LEZIONE 16 – Sistemi di regolazione

SISTEMI DI REGOLAZIONE A DUE COMPONENTI

In che modo un batterio sente e risponde a specifici segnali provenienti dall’ambiente?

Per esempio, nel caso dell’operone lac la presenza del lattosio nel terreno determina l’attivazione
dell’espressione genica dell’operone.
Un altro tipo di regolazione è quello operato dall’utilizzazione di fattori sigma alternativi che,
insieme con altre proteine, regolano l’attività dell’RNA polimerasi e quindi modulano la
trascrizione.
Ma in che modo i le cellule batteriche “sentono” stimoli esterni come per esempio il pH, che non
coinvolgono sostanze specifiche e in che modo questi stimoli sono convertiti in segnali interni?

In natura, i batteri devono poter recepire e rispondere rapidamente a cambiamenti ambientali quali
variazioni nella disponibilità di nutrienti, osmolarità, temperatura etc.. Per questo motivo si è
evoluto un sistema piuttosto complesso che è in grado di “sentire” l’esterno e ridirigere
l’espressione genica in risposta ai segnali percepiti. Questo meccanismo è noto come SISTEMA DI
REGOLAZIONE A DUE COMPONENTI.
Sono noti almeno 24 esempi di questo tipo di regolazione.

Quali tipi di segnali esterni vengono riconosciuti?

* Osmolarità
* Fosfato
* Zuccheri
* Nitrato
* Essudati di piante
* Livelli di ossigeno
* Livelli d’azoto

L’organizzazione del sistema di regolazione a due componenti è conservata.

Tutti i sistemi di regolazione a due componenti consistono di due componenti costituiti da due
proteine.
Il primo componente è un SENSORE-TRASMETTITORE che attraversa la membrana
citoplasmatica. Questa proteina che attraversa tutta la membrana presenta due domini: il dominio
esterno costituisce il sensore. E’ localizzato nello spazio periplasmatico ed è il dominio che
riconosce specifici segnali esterni e quindi “percepisce” il segnale.
Il secondo dominio è il dominio trasmettitore che è localizzato nel citoplasma. I due domini sono
ancorati alla membrana citoplasmatica da due regioni che attraversano la membrana.
Il trasmettitore è capace di autofosforilarsi utilizzando ATP. Durante questa reazione, un gruppo
fosfato (PO4) è trasferito ad uno specifico residuo di istidina (His) presente nella proteina. Il
dominio trasmettitore contiene anche un’attività chinasica che lo rende capace di trasferire il gruppo
PO4 ad un secondo componente ricevente-regolatore nel momento in cui viene rilevato il segnale
ambientale.

Il secondo componente è il RICEVENTE-REGOLATORE che è localizzato nel citoplasma. Anche

questo componente è costituito da due domini. Il primo è un dominio ricevente che presenta un
residuo di acido aspartico (Asp) che può accettare il gruppo fosfato trasferito dal dominio
trasmettitore del primo componente. Il secondo dominio è il regolatore che, in risposta alla presenza
di un gruppo PO4 legato al dominio ricevente, può legare a specifiche sequenze di DNA in specifici
promotori e attivare l’espressione genica. Questi due domini sono legati da un linker flessibile.

Tali domini sono altamente conservati tra i sistemi di regolazione a due componenti identificati fino
ad ora.
Ciò è molto interessante in quanto ogni sistema è altamente specifico per un dato segnale e non ci
sono sovrapposizioni tra diversi sitemi.
Questo è un chiaro esempio conservazione evoluzionistica e, nello stesso tempo, di indipendenza
funzionale.
Un altro nome per questo tipo di regolazione genica è “trasduzione del segnale” poiché un segnale
esterno alla cellula viene decodificato all’interno della cellula.

Il sistema a due componenti OmpR/EnvZ di E. coli

Per osmolarità si intende la quantità di soluti in soluzione. Più alta è òla quantità di soluti (fonti di
carbonio, sali, ioni etc.), più è alta l’osmolarità..

La parete cellulare di E. coli è composta dalla membrana esterna che insieme alla membrana
citoplasmatica avvolge lo spazio periplasmatico contenente lo strato di peptidoglicano. La
membrana citoplasmatica è la principale barriera di permeabilità, ma non può sostenere un
gradiente di pressione. La membrana esterna invece esclude le macromolecole, ma contiene
numerosi pori che permettono l’ingresso per diffusione di piccole molecole idrofiliche anioniche
nello spazio periplasmatico. In questo modo viene mantenuta la pressione osmotica tra il periplasma
ed il citoplasma.
Le due porine principali sono OmpF e OmpC, codificate rispettivamente dai geni strutturali ompF e
ompC. Queste proteine formano dei canali, o pori, nella membrana esterna che consentono il
passaggio di molecole con diversa taglia. Ogni canale è formato da tre subunità di porina e OmpF
forma dei pori leggermente più grandi rispetto a quelli formati da OmpC. Sebbene il numero di pori
rimanga costante nella membrana esterna, il rapporto tra i pori formati da OmpF e OmpC cambia in
risposta al grado di osmolarità del terreno che circonda la cellula.

