BIOLOGIA MOLECOLARE

1. Stuttura del DNA

Il DNA è formato da nucleotidi, unità monomeriche composte da base azotata, zucchero pentoso
e gruppo fosfato; il nucleotide privo del gruppo fosfato è chiamato nucleoside.
Le basi azotate possono essere purine (molecola a doppio anello, adenina o guanina) o
pirimidine (molecola a singolo anello, citosina o timina); la base è legata al carbonio 1’ dello
zucchero (legame β-glicosidico); lo zucchero in questione è il 2-deossi-β-D-ribosio.
Il gruppo fosfato è legato al carbonio in posizione 5’ del ribosio; un secondo gruppo fosfato si lega
all’ossidrile in posizione 3’ per unire i nucleotidi tra loro (legame 3’, 5’ fosfodiesterico).
La catena del DNA è sempre orientata in direzione 5’ —> 3’.
La molecola del DNA è a doppio filamento: lo scheletro di ciascun filamento è formato da
zucchero + fosfato, le basi si trovano in posizione interna e si accoppiano C+G | T+A.
L’accoppiamento delle basi è definito dalle regole di Chargaff, secondo cui in una molecola a
doppio filamento: C=G, T=A e C+T = G+A .
Le basi formano tra loro ponti idrogeno, 3 per C+G e 2 per T+A.
I due filamenti del DNA sono antiparalleli, ossia decorrono in direzione 5’ —> 3’ l’uno e il
complementare in direzione 3’ —> 5’.
I due filamenti inoltre si dispongono in una struttura caratteristica a doppia elica, come una scala
che ruota su se stessa: i pioli sono le basi e i corrimano sono lo scheletro zucchero + fosfato.
Il passo dell’elica è di circa 10 paia di basi (3,4 nm).
Lo studio sulla struttura del DNA è stato possibile grazie agli esperimenti di Rosalind Franklin
(raggi X) e alla teoria formulata nel 1953 da Watson e Crick.
2. Replicazione del DNA

La replicazione del DNA si rende necessaria nel momento in cui una cellula si divide e
quindi deve trasmettere alle cellule figlie il suo patrimonio genetico: avviene infatti durante
la fase S del ciclo cellulare, che prelude alla divisione.
La replicazione del DNA è un processo semiconservativo, nel senso che ciascuno dei
due vecchi filamenti funge da stampo al nuovo filamento, per cui la molecola di DNA
replicato sarà formata per metà dal DNA preesistente e per metà da quello di nuova
generazione. La replicazione semiconservativa spiega la trasmissione delle mutazioni,
ossia cambiamenti nella sequenza di basi del vecchio che si riflettono nel DNA di nuova
formazione.

Il processo inizia in prossimità di molteplici siti sulla molecola detti regioni ori dove una
DNA elicasi ATP-dipendente svolge la doppia elica destabilizzandola e rompendo i
legami idrogeno: si forma una “bolla di replicazione” e due strutture a forma di Y dette
forche di replicazione, orientate in direzioni opposte e che si spostano insieme
all’elicasi.
Dopo che i due filamenti si sono separati, le proteine SSB legano ciascun singolo filamento
e lo stabilizzano, in modo che non si riavvolga.
Inoltre quando l’elica si svolge in un altro punto dell’elica si forma un superavvolgimento:
gli enzimi topoisomerasi effettuano dei tagli in alcuni punti per risaldarli in una
configurazione più rilassata.
La sintesi del nuovo DNA avviene per aggiunta di nucleotidi trifosfato ai filamenti
preesistenti sempre in direzione 5’ —> 3’ e seguendo l’appaiamento delle basi. Il
processo è reso possibile dall’energia che deriva dalla rottura dei due legami fosfoesterei
del nucleoside ed è catalizzato dalla DNA polimerasi.
L’enzima ha bisogno di di un innesco ad RNA che permetta di iniziare l’aggiunta di
nucleotidi: è detto RNA primer e consiste di 5-14 nucleotidi sintetizzati dall’enzima DNA
primasi.
La replicazione del DNA avviene diversamente sui due filamenti. Su di uno essa è priva di
interruzioni e procede seguendo la direzione di avanzamento della forca di replicazione
(filamento leading o guida); sull’altro invece essa è discontinua ed avviene in direzione
opposta alla forca di replicazione (filamento lagging o ‘in ritardo’).
Il montaggio di filamenti corti e discontinui porta alla delimitazione di frammenti di circa
100-200 nucleotidi detti frammenti di Okazaki. Ciascun frammento è sintetizzato ad
intervalli regolari a partire da un RNA primer: alla fine del processo i primer vengono
eliminati e i frammenti sono uniti da una DNA ligasi che ha il compito di “saldare i ponti”.

