BIOLOGIA MOLECOLARE E BIODIVERSITA’

GENETICA VEGETALE

(Ripassone)
(Esperimento di Frederick Griffith nel 1928 sull’elemento
trasformante e di scoperta che esso era il DNA).
Direzionalità del DNA: 5' -> 3'
Ciò vuol dire che l’ossigeno attaccato all’estremità del
gruppo fosfato dell’estremità 5’ si attacca attraverso
legame fosfodiesterico al terzo carbonio del
deossiribosio successivo.
(Franklin e Wilkins producono l’immagine del DNA con i
raggi X ma sono Watson e Crick a dare una spiegazione
della stessa.)
L’immagine della Franklin rappresenta quindi si scopre
una croce di malta, la quale viene rappresentata nel
momento in cui la luce colpisce delle linee inclinate,
(come è in un’elica fatta da uno o più filamenti).
Si è quindi giunti alla conclusione che il DNA ha struttura
elicoidale.
Le due eliche sono sfasate per tre ottavi di giro d’elica
con periodicità di 3,4 nm.
Non è inoltre una striscia, ma ha una struttura granulare
L’elica può avere tre tipi di conformazione: A, B e Z.
A e B sono destrorse e mentre la prima è sottile e
allungata (più frequenta con bassa [H2O] e con DNA più
concentrato, molto simile a dsDNA) la seconda è larga e
corta (più probabile in soluzione diluita). Z è sinistrorsa e
avviene ad alte concentrazioni di Na+.
Il DNA è composto da uno zucchero, una base azotata
(di quattro possibili) e un gruppo fosfato.
Le basi azotate sono Purine (Adenina e Guanina) o
pirimidine (Citosina e Timina).
Questa composizione crea una struttura chiamata
nucleotide.
5' - A T G T C A - 3'
3' - T A C A G T - 5'
il DNA sta insieme grazie a ponti idrogeno, che sono
legami deboli. tra A e T due ponti idrogeno e tra C e G 3
legami idrogeno. le interazioni deboli sono importanti
perché permettono al DNA di stare insieme ma anche di
separarsi.
I geni sono sempre scritti con un + o un - perché sono
presenti su entrambi i filamenti, sia sul filamento + che
sul filamento - in modo casuale. il 50% dei geni è
trascritto a partire dal + e l'altro 50% a partire dal meno.
una stessa sequenza può addirittura codificare per due
geni diversi in base alla direzione in cui viene trascritto;
trascritti sempre in direzione 5'-3'
Quando i due filamenti si separano -> denaturazione,
dato che sono deboli i legami è facile che i legami si
ricostruisce, facilmente si rinatura
Scaldando il DNA si denatura facilmente -> dal fatto che
sia così facile si è capito che è proprio così che si
replica il DNA, separando i due filamenti, che sono
complementari.
Poiché la DNA polimerasi è in grado di sintetizzare in
direzione 5'-3' quindi utilizza il filamento-pirofosfatasi si
forma durante la replicazione, è tossico e viene
trasformato in fosfato libero da alcuni enzimi
Replicazione semiconservativa, un'elica vecchia e
un'elica nuova.
Denaturazione: scaldando a poco meno di 100 °C
oppure a pH elevato (intorno a 10), per aumentare il pH
usiamo idrossido di sodio (NaOH), è un processo
reversibile a temperatura ambiente, si rinatura se lo
faccio lentamente, se invece metto la provetta a 100°
direttamente in ghiaccio (Shock termico freddo) il DNA
non si rinatura ma si arrotola su sé stesso. Questo
perché è progressiva, va in ordine.
Il DNA è una molecola chimica, chimicamente non è
diverso in base alle specie, cambia la complessità
(numero di basi) e la sequenza di basi.
Ibridazione: la possibilità di rinaturare filamenti di DNA
complementari denaturati permetta la formazione di
molecole ibride artificiali semplicemente abbassando la
temperatura di una miscela di DNA denaturato
proveniente da fonti diverse. Allo stesso modo possiamo
formare ibridi mescolando filamenti complementari di
DNA e RNA. Funziona anche con una mutazione.
Primi esperimenti negli anni 50 monitorando
l'assorbimento di raggi ultravioletti da parte di una
soluzione di DNA, il DNA assorbe i raggi ultravioletti,
massimo a 260 nm. si misura con lo spettrofotometro.
calcolando quanta luce passa dall'altra parte dello
spettrofotometro posso misurare la massa che ho
dentro,
A = E (coefficiente assorbimento molare dipende dal
composto) x L (lunghezza frammento) x C
(concentrazione)
Oggi abbiamo il nanodrop: pinzetta in cui metto 1
microlitro e dà la misura in modo istantaneo.
I primi strumenti dicevano che quando la temperatura di
una soluzione raggiunge i 100 gradi, l'assorbanza del
DNA aumenta in maniera esponenziale per poi
stabilizzarsi. Aumenta quando il DNA inizia a
denaturarsi. a mano a mano che il DNA si apre le
molecole assorbono di più, singoli filamenti assorbono di
più-> temperatura melting: metà delle molecole
denaturate. (melt = fondere).
La Tm dipende da:
- composizione in basi del DNA, doppi legami sono piu
facili da rompere, quanto piu è alta la percentuale di G-C
e la concentrazione salina tanto più cresce la Tm.
Tm = 2(A+T) + 4(C+G) solo in un filamento
- concentrazione salina del composto

STRUTTURA TOPOLOGICA DNA

il DNA si può trovare in tre forme:
- forma circolare, molecola chiusa con legami covalenti
come nei plasmidi nei batteri. Può essere superavvolta,
ripiegandosi attorno ad un asse. superavvolgimento a
spirale o a toroide (nei cromosomi, DNA avvolto intorno
a proteine)
- forma lineare: a singolo filamento, nel caso di molecola
covalentemente chiusa le due eliche si separano in
alcuni punti e liberano due singolo eliche, avviene molto
spesso. l'energia della forma superavvolta è quella che
lo fa dividere formando pezzi a singolo filamento
DNA circolare covalentemente chiuso (cccDNA) viene
considerato una struttura topologicamente vincolata
Linking number: numero di volte che un filamento deve
passare attraverso l'altro per essere svolto. ci sono
enzimi che lo possono cambiare.
LK = Tw (twist) + W (writhe)
Twist: numero di volte che un filamento si gira attorno
all’altro.
Writhe: avvolgimento lungo l'asse longitudinale,
avvolgimento sinistrorso (negativo) o destrorso. esiste il
Writhe legato alla toroide, quando il DNA si avvolge
sulle proteine (a formare nucleosoma).
cambia il LK se l'avvolgimento è positivo o negativo, se
l'avvolgimento tra le eliche è opposto a quello
dell'avvolgimento su sé stesso.
Il DNA è normalmente superavvolto negativamente, in
quanto questa conformazione gli permette di
immagazzinare energia libera. Inoltre, nei punti di
superavvolgimento negativo si ha la tendenza a
disavvolgersi localmente, ciò aiuta la denaturazione e la
trascrizione del DNA.

Enzimi che cambiano stadio topologico del DNA lo

fanno per districare i "nodi", la topoisomerasi 2 (agisce
tagliando i filamenti) taglia e riattacca l'elica dove ci
sono dei nodi cambia il segno del Writhe! la
topoisomerasi 1 (taglia un filamento solo) taglia un
filamento e può ricucirlo dall'altra parte, cambia il linking
number perché aumenta di 1 il twist
le topoisomerasi sono nucleasi perché tagliano acidi
nucleici e sono in grado di ricucirli.
possono concatenare o deconcatenare
Su gel di agarosio, la stessa molecola può presentarsi in
4 topoisomeri, con linking number differente
non si può misurare la dimensione di un plasmide
circolare perché ha troppe topoforme, bisogna
linearizzarlo con degli enzimi di restrizione
bromuro di etidio: marcatore colorante fluorescente che
si utilizza per studiare il DNA, fissandolo su gel. è una
sostanza mutagena tossica, oggi non si utilizza più, si
usa il gel red. Il bromuro di etidio è utile per lo ione +
etidio che è una molecola fluorescente, se eccitata ad
una certa lunghezza d'onda emette una luce visibile, a
lunghezza d'onda superiore noi vediamo il DNA colorato
di rosso purpureo. il bromuro di etidio si intercala al
DNA, quando il DNA è avvolto vediamo tanto rosso
vicino. Bromuro crea una struttura artefatta, causa
srotolamento della doppia elica di 26°, non da fastidio
ma da considerare per purificazione da gel.
RNA

Acido ossiribonucleico: legami per condensazione di un

H2O.
in posizione abbiamo un OH, differenza con il DNA
non timina ma uracile.
Deamminazione spontanea: citosina perde gruppo
amminico e diventa uracile.
A volte la citosina va incontra a deamminazione
spontanea e si trasforma in uracile, ma il DNA ha modi
per riparare questa cosa.
L'RNA si trova normalmente in una singola catena
polinucleotidica, non esiste il suo complementare, è
infrequente che si accoppi a formare doppia elica
Funzioni dell'RNA:
- intermediaria: molecole di RNA messaggero che
trasferiscono info dal genoma alla serie di sintesi del
genoma
- raccordo: tRNA che è in grado di portarsi dietro gli
amminoacidi
- strutturale, una delle piu rappresentate, presente nei
ribosomi
- regolatoria: grazie alla complementarità può legare altri
RNA e interferire con la loro sintesi (miRNA e siRNA).
Spesso sequenza di un gene e spesso si trova piu
avanti il contrario dello stesso gene, quelle sequenze a
occhio sono sequenze regolatorie, regolano la quantità
di trascritto prodotta
- enzimatica: in grado di fare delle reazioni enzimatiche,
alcune di queste sono quelle presenti all'interno della
traduzione
Topologia: lineare a singola elica(mRNA), ripiegato a
singola elica(tRNA) a croce, elica di tipo A.
Strutture che si possono formare del t RNA:
- anse interne, quando le basi con corrispondono del
tutto all'altro filamento
- gemme
- biforcazione

PROTEINE
Struttura chimica: polimeri i cui monomeri sono gli
amminoacidi, che sono le unità base delle proteine.
gli amminoacidi sono strutture ripetute: C legato ad un
gruppo amminico, un gruppo carbossilico e un gruppo
R, radicale variabile. R può essere un atomo di
idrogeno, un anello benzenico, ...
possono essere:
- neutri non polari:
- neutri polari
- acidi: nel radicale R hanno acidi carbossilici
- basici
Legame peptidico: tipo particolare di legame amminico,
lega tra loro gli amminoacidi, con perdita di una
molecola di acqua.
Gli amminoacidi possono creare una catena
polipeptidica lineare (non ramificata), il legame peptidico
ha scarsa capacità torsionale.
Glicina: unico amminoacido non chirale, per ogni
amminoacido può avere forma L (in natura) o D
Prolina: forma un anello su sé stesso, un pezzo
angolare, permette di fare un angolo nelle proteine,
importante perché da forma alla proteina, ma non le
permette di partecipare a strutture secondarie.

Cisteina: ha un gruppo SH, che si può trovare in forma

ridotto all'interno delle cellule, oppure all'esterno della
cellula si trova in forma complessati con altri SH a
formare SS, ponte disolfuro, che è un legame covalente
forte. Le cisteine sono molto importanti quando ossidate
a formare i ponti di solfuro perché avendo un legame
covalente in più la proteina è più stabile.

Quattro livelli di strutture, di livello di complessità

- struttura primaria: sequenza degli amminoacidi, che
forma una catena monodimensionale in successione di
legami chimici.
- struttura secondaria: ripiegatura della proteina a
formare alfa-elica (con legami idrogeno distanti quattro
posizioni le une dalle altre) o beta-foglietto nelle quali i
gruppi carbossilici spuntano fuori e ci sono ponti
idrogeno tra atomi di due filamenti adiacenti.
I beta strand possono avere direzioni parallele o
antiparalleli (spesso sono misti).
- struttura terziaria: ripiegamento della struttura
secondaria assieme alla formazione di loops (meno
regolari).
- struttura quaternaria: proteine formate da molte altre
proteine composte a loro volta da più catene
amminoacidiche. Possiamo definire quando c’è un
numero definito di subunità o casi in cui ci sono più
subunità diverse.

Ripiegamento = folding
Quando la proteina si ripiega si forma una parte esterna
e una interna questo definisce gli amminoacidi come
immersi nell’ambiente o esposti.
Se la catena è troppo corta non si nascondono a dovere
i legami idrofobici e quindi la struttura è instabile.
Se la catena è troppo lunga probabilmente presenta
errori e per questo una conformazione proteica stabile è
lunga dai 50 ai 300 amminoacidi.

La sequenza della proteina da anche la forma, in certe

condizioni ambientali una data proteina si ripiegherà
sempre allo stesso modo, è caratteristica di ogni
proteina. Esperimento di Anfinse: in laboratorio se
trattate con alcune sostanze denaturanti e poi riducenti
non si ripiegano come al solito e non sono funzionali.
Come studiamo il folding della proteina? si produce
proteina, si cristallizza, raggi uv e modelli della proteina.
oggi si riesce a ricavare la forma della proteina grazie ad
un'intelligenza artificiale, la quale predice con alta
probabilità quella che è la struttura della proteina (alfa
fold).