* Alta osmolarità: predomina OmpC

* Bassa osmolarità: predomina OmpF

Es. nell’intestino, dove l’osmolarità e la temperatura sono elevate, predomina OmpC. In questo
modo la cellula si protegge dall’ngresso dei sali biliari che sono tossici. Al di fuori dell’intestino,
l’osmolarità e la temperatura sono più basse. In questa situazione predomina OmpF che consente
l’ingresso nella cellula di un maggior numero di nutrienti.

Regolazione dell’espressione genica di ompF e ompC in risposta a cambiamenti osmotici

In E. coli il pathway di trasduzione consiste di due proteine EnvZ (sensore-transmettitore) e OmpR

(recevente-regolatore).

ompC è localizzato a 48 minuti sulla mappa di E. coli mentre ompF è localizzato a 21 minuti,
indicando che i 2 geni non sono vicini. Comunque, le regioni del promotore di entrambe i geni
contengono siti di legame per OmpR nella sua forma fosforilata (OmpR in quanto ricevente-
regolatore può agire come attivatore della trascrizione solo quando è fosforilato).
Il segreto della regolazione risiede nel numero di siti e nell’affinità che questi presentano per
OmpR-fosforilato.
Nel promotore di ompC sono presenti tre siti a bassa affinità per OmpR.
Al contrario. Nel promotore di ompF è presente un sito a bassa affinità e due siti ad alta affinità per
OmpR.

Bassa osmolarità

In condizione di bassa affinità, nessun segnale è percepito da EnvZ e quindi OmpR non viene
fosforilato (attivato). In ogni caso, nella cellula ci sono sempre alcune molecole di OmpR
fosforilate, anche in condizioni di bassa osmolarità; queste poche molecole saranno catturate dai siti
ad alta affinità presenti nel promotore di ompF, determinando l’espressione del gene ompF. Il
risultato sarà un incremento di pori più grandi, formati da OmpF, che permetteranno il passaggio
nello spazio periplasmatico di più molecole.

Alta osmolarità

In condizioni di alta osmolarità, le alte concentrazioni di soluto sono percepite da EnvZ con
conseguente fosforilazione di molte proteine OmpR nel citoplasma. A questo punto, l’incremento di
OmpR fosforilato determina due eventi:

1. OmpR di lega non soltanto ai siti ad alta affinità presenti nel promotore di ompF, ma anche
ai siti a bassa affinità presenti nello stesso promotore. Quando OmpR è legato a questi siti a
bassa affinità nel promotore di ompF funziona da repressore e quindi la proteina OmpF.
OmpR, infatti, è un regolatore della trascrizione che può agire sia da attivatore che da
repressore. (Questa caratteristica è comune a molte proteine che legano il DNA; proteine che
normalmente agiscono da attivatori possono funzionare da repressori se si legano a dei siti
che alcuni autori hanno chiamato “zona esclusiva di repressione”.)

2. OmpR si lega ai tre siti a bassa affinità presenti sul promotore del gene ompC attivandone la
trascrizione. In queste condizioni infatti compaiono i pori piccoli formati dalla porina
OmpC.

Riassunto: La quantità della proteina ompR fosforilata nella cellula determina quale proteina
tra ompF e ompC viene prevalentemente espressa. La quantità di OmpR fosforilata è
determinata dalla percezione della pressione osmotica da parte di EnvZ.
REGOLAZIONE ANTISENSO

Gli RNA antisenso sono piccole molecole di RNA non tradotte che si appaiano a regioni
complementari di specifici mRNA bersaglio (target). Questo appaiamento determina il
cambiamento nell’espressione o nella funzione del mRNA bersaglio a livello post-trascrizionale.

La presenza di RNA antisenso è ben documentata nei procarioti, principalmente nei plasmidi e nei
batteriofagi. Inoltre, svolgono un ruolo importante nella regolazione genica sia nei procarioti che
negli eucarioti.
Gli RNA antisenso contengono molte strutture a forcina (stem-loop: stelo con ansa). I domini
presenti nell’ansa (loop) sono importanti per la specificità del target mentre le strutture dello stelo
(stem) sono coinvolte nella stabilità dell’RNA.