Il DNA procariotico si trova sotto forma di un’unica molecola circolare ma sono presenti
anche i plasmidi, ossia ridotte porzioni di materiale genetico procariote
extracromosomiali, facilmente identificabili perché situate in posizione periferica, che si
replicano in modo autonomo. La replicazione del DNA batterico ha una sola origine di
replicazione ed viene seguendo la forma circolare della molecola.
A differenza della molecola genetica circolare dei procarioti, i cromosomi eucariotici hanno
estremità libere. Nel corso di successive replicazioni, i segmenti terminali di DNA non
possono essere replicati accuratamente, per cui si perde una porzione di informazione
genetica. Fortunatamente le estremità terminali dei cromosomi eucariotici sono rivestiti da
una abbondante porzione di nucleotidi non codificanti detta telomero, che le incappuccia.
Quindi una cellula prima di perdere geni importanti deve replicarsi molte volte. Il DNA
telomerico può essere allungato dall’enzima DNA telomerasi, molto abbondante in cellule
con elevato tasso di divisione (cellule ematiche, epiteliali, germinali e cellule cancerose).
L’accorciamento dei telomeri è diretamente collegato all’invecchiamento cellulare e
all’apoptosi; è stato verificato sperimentalmente anche l’opposto. Le cellule tumorali
presentano telomeri molto lunghi e telomerasi molto attive.

3. Correzione degli errori di appaiamento e mutazioni derivabili

Sebbene la replicazione del DNA sia un processo molto efficiente, si possono verificare
degli errori nell’appaiamento delle basi. La DNA polimerasi nel corso della sua attività
effettua simultaneamente una “correzione di bozze” sui nucleotidi aggiunti, per cui se
rileva un nucleotide errato lo sostituisce immediatamente con quello corretto.
Se qualcosa sfugge alla DNA polimerasi intervengono i complessi enzimatici della
mismatch repair che riconoscono i nucleotidi appaiati in modo errato, li segnalano alla
DNA polimerasi e quest’ultima risolve il problema; la mancanza di questi enzimi è collegata
ad alcune forme di cancro al colon.
Alcuni tipi di riparazione del DNA si rendono necessari nel momento in cui le cellule sono
sottoposte a radiazioni e/o sostanze cancerogene o mutagene, che inducono alterazioni
dell’appaiamento nucleotidico. Ad esempio la riparazione per escissione nucleotidica
viene effettuata quando un’esposizione eccessiva alla radiazione UV causa errori di
replicazione.
4. Struttura e tipologie RNA

L’acido ribonucleico differisce dal DNA per la presenza dello zucchero ribosio (anzichè
desossiribosio), per la singolarità della catena e per la presenza della base azotata
pirimidinica uracile al posto della timina.
La sintesi di RNA avviene a partire dal DNA col processo di trascrizione: vengono trascritti
3 principali tipi di RNA.
L’ RNA messaggero (mRNA) consiste di un unico filamento lineare trascritto nel nucleo
che ha la funzione di contenere le istruzioni per il montaggio della proteina nei ribosomi.
L’ RNA transfer (tRNA), sempre trascritto nel nucleo, assume dei ripiegamenti caratteristici
per assolvere il compito di trasportare gli aminoacidi e di fornirli al ribosoma che, seguendo
le istruzioni del messaggero, svolge la manodopera.
L’ RNA ribosomiale (rRNA), assemblato nel nucleolo, ha forma globulare e rappresenta la
porzione di acido nucleico (l’altra è proteica) nel ribosoma.
5. Trascrizione

Il processo di trascrizione consiste nel passaggio da DNA a RNA (medesima sequenza di

basi) ed è catalizzato dalle RNA polimerasi, enzimi dal ruolo affine alle DNA polimerasi.
Come queste ultime infatti, esse effettuano la sintesi in direzione 5’ —> 3’ leggendo in
direzione opposta un filamento di DNA detto trascritto ed inseriscono nucleotidi trifosfato
(molecole esoergoniche); a differenza della DNA polimerasi, la RNA polimerasi non
richiede un primer.