Proteine: in formato fasta = segno maggiore e poi tutta

la sequenza primaria.
La proteina ha una struttura 3D che dipende
dall'ambiente in cui si trova, considerando anche la
presenza di substrato, che può cambiare la struttura
ternaria e quaternaria, ma assumerà sempre e
comunque quella con il livello di energia più basso.
Quando il glucosio si trova nella tasca dell’enzima
esochinasi vi è un cambio conformazionale della
proteina, segue una reazione catalitica per degradare il
substrato (in questo caso il glucosio).

Proteina CAS9 è molto importante, è una nucleasi

presente i n moltissimi batteri, enzima di difesa dei
batteri nei confronti dei virus, il batterio immagazzina
pezzi del genoma batterico, l'enzima CAS prende questi
pezzi e vengono usati in caso di nuova infezione per
legare al virus, è come un "sistema immunitario",
sistema di riconoscimento di sequenze esogene (Nobel
nel 2020). È una tecnologia che permette di modificare
sequenze di DNA in molto molto rapido e preciso. La
proteina non è statica ma è sempre dinamica, cambia
l'effetto finale.
Se modifichiamo uno o più amminoacidi in posizioni
chiave, la proteina cambierà il proprio prodotto.
DND1: se viene rotto (knock out) la pianta, non muore a
causa del patogeno, da resistenza a questi mutanti ma
sono piante che rimangono nane. Con CRISPR hanno
trovato un mutante con due mutazioni, non è nano.
Non è un monomero ma ha quattro monomeri uguali.
Anche un solo amminoacido cambiato, si può
determinare una mutazione di conformazione ad alto
impatto.
Le proteine hanno la capacità di legare siti specifici,
sono in grado di legare porzioni di DNA in determinate
sequenze:

GCN4: fattore trascrizionale di lievito, struttura terziaria

e quaternaria che non esistono quando la proteina non è
associata al DNA, solo in presenza di DNA si formano
due eliche.
I fattori trascrizionale promuovono il legame della DNA
polimerasi al DNA, promuovono la trascrizione,
riconoscono dei pattern che si trovano sul DNA.

Repressore del batteriofago lambda, è un virus dei

batteri che li mangia, è un dimero simmetrico e ogni
proteina è fatta a partire dal gene ripetuto, con 6 domini
ripetuti, una subunità è fatta da 5 alfa eliche, i domini
che formano le eliche sono due: un dominio di
dimerizzazione e uno di legame al DNA. Il dominio che
lega il DNA si chiama HTH, dominio che si mette dentro
il solco maggiore del DNA, l'altra elica fa da
collegamento tramite ponti idrogeno.
I legami che fanno legare i domini al DNA sono legami
deboli a idrogeno, sono molto dinamici perché
facilmente rompibili.
Esistono dei temi ricorrenti delle proteine, quando si
formano fattori trascrizionali che polimerizzano le eliche
sono in grado di andare a coprire i solchi uno dopo
l'altro. Ad esempio, il repressore si ferma intorno al DNA
e impedisce alla DNA polimerasi di andare avanti.

Zinc finger domain protein: fatto da un'alfa elica e due

foglietti beta il dominio può ospitare uno ione zinco,
dominio lungo 30 amminoacidi, si trova sempre insieme
ad altri. Lo ione zinco determina la compattezza.
Le proteine per avere degli ioni complessati all'interno
devono avere degli amminoacidi in posizioni chiave, due
cisteine e due alternative al ponte disolfuro. Posizione di
contatto con il DNA sono -1, 2, 3, 6.
Quando le Zinc finger si legano al DNA un’elica si
posiziona sul solco maggiore, un dito di zinco copre 3
paia di basi, se ci sono tre dita di zinco si coprono circa
10 paia di basi.

Fattore enhancer dei linfociti 1 (LEF-1): fattore

trascrizionale con 3 alfa eliche e fa una cosa particolare,
si inserisce all'interno del DNA in porzioni non polari e
riesce a cambiare la curvatura del DNA, lo fa arrivare ad
avere un angolo di 90°.Proteina architettonica, questo
serve per mettere in comunicazione delle regioni che
normalmente non sono a contatto, normalmente sono
regioni che quando entrano in contatto determinano
inizio della trascrizione.

Fattore bHLH (basic helix loop helix): è in grado di

determinare l'inizio della trascrizione, lega una certa
porzione a monte di un gene e determinare l'inizio
trascrizionale.
{Esperimento sul mandorlo: studiato dal punto di vista
dell'addomesticazione, ovvero la differenza tra il
mandorlo selvatico e quello addomesticato, la differenza
è la produzione da parte del mandorlo selvatico di una
sostanza tossica, cianuro. Per quello addomesticato
sono stati eliminati alcuni geni. Nella mandorla amara un
gene è sovraespresso mentre in quella dolce,
addomesticata, il gene non è espresso. Tra i due tipi di
mandorle c'è un amminoacido diverso nella stessa
posizione!!}
Le proteine interagiscono tra di loro, le proteine
riconoscono altre proteine. le interazioni proteina-
proteina tendono a essere ancor più complementari
delle interazioni proteina-DNA.
Riconoscimento tra proteine può dipendere:
- dall'associazione delle superfici di due subunità già
ripiegate, come avviene nella formazione del tetramero
dell'emoglobina
- dal ripiegamento coordinato di due catene
polipeptidiche, come avviene nella dimerizzazione di
GCN4
- dall'adesione di un segmento partner non strutturato a
una superficie di riconoscimento di una proteina già
ripiegata.
Proteine riconoscono molecole di RNA U1A interagisce
con il piccolo RNA nucleare (snRNA) U1 per coadiuvare
il processo di splicing.

ENZIMI: sono proteine che hanno la funzione di

catalizzare delle reazioni biochimiche, tutte tranne quelle
spontanee
il catalizzatore entra all'interno della reazione, abbassa
l'energia libera e rende possibile la reazione senza
consumarsi, rende una reazione, che
termodinamicamente non avverrebbe, possibile.

DNA RICOMBINANTE

Utilizza tutta una serie di tecniche, clonazione/clonaggio.

significa che prende un frammento genico e la inserisce
all'interno di molecole di DNA per creare delle molecole
genomiche con il fine ultimo di ricavare la stessa
molecola moltissime volte. Bisogna poi estrarre il
frammento voluto per poterlo sequenziare, studiare, ...
Tecniche di estrazione del DNA:
preparazione del campione, ad esempio foglie: si
prende la foglia, si mette nel mortaio e si macerano i
tessuti, a freddo, con azoto liquido, in modo che la foglia
si dura e si ricava polvere, spaccare la foglia molto
bene. Lisi cellulare che fa uscire il DNA, normalmente
questa lisi si usano dei detergenti (sapone), che
sciolgono il doppio strato lipidico. A questo punto si ha
un mischione di tutto il contenuto cellulare, andiamo ad
eliminare le proteine usando soluzioni (fenolo), fase
polare e fase apolare (in cui ci sono grassi e altri), in
mezzo ci sono le proteine, che sono fatte da
amminoacidi, possono avere sia carica positiva che
carica negativa, per questo stanno in mezzo. Con
pipetta prendiamo parte acquosa e DNA. Abbiamo una
soluzione ricca di acidi nucleici che legano cationi (sali
di ammonio) con DNA, poi si aggiunge alcol. Abbiamo
quindi estratto gli acidi nucleici, il campione è ancora
sporco, per estrarre solo il DNA si una RNAsi, enzima
che separa.
Per staccare il DNA secco dal filtro si usa acqua con
forza ionica per staccarlo, pH 6/6,5. Tutto questo costa
molto per la quantità di DNA estratto.

TECNICHE RESTRIZIONE E LIGAZIONE

Restrizione: digestione enzimatica usando endonucleasi
digestione
Ligazione: legare con enzimi ligasi
Endonucleasi di restrizione tagliano riconoscendo delle
specifiche sequenze, che sono sequenze palindromiche.
ci sono poi enzimi in grado di rincollare le sequenze.
Enzimi di restrizione: esistono in natura, all'interno di
sistemi batterici, scoperti alla fine degli anni '60 e sono
in grado di degradare particolari frammenti di DNA
Endonucleasi: riconoscono sequenze specifiche di un
DNA estranee e le tagliano all'interno del sito, sono
specifiche e tagliano solo quella sequenza a meno che
non vengano cambiate le condizioni ambientali
Esonucleasi: non sono specifiche ma generiche,
tagliano qualsiasi DNA a partire dalle estremità, lo
distrugge tutto forando nucleotidi.
Si usano quasi sempre le endonucleasi tranne quando
vogliamo mantenere solo le componenti di RNA
tantissimi tipi di endonucleasi, chiamate in modo molto
standard: dipende dal batterio da cui sono stati ricavati
Hind III: H è la prima lettera del genere del batterio, 2
lettere della specie (in), una lettera (non sempre
presente) che richiama il ceppo (d), numero che
rappresenta quando è stato scoperto (III).
Gli enzimi di restrizione riconoscono sequenze diverse
per ogni enzima, possono riconoscere sequenze da 4,
6, 8, 30 coppie di basi, piu la sequenza che riconoscono
è lunga, meno è probabile che trovino quella sequenza.
In base al nostro scopo scegliamo un enzima diverso.
EcoRI funziona a temperatura corporea, 37 °C
Il taglio può essere simmetrico o asimmetrico, rispetto
alla sequenza riconosciuta.
Possiamo piu o meno sapere quanti tagli fa un enzima
in un frammento in base alla lunghezza del frammento e
della sequenza riconosciuta. (4 elevato al numero di
basi scelte)
Isoschizomeri: enzimi che riconoscono la stessa
sequenza di DNA, ma la tagliano in modo diverso molto
utili nel clonaggio dei geni

Estremità appiccicose: possono attaccarsi ad altri pezzi

uguali di un altro frammento quando il taglio non è
simmetrico.

Estremità blunt: quando i tagli sono netti le estremità

non sono sporgenti, si riassociano insieme con
maggiore difficoltà posso fornire tanto DNA per
aumentare le probabilità oppure aumentare la
temperatura per aumentare il movimento.

Sistema RM: restrizione e metilazione, ogni enzima ha

gene per restrizione e per metilazione dello stesso sito
di azione.

DNA LIGASI: due molecole di DNA possono essere

legate covalentemente se:
- hanno estremità -OH (al 3') e un gruppo fosfato libero
(al 5')
- è presente l'enzima DNA ligasi
- è presente ATP
VETTORI: funzionano da trasportatori di DNA e
possono essere moltiplicati per produrre molte copie del
DNA di interesse.
Plasmidi: i primi erano del tipo pBR, oggi sono della
serie pUC, simili agli altri ma quelli di una volta erano più
grandi e più difficili da manipolare, oggi piu piccoli del
40%.
Ai batteri i plasmidi servivano per portare dei geni,
codificano per proteine che solitamente portano geni di
resistenza ad antibiotici. Molecole utili per resistere
nell'ambiente, sono molto facili da passare da un
batterio ad un altro. Inoltre, i plasmidi hanno un’origine
di replicazione, quelli da laboratori sono stati lavorati per
essere facili da utilizzare, hanno inserito tanti siti di
restrizione unici, sono siti di clonaggio multiplo.
Polylinker: creato dall'uomo, in cui ci sono siti di
riconoscimento per enzimi che tagliano solo lì.

TRASFORMAZIONE BATTERICA: metodo classico che

prevede di incubare le cellule batteriche in una
soluzione salina concentrata di calcio la soluzione rende
permeabile le membrane cellulari al passaggio di DNA
plasmidico. Altri metodi usano un elevato voltaggio per
guidare il DNA dentro le cellule in un processo chiamato
elettroporazione.
Il DNA inserito nel vettore può essere introdotto negli
organismi ospiti mediante trasformazione. La
trasformazione è il processo mediante il quale un
organismo ospite può catturare del DNA dall'ambiente.
Alcuni batteri, ma non E. coli, sono in grado di compiere
questa operazione in modo naturale, e perciò si dice che
sono dotati di competenza genetica.
E. coli può essere reso competente, però, tramite un
trattamento con ioni calcio. Sebbene il meccanismo con
cui il DNA viene catturato non sia noto, è verosimile che
gli ioni Ca++ schermino le cariche negative del DNA,
permettendogli di passare attraverso la membrana
cellulare. Si dice pertanto che le cellule trattate con
calcio sono competenti per la trasformazione.
Si parte sempre da batteri resi competenti e sensibili ad
antibiotici. Al mezzo di coltura viene aggiunto un
antibiotico, la cui resistenza è codificata dal plasmide,
per selezionare le cellule che hanno ricevuto il plasmide
queste cellule sono dette trasformanti. Le cellule che
ospitano il plasmide saranno in grado di crescere in
presenza dell'antibiotico, mentre quelle prive di plasmide
no.
La trasformazione è un processo inefficiente in E. coli,
solo una piccola percentuale delle cellule recepisce,
l’efficienza di trasformazione è espressa come CFU/ug
DNA.
Un esperimento per creare un plasmide resistente sia a
tetraciclina che ad ampicillina è quello di tagliare sia un
plasmide che l’altro con gli stessi enzimi di restrizione e
quindi fare si che i due plasmidi con le estremità
complementari si unissero e combinassero le due
resistenze. I siti di restrizione possono tagliare anche i
siti di resistenza, interrompendone così il
funzionamento.

pUC e betagalatosidasi con colorante e XGAL che si

colora di blu se il plasmide presente nella cellula non è
trasformato e quindi non passa il gene che codifica per
la repressione dell’enzima BetaGal.

