ACIDI NUCLEICI

Gli acidi nucleici sono polimeri e i loro monomeri sono i nucleotidi.

Ogni nucleotide è formato da tre parti:

● Gruppo fosfato, si lega in posizione 5 e ha delle cariche.

Parte fissa
● Zucchero a 5 atomi di carbonio.
● Base azotata, che può essere una purina, ovvero con due anelli (adenina e guanina)
oppure una pirimidina, con un solo anello (timina, citosina e uracile). Si lega sempre in
posizione 1.

Base azotata e zucchero costituiscono il nucleoside.

Nel DNA e nell’RNA i nucleotidi sono legati tra loro per formare lunghe catene. Tra il gruppo
fosforico al C5 dello zucchero di un nucleotide e il gruppo –OH al C3 dello zucchero del nucleotide
adiacente si forma un legame 5’- 3’ FOSFODIESTERICO.

Il DNA si presenta come una molecola lineare, con due

coppie di nucleotidi aventi orientamento opposto, cioè
antiparallelo (5’-3’ e 3’-5’). Le basi sono rivolte
internamente e ciascuna base si lega attraverso dei ponti
idrogeno alla base complementare, presente nell’altro
filamento. Adenina e timina creano un doppio legame
idrogeno, mentre tra guanina e citosina è presente un
triplo legame, tali accoppiamenti permettono di tenere
costante la lunghezza di legame. Ciò costringe la molecola
ad una torsione su se stessa, creando una struttura
elicoidale che si ripete per 340 nm, che corrispondono a 10
basi azotate.

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 DUPLICAZIONE DEL DNA

La doppia elica del DNA è una molecola autoreplicante: è in grado di

produrre catene identiche a se stessa nella fase di preparazione alla
divisione cellulare. L’autoreplicazione avviene con un meccanismo “a
cerniera”, la doppia elica si apre ad un’estremità e, sulla base dello
stampo costituito dai due filamenti, si dispongono nuovi nucleotidi che
si uniscono tra loro con la base complementare, sempre per mezzo di
ponti idrogeno. Con il procedere dell’apertura della doppia elica si
formano due doppie eliche figlie, costituite da un filamento nuovo e
da una già esistente che funge sta stampo, per questo il processo di
duplicazione del DNA è detto semiconservativo.

La duplicazione avviene mediante l’utilizzo di diversi enzimi, i quali

permettono la rottura dei legami idrogeno tra le basi azotate
permettendo l’allontanamento dei filamenti. Si può originare
contemporaneamente in più punti della doppia elica, attraverso delle
bolle di replicazione che permettono che il processo avvenga più velocemente.

La duplicazione dei filamenti può procedere in modo lineare dal punto di apertura della bolla solo
in direzione 5’🡪3’ (filamento guida), ed è catalizzata dalla DNA polimerasi. Il DNA forma una bolla
di duplicazione alle cui estremità troviamo le forcelle di duplicazione (a Y).
La DNA polimerasi necessita di tre elementi:

❖ Un filamento di DNA stampo

❖ Un innesco, detto primer, di DNA complementare al filamento stampo
❖ Una miscela di quattro basi azotate

La DNA polimerasi si lega al filamento stampo a livello dell’innesco

complementare, a cui lega il nucleotide con la base complementare a
quella presenta sul filamento stampo. Si forma un legame fosfodiesterico
con liberazione di due fosfati non utilizzati e allungamento della catena di
DNA di un nucleotide. Agisce solo in direzione 5’🡪3’.
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La DNA polimerasi necessita anche di altri enzimi:

❖ Primasi: sintetizza il primer

❖ Elicasi: apre la doppia elica parentale, si muove solo in direzione 5’🡪3’
❖ Ligasi: unisce i diversi segmenti neosintetizzati per ricostruire l’integrità del cromosoma

La DNA polimerasi però non permette la lettura del filamento in direzione 3’🡪5’, perciò il filamento
complementare (filamento lento) viene sintetizzato per brevi segmenti in direzione 5’🡪3’. Tali
segmenti vengono detti frammenti di Okazaki, che vengono poi riuniti dal DNA ligasi.