Gli RNA antisenso sono sintetizzati in due modi differenti

1) Tramite la trascrizione opposta all’interno di un gene. Per definizione, la trascrizione di una

della doppia elica di DNA sarà 100% complementare al prodotto della trascrizione dell’elica
opposta.
2) Tramite la trascrizione di una regione non correlata del genoma. In questo caso la sequenza
dell’RNA antisenso è normalmente complementare alla sequenza target con qualche errore
(meno del 100% di complementarietà). Ciò è dovuto al fatto che le due regioni trascritte sono
distinte e non c’è una selezione per mantenere la complementarietà.

Il controllo mediato dall’RNA antisenso riguarda le più disparate funzioni biologiche e include la
replicazione del DNA plasmidico, la trasposizione, lo sviluppo di batteriofagi e l’espressione di
specifici geni batterici.

Controllo del livello di proteina OmpF

Abbiamo precedentemente discusso la regolazione dell’espressione genica delle porine ompF e

ompC in E. coli attraverso il sistema di regolazione a due componenti EnvZ/OmpR. In questo
sistema a due componenti EnvZ e OmpR determinano l’espressione di ompF e ompC a seconda
della osmolarità dell’ambiente circostante. In ogni caso, la cellula ha la necessità di variare la
quantità di OmpF nella membrana esterna in risposta ad altri stimoli ambientali quali la presenza di
antibiotici specifici ed in risposta a variazioni di temperatura. Il sistema EnvZ/OmpR non risponde
a questi segnali quindi, E. coli ha evoluto un altro meccanismo per regolare i livelli di porina OmpF.
E. coli contiene un gene, chiamato micF, che codifica per un RNA non tradotto lungo 93 nt (MicF).
micF (49.8’) è fisicamente distante da ompF, ma è localizzato vicino a ompC (49.7’).

MicF è complementare al mRNA di ompF al 70%, si può comunque appaiare all’estremità 5’ del
mRNA ompF e questo appaiamento impedisce il legame del ribosoma al codone d’inizio AUG. In
questo modo, MicF inibisce l’inizio della traduzione del mRNA di ompF mascherando i siti di
riconoscimento da parte del ribosoma.

MicF non ha un ruolo nell’espressione di ompF in risposta a cambiamenti di osmolarità in quanto

una delezione di micF non determina cambiamenti sulla quantità di OmpF prodotta in queste
condizioni.
Tuttavia ha effetto su altri stimoli ambientali quali:
1. temperature elevate

2. esposizione al salicilato

3. stress ossidativo

Tutte queste condizioni riducono i livelli di ompF tramite la regolazione da parte dell’RNA
antisenso prodotto da MicF.

Inoltre, MicF è anche parzialmente responsabile per gli effetti osservati in:

1. mutanti tolC (resistenti al toluene)

2. mutanti marC (resistenza multipla agli antibiotici)

3. resistanza ai macrofagi

E’ perciò evidente che MicF è coinvolto nella difesa cellulare contro molecole tossiche esterne
tramite la riduzione delle porine OmpF sulla membrana esterna.
Approfondimento:
IL SISTEMA DEL DOPPIO IBRIDO
Il sistema del doppio ibrido viene utilizzato per mettere in evidenza l’interazione tra proteine in un
sistema cellulare, il lievito, quindi in condizioni definite “in vivo”
Questo sistema si avvale della caratteristica struttura a domini di alcuni fattori che regolano la
trascrizione e del fatto che questi domini conservano la loro funzione anche quando sono separati
dal resto della proteina.
Es. la proteina Gal4 possiede un dominio che lega il DNA (BD= DNA binding domain) e un altro
dominio che attiva la trascrizione (AD= activation domain).

La porzione di proteina tra i due domini può essere sostituita da altre sequenze proteiche non
correlate alla proteina. Quando il BD viene isolato dal gene originario e fuso ad un gene X che
codifica per una proteina che normalmente non lega il DNA e non attiva la trascrizione, la proteina
chimerica che contiene questa fusione sarà in grado di legare il DNA allo stesso sito operatore del
BD originario, ma non potrà attivare la trascrizione (manca l’AD).
Quando l’AD viene isolato e fuso ad un gene Y che codifica per una proteina che normalmente non
lega il DNA e non attiva la trascrizione, la proteina chimerica è potenzialmente in grado di attivare
la trascrizione.

Se le proteine X e Y interagiscono, si otterrà la trascrizione del gene a valle del promotore

contenente il sito operatore per il sito di legame al DNA ovvero il DNA Binding Domain (BD).
Altre informazioni le potrete trovare al sito
http://bmbpcu01.leeds.ac.uk/staff/pam/HYBRID.HTM