Per clonaggio direzionale si intende l’inserimento di un

gene esogeno all’interno di un vettore di trasmissione
genica per la produzione di una proteina da parte di un
batterio.
Per TA cloning si intende l’aggiunta di code TA ai
frammenti amplificati con PCR per rendere sticky hands
i tagli blunt.
Per clonaggio Golden gate si intende il metodo che
assembla in successione e in un unico passaggio diversi
frammenti di DNA attraverso l’utilizzo di endonucleasi di
tipo IIS che tagliano il DNA in corrispondenza di una
distanza definita rispetto al loro sito di riconoscimento.

I fagi come vettori: sono molto più efficienti rispetto ai

plasmidi per infettare le cellule, Utilizzando vettori fagici
non parliamo di cloni, ma di placche riferendoci alla
concentrazione di cellule morte in una zona.

Ciclo lisogenico: il virus si fissa sulla cellula e inietta il

materiale genetico all'interno, il quale si chiude a cerchio
e diventa parte del genoma batterico, il batterio se lo
porta avanti e replicandosi si replica anche il pezzo del
genoma virale. il batterio continua la sua vita e non se
ne accorge.

Ciclo litico: il genoma virale si ciclizza, torna a fare il

genoma virale, codifica solo per le proteine del virus e
comincia a farsi trascrivere i suoi geni e si creano
porzioni vuote di capside virale e filamenti, si formano le
strutture base del virus dentro alla cellula batterica, se fa
replicare e introduce i filamenti genomici nei fagi, la
cellula poi muore e scoppia liberando i nuovi fagi.

Ci sono geni che codificano per la testa, altri per la

coda, e altri per le funzioni litiche. si è scoperto che
esiste anche una regione, chiamata regione
rimpiazzabile, che, che ci sia o non ci sia, il virus vive
comunque, se non c'è o se è troppo piccola il virus non
funziona, può essere sostituito con qualsiasi pezzo di
genoma e il virus funziona, si possono mettere dei pezzi
di interesse. questo pezzo è di circa 20 kb.
Libreria per FAGO LAMBDA:
mi serve il DNA ricombinante (copiato più volte, nella
regione rimpiazzabile diversi pezzi) ed elementi
necessari per l'impaccamento di lambda. Si creano fagi
infettati e si mettono le cellule infettate su una piastra, si
formano delle placche.
Le copie con regione rimpiazzabile diverse si fanno
grazie all'enzima EcoRI che taglia le regioni
rimpiazzabili.
Una libreria genomica contiene tutti i geni o i frammenti
genici di una determinata specie, dato che una placca
ha tutte molecole di uno stesso tipo, ogni placca
rappresenta un genoma. Quanti fagi servono per
rappresentare un intero genoma? dipende dalla
lunghezza del genoma che ci interessa.
Come si analizzano le librerie? come si trova un gene
che voglio? Una volta si utilizzavano dei marcatori
molecolari, si partiva da una proteina nota (emoglobina),
si prendeva un filtro di nylon e si appoggiava sulle
placche, i fogli di nylon sono carichi + e attirano il DNA,
poi si lavano via i pezzi di cellule morte e rimangono
solo i pezzi di DNA, rimangono filamenti a singoli
filamenti pronti a ospitare ibridazione, si mette sonda per
meta globina. Ai raggi uv si vedrà luce se c'è il gene che
a noi interessa. Con lastra da fotografia sul filtro ci
saranno dei puntini che si accendono, dove ci sono dei
cloni positivi, la luce si accende dove c'è la meta
globina.

COSMIDI: sono progettati per clonazione di frammenti di

grandi DNA si aumenta sempre di più la grandezza del
genoma di sostituzione per usare meno vettori.
I cosmidi posseggono siti cos, estremità coesive di DNA
fagico utili all’impacchettamento nel capside fagico.
Praticamente tutte le componenti fagiche sono state
rimosse quindi si possono inserire frammenti di DNA
anche molto grandi.
Phagemids: fasmidi (plasmidi + fagi), assomiglia ai
plasmidi moderni, ma ha replicazione fago F1 e questo
permette il recupero di DNA a singolo filamento assieme
a due promotori per RNA polimerasi ad ogni lato
dell’MCS, e ad un MCS.

Vettori eucariotici a largo inserto BAC e YAC. Ad oggi

facciamo librerie liquide e che mettiamo all’interno di
sequenziatori automatici che riducono tempi e costi.

Cloning single gene: clonazione di un singolo gene

d'interesse. Dato un genoma si può amplificare il
genoma con PCR, ottengo tutte colonie identiche tra
loro, poi solito passaggio con ligasi e vettore.

Library construction: copia di TUTTI i geni genoteca,

raccolta di tanti frammenti genici (e non genici), si può
fare lo screening delle singole colonie

Library construction + NGS tutti questi con un singolo

enzima di restrizione, il frammento si potrà inserire in
entrambi i versi, testa coda o coda testa
Esiste un modo per fare clonaggio direzionale, usano
più di un enzima, in questo modo il gene può entrare in
una singola direzione, ovvero impedisco colonie blu, self
selection (quando il genoma si racchiude su sé stesso),
con due estremità differenti queste non si possono
attaccare. Viene usato questo metodo anche per motivo
legato ai vettori di espressione

Lo 0,5/1 % del genoma è codificante. Quindi la maggior

parte delle placche ha filamenti non codificanti.
Il cDNA sono invece sequenze trascrittomiche ovvero
solo di quelle sequenze che codificano per un gene. Di
norma una specie vegetale possiede circa 30k geni.

Una libreria di cDNA non è univoca, a seconda del

tessuto che abbiamo preso per fare l’estrazione del
DNA. Una libreria di cDNA quindi non è univoca, ma
rappresenta quante più possibili sequenze di RNA di un
dato tessuto ad un dato tempo.

Enzimi necessari sono: la retrotrascrittasi (bisogno di

primer per iniziare la sintesi), normalmente serve una
coda di polyA per avere dei primer per RT
(retrotrascrittasi dei virus), Ribonucleasi H (noi siamo
pieni soprattutto nelle mani), TTT (Trailing Terminal
Trasferasi): che crea sticky ends a partire da code fatte
di poliC.

Scelta del vettore normalmente si usano i plasmidi,

RNAseH (librerie liquide).

La RT ha bisogno di un primer per iniziare la sintesi ed è

per questo che utilizziamo la TTT che crea code di poli T
che funzionano da primer per essa. A questo punto
abbiamo bisogno della ribonucleasi H che degrada
parzialmente l’mRNA i quali frammenti verranno utilizzati
dalla DNA polimerasi come primer per creare frammenti
ibridi RNA-DNA. La RT può inoltre finire con un oligodiG
a fine corsa.

Se un cDNA non è completo ma presenta delle parti

mancanti posso provare a isolare la sequenza mancante
con la tecnica RACE.

Metodologia RACE 3’, se devo amplificare un ulteriore

frammento dal 3' si può usare una coda di polyA. Quindi
costruirò un primer che si attacca alla coda di polyA e
l'altra in base al mio gene specifico di mRNA alla quale
poi la RT si andrà ad attaccare e quindi andrà a
ricostituire il frammento che andrà dunque incontro a
PCR.
Nested PCR è questo procedimento seguito da un'altra
PCR con primer più interni e che ci permettono di
amplificare il frammento desiderato.
RACE 5' si usa un procedimento simile, si usano delle
terminal trasferasi per aggiungere polyA all'inizio e si
costruisce un primer specifico per l'altra sequenza. Il
frammento di polyA si aggiunge dopo che la RT ha fatto
il suo lavoro. Di nuovo eseguo una Nested PCR e uso
primer più interni, e così analizzo il frammento
d'interesse
Ad oggi si applicano ancora vettori di espressione per
produrre proteine di interesse terapeutico, proteine di
interesse commerciale, vaccini, enzimi di restrizione e
reagenti.
Possiamo usare delle proteine per dire ai batteri di
produrre proteine nel substrato e non dentro di loro in
modo che sia più facile estrarla.
Possiamo poi produrre delle proteine di fusione.
Regione di legame al ribosoma, Regione di Shine
Dalgarno che è attaccata al promotore e se non vi è non
si attacca al ribosoma, questo perché la sezione è
complementare al 3’ del rRNA 30S dei batteri, dopo di
essa deve essere presente la tripletta d’inizio AUG.
Un gene batterico dentro un batterio sarà molto più
efficiente rispetto ad un gene umano o vegetale.
Questo perché l’uomo e i batteri usano per gli stessi
amminoacidi diverse triplette che li codificano.
Essendo i tRNA specifici i ribosomi devono smezzarsi
quelli che utilizzano quella tripletta per riconoscere
l’arginina.
Si parla quindi di ottimizzare il codon usage.

I geni nei procarioti sono costitutivi o inducibili.

Alcune volte la proteina di nostro interesse è tossica per
lo stesso, perdita di energia (spende troppe energie per
fare la nostra proteina), perdita del plasmide e quindi
accrescersi di più.
Spesso, quindi, i promotori sono forti ma regolabili
(inducibili).
La proteina d’interesse possiede un tag che permette di
purificarla facilmente.
Il glutatione S Trasferasi mette una proteina di glutatione
prima della proteina d’interesse, ma deve essere in
frame, perché se sfaso di una base salta tutto.
A quel punto la proteina di nostro interesse si lega al
glutatione e ci aiuta a purificarla facendola rimanere
attaccata a sé finché non decidiamo di staccare il
glutatione.
Per staccarlo dal nostro cilindro, eccesso di glutatione, e
poi proteasi specifica per staccare proteina d’interesse
al glutatione.

Istidine tag (nichel), basta attaccare a monte o a valle

sei istidine. Queste riescono ad attaccarsi al nichel da
una parte e alla nostra proteina d’interesse dall’altra, e
quindi la colonna sarà fatta di ioni nichel se messa in
ambiente basico.

TECNICHE IBRIDAZIONE MOLECOLARE

Southern Blot: serve per capire se c'è frammento uguale

alla sonda nel genoma
- Frammentazione del DNA genomico in modo
riproducibile con enzimi di restrizione
- Separazione con elettroforesi non si vedono le singole
bande ma si vede una strisciata (smear)
- Trasferimento (Blot) dei frammenti su membrana di
nylon (oggi si può fare con risucchio grazie a delle
pompe) la membrana si mette a bagno in una soluzione
contenente la sonda (marcata con 32P o colorazioni
fluorescenti)
- Analisi della membrana con una sonda nota a DNA la
sonda si legherà in alcuni punti specifici.
- Rilevazione della sonda marcata e analisi.

Tecnica PCR: “Danza” a tre stadi, si usa una provetta

con all’interno: H2O, DNA, nucleotidi, oligonucleotidi,
TAQ polimerasi e Mg++.
Si porta poi a 95° per la denaturazione del DNA, si fa
lavorare la TAQ polimerasi e poi si va a 55° per la
rinaturazione. Ci sono 30/40 cicli e alla fine si avrà una
quantità di DNA 10^9 volte maggiore rispetto all’inizio.

Se uso un marcatore sul primer, quando la PCR andrà

ad amplificare il segmento, ne creerà uno marcato e
quindi alla fine avrò frammenti tutti marcati. Si possono
usare anche marcatori non fluorescenti che possiamo
rendere fluorescenti attraverso un procedimento in più
(antigeni).

A seconda della concentrazione di agarosio che usiamo

distinguiamo grandezze di frammenti differenti, più uso
agarosio concentrato e più vado a vedere frammenti
grossi di DNA.
L'elettroforesi capillare funziona esattamente come
quella normale ma in verticale anziché in orizzontale.
Disegna un elettroferogramma che invece che essere a
bande è a picchi.

TECNICHE DI SEQUENZIAMENTO DNA.

Metodo Sanger: metodo dell’interruzione di catena, se

abbiamo un frammento di mille basi creiamo tutti e mille
i frammenti possibili (1000-1, 1000-2, ...),
successivamente li separiamo su un gel di
poliacrilamide e successivamente leggiamo l’ultima base
di ogni frammento. In questo modo avremo alla fine la
sequenza tutta sequenziata. Per farlo si usano dei
dideossi ovvero dei nucleotidi modificati, che
interrompono la sintesi (no legame fosfodiesterico). Il
metodo di Sanger utilizzava quattro marcature, una per
ogni base azotata, In questo modo formiamo tutti i
frammenti che finiscono per T, A, C, G in quattro
eppendorf diverse, a questo punto vengono caricati su
un gel di poliacrilamide e vediamo la sequenza in base
alla corsa elettroforetica.