La DNA primasi crea i primer per dare inizio al processo e successivamente torna indietro
all’origine della forcella per creare un secondo sul filamento in ritardo. La DNA polimerasi continua
ad allungare il filamento guida, mentre sul filamento in ritardo sintetizza DNA dal secondo primer,
in seguito primer vengono rimossi e sostituiti con il DNA. Sul filamento in ritardo la DNA ligasi
forma un legame covalente fra il primo e il secondo frammenti di Okazaki, viene formato un terzo
segmento e il filamento continua ad allungarsi.

Proofreading: processo attraverso cui la DNA polimerasi che sta replicando il DNA rileva

l'appaiamento di un nucleotide scorretto e lo rimuove, per questo si dice che è autocorrettivo.

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 LA SINTESI PROTEICA

La sintesi proteica è il processo che porta alla formazione delle proteine utilizzando le informazioni
contenute nel DNA. Questo processo avviene sia negli eucarioti che nei procarioti, per gli eucarioti
comincia nel nucleo e termina nel citoplasma o nel reticolo endoplasmatico ruvido.

Esistono diversi tipi di RNA, ognuno con una funzione diversa:

❖ mRNA (RNA messaggero): copia i messaggi genetici contenuti nel DNA che consentono di
produrre specifiche proteine. Viene assemblato usando come stampo uno specifico
segmento di DNA il base all’accoppiamento delle basi azotate. Fa da tramite tra nucleo e
citoplasma.
❖ rRNA (RNA ribosomiale): costituisce buona parte dei ribosomi, organuli responsabili della
composizione del filamento proteico.
❖ tRNA (RNA trasportatore): adibito al trasporto di amminoacidi specifici dal citoplasma ai
ribosomi. È un filamento singolo che si ripiega grazie a legami idrogeno e assume una
forma a trifoglio, presenta una tripletta di nucleotidi, detta anticodone, complementare al
codone dell’RNA messaggero.

La sintesi proteica è costituita da due fasi:

● trascrizione: avviene nel nucleo per gli eucarioti e in questa fase si ha passaggio
dell’informazione dal DNA all’RNA messaggero. La doppia elica di una porzione di DNA
viene aperta grazie all’RNA polimerasi e, prendendo come stampo uno dei due filamenti, si
inizia a costruire una molecola complementare di mRNA. RNA messaggero appena formato
sarà una sorta di impronta “in negativo” del genere da cui si è originato e migrerà nei
ribosomi.
● traduzione: ha inizio quando RNA messaggero si attacca al ribosoma. Le informazioni
contenute nell’RNA messaggero vengono utilizzate per formare un polipeptide, ovvero una
proteina, finché non si arriva ad un codone di stop e le sintesi si interrompe.

Il codice genetico è ridondante ovvero ci sono più triplette che codificano lo stesso amminoacido e
inoltre, ci sono le triplette di inizio (AUG) e quelle di stop (UAA, UAG e UGA) che determinano
l’inizio e la fine della sequenza polipeptidica e non corrispondono a nessun amminoacido.

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 DNA RICOMBINANTE

Il DNA ricombinante è un frammento di DNA che può essere modificato e inserito in altre cellule
per essere copiato più volte. Il DNA ricombinante è ottenuto dalla combinazione di materiale
genetico di diversa origine.

Tecniche:

✧ Clonazione Genica
✧ PCR
✧ Sequenziamento del DNA
✧ Libreria Genomina
✧ Ibridazione

Clonazione Genica: nel 1973, con il primo esperimento di clonazione di un segmento genico
inserito nel batterio dell’Escherichia Coli, S. Cohen e H. Boye dimostrarono che è possibile
produrre copie multiple di un determinato gene. La Clonazione serve, quindi, a produrre grandi
quantità di una specifica sequenza di DNA.

I due biochimici individuarono nell’Escherichia Coli,

batterio che vive nell’intestino, due geni, ognuno dei
quali resisteva ad un diverso antibiotico. Questi geni
erano contenuti anche nei plasmidi, frammenti di
DNA a forma di anello che si replicano
indipendentemente dal cromosoma batterico.
Utilizzando specifici enzimi di restrizione, tagliano i
due geni e li uniscono in un nuovo plasmide grazie al
DNA ligasi. Il nuovo plasmide si reinserisce nelle
cellule dell’Escherichia Coli e si può osservare che
questi batteri risultano immuni ad entrambi gli
antibiotici. Si ottiene un nuovo organismo, il cui
patrimonio genetico è modificato.