Sia nei procarioti che negli eucarioti la regione di DNA alla quale la RNA polimerasi si lega
per iniziare la trascrizione è detta promotore (che si trova a monte): poiché il promotore
non viene trascritto, la polimerasi dopo averlo riconosciuto passa oltre ed inizia il suo
lavoro.
La fase di inizio prende il via all’estremità 5’ con la sequenza leader a monte e l’aggancio
di un ribonucleotide trifosfato, il cosidetto codone di inizio o start (AUG, che codifica per
la metionina negli eucarioti e per la formilmetionina nei procarioti), che rappresenta
l’inizio della sequenza codificante.
La fase di allungamento procede in direzione 3’ fino ai codoni di stop (UAA, UAG,
UGA) che rappresentano la fine della sequenza codificante dell’ RNA, poi troviamo un
breve tratto detto sequenza trailing a valle.
La polimerasi dunque riconosce un terminatore sulla sequenza del DNA che nei procarioti
causa l’immediata terminazione della trascrizione, mentre negli eucarioti viene trascritta e
poi causa il distacco della polimerasi.

È importante ricordare che i geni eucariotici presentano sequenze codificanti interrotte, nel
senso che si alternano segmenti che vengono trascritti ma non espressi (introni) e
segmenti (in numero molto minore) che vengono trascritti ed espressi (esoni). I termini si
riferiscono sia al DNA che al RNA in quanto i frammenti vengono copiati dal primo al
secondo. L’ RNA messaggero appena trascritto è propriamente detto pre-mRNA nel senso
che non è ancora pronto per essere letto dal ribosoma. Per maturare deve subire diverse
modifiche post-trascrizionali come il capping in 5’, la poliadenilazione in 3’ e lo
splicing.

Lo splicing consiste nella rimozione degli introni dal mRNA e dall’unione degli esoni a
formare un segmento continuo, che avviene quando il messaggero si unisce a dei
complessi proteici e forma una struttura detta spliceosoma. Solo allora l’mRNA maturo
può uscire dal nucleo ed essere letto dai ribosomi. *splicing alternativo —> nuove proteine

Nei procarioti la sintesi dell’RNA avviene nel citoplasma (essendo privi di nucleo) e l’mRNA
neosintetizzato può essere usato subito dal ribosoma senza subire modifiche. Si dice infatti che
trascrizione e traduzione nei procarioti siano accoppiate (avvengono simultaneamente); inoltre nel
processo di trascrizione sono coinvolti più ribosomi per ciascuna molecola di mRNA (poliribosomi).

START STOP
6. Traduzione

Il tRNA è una molecola di RNA ripiegata ad assumere una struttura caratteristica che ha la
funzione di legarsi ad uno specifico aminoacido e poi di dirigersi verso il ribosoma.
La sua struttura ad anse gli permette di mostrare ad un’estremità un anticodone, ossia
una tripletta di basi che vengono riconosciute dal mRNA nei ribosomi; ad un’altra estremità
presenta i siti di riconoscimento per i ribosomi; all’estremità 3’ ci sono i siti di attacco
per l’aminoacido ed i siti di riconoscimento per gli enzimi che ne catalizzano l’aggancio.
Tale aggancio avviene mediante legame covalente ad opera degli enzimi aminoacil-tRNA
sintetasi ATP-dipendenti che vanno a formare il complesso aminoacil-tRNA.

I ribosomi rivestono un ruolo cruciale e sono simili nei procarioti e negli eucarioti: sono
composti da due subunità, una proteica (40% in massa) con funzione strutturale ed
una di rRNA (60% in massa, assemblato nel nucleolo) con funzione catalitica, che si
comporta come un ribozima.
Il ribosoma presenta 4 siti di legame, tre per i tRNA ed uno per il mRNA. Il sito A
(aminoacilico) è dove si legano gli aminoacil-tRNA entranti grazie al riconoscimento
dell’anticodone; il sito P (peptidilico) è dove permangono i tRNA che legano la catena
polipeptidica uscente; il sito E è dove transita il tRNA privato del suo aminoacido prima di
uscire dal ribosoma.
L’inizio richiede l’ingresso del mRNA nel ribosoma e l’arrivo di un tRNA iniziatore, che
porta l’anticodone UAC (codone di start AUG) e l’aminoacido metionina (formilmetionina
nei procarioti). Successivamente la Met può essere mantenuta o rimossa dalla catena.
Il processo è endoergonico e avviene grazie alla molecola energetica GTP.