I sequenziatori automatici al giorno d’oggi fanno lo

stesso lavoro e danno come risultato una corsa
elettroforetica dove ogni base è fluorescente per un
colore diverso, ciò ci permette di usare una sola provetta
con tutte le basi dentro e non 4. Il risultato è un
cromatogramma con tutte le basi in ordine.
Ad oggi si hanno 1 migliaio di basi per singola corsa.
Nel 1977 si scoprì quindi il metodo Sanger e per trovare
sequenze più lunghe si sequenziava il pezzo prima e si
usava quello come primer per il pezzo successivo.
Il metodo successivo (shotgun system) è quello di
tagliare in maniera casuale in frammenti la nostra
sequenza e poi uniamo i frammenti che fanno
overlapping.

(guardati Chromas e gedit).

Nella prima sequenza ci sono due mutazioni, perché

essendo in eterozigosi sono presenti entrambi i geni (e
quindi due basi azotate nello stesso punto base 380 e
198).
Tecniche di sequenziamento NGS, si è passato da
avere un costo di 10000$ per milione di basi, adesso
costano meno di
1$. (PacBio 40/50k basi per filamento)
Ad oggi Illumina sequenzia 1Gb (1000000000 b) per 6$

Il sequenziamento illumina parte sempre con la rottura

della nostra sequenza di DNA (Onde d’urto per rendere i
frammenti di 100-150 bp), si prosegue riparando le
estremità che crea delle blunt end a cui poi vengono
aggiunte delle code di A per renderle sticky, si legano
poi degli adattatori e quindi si mandano i frammenti ad
essere sequenziati (dopo qualche ciclo di CPR).
Per sequenziare dentro Illumina abbiamo bisogno di una
flowcell, dove ci sono siti di legame per gli adattatori di
Illumina.
Gli adattatori in Illumina si attaccano su una flow cell che
possiede frammenti per attaccarsi agli adattatori delle
nostre sequenze. A questo punto si crea un
collegamento a ponte tra due adattatori vicini e si fa
girare una PCR detta "a ponte" che poi formeranno altri
collegamenti a ponte con gli adattatori vicini fino a
formare dei cluster per circa 200 milioni di basi. A
questo punto uno dei due filamenti viene lavato via e si
usa un software che rileva la fluorescenza (gli do basi
azotate fluorescenti) e legge la sequenza, dopodiché si
fa girare la DNA polimerasi e si fa la stessa cosa per
l'altro frammento. Vado infine a vedere i punti di parziale
sovrapposizione e ricostruisco la sequenza iniziale.

DNA polimerasi

Ogni filamento serve come template per creare il proprio

partner.
La replicazione del DNA in E. Coli e semicontinua, i
frammenti Okazaki creati sono lunghi 1000, 2000 basi.
Questo permette al DNA di essere sempre trascritto con
direzione 5’ 3’. La maggior parte dei DNA eucariotici si
replica bidirezionalmente.
Ci sono 6 DNA polimerasi Pol 1, 2, 3 sono le più
importanti ed è la 3 che apre il DNA in forcelle e inizia la
clonazione. Ha infatti più subunità e ce ne sono di 2 tipi
(oloenzima e core), 4 e 5 riparano il DNA e fanno sintesi
delle lesioni.

La DNAP1 riesce a degradare molecole di DNA sia in

direzione 3'-5' che al contrario. È formata da due
polipeptidi, frammento di Klenow e uno più piccolo. Ha
funzione di correzione di bozze, se si accorge di aver
fatto un errore riesce attraverso la P1 a tornare indietro
e a correggerli.

DNA polimerasi fatto come una mano e la doppia elica

passa in mezzo a pollice e dita, due ioni magnesio
coordinano l'attacco del nuovo nucleotide. Sempre nella
tasca ci sono le prime correzioni, sia tra basi azotate
che tra acidi nucleici. La esonucleasi degrada anche
alcuni primer che magari fornirebbero da innesco per
un'altra DNA polimerasi o frammento di Okazaki.

Attività 5-‘3’ esonucleasica, permette alla Pol 1 di

degradare il filamento che si trova di fronte, rimuovendo
eventuali primer e riparando i Nick.
Pol II non è richiesta nella replicazione del DNA e quindi
si arriva a Pol III che replica il DNA batterico.

L'oloenzima è costituito da otto subunità e le subunità

alfa e theta si distinguono i lavori. In particolare, in alfa
risieda l’attività di polimerasi, mentre in quella epsilon vi
risiede l’attività esonucleasica. Vi è poi un complesso
chiamato Y, contenente cinque subunità. Il sistema di
replicazione ha una correzione delle bozze che richiede
il priming. Senza di esso la DNA polimerasi si
fermerebbe.

Negli eucarioti invece le polimerasi importanti sono: alfa

che inizia nuove catene e viene immediatamente usata
nella sintesi per poi lasciare spazio alla sigma, epsilon e
sigma.
La DNA Pol alfa è quella che inizia la sequenza,
sintetizzando l’innesco stampo che viene riconosciuto e
utilizzato immediatamente.

L'elicasi è la proteina il cui compito è quello di aprire

l'elica.
Topoisomerasi induce una forza di superavvolgimento
negativa di compensazione che va a riequilibrare gli
scompensi dati dall’elicasi.
Le SSB impediscono al DNA l’immediato reannealing
sul filamento partner una volta che questi sono stati
divisi.

La replicazione si divide quindi in tre momenti, inizio

elongazione e terminazione.
L'inizio si ha a partire da una sequenza che viene
evidenziata come uno starter chiamato primosoma,
questo starter sono otto paia di base sia a valle che a
monte del frammento, se succede allora si può replicare
il DNA.
Un primosoma composto da DNA a che si approccia
all’elica e la denatura parzialmente, DNA b (elicasi),
DNA c che lega l’elicasi alla doppia elica e la apre
facendola piegare di 90°.

La primasi quindi sintetizza a stampo un oligonucleotide

di RNA che funge da primer e da stampo poi per la
DNAP3 per iniziare a sintetizzare, la DNA polimerasi
non può iniziare un nuovo frammento ma solo
continuarne uno già iniziato.
La primasi sintetizza sia su filamento leading che su
quello lagging.

Priming negli eucarioti: molto più complessa, dato da

maggiori genomi, movimento più lento, più punti di inizio
per ogni cromosoma.
L’origine di replicazione del lievito per intendersi è lunga
11 bp.

Elongazione La POL III sintetizza molto velocemente

(730 nt/s) ed è molto processivo. Il core, tuttavia, è
molto poco efficiente, esiste quindi uno sliding clamp
(subunità beta) ed ha una forma a ciambella attraverso il
quale passa il DNA e si posiziona dietro alla polimerasi
per fare in modo che 1 stia attaccata e che 2 vada più
veloce.
Negli eucarioti si chiama PCNA e fa la stessa identica
cosa.
La subunità beta da sola non riesce ad agganciarsi al
DNA ma ha bisogno di un altro enzima la fa attaccare, e
questa proteina si chiama clamp loader. Il clamp loader
quando riconosce della DNA apre l'anello del clamp e lo
carica per poi richiuderlo utilizzando ATP. Gli serve
tuttavia un aiuto dalla subunità sigma.

Fase di terminazione: le replicating forks lasciano due

figlie aggrovigliate, serve la decatenzaione dei catenani.
Succede con la digestione dell'ultimo frammento di
Okazaki, inoltre un telomero si attacca da ogni parte del
cromosoma e la telomerasi chiude e sintetizza l'ultima
parte di esso.

Danni e riparazione del DNA. Il danno è un’alterazione

chimica del DNA, la mutazione è il cambio di una coppia
di basi ad opera di agenti alchilanti radiazioni UV.
Le mutazioni possono essere di tipo transizionale o
trasversione (tra purina a pirimidina).
Alchilazione delle basi (data da agenti alchilanti)
cambiano una base che può portare a codoni di stop o
nonsense o mutazioni letali per la cellula.
I raggi UV vanno a modificare la configurazione delle
timine nella doppia elica (creano un ciclobutano tra due
timine) che porta al blocco della replicazione o della
trascrizione. Un enzima chiamato fotoliasi utilizza
l'energia luminosa per ripristinare la struttura del dimero
dal DNA rompendo i legami delle due timine. Esistono
enzimi suicida O6 metilguanina metiltransferasi che si
suicidano per rimuovere l'agente alchilante dalla base
azotata e quindi proteggere il DNA (vengono degradati).
Un altro tipo di riparazione è quello per escissione che
va a rimuovere in toto il nucleotide alchilato (Ber) e
lascia al suo posto un buco che verrà riparato da enzimi
di DNA polimerasi.

Un altro tipo di riparazione è la NER che rimuove il

frammento che contiene il nucleotide modificato e poi
ripara il filamento con DNA polimerasi che usa l'altro
filamento (sostituisce e ripara anche frammenti lunghi
12/13 nt) sigilla con ligasi.
DSBR è la rottura del doppio filamento che porta alla
morte della cellula o alla formazione di tumori.
NHEJ sono proteine che si attaccano alle estremità del
DNA che è stato recesso, Ku avvicina le due parti e crea
dei frammenti di omologia (microdelezione o
microinserzione come se mettesse una pezza).

Differenze cellule eucariotiche e procariotiche.

Gli organismi più complessi hanno minore densità

genica.
Nel genoma umano su 3200 Mb 2000 di queste sono
sequenze intergeniche o sequenze altamente ripetute, e
1200 sono sequenze genomiche o collegate a geni.
Gli pseudogeni codificano per un gene scritto sul
genoma ma avendo perso la capacità di trascrizione o
traduzione (attraverso trascrittasi inversa).

Nei cromosomi normali vi è un solo centromero, due

telomeri e più origini di replicazione e grazie alle fibre di
tubulina si attacca alle cellule e coadiuva la replicazione
cellulare. I centromeri tengono assieme i due cromatidi.
Dopo la moltiplicazione dei cromosomi, i centromeri
formano il cinetocore. A questo punto i centromeri del
cromosoma vengono attratti e si separano i cromosomi
omologhi.
Fase S: tolto il centromero a tenere insieme i cromatidi
fratelli, è una molecola di coesina, replicazione del DNA,
in G2 preparazione per la segregazione, M
segregazione cromosomica, G1 preparazione per la
divisione cellulare, fase M i filamenti di coesina si sfilano
e i cromatidi fratelli si separano.

Il DNA non ha sempre la stessa struttura durante la sua

vita, ma per la maggior parte della sua vita sono
decondensati sotto forma di creatina. Esistono SMC che
sono in grado di interagire con il DNA attraverso dominii
coiled-coil che connette i due cromatidi fratelli e che
vengono tolti in fasi di mitosi, inoltre le condensine
legano in fase decondensata il DNA di regioni distanti.
Uno dei livelli di struttura dei cromosomi è il filo di perle.
I fili di perle possono essere fibre spesse 30 nm o 10
nm.
Esperimento, preso un esempio di DNA non condensato
e messe assieme a una nucleasi micrococcica che va a
tagliare nei DNA linker e quindi forma il filo di perle se
trattato con proteasi e digestione completa, sennò vedo
solo una banda in quanto il DNA "nudo" è attaccato al
core nucleosomico. La struttura è formata da un DNA
linker (20/60 bp), un core istonico e un DNA core (147
bp). Il nucleosoma è formato da core istonica e DNA
core. Queste proteine si chiamano proteine istoniche in
quanto si attaccano al DNA essendo di carica positiva.
(Configurazione con amminoacidi lisina e arginina).
Queste proteine sono formate da porzioni ad alfa elica e
si foldano in queste porzioni a formare dei dimeri. Il
nucleosoma si forma solo in presenza di DNA.
Nel nucleosoma si legano H3 e H4 che si legano al
dsDNA e poi reclutano H2A e H2B fino a formare una
struttura a 8 proteine, H1 invece ha il compito di legare
due nucleosomi adiacenti. Le porzioni interna del core
istonico è molto impaccata e non si sfalda neanche se
trattata con tripsina che invece fa cadere le code
esterne.
Ha una struttura simmetrica a doppio asse di simmetria.
L’entrata del DNA è alle ore 13 mentre la sua uscita è
alle ore 11.
Ha 14 punti di contatto con il DNA per un totale di 40
ponti a idrogeno. Ma le proteine e le basi hanno solo
sette punti di contatto, queste perché deve essere
aspecifico alla sequenza a cui si attacca. Le code
dell’ottamero si avvolgono attorno all’ottamero e
stabilizzano il DNA.
Il DNA procariotico non presenta proteine istoniche e
quindi presenta solo una struttura superavvolta. Se
aggiungiamo la proteina istonica H1 il DNA si aggiorna a
struttura a zig-zag (influenzata anche da pH e
concentrazione salina).