Gli
enzimi di restrizione sono proteine in grado di tagliare il DNA a livello di sequenze nucleotidiche
ben precise, chiamate siti di restrizione. Solitamente sono prodotti ai batteri per proteggersi dai
virus che li parassitano tagliandone il DNA. Agiscono solo sul DNA estraneo perché “marchiano”
con un gruppo metile (-CH3) la citosina e l’adenina che compongono i siti di restrizione presenti sul
proprio DNA, evitando di autodistruggersi.

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 Un sito di restrizione è una sequenza palindroma di 4, 6 o 8 coppie di basi azotate. La frequenza
dei siti di restrizione non è regolare e dipende dalla loro composizione e dalla loro lunghezza in
coppie di basi (bp) azotate. Più lunghe sono meno frequenti sono. Ogni
volta che un enzima riconosce la propria sequenza palindroma, rompe i legami tra i nucleotidi. Il
taglio può essere netto da cui si originano estremità piatte, ma principalmente si effettua un taglio
sfalsato che forma estremità adesive.

Clonazione molecolare: tecnica che consente di ottenere un elevato numero di copie di una
specifica regione genomica sfruttando un sistema cellulare. Il clonaggio prevede l’inserimento del
DNA oggetto di interesse nel vettore di clonaggio. Il vettore ricombinante ottenuto dovrà essere
introdotto all’interno di una cellula ospite che si moltiplichi velocemente e favorisca la replicazione
del vettore. La trasformazione batterica consiste nell’introdurre il vettore nella parete del batterio.
Una volta all’interno i vettori ricombinanti si duplicano e si moltiplicano, ottenendo grandi
quantità di frammenti specifici di DNA. La trasformazione non è efficace in tutti i batteri, per poter
selezionare solo quelli che contengono il vettore si sceglie un plasmide contenente un gene
resistente all’antibiotico. Esponendo i batteri all’antibiotico, sopravvivranno solo quelli resistenti,
che non è detto siano quelli contenenti il vettore ricombinante. Il vettore, per distinguere le cellule
batteriche trasformate con il vettore ricombinante, deve includere un gene reporter.

Dopo l’esperimento di Cohen e Boyer sono stati sviluppati diversi vettori di clonaggio che devono
possedere particolari caratteristiche:

● Origine di replicazione indipendente (ori) in modo che la duplicazione proceda in maniera

autonoma rispetto al cromosoma ospite
● Gene per la resistenza ad un antibiotico
● Tratto contenente un sito di clonaggio multiplo (polylinker), ovvero una breve sequenza
nucleotidica contenente molti siti di restrizione specifici per i singoli enzimi
● Gene reporter che funziona come marcatore per la selezione delle cellule ospiti che hanno
ricevuto il vettore ricombinante

PCR (Polymerase Chain Reaction): tecnica che consente di riprodurre rapidamente milioni di copie
identiche di una regione di DNA grazie a cicli successivi di duplicazione. Una volta selezionata la
regione da duplicare, bisogna conoscere perfettamente le sequenze che la delimitano, poiché
rappresentano gli “stampi” per la sintesi dei primer, sequenze di 17-30 nucleotidi, complementari
alla regione bersaglio, che ne costituiscono l’inizio su un filamento e la fine sul filamento opposto. I
primer sono progettati in modo che consentano alla DNA polimerasi di aggiungere nucleotidi in
direzione 3’ (la sintesi è quindi in direzione 5’🡪3’). Partendo dai primer, la DNA polimerasi catalizza
l’aggiunta dei singoli nucleotidi sulla base della sequenza complementare che fa da stampo.

La reazione ha luogo in uno strumento detto termociclatore e prevede il susseguirsi di cicli di

amplificazione durante i quali si alternano tre temperatore diverse:
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 ● 94°C: denaturazione della doppia elica del DNA stampo in due singoli filamenti mediante il
riscaldamento
● 50-65°C: appaiamento dei primer alle sequenze di DNA a singola elica localizzate alle
estremità del frammento bersaglio. La temperatura in questa fase varia in base ala
lunghezza e alla composizione del primer
● 60-75°C: estensione dai primer mediante aggiunta di nucleotidi in direzione 5’🡪3’ dalla Taq
polimerasi (efficace a 60°, quindi appaiamento ed estensione avvengono alla stessa
temperatura riducendo i tempi di reazione).

Durante il primo ciclo di PCR, da ogni molecola di DNA presente nel campione originale se ne
ottengono due.