La fase di allungamento consiste in:

- arrivo di un aminoacil-tRNA presso il sito A: qui avviene il riconoscimento tramite

l’anticodone e l’appaiamento al mRNA.
- su fosforilazione di GTP, il complesso raggiunge il sito P, dove avviene la formazione del
legame peptidico grazie all’enzima peptidil transferasi. Il nuovo tRNA infatti si sposta e
lega covalentemente la catena polipetidica in via di formazione, prendendo il posto del
vecchio tRNA. Quando arriverà un nuovo tRNA, ne occuperà il posto.
- il vecchio tRNA che ha ceduto l’aminoacido dunque raggiunge il sito E e viene espulso.

In poche parole, la fase di allungamento consiste nella formazione della catena

polipeptidica attraverso l’aggiunta degli aminoacidi uno ad uno.
La sintesi proteica avviene in direzione 5’ —> 3’ rispetto al filamento di mRNA in cui
l’estremità 5’ è rappresentata dal gruppo amminico (NH2) e quella 3’ dal gruppo
carbossilico (COOH).
Bisogna notare che il ribosoma scorre lungo la molecola di mRNA, la quale rimane passiva;
l’energia per muoversi è fornita dalla GTP.

La fase di terminazione prevede l’arrivo di un fattore di rilascio che riconosce i codoni di

stop e li lega (nessun tRNA si lega ai codoni di stop), causando il distacco del polipeptide.
Questa reazione di idrolisi non solo libera il polipeptide ma separa le unità ribosomiali.
Il trasferimento delle proteine neosintetizzate nel lume del RER permette agli chaperon
molecolari di assistere la proteine nel processo di ripiegamento tridimensionale.
7. Mutazioni (vedi anche Genetica*)

Le mutazioni possono essere genericamente definite come alterazioni ereditabili della

sequenza nucleotidica del DNA, di incidenza casuale e spontanea (in particolare in certi
punti del DNA detti hotspot) o indotta da agenti mutageni e cancerogeni (radiazioni
ionizzanti, agenti chimici).

Esse dunque possono avvenire sia a causa di fattori ambientali sia a causa di errori
endogeni ad esempio nella meiosi (mutazioni del cariotipo* o aneuploidie), durante la
replicazione o trascrizione del DNA (mutazioni geniche puntiformi), o durante il
crossing-over (mutazioni cromosomiche strutturali*).

Sebbene la maggior parte delle “possibili mutazioni” venga subito rilevata e corretta da
meccanismi di riparazione (vedi replicazione DNA), alcuni errori sfuggono alle precise
macchine enzimatiche. Dunque distinguiamo mutazioni silenti (ossia dagli effetti
funzionali non rilevabili) oppure mutazioni manifestate; esse a loro volta possono essere
dannose ma a volte possono risultare utili. È proprio sulle mutazioni “utili" che si basa il
principio dell’evoluzione delle specie e della sopravvivenza del più forte.

Le mutazioni geniche possono avvenire per sostituzione di una singola base che quindi
comporta la mutazione di una singola coppia di nucleotidi. Queste mutazioni derivano
spesso da errori durante la replicazione del DNA; esse possono o non avere alcun effetto
visibile (mutazioni silenti, che non causano alcun effetto grazie alla ridondanza del codice
genetico) oppure essere trascritte in un mRNA difettoso e quindi causare anomalie della
sintesi proteica.
Le mutazioni missenso (di senso) provocano l’alterazione di un codone con conseguente
alterazione dell’aminoacido codificato: ne segue una alterata sintesi proteica e quindi una
funzionalità proteica compromessa in senso ampio.
Le mutazioni nonsenso invece possono modificare un codone che normalmente codifica
per aminoacido trasformandolo in un codone di stop. Per esempio la tripletta TAC è
sostituita da TAG, che verrà trascritto nell'mRNA come UAG, uno dei tre codoni di stop. Si
crea una proteina tronca.

Le mutazioni che avvengono tramite l’inserzione o la delezione di coppie di basi sono dette
mutazioni frameshift e provocano l’alterazione della griglia di lettura a valle del sito di
mutazione; causeranno dunque un alterato mRNA ed una alterata sintesi proteica.
Le inserzioni causano uno slittamento della lettura delle triplette a partire dai nucleotidi
inseriti; le delezioni causano uno slittamento della lettura delle triplette a partire da quelli
deleti.

Alcune mutazioni infine coinvolgono segmenti mobili di DNA, i trasposoni.

Le mutazioni geniche causano la comparsa di alleli mutati (autosomici o

eterosomici; dominanti o recessivi) che causano gli errori congeniti del
metabolismo; le aneuploidie e le mutazioni cromosomiche strutturali
(autosomiche o eterosomiche) causano le sindromi (vedi Genetica).