La proteina H1 si lega al DNA linker e restringe l'angolo

compattando. La fibra da 30 nm è realizzata grazie
all'intervento delle code amminoistoniche che contattano
i nucleosomi adiacenti.
Scaffold nucleari: strutture nelle quali si possono
formare anse di 40-90 kb di DNA. Organizzazione della
cromatina è dinamica. Possiamo quindi pensare che i
nucleosomi possano scivolare rendendosi sensibili alla
trascrizione o presenza di sostituzioni o inserzioni di
proteine di DNA.
La coda ammino terminale degli istoni viene
frequentemente modificata (attraverso acetilazione, o
metilazione, fosforilazione...). Sia le lisine che le arginine
possono venire metilate o fosforilate.

Trascrizione da DNA a RNA.

Inizio, allungamento e terminazione.

INIZIO
Quando l’RNA polimerasi contatta il promotore si forma
un complesso chiuso ed una bolla di trascrizione, che
avviene solo in un verso: 5’, 3’. Orientamento prefissato
dalla
frequenza. La trascrizione avviene SEMPRE in
direzione 5’,3’ e al massimo il filamento su cui vi è il
gene viene poi copiato a partire dall’altro.
ALLUNGAMENTO
Appena finito di sintetizzare un frammento di DNA lungo
dieci basi inizia l’allungamento.
A questo punto succede che: vi è catalasi dell’RNA, si
separano i due filamenti di fronte all’enzima che li
riavvolge dopo il suo passaggio, stacca la catena di
RNA dallo stampo di DNA mentre si muove sul filamento
e funziona da correzione di bozze.
TERMINAZIONE
Una volta finito di trascrivere il gene o i geni nella loro
lunghezza la polimerasi deve fermarsi, rilasciare l’RNA
prodotto e dissociarsi lei stessa dal DNA.

A differenza della replicazione del DNA qui fa tutto

l’RNA polimerasi (correzione bozze, apertura
forcella, ...). Dal punto di vista evolutivo è venuto prima
e quindi ci sta che sia meno complesso. Una volta finito
si ferma, rilascia il frammento prodotto e si stacca dal
DNA. Un esperimento in escherichia coli mostrò diverse
subunità: 2 beta, un sigma, un alfa ed un omega che
tuttavia non era necessario alla vita della cellula.
La subunità sigma media il riconoscimento di
determinate frequenze sul DNA genomico. Quanto forte
si lega al DNA? Dipende se sottoforma di core o
oloenzima (con fattore sigma che permette il
riconoscimento dei promotori sulla catena di DNA).
L’oloenzima migliora le sue performance a seconda
della temperatura (T più elevate promuovono il DNA
melting e quindi l’attacco dell’oloenzima).

Inizialmente si fa un complesso promotore chiuso, e poi

la subunità sigma contatta la molecola di DNA e il
sistema diventa aperto con l’oloenzima che si lega
saldamente al DNA. Nei batteri esistono regioni
promotori comuni lunghe 6-7 bp a circa 10 bp monte
della trascrizione (può anche essere di 35 bp a monte).

Le sequenze consenso (conservate) sono dei promotori

e possono subire mutazioni che alterano la forza di
legame tra DNA e RNA polimerasi. Distinguiamo quindi
promotori deboli e forti, ma anche costitutivi (DEVONO
essere espressi) e inducibili (si esprimono in situazione
di necessità).
Up element è un promotore che stimola trascrizione di
fattori 30. La trascrizione di rRNA è mediata da UP e
associato a tre siti Fis ovvero degli attivatori di
trascrizione.
In E. Coli le porzioni 2 e 4 di sigma riconoscono i
promotori 10-35 e si attaccano alla doppia elica.
Il fattore sigma riconosce gli elementi UP e le regioni a -
10 e -35 grazie alla sua composizione a 4 regioni ad alta
similarità di sequenza.
Ogni polimerasi crea una separazione a -11 e +2
rispetto al sito di inizio della trascrizione (10bp).
L’inizio della trascrizione finisce nel momento in cui il
primo nt è stato attaccato ma sono state trovate sezioni
abortive di 2-6 nt di grandezza.
L’elongazione avviene quindi nel momento in cui la
polimerasi del nucleo continua ad allungare l’RNA.

L’RNA polimerasi ha struttura simile alle chele di un

granchio perché deve pinzare il DNA e srotolarlo, (il
DNA esce di nuovo unito), la sintesi avviene perché
coadiuvate dalle chele beta ‘ e beta ‘’. Ci sono anche dei
terminatori di sequenza e sono: ausiliari (rho
dipendenti), o terminatori intrinseci. Rho (proteina)
inibisce la capacità dell’RNA polimerasi di trascrivere
DNA, funziona a patto che ci sia una sequenza con alta
presenza di C a monte del sito di terminazione. Quando
è Rho indipendente ha due sequenze ripetute e invertite
vicino ad un polyT che fa in modo di richiudere a forcina
il DNA non lasciando lavorare l’RNA polimerasi.
Negli eucarioti si definisce core il gruppo minimo di
sequenze necessarie all’interno di un promotore. I fattori
trascrizionali sono: TF2A e TF2B e preparano il
filamento ad essere approcciato dall’RNA polimerasi. I
complessi del mediatore sono in grado di mediare il
legame tra RNAP e filamento e formano il TATA box
circa 30 basi prima dell’attacco dell’RNA polimerasi.

Modificazioni post trascrizionali: splicing, capping e ...

L’informazione si presenta come sense e non-sense,

(introni ed esoni) lo splicing taglia gli introni e mantiene
gli esoni. Gli introni sono quindi presenti a livello di geni
ma non a livello di mRNA maturo. Avviene a livello di
mRNA primario. Per riconoscere introni da esoni basta
guardare alle sequenze di giuntura, perché sono sempre
le stesse anche tra geni diversi (GURAGU all’inizio e poi
NCAAG) per la giuntura finale. Lo splicing è un
meccanismo a due tappe, il secondo gruppo
dell’adenina del branching point si attacca al gruppo G
dell’inizio dell’introne, a questo punto il terzo gruppo
della guanina si attacca al lariato (fosfato della giuntura
finale dell’introne) formando un cappio che se ne va via.
Tutto questo viene coadiuvato da enzimi chiamati
SNRPN (snurp) che di base avvicinano solo gli esoni.

È possibile prevedere che alcuni splicing vengano

saltati. Questi procedimenti si chiamano splicing
alternativi a causa di diversi motivi (esone ignorato,
inizio di trascrizione, ...).
Siti alternativi 5/3 splice portano all’inclusione di un
introne o all’esclusione di un esone, un introne ritenuto
può essere mantenuto su mRNA se non viene
riconosciuto, o taglio prematuro del DNA.
Modificazione post trascrizionale: capping. Alcuni mRNA
sono stati ritrovati metilati nei virus, sempre nello stesso
punto. Il CAP protegge l’mRNA dalla degradazione, ne
migliora la traducibilità e trasporta i mRNA fuori dal
nucleo. Ci sono tre tappe nel capping: una rimuove il
fosfato dell'adenina, uno che aggiunge una guanina
dall’altra parte e una che aggiunge una metionina sulla
prima base azotata.

Poliadenilazione funziona attraverso all’attaccamento di

una coda di poli A che aiuta a dire alla cellula dove
tagliare sequenze non sense (aiuta a capire la fine del
mRNA e trasporta gli mRNA dal nucleo al citoplasma)
Le modifiche al DNA avvengono durante la trascrizione,
nello specifico il capping quando il frammento è lungo
almeno 30 nt e la poliadenilazione quando riconosce un
sito.

REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE.

L’operone è un insieme di geni, dei loro promotori ed

operatori, un gene assieme alla sua sequenza
promotrice è detto cistrone, si può quindi dire che
l’operone sia l’insieme dei cistroni e degli operatori.

Scoperta dell'operone, studiato dal metabolismo del

lattosio in E. coli tre attività enzimatiche scoperte in
merodiploidi.
Operone lac sono delle proteine (geni) che riconoscono
il lattosio e consentono all'E. coli di usarlo tramite
produzione di enzimi. I geni sono tre dell'operone lac e
sono trascritti insieme (consistono in galattoside
permeasi che trasporta il lattosio nelle cellule, beta
galattosidasi che trasforma il lattosio in galatosio e
glucosio, e galattoside transacetilasi che detossifica i
cataboliti).
Questi tre geni sono raggruppati nella stessa regione, e
sono trascritti insieme formando un unico mRNA
policistronico.
Questi sono controllati da un controllo negativo
(presenza di lattosio), ed uno positivo mediante un
attivatore (bassa [glucosio]). Di norma c'è una proteina
chiamata repressore attaccata al DNA che non permette
alla RNA polimerasi di trascrivere quel frammento. Se
invece è presente nell'ambiente un induttore, esso si
lega al repressore, questo si stacca dall'operone e
kaboom parte la trascrizione di quel gene. Il repressore
Lac 1 è allosterico, cioè l'allolattosio (forma alternativa
del lattosio) ne cambia la forma e non permettendole di
legarsi alla catena di DNA. Da dove proviene
l'allolattosio? La pochissima quantità di beta
galattosidasi trasforma una piccola parte di lattosio in
allolattosio che poi andrà ad attaccarsi al repressore.
Una proteina di nome CAP riesce a bypassare il
controllo dell'operone Lac, si lega con il cAMP (un
catabolita attivatore di proteine) che facilita l'attacco al
promotore e conseguente trascrizione anche in
presenza di glucosio. Gli operoni regolati da CAP e
cAMP hanno promotori deboli, ma noi possiamo andare
a giocare sulla [glucosio] per la trascrizione di questi
geni (- glucosio c'è e più la CAP si attiva).

Riboswitch: un prodotto a valle va ad attaccarsi ad un

aptamero a monte e blocca la sua stessa trascrizione
(blocca la sua produzione quando ce n'è già tanta).
Tra i vari domini di regolazione genica, i più importanti
sono: domini acidi, ricchi di glutammina o di proline.
La prolina è come Adele, un amminoacido scomodo
perché spazioso e angolato.

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Marcatori genetici: Sono caratteri mendeliani che

possono essere utilizzati per evidenziare una regione
d'interesse.
Possono essere: marcatori morfologici, biochimici o
molecolari.
I marcatori molecolari sono quelli che più si avvicinano
ad un marcatore ideale. Un marcatore molecolare è un
locus genico rilevabile e riconoscibile e che in virtù della
sua presenza contraddistingue in modo univoco un
tratto con il quale si identifica le regioni che lo
circondano. Spesso i marcatori molecolari vanno ad
influenzare un carattere che usa un colore come
evidenziatore. I marcatori molecolari possono coprire
tutte le basi del genoma, non subiscono interferenze e
sono dipendenti dallo stadio di sviluppo. (Guarda slides
su marcatori molecolari: elenco lista della spesa dei loro
pro).
In Biologia molecolare parliamo di polimorfismo genetico
quando la variazione è superiore all'1%. Se stiamo
parlando di variazioni basi nelle sequenze allora
parliamo di SNP (snip).
Prendiamo ad esempio la sequenza GAATTC che può
variare ed essere GAAATC, noi possiamo attraverso un
enzima di restrizione (elettroforesi) andare a vedere la
presenza di uno SNP. Polimorfismo può essere di
inserzione delezione (indel) o di ripetizione (in tandem),
Marcatori vengono classificati in base a: tecniche di
restrizione, tecniche di amplificazione, sequenziamento
NGS.
Possono poi dividersi in singolo locus o multi-locus.
Marcatori RFLP e VNTR prevedono una digestione
enzimatica seguita da un’ibridazione fatta con una
sonda.
In elettroforesi poi si va a vedere quali alleli sono
presenti nei locus.
Gli alleli possibili sono sempre più rispetto a quelli reali.
Marcatori basati su tecniche di amplificazioni PCR
RAPD (con singolo primer decamero) a 36° che si deve
attaccare in tante sezioni del genoma, amplificando
frammenti, ma amplificando di più i frammenti più corti e
meno quelli più lunghi su tutto il genoma. Quando il
primer si attacca solo su uno dei due filamenti nella
stessa regione o ne amplificano una delle due in modo
più corto, allora andremo poi a vedere su gel i
polimorfismi dei singoli loci. È un marcatore dominante,
non mi sa dire se è omozigote o eterozigote.

Microsatelliti: Sono brevi frequenze di DNA in tandem

(ripetuto), di una lunghezza variabile da 3 a 16/20 basi.
L'importante durante la pcr è avere dei primer che lo
fiancheggiano. Nel caso dei microsatelliti siamo in
presenza di un marcatore codominante. (varia la
lunghezza del motivo microsatellite).
Un gene può risultare un problema se al suo interno vi è
una sequenza codificante (stretch proteico), ma molto
spesso i microsatelliti si posizionano in sezioni UTR che
vanno a influenzare solo la quantità di proteina prodotta
e non la qualità.
Una PCR può fare 14 loci in contemporanea. Non
possiamo costruire un microsatellite a meno che non
conosciamo le due sequenze fiancheggianti. Per
identificare SSR si possono usare librerie genomiche e
tramite ligazione degli adattatori. (guarda slide che
spiega il procedimento con disegnini bellini).