Elettroforesi su gel: metodo che sfrutta le caratteristiche chimiche delle molecole per separarle e
identificarle grazie al loro diverso comportamento sotto l’azione di un campo elettrico.
A pH neutro, i frammenti di DNA sono tutti carichi negativamente a causa dei gruppi fosfato, se
sono sottoposti ad un campo elettrico, si muovono verso l’elettrodo positivo con velocità diverse i
funzione della loro dimensione. I fogli di gel si comportano come un setaccio che rallenta in modo
differenziato le molecole: le più corte sfuggono meglio, mentre le più lunghe sono più trattenute.
A separazione effettuata, i frammenti intrappolati nel gel vengono colorati per renderli visibili ed
eseguire un’analisi comparativa. I gel di agarosio sono semplici da preparare e vengono utilizzati
per analisi di routine del DNA. I gel di poliacrilammide hanno un’elevata risoluzione, ma sono più
complicati da produrre e utilizzare. Ogni individuo possiede la sua impronta genetica:
frammentando il DNA e analizzandolo sul gel di elettroforesi, ognuno di noi può essere identificato
da una specifica combinazione di polimorfismi della lunghezza del frammenti di DNA (RFLP).

Sequenziamento del DNA: nel 1975 Frederick Sanger elaborò il metodo di Sanger, grazie al quale è
possibile determinare la sequenza nucleotidica di un segmento di DNA. Viene isolato un
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 frammento di DNA a singolo filamento di cui si vuole determinare la
sequenza delle basi. Ogni ddNTP è legato ad un diverso colorante
fluorescente. Al DNA di cui si vuole determinare la sequenza viene
aggiunto un primer, la DNA polimerasi, i dNTP e i ddNTP fluorescenti:
inizia la sintesi. Si ottengono una serie di filamenti di lunghezza
differente, ognuno dei quali termina con un ddNTP. I frammenti
vengono separati mediante elettroforesi. Ogni frammento emette
fluorescenza di un colore che identifica il ddNTP che ne ha determinato l’arresto della sintesi. Il
colore all’estremità viene rivelato per mezzo di un raggio laser. La
sequenza di DNA può essere dedotta in base ai colori di ciascun
frammento di DNA neo sintetizzato e convertita nella sequenza
complementare del filamento stampo.

Librerie genomiche: collezione di segmenti di DNA provenienti dal genoma di un organismo,

ospitati in vettori ricombinanti all’interno di cellule batteriche. Rappresentano il materiale su cui
realizzare le reazioni di sequenziamento di genomi di grandi dimensioni, dopo questo vengono
uniti nell’ordine corretto per costituire il genoma iniziale. Viene utilizzato il metodo shotgun (=
colpo di pistola) perché come un proiettile frammenta ciò che colpisce. Il genoma, viene quindi
frammentato per poi poterne ricostruire la sequenza.

Identificazione di un gene: per identificare un gene si effettua lo screening attraverso un processo

che può realizzarsi attraverso:

● PCR
● Ibridazione con una sonda di acidi nucleici

In entrambi i casi la genoteca deve essere diluito e poi fatto crescere su delle piastre. Nel caso
della PCR bisogna conoscere una parte della sequenza del gene di interesse in base alla quale
costruire il primer.
Il secondo metodo di screening è una tecnica utilizzata per localizzare un segmento di DNA in un
cromosoma. Per lo screening a ibridazione c’è bisogno di una sonda, molecola di acido nucleico
complementare alla sequenza di interesse marcata con traccianti chimici o radioattivi, quando

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questa incontra molecole di DNA complementari, si appaia evidenziandole. La sonda si può
ottenere:

● Dalla sequenza del gene di interesse

● Dalla sequenza di un gene omologo di un’altra specie
● Partendo dalla proteina e risalendo alla sequenza nucleotidica

Per procedere con l’ibridazione i cloni della genoteca diluita devono essere trasferiti su una
membrana di nitrocellulosa (filtro), questa viene trattata in modo da rompere le cellule batteriche
ed esporre il DNA. Il filtro viene messo a contatto con la sonda che si legherà alle sequenze
complementari (ibridazione).

Progetto Genoma Umano: frammentando il DNA con enzimi di restrizione si ottengono segmenti
che possono essere separati (tramite elettroforesi), clonati, sequenziati e conservati in banche dati
informatizzate. Il Progetto Genoma Umano ha permesso di mappare l’intero genoma dell’uomo.