
- Chiudere la piastra dopo aver flambato il coperchio
- Procedere appoggiando in un punto della piastra lansa e muovendola a zig zag fino a circa un terzo
- Girare di 120 la piastra e rifare lo stesso procedimento partendo da un punto della piastra gi
seminata in precedenza
- Girare di 120 la piastra e rifare lo stesso procedimento partendo da un punto della piastra gi
seminata in precedenza in modo da separare il pi possibile i batteri
- Chiudere la piastra dopo aver flambato il coperchio e arroventato lansa
- Lasciarla 24-48 ore nel termostato a 37 e osservare
CONCLUSIONI: I batteri si sono divisi lungo la linea lasciata dallansata, ci sono parti dove i batteri sono
molto vicini tra loro e parti dove i batteri sono staccati.
PARTE F: SEMINA PER INCLUSIONE
NOTE TEORICHE: la semina per inclusione serve alla valutazione quantitativa dei batteri presenti in un
determinato campione liquido (contando con lo Stomacher). Il terreno utilizzato il PCA (plate count Agar)
formato da estratto di lievito 2.5 g/L, peptone digerito pancreatico di caseina 5 g/L; glucosio 1 g/L, Agar 15
g/L. preleveremo il batterio da una coltura liquida in soluzione acquosa. Dalla separazione dei batteri
possiamo anche definirne la morfologia (dimensioni, colore...)
Materiali: DPI, bunsen, carta da laboratorio, PCA liquido, pipetta sterile, propipetta, Stomacher, Piastra di
Petri sterile, coltura liquida in soluzione acquosa (sospensione batterica)
PROCEDIMENTO:
- Sistemare la postazione di lavoro in modo da poter lavorare in sicurezza
- Indossare i Dispositivi di Protezione Individuale (DPI)
- Prendere un pezzo di carta da laboratorio e posizionarlo sotto il bunsen
- Accendere il bunsen con fiamma ossidante per sterilizzare laria intorno alla fiamma
- Sistemare vicino il bunsen i materiali per il lavoro
- Siglare la piastra che conterr il terreno di coltura
- Nota: lavorare sempre vicino il bunsen con fiamma ossidante
- Prelevare 1 mL di sospensione batterica con la propipetta e versarlo nella piastra di Petri
- Aggiungere il PCA fuso a 50C
- Flambare il becco della bottiglia di Petri e il tappo del PCA
- Mescolare il contenuto della piastra di Petri muovendolo sia in senso orario, che in senso antiorario
formando un otto.
- Lasciar solidificare in posizione semiaperta la piastra
- Capovolgere e lasciare nel termostato a 37C per 24-48 ore
- Osservare
- Contare le colonie batteriche nel terreno di coltura
- Osservare la morfologia dei batteri
CONCLUSIONI: nella semina per inclusione io e il mio compagno abbiamo sbagliato probabilmente perch
non abbiamo mischiato la sospensione batterica prima di prelevarla, ma nelle atre piastre abbiamo notato
che le colonie batteriche si potevano contare ed erano distaccate luna dallaltra, fatta eccezione per
qualcuna.


PARTE G: Semina per spatolamento
NOTE TEOICHE: la semina per spatolamento richiede che i microrganismi si trovino in mezzo liquido.
Consiste nel deporre al centro della superficie del terreno solidificato una goccia di sospensione microbica,
di volume 1 mL. Questa semina viene utilizzata per compilare un antibiogramma ovvero per determinare la
sensibilit di un batterio nei confronti di un certo antibiotico
MATERIALI: DPI, sospensione microbica, piastra contenente PCA, sospensione microbica, propipetta,
pipetta, spatole monouso sterili/tampone sterile, bunsen, carta da laboratorio
PROCEDIMENTO:
- Sistemare la postazione di lavoro in modo da poter lavorare in sicurezza
- Indossare i Dispositivi di Protezione Individuale (DPI)
- Prendere un pezzo di carta da laboratorio e posizionarlo sotto il bunsen
- Accendere il bunsen con fiamma ossidante per sterilizzare laria intorno alla fiamma
- Sistemare vicino il bunsen i materiali per il lavoro
- Siglare la piastra che contiene il terreno di coltura
- Nota: lavorare sempre vicino il bunsen con fiamma ossidante
- Prelevare 0.1 mL di sospensione batterica con la propipetta e versarlo nella piastra di Petri, al
centro
- Con il tampone sterile, procedere a zig zag 4 volte lungo la superficie della piastra ed infine farla
strisciare lungo il bordo di essa
- Lasciare capovolta la piastra nel termostato 24-48 ore
- Osservare
- Contare le colonie batteriche presenti nel terreno di coltura
CONCLUSIONI: nel nostro terreno di coltura sono presenti 9 colonie batteriche distanti tra loro. Non sono
colonie spesse, il diametro supera il millimetro. Prendendo i dati della classe si pu ipotizzare che vi fossero
90 colonie su un millimetro di sospensione batterica