Metodo bits visto a lezione. Una volta ripulito il nostro

campione usiamo poi un polylinker, e andiamo in piastra
a vedere le colonie batteriche. A noi interessano quelle
bianche e non quelle blu perché ci interessa il lac
operon. A questo punto prendo una colonia e la metta
direttamente in pcr, per poi far correre su gel e vedere
dove avevo il microsatellite.
Qual è l’origine dei microsatelliti: slippage della DNA
polimerasi, questo crea una frequenza di SSR di circa
500 loci in uomo. Questo influenza spesso la quantità di
proteina prodotta, la quale porta ad una variazione
fenotipica.

Metodo Bits: Restrizione del DNA genomico, ligazione

degli adattatori, e ibridazione di arricchimento con
biotinilata, costruzione di una libreria genomica
mediante clonaggio in vettori plasmidici, e sviluppo dei
batteri con individuazione delle colonie trasformate.
A questo punto si avrà una libreria arricchita nella quale
si potrà andare a marcare molto facilmente con appositi
SSR e sequenziamento di cloni positivi.

Marcatori AFLP: Restrizione enzimatica, ligazione,

preamplificazione con adattatori e infine amplificazione.
La separazione è fatta su gel di poliacrilamide. Si usano
enzimi di restrizione che vanno a creare tot frammenti
(si usano rare cutter in combinazione con frequent
cutter), poi costruiamo adattatori per i nostri tagli degli
enzimi di restrizione. Facciamo la PCR e facciamo una
pre-amplificazione con primer che si attaccano agli
adattatori (con una base azotata in più) ma così butto
1/16 dei frammenti? Sì, ma altrimenti vedo un smear e
noi dobbiamo vederle una alla volta in queste 16 parti.
Si fa così amplificazione selettiva. Posso però trovare
frammenti omoadattatori, ma in realtà è stato visto che
ne troverò pochissimi alla fine perché si legano in loop
sequestrando alla reazione.

SNP: ovvero il polimorfismo del singolo nucleotide. I

marcatori SNP riescono ad evidenziare la singola
variazione. Marcatori CAPS o STS (VINTAGE)
amplifichiamo un frammento e quando lo amplifichiamo
non vediamo polimorfismo. Ma CAPS va a tagliare
esattamente dove io so che c’è un polimorfismo.

Marcatori indel vanno a comparare più organismi per

vedere se c’è stata un’inserzione o una delezione.

Altro marcatore è ARMS (disegno il primer sulla

posizione SNP) se il primer non si attacca la PCR non
parte e quindi il mutante non sarà amplificato. (Posso
avere falsi negativi e positivi per errore sperimentale).

Arms prevede l’utilizzo di quattro primers, due interni

(disegnati sulla mutazione) e due esterni, si chiamano
anche outer e inner. Questi inner primer hanno la
capacità di attaccarsi o meno a seconda del fatto che ci
sia o meno la base mutata. Si va su gel e si trovano
bande a seconda che l'allele è specifico o non specifico
(bande alte= allele non specifico). Il caso peggiore qui è
il falso negativo perché la banda alta è la nostra banda
di controllo (se c’è la PCR è andata a buon fine),
che vi è in tutti i casi, se mancano le altre bande siamo
in presenza di un falso negativo a volte. Il metodo per
risolvere i falsi negativi chi ha inventato questa tecnica
ha introdotto un errore in - 3 in un inner primer (che
permette alla PCR di partire lo stesso), ma se non trova
l’allele giusto allora la PCR non parte e quindi noi non
vediamo nulla su gel (Destabilizzazione al -3).
Si disegnano i primer in modo che lo SNP è sempre
spostato, in modo da vederlo meglio.

Il sequenziamento si sta spostando nella direzione di

whole genome, si possono identificare tutte le mutazioni,
e le varianti genetiche in ogni posizione (tramite
allineamento dei risultati). Sennò andiamo a
sequenziare solo dove sappiamo che ci sono i siti di
restrizione (e andiamo a vedere gli SNP nelle regioni)
perché sono meno costosi da fare.
GBS sono altre NGS per sequenziare genotipi e
riescono a copiare i frammenti tra i siti di restrizione e ad
evidenziare tramite confronto gli SNP presenti.
La piastra di GBS è a 384 campioni (nello spazio di un
pozzetto ci sono 4 sotto pozzetti), si mette il DNA nelle
diverse piastre e si digeriscono i pozzetti, poi si legano
gli adapter (tutti diversi), poi possiamo mischiare tutto in
un’unica provetta, PCR in modo da averne una buona
quantità e poi elettroforesi per valutare la lunghezza
media dei frammenti e infine si vanno a vedere i ritz che
compongono una library e possiamo distinguere le
varietà tramite il barcode che avevamo messo negli
adattatori. (Delirio di Acquadro su metodi per ricordarsi
le tecniche di sequenziamento).

Il principale utilizzo a nostro interesse è l'identificazione

varietale (fingerprinting), studi di filogenesi (vicinanza tra
individui), realizzazione di mappe genetiche molecolari,
individuazione di regioni codificanti per caratteri
d’interesse agronomico.

Filogenesi molecolare, ovvero quanto due individui

siano distanti (geneticamente) l'uno dall'altro.
Geni suddivisi in ortologhi e parologhi. Ortologhi se geni
simili in organismi simili che si sono specializzati in
maniere diverse, parologhi se originate da duplicazione
nello stesso organismo. Ortologhi tra specie diverse,
paraloghi nella stessa specie.

La distanza si va a vedere negli amminoacidi che

compongono le proteine. Andiamo a vedere quanti
aminoacidi hanno in comune le proteine. Si può anche
andare a vedere gli SNP, ma possono essercene mille
tipi (nucleotide che cambia ma poi ricambia, muta, ...).

Per studiare la filogenesi si sono proposti molti modelli

(assunzioni a priori), ma il più complesso e recente che
abbiamo si basa sulla relazione tra proteine e acidi
nucleici. Uso una matrice 4x4 per le quattro basi azotate
e do un valore 1 se la base è giusta o 0 se assente. Per
le proteine usiamo invece matrici 20x20 e sono molto
più complesse.

Teoria dell'orologio molecolare: assunta una velocità di

mutazione, gli organismi si distanziano più tempo passa.
Quanto più hanno accumulato mutazioni tanto più
possono considerarsi distanti. Calcolato che l'uomo e il
topo sono distanti 83 milioni di anni calcolata usando le
globine, ma si possono usare anche altri geni ortologhi.
A seconda di quante assunzioni a priori facciamo, allora
il modello sarà più semplice o più complesso.
Gli alberi filogenetici sono composti da nodi (dove si
separano le specie), possono essere con o senza
radice, se hanno la radice allora prendono per vera
l'assunzione dell'orologio molecolare.
Un clade è un gruppo di organismi generati tutti dallo
stesso nodo.
Per costruire alberi genetici, si usano software che
guardano le matrici di similarità e poi compongono
l'albero, o algoritmi di ottimizzazione che guardano
caratteri obiettivi. UPGMA è un dendrogramma che si
compone in più step: Si identificano le otu più vicine,
queste vengono considerate come OTU composte e si
ha un calcolo di similarità che va ad avvicinare le OTU
più vicine e così via, fino a quando tutte le OTU sono
state confrontate. Il metodo OTU non ha senso se si
considera il fatto che i tassi di mutazione possono non
essere gli stessi. La radice viene di solito messa
equidistante da tutte le OTU.
Questo dendrogramma non tiene conto di tante cose, tra
le quali se ci sono diverse velocità di mutazione. Altri tipi
di composizione di alberi genetici sono quelli di
Neighbour-Joining.
Bootstrapping è il metodo utilizzato per vedere se un
risultato è significativo o meno, maggiore è il livello di
bootstrap da ogni nodo e maggiore è l'affidabilità.
Analisi di similarità può essere fatto anche con l'utilizzo
di marcatori molecolari. si usano siano tecniche di tipo
dominante o codominante. Spesso si usa la GS o la GD
ovvero genetic similarity o genetic distance. Si usano
sempre gel e bande a cui assegniamo + se ci sono e -
se è assente.
A questo punto si usa la formula che trovi nelle slide che
mette in rapporto sia le bande che ci sono in uno e non
nell'altro, quelle in comune. (Dice) D = 2°/(a+b)+(a+c)
Per sviluppare questo, tuttavia, abbiamo bisogno di
usare marcatori molecolari a singolo locus e
codominanti.

Coefficiente di jaccard: altra formulina nelle slide ed è

più efficace in caso di utilizzo di marcatori dominanti.
j = a/(a+b+c)
Simple matching: altra formula e tiene in considerazione
anche le bande assenti in entrambi gli individui.
Anche questo metodo è molto utile ed efficace se usato
con marcatori dominanti.
SMx = a + d / (a+d)+(b+c)
Bar coding

Bisogna trovare un qualcosa che sia presente in ogni

organismo e che sia differente in ogni specie diversa, la
risposta è il citocromo C ossidasi (subunità 1).
DNA mitocondriale perché molto presente e presenta
molte differenze tra specie diverse, quindi facile da
amplificare.
Per creare un barcode abbiamo bisogno di: uno
specimen, estrarre il DNA, il gene utilizzato per
sequenziare è CO1, si sequenzia e si asporta la
sequenza e si immagazzina all’interno di un database
centralizzato. Ogni volta che una specie entra a far parte
del database entra anche in un albero filogenetico.
Mette in evidenza inoltre specie criptiche, ovvero che
non riusciremo a distinguere morfologicamente.
A livello umano la CO1 (Singolo locus) è praticamente
sempre uguale, con lo scimpanzé è di 60 nucleotidi, e
così via con le altre scimmie.
In alcune piante si può avere un trasferimento
orizzontale del DNA e quindi il gene CO1 può essere
mutato. Per questo CO1 non funziona benissimo con
tutti gli organismi vegetali.
Si usano quindi in pianta diversi geni, tra cui maturasi K
e rubiscoL (entrambe multi-locus).
È meglio utilizzare un sistema a due loci che a tre loci, in
quanto costa semplicemente di più (terzo utilizzato solo
quando utile). Questi dati vanno a finire sempre in
genebank, EMBL, …
Per sequenziare in pianta devo prima di tutto eziolare,
cioè tenere al buio, e togliere quindi un po’ di genoma
cloroplastico.
Poi facciamo genome skimming cioè scremiamo il
genoma e iniziamo a ricostruire partendo da sequenze
brevi.

Origine delle specie coltivate: In quale modo la

coltivazione di una specie è iniziata e dove.
Il signor Alphonse de Candolle assieme ai suoi amici
fece studi in merito.

Alphonse seguì ricerche sui wild relative, ovvero le

varianti selvatiche delle piante domestiche. Ipotizzò che
data una certa area le varianti selvatiche erano le stesse
di quando l’uomo le addomesticò. Però per verificare
bisogna incrociare e avere progenie fertile. Abbiamo
oggi una prova che l’uomo addomesticò certi cereali
nella mezzaluna fertile della Mesopotamia mutando il
suo comportamento da nomade a stanziale. 6000/8000
anni fa arrivò anche in Europa.
Le specie più antiche ad essere addomesticate sono il
frumento duro nel vecchio mondo e il mais nel nuovo
mondo, alcune delle più recenti sono patata e frumento
tenero. Le piante coltivate dall’uomo si divisero in
primarie: coltivate volontariamente e secondarie,
infestanti che col tempo l’uomo ha addomesticato
(avena, segale). L’assenza di dispersione del seme è
una forma di domesticazione della varietà (selezionate
per quello). Rachide fragile e ariste lunghe e dure (wild
type), rachide coriaceo e ariste corte e flessibili
(domestica). Informazione di tipo archeologico, test su
carbonio 14, si stima quanto C14 c’è sul campione e poi
si va a vedere l’epoca storica. Per questo sappiamo che
10000 anni fa circa (da semi di frumento ritrovati) i
popoli hanno iniziato ad addomesticare il frumento.

La formula per la stima del C14 è Deltat = -Tau*ln(C/C0)

Nicolai Vavilov lavorò con Bateson per raccogliere e

catalogare il germoplasma vivente (semi). Pubblica lo
studio alla base dell’origine delle colture. Ipotizza che
esistano centri di origine della specie, ovvero aree in cui
è presente un'enorme varietà di forme (tutte ad
altitudine 1000-2000 e con una stagione secca e una
umida).
Nelle zone più interne dei centri di origine ci sono più
alleli dominanti, nelle zone più periferiche si hanno più
alleli recessivi. Non tutte le ricchezze di forme
significano che si è in un centro di origine perché è
possibile che la specie abbia trovato caratteristiche
fenologiche e strutturali che ne hanno influenzato la
variabilità genetica e che quindi non sia presente il
corrispettivo selvatico.

Domesticazione vicaria: l’uomo in regioni diverse

seleziona gli stessi caratteri.
FRUMENTO

Domesticazione in Mesopotamia, ma disperso poi in

tutto il mondo. I wild relatives comprendono Iran, Iraq,
Turchia e Arabia saudita. ha più wild relatives (triticum e
aegilops). Nel triticum è avvenuta per prima una
differenziazione in base al corredo cromosomico,
formazione di poliploidi che si sono generati da incroci
interspecifici che davano ibridi sterili che una volta
poliploidati si rendevano fertili.
È successo innanzitutto un riarrangiamento dei genomi
delle varietà diploidi 2n = 14 poi seguito da incroci
interspecifici con poliploidizzazione delle varietà sterili.

Il corredo cromosomico di base è di 7 cromosomi, il

piccolo farro ne ha 14, il frumento duro ne ha 28 e il
frumento tenero 42. Vi sono stati quindi più incroci da
due distinte filogenesi: Triticum uratu e speltoides che
danno una volta poliploidizzato diventa dicoccum (farro
medio) e durum (grano duro), e se incrociato con
tauschii e poi raddoppiato il corredo diventa spelta e
aestivum. Le combinazioni tra i geni A, B, D vennero
indagate tutte attraverso i mutanti di aestivum AADD o
AABB. Si vide che le 21 coppie potevano riunirsi in 7
gruppi di omoeologhi.
RISO

Specie più coltivata di riso è l’Oryza sativa e in Asia vi

sono entrambe le sue corrispettive selvatiche: Oryza
nivara e Oryza Rufigopon, il suo corredo cromosomico è
di 2n = 2x = 24 cromosomi.
Da Oryza nivara deriva il lowland rice cresce in terreni
inondati grazie alla capacità di trasportare ossigeno
dalle foglie alle radici. Si è poi sviluppato l’upland rice
che cresce sugli altipiani senza bisogno d’inondazione.
Da Oryza Rufigopon deriva il floating rice che si
accresce seguendo il livello dell’acqua e può arrivare a 4
metri di altezza.

Un’altra differenziazione ha portato a due specie distinte

incompatibili tra loro: O. sativa subsp japonica coltivata
in Corea, Cina, Giappone ed Europa, mentre la sub
specie indica coltivata in india e sud est asiatico.
In Africa si ha la specie glaberrima con cariossidi rosse
invece che bianche molto resistente alle condizioni
avverse africane.

MAIS

2n = 2x = 10

Mais: Il progenitore del mais è il teosinte, anche

chiamato euclena mexicana, (mais nasce in Messico).
La differenza sta nei semi e nella spiga (semi in capsule
durissime). 1939 George Beadle afferma che il teosinte
è l’unico progenitore. Teosinte più ramificato mentre il
mais monogemma. Mais e teosinte si incrociano e
danno progenie fertile e il frutto è una via di mezzo tra la
pannocchia del mais e la spiga del teosinte, inoltre
quando emergono sono indistinguibili l’una dall’altra e
per questo il primo è una fastidiosissima infestante.
Il teosinte ancestrale è Zea mays sbsp parviglumis,
mentre quello che ha dato origine al mis ad elevate
altitudini è Zea mays sbsp mexicana.
Il mais possiede una grande variabilità morfologica e
genetica probabilmente data da processi di
domesticazione indipendenti a partire dal teosinte.

Algoritmo MCMC definisce un valore k che:

inizia a calcolare le frequenze geniche in ciascuna
popolazione e poi gli individui vengono assegnati alla
popolazione in base a frequenze geniche in comune in
ciascun individuo. K ci dice solo la probabilità che il
nostro risultato sia giusto.
(Guarda il video che ci ha fatto vedere il prof sul mais ed
il teosinte perché è una bomba).

Mais, fagiolo e zucca coltivati spesso insieme

(integrazione a livello dietetico).
FAGIOLO

Avvenute due domesticazioni distinte, una in

Mesoamerica e l’altra in America Latina: la prima
tipologia rosa, nera e pezzata, mentre la seconda
tipologie reniformi di colore verde.

PATATA

Origine della catena delle Ande in America centrale e

meridionale. 2n = 4x = 48. (Solanum tuberosum)
Tuttavia, vi sono specie triploidi, tetrapoidi ed esaploidi.
È molto probabile che sia un autotetraploide e non un
allotetraploide tra S. stenotomum e S. sparsipilum.

ERBA MEDICA

L’erba medica (Medicago sativa subsp. sativa) ha come

centro di origine primario individuato negli altopiani del
Caucaso e poi allargata nel mediterraneo. Sono presenti
tre livelli di poliploidia 2n = 2x = 16/32/48. È una specie
perenne che ha tratto vantaggio nella poliploidia per
espandersi in nuovi ambienti. Si presume arrivino da M.
glomerata sia M. corulea che M. falcata che M. sativa.

La selezione rappresenta un'evoluzione accelerata che

coinvolge un numero limitato di geni, il cui scopo è il
soddisfacimento delle esigenze umane.
Vari meccanismi di domesticazione sono:
disseminazione spontanea, dormienza dei semi, indice
di raccolto, adattamento al fotoperiodo, dimensione e
variabilità dei semi e frutti.

La domesticazione (uomo) prevede una forzata

selezione detta a collo di bottiglia, con conseguente
riduzione del numero di alleli (l’uomo sceglie solo alcuni
fenotipi). Si parla di selective sweep quando vi è
riduzione o eliminazione di variabilità nucleotidica vicino
ad una mutazione, data da una forte pressione selettiva.
La prima selezione è legata alla domesticazione, la
seconda è legata alla differenziazione ed è più
“cosciente”.
La domesticazione usa come metodo di selezione la
mutazione come primo metodo, e questa si divide in:
PAV (delezione), CIVV (duplicazione in tandem) e TE
insertion (transposon elements) questo per avere piante
rispettivamente: più vocate alla produzione, più
produttive o diverse

Un esempio di ciò è il tb1 e tga1 nel mais. Il tb1 nel mais

porta ad essere ramificato nel teosinte e non ramificato
nel mais. È un QTL responsabile di controllare la
differenza nella dominanza apicale tra i due. La
selezione umana ha portato ad avere più trascrizione di
tb1 in mais. Vi è stato un selective sweep in una regione
che si estende per -58,7 e + 69,5 kb, ma a -7 kb le
sequenze diventano specifiche, 2 SNP e 2 grandi
inserzioni in mais, e ulteriori ricerche hanno evidenziato
un retrotrasposone e un MITE.
Invece tga1 è responsabile delle glume che ricoprono
mais/teosinte. La differenza di funzionamento del gene
tra mais e teosinte è la modifica di un singolo
amminoacido.
Possiamo poi avere una serie di CIS regulatory variation
che aumentano o diminuiscono l’espressione della
proteina finale, possono però anche essere mutazioni
che portano a proteine tronche o aberranti.
In quella regione ci sono un retrotrasposone, un
trasposone e due SNP (il più importante che è presente
in mais e non in teosinte è Hopscotch che è il
retrotrasposone).
La differenza invece tra tga1 tra mais e teosinte è legata
ad un amminoacido.
Attraverso dei marcatori chiamati BAC si potrebbe
restringere a mano a mano la sezione di cromosoma
andando BAC by BAC fino ad arrivare alla sequenza
(gene) d’interesse. Allora hanno provato su riso, (di cui il
genoma era già stato sequenziato) e hanno osservato
come si disponevano, sono poi così tornati su mais e
hanno costruito primer e marcatori specifici per riuscire
a sequenziare ed evidenziare le zone d’interesse nel
mais. Si è andato a stringere sempre di più e quindi si è
andato a scoprire che tra mais e teosinte a gestire la
chiusura o meno del seme era una proteina più o meno
espressa.
In mais clonato il gene coinvolto è SBP che presenta tre
esoni e due introni. A mutare era una singola base che
poteva portare in un caso all’asparagina e nell’altro alla
lisina.
Si è andato inoltre a vedere che la sezione che
presentava più selective sweep era quella del promotore
piuttosto che dei due esoni.

In frumento il gene Q regola la dispersione del seme e la

domesticazione ha portato alla scomparsa di alleli di
questo gene. Q è stato identificato come un gene
appartenente alla famiglia AP2, ovvero fattori
trascrizionali che influenzano lo sviluppo della pianta
soprattutto nella fioritura.
In riso il gene sh4 è un QTL che controlla la dispersione
della spighetta; infatti, è stato osservato che
introducendo nel selvatico un gene trasformato a singola
mutazione amminoacidica si passa dal fenotipo
shattering a quello non shattering.

Nel pomodoro si è passati da avere tanti piccoli frutti ad

avere pochi frutti ma molto grandi (gene F2w2).
Fw2.2 agisce come regolatore negativo della divisione
cellulare del frutto e la sua domesticazione si pensa
abbia favorito questo processo promuovendo una
crescita continua della bacca.
Gn1 controlla il numero delle cariossidi in riso, in quanto
va a controllare una ossidasi deidrogenasi che
degradano la citochinina.

BoCAL in cavolo è coinvolto nella formazione

dell’infiorescenza grazie ad uno stop codon precoce.

Geni trasposoni forniscono la rugosità al pisello, anche

se esso sarebbe liscio che lo aiuta a regolare l’osmosi
rendendo il pisello rugoso più dolce.

Altri geni specifici per la domesticazione sono gli y1

(Yellow 1) che attraverso un trasposone dona il colore
giallo alle cariossidi riempendole di carotenoidi. All’inizio
il mais coltivato era bianco, ma scoperte le proprietà
alimentari del mais giallo si è iniziato a coltivarlo in
maniera più ampia.

Esistono anche mais di colore bluastro/rosso selezionati

per motivi estetici. La produzione di antocianine in
entrambi i geni regolatori sono c1 (MYB factor) e r1
(bHLH factor) probabilmente legati da trasposoni.

La varietà waxy in riso (glutinosa) manca di amilosio

sono date da SNP che vanno a saltare una parte di
splicing e che quindi produce amido ramificato
(appiccicoso).
Brix 925 in pomodoro va a influenzare i solidi solubili.
Invertasi nel pomodoro che cambia le concentrazioni
(inverte il saccarosio in glucosio e fruttosio) di zuccheri,
nel wild type è molto espressivo il Brix 9-2-5.

Quali sono i geni che differenziano il pomodoro in più

forme?
Ha riconosciuto otto classi di forme.
La differenza di alleli presenti viene influenzata la forma
del pomodoro. Dai primi pomodori, wild type, derivano
direttamente ovate e LC il quale porta a FAS e SUN.
Il numero di alleli influenza il numero di loculi nel
pomodoro.
Gli alleli LC e FAS agiscono sul numero di loculi e le
varietà contenenti alleli mutanti dai due sopracitati
portano a frutti multiloculari (il wild type contiene solo
due loculi).
Inoltre, questi geni sono controllati da vie di
segnalazione CLV-3 e WUS, il primo promuove il
differenziamento mentre il secondo le cellule staminali.

Il locule number è stato identificato sotto forma di due

SNP che sono situati sul cromosoma due del pomodoro.
La presenza di questi due SNP influenza il numero di
loculi del pomodoro. Esiste poi Fasciated che controllato
da clv3 influenza la polarità delle cellule meristematiche
e che contribuisce allo sviluppo di organi floreali
soprannumerari.
In breve: in mutante LC c’è un enzima chiamato AG
(coinvolto nella differenziazione, proliferazione e
terminazione del meristema floreale), che sopprime
WUS, In FAS sia CLV3 che AG sopprimono WUS,
mentre in LC/FAS AG non è attivo e quindi WUS è più
libero. OVATE è stato mappato su chr2 e codifica per
una proteina che dà la tipica forma a pera ai pomodori,
(uno SNP che porta ad un codone di stop prematuro).

Agamus (mutante coinvolto nella proliferazione florale)

se overespresso diventa regolatore del numero di loculi.
Ovate è stato mappato sempre sul cromosoma 2 e
agisce durante la formazione del gineceo (forma a pera
del pomodoro).
Gene SUN influenza uno sviluppo longitudinale. Dato
dalla duplicazione del gene dal cromosoma 10 al
cromosoma 7.
FW2.2 è un QTL mappato su cr2 se mutato porta a
bacche più grandi. Anche FW3.2 che va a determinare il
peso del frutto se mutato da uno SNP, incrementa le
dimensioni del pericarpo e del setto.

Origine delle arance rosse: controllo da parte dei

retrotrasposoni sulle antocianine. Geni Myb coinvolti
nella regolazione delle antocianine (amminoacidi ed
esoni) il suo trascritto viene chiamato ruby ed è
responsabile nella produzione di antocianine in foglia,
ma è presente sia arancia rossa che bionda. Ciò che
cambia è l’espressione, se espresso allora si ha la polpa
rossa, sennò quella bionda. A scenda dell’espressione
si avrà la polpa più o meno rossa. A monte del gene
RUBY è presente un retrotrasposone ovvero un forte
attivatore trascrizionale. Il livello di espressione cala o si
alza in base alla temperatura.

Biodiversità genetica e varietale: il primo livello sono i

wild type, poi gli ecotipi e infine le varietà locali. Le
varietà locali sono varietà affermatesi grazie all’uomo.
Come fonte di varietà naturali non sono utili solo le
varietà locali o gli ecotipi, ma anche i mutanti o ibridi
interspecifici.
La selezione porta ad un'uniformità di colture e per
molto il concetto di biodiversità è stato trascurato. I rischi
collegati alla perdita di biodiversità sono: erosione
genetica, perdita di geni e genotipi che potrebbero
rivelarsi utili se cambiassero le esigenze biologiche-
socioeconomiche.
In passato eravamo raccoglitori e quindi ci nutriamo con
migliaia di specie, tre specie la fanno da padroni che
sono frumento, riso e mais.

Ci sono però delle conseguenze:

Ø Maggiore rischio di diffusione delle malattie → se abbiamo
del materiale omogeneo
quando emerge un patogeno se tutte le piante sono
simili tutte sono sensibili se una
lo è. Molte carestie sono dovute a questo:
o 1850 peronospora della patata in Irlanda
o 1970 ibridi di mais maschiosterilità e associazione alla
sensibilità della sporiosi
(epidemia)

Ø Concentrazione del mercato dei semi a livello di poche

grandi imprese multinazioni →
produzione serve investimento notevole e in alcune aree
del mondo tende a far
sparire i piccoli agricoltori
Ø Impossibilità di costruire delle nuove varietà → spesso
varietà ibride sono sterili o
bassa produttività della progenie
Ø Omogeneizzazione alimentare e culturale → tendenza a
questo (ma esagerazione)
La biodiversità va conservata nella sua globalità.
Per conservarla nel tempo dagli anni 60-70 sono nate
delle iniziative che avevano come obiettivo
di fondo di conservare la biodiversità in banche del
germoplasma → conservazioni ex situ (al di
fuori del luogo di coltivazione). Normalmente si è
all’interno di strutture fisiche che contengono
a temperature controllate che contengono sementi e
quindi fonti genetiche. Conservare una
busta di semi è funzionale perché risparmio spazio
rispetto all’organismo vivo. Possiamo
conservare moltissime risorse in poco spazio. Anche la
gestione è più semplice perché
conserviamo in forme ferme.
Il problema è che le piante quando sono nell’ambiente
sono sottoposte a selezione continua e se
le mettiamo nelle banche non si selezionano (anche noi
selezioniamo delle piante) (NB meglio
che niente). Alcuni semi possono essere conservati in
azoto liquido o in colture in vitro.
Possiamo anche avere una conservazione in situ,
ovvero il mantenimento delle varietà locali nei
luoghi di origine. È più complicato e va fatto fare a
coltivatori che hanno già lavorato con quel
materiale (devono essere agevolati a conservare quel materiale
genetico) → viene detta anche
conservazione on farm. In questo modo non blocchiamo
la selezione, ma tutto il suo habitat
(comprese colture che stanno dietro a quella
coltivazione). Il problema è che questo ha un costo
molto grosso e non si possono lasciare lì, ma devono
essere mantenute (fare proprio agricoltura).
Spesso ci sono progetti a sostegno della coltivazione di
queste pianta.
Abbiamo due grandi obiettivi:
- Tutto il materiale che è a rischio di estinzione
- Materiale per il miglioramento genetico (sorgenti di
geni utili)
Es. adesso c’è tantissimo interesse a piante resistenti
ad una mutata condizione ambientale
(anche con poca acqua). Si fa quindi tantissima analisi
su materiale esistente che ha la
predisposizione a vivere senza acqua.
Una collezione ex situ:
¶ Missioni di esplorazione e raccolta di materiale (è una
cosa che deve essere pianificata)
¶ Raccoglierlo e registrarlo su schede (con luogo di
campionamento, ecc..)
¶ Valutati fenotipicamente
¶ Eventuale moltiplicazione → anche sottoforma di seme
vanno a morire e devono essere
moltiplicati nel tempo
¶ Preparazione del campione
¶ Caratterizzazione
¶ Conservabilità
¶ Monitoraggio vitalità → quando seme sta per morire deve
essere ri-piantato
¶ Ringiovanimento
¶ Distribuzione del campione → non solo in un posto e per
una banca, ma anche per studi

La forma più conservata è il seme (viene conservato

naturalmente), in spazi ristretti e facili
scambi e trasferimenti.
Possono essere anche conservati individui vivi (quando
specie che non producono semi e quindi
sterili, oppure quando semi non facilmente conservabili,
rischio di perderli, necessità di spazi e
cure)
Possiamo conservare anche il polline (conservabilità più
bassa del seme, con polline non
possiamo fare nulla se non abbiamo la portaseme).
Possiamo conservare anche colture cellulari, colture in
vitro (si fa per specie sterili o per un
certo genotipo in purezza, anche in questo caso qualche
rischio perché possono essere infettati,
devono essere trapiantati e rischio di introdurre
mutazioni somaclonali).
È importante registrare alcune informazioni perché
venga riutilizzato il seme in un futuro
(identificazione geografica del sito, altitudine ed
esposizione, dati climatici e pedologici, dati
vegetazionali).
La valutazione per i principali caratteri morfo-fisiologici
ed agronomici deve essere il più
possibile oggettiva e ripetibile. Ogni specie ha i suoi
descriptors: parametri descrittivi che
consentono di acquisire informazioni standardizzate e
facilmente immagazzinabili e consultabili
nei database delle banche del germoplasma di tutto il
mondo. Se dobbiamo caratterizzare in
modo fenotipico una specie dobbiamo subito cercare il
suo descriptor. Devono essere inserite
queste informazioni su un database.
Collezioniamo:
¯ Collezioni di base → ci permettono una vera e propria
conservazione nel lungo periodo,
dovrebbero comprendere la maggior parte della
variabilità genetica della specie,
materiale non usato per miglioramento, ma solo per
aumentare la vitalità e la
numerosità della specie. È importante avere dei duplicati
per evitare di perdere tutto
a causa di danni.
¯ Collezioni di lavoro → servono per fare scambi e invio di
materiali, conservati per meno
tempo e meno numerosi

Quando vado a collezionare devo capire quanto

materiale raccogliere. Dipende dal sistema di
propagazione:
o Specie a propagazione vegetativa → almeno 20-30 individui
per area (meno variabilità
genetica)
o Specie autogame → meno variabilità e quindi 40-60
campioni
o Specie allogame → maggiore variabilità e quindi 80-100
campioni
Dietro a questo numero ci sono studi probabilistici. Le
procedure di campionamento sono casuali
perché non sappiamo per quali esigenze serviranno.
Talvolta posiamo campionare sulla base di
caratteristiche morfologiche in base ai criteri di
interesse.
quando vado a campionare devono sapere la
disposizione delle specie nel territorio.

Le piante spesso muoiono anche sottoforma di semi se

passa del tempo. Si interviene quando la
germinabilità dei semi accenna a diminuire (massimo
10% in meno rispetto a quella iniziale). Si

utilizzano almeno 50-100 piante. Si deve operare in

isolamento (soprattutto per specie allogame).
Si deve operare nello stesso ambiente in cui
l’accessione è stata prelevata (per evitare selezioni
indesiderate)
FATTORI CHE INFLUENZANO LA CONSERVABILITÁ
DEI SEMI
1. INTERNI
a. attitudine genetica
b. tipo di sostanze di riserva
c. vigore iniziale - maturazione
d. condizioni durante la formazione dei semi
2. ESTERNI
a. umidità (4-6%)
b. temperatura (3-4°C per brevi periodi; -20°C per lunghi
periodi)
c. atmosfera

ci sono dei semi che non accettano di essere osservati. I

semi che riusciamo a conservare sono
detti semi ortodossi (Mantengono la germinabilità per
lungo periodo in condizioni ottimali di T°
ed Umidità (Condizioni ottimali: U. del 3-7% a -18-20°)),
ma ci sono dei semi che muoiono a
queste condizioni e sono detti semi recalcitranti
(Perdono velocemente la loro vitalità quando
sottoposi a basse T° ed Umidità (Condizioni ottimali: U.
del 30% a 0-10°)). Spesso di questi ultimi
si usa le conservazioni di parti vegetative con
micropropagazione.
Il mantenimento di queste strutture costa moltissimo,
inoltre devono essere pensate sia come
conservazione sia come ricerca e questo serve anche
per ricevere finanziamenti. Inoltre, devono
essere accessibili alle persone (sono risorse che
servono). Ci sono quindi dei database in cui puoi
addirittura, ordinare dei semi. Il più importante catalogo
è l’EURISCO.
È nata una sensibilità sulla biodiversità negli anni 60-70.
In particolare, la consapevolezza è
arrivata come conseguenza della rivoluzione verde,
processo nel dopoguerra fino ad oggi che ha
portato ad un aumento della produzione (es tipico il
frumento). Da una parte ha portato
ricchezza, ma dall’altra ha uniformato la variabilità
genetica. Sono nate così delle reti di
salvaguardia.
Rivoluzione verde è un termine che è stato inventato per
indicare il nuovo apporto di sementi e
mezzi tecnici ha portato aumento di produzione a parità
di superficie di produzione. La rese dei
cereali è sempre cresciuta ed è rimasta costante la
superficie coltivata. Dal 1944 quando Norman
(premio Nobel) ha creato delle varietà a taglia bassa di
frumento. Sono nati poi anche dei centri
per le conservazioni della biodiversità nello stesso
periodo.
Il pioniere Borlaug (Nobel per la pace) ha creato varietà
a taglia bassa e distribuiva questi
materiali in paesi più poveri (in modo che ci fossero meno
perdite) → rese più elevate. Noi ora
sappiamo che questi frumenti della rivoluzione verde
sono dei mutanti RHt-B e RHT-D, che
producono proteine DELLA, repressori della crescita.
Sono delle forme alleliche che sono in
grado di degradare di più le gibberelline.
Bisogna tenersi delle risorse genetiche mentre si
attuava il miglioramento genetico. CGIAR,
gruppo di consultivo sulla ricerca agricola mondiale. Il
CGIAR è formato da 15 centri di ricerca e
si trovano in zone in cui le maggiori colture che usiamo
si sono originate. Ne fanno parte 47 paesi
e moltissimi enti (soprattutto quelli principali). CGIAR ha
fondato anche un ente chiamato IPGRI
che ora è diventato la Bioversity International. Ha diversi
obiettivi:
o coordinamento di iniziative internazionali per la
salvaguardia delle risorse genetiche
o organizzazione di missioni per la raccolta di
germoplasma
o realizzazione e supporto alle iniziative di carattere
locale
o formazione di personale specializzato nel settore
Ha la sede a Roma e vi aderiscono 51 paesi. Ci sono
ovviamente diversi centri che sono
responsabili di tre obiettivi: migliorare la specie, studiare
i sistemi colturali più idonei, creare
banche del germoplasma per conservare i tipi locali
delle singole specie.
Ci sono diversi tipi di enti come ENSCONET, la sede è a
Londra.

Uno dei centri più importanti è il Royal Botanica

Gardens, Kew. È un parco botanico con una
banca del germoplasma anche di funghi e di altro. Ha
sia conservazione in situ sia ex situ.
In Italia abbiamo enti essenzialmente nazionali. Anche
noi abbiamo una piccola banca del
germoplasma che sono però varietà locali (su fagiolo,
peperone e carciofo).
Tutte queste collezioni sono affiancate da analisi del DNA →
associamo geni a caratteristiche.
La sensibilità per la conservazione è cresciuta e nel
1992 tutti i capi mondiali hanno concordato
sull’esigenza di avere una strategia comune e globale
sullo sviluppo sostenibile che tendesse a
conservare anche le risorse energetiche. Sono emersi
alcuni accordi, la più importante è la
convenzione sulla biodiversità (CBD) firmata da 193
Parti. È giuridicamente vincolante e si basa
su:
1. conservare la biodiversità
2. uso sostenibile della biodiversità
3. giusta ed equa ripartizione dei benefici derivanti
dall’utilizzo delle risorse genetiche
il terzo punto importante perché spesso le risorse si
trovano nei paesi non sviluppati e quindi
questo è utile per gestire i rapporti con questi paesi.
La convenzione copre la biodiversità su tutti i sistemi e
si attua in base a due protocolli: Protocollo
di Cartagena e Protocollo di Nagoya (risponde
direttamente al terzo obiettivo della CBD e adotta
un quadro giuridico condiviso che regolamenta l’accesso
alle risorse genetiche e garantisce una
equa ripartizione dei benefici derivanti dal loro utilizzo.
Da un lato, il Protocollo faciliterà
l' accesso alle risorse genetiche e alle conoscenze
tradizionali, dall’altro sosterrà la giusta ed equa
ripartizione dei vantaggi con il paese fornitore e le
comunità indigene e locali. La sua
applicazione fornirà maggiore certezza giuridica e
trasparenza, facilitando sia per i fornitori che
per gli utilizzatori l’accesso alle risorse genetiche ed alle
conoscenze tradizionali). Il protocollo
sostiene la biodiversità e la sua ripartizione. Esistono
delle normative che si basano su questo
protocollo e impediscono lo sfruttamento di questi
territori.

The end…