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1.Struttura del DNA e dellRNA.

ESPERIMENTI
-Max Delbruck e Salvator Luria: esperimenti con il fago
-Mendel: basi dellereditariet
-Mischer: isola il DNA (nucleina)
-Griffith: esperimenti sullo STREPTOCCOCCUS PNEUMONIAE che ha due colonie:
1. R(ough) non virulento 2. S(mooth) virulento . Si uccidevano (col calore che
denaturava le proteine) delle cellule S, e pezzi di DNA potevano ricombinarsi
con cellule R e uccidevano la cavia. Inoltre le cellule S vive erano trovati nei
campioni di sangue della cavia.
-Avery, Mc Leod e McCarty: una cellula uccisa con il calore, frammenti di DNA
si ricombinano con unaltra cellula: si scopre pertanto che il principio
trasformante il DNA.
- Hershey e Chase: usano isotopi radioattivi, 32p per il DNA e 35s per le
proteine. Dimostrano che il responsabile dellinfezione di E.Coli il DNA.
-Mischer: sottopone le cellule a soluzione alcalina e poi acido per separare
citoplasma e nucleo: ottiene la nucleina e stabilisce che gli acidi nucleici hanno:
un gruppo PO4 3-, uno zucchero a 5atomi di C e una base azotata
(costituiscono un nucleotide; conosciamo due tipi di nucleotidi: Purinici con 2
anelli, adenina e guanina pirimidinici 1 anello, citosina e timina).
Pi nucleotidi (per eliminazione di un H2O tra lOH e il carbossile del Carbonio
4) si legano in modo casuale tramite un legame fosfodiestereo e si susseguono
in direzione 5 3.
-Chargaff: primi anni 50 (esperimenti sul DNA idrolizzandolo con acidi forti) e
giunse alla conclusione che le concentrazioni erano tali che A=T e C=G quindi
A si appaia con T con 3 legami a H e C con G con 2 legami ad H. Questo
appaiamento fa si che la distanza tra le basi sia costante (10,8 A)
STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI
-Legame a H: *interazione dipolo dipolo tra: 1 un atomo di H legato a un atomo
elettronegativo (O o N) e dunque delta+ e 2 un atomo elettronegativo delta
meno. *Energia= -3/-7 kcal/mol. * un legame direzionale
-Forze di Van Der Waals: *interazione dipolo istantaneo-dipolo indotto;
*Energia=-1 kcal/mol.
Un tipo di forza di Van der Waals sono le forze idrofobiche i cui gruppi apolari in
soluzione acquosa tendono ad avvicinarsi escludendo lacqua.
-Conformazioni: pirimidine: *amminica (presente in natura) *imminica
Purine: *chetonica (presente in natura) e *enolica
(Differiscono per gli H donatori e accettori di legame).
-2 Filamenti con direzione antiparallela: il primo in direzione 5 3, il secondo 3
5.
-Struttura elicolidale destrogira (scoperta da Rosalind Franklin tramite
diffrazione a raggi X. Watson e Crick realizzarono il modello tridimensionale).
La struttura elicoidale comprende: * un giro dellelica=3,4nm=10,5 coppie di
basi; * solchi (maggiore 2,2 nm-minore 1,2 nm), il solco maggiore fonisce
informazione per legare le proteine basate su un codice ADMH di:
Accettore di legame a H
Donatore di legame a H
M gruppo metilico
H idrogeno non polare. Es. G-C: AADH C-G:HDAA A-T: ADAM T-A: MADA

-Conformazione:
A-Dna: pu essere riscontrata in condizioni patologiche, in caso di
disidratazione del DNA. In condizioni fisiologiche essa caratterizza la
conformazione degli eteroduplex di DNA-RNA e le associazioni DNA-proteine.
Z-Dna: con andamento sinistrorso, riconosciuta dalle Z-DNA binding proteins.
presente in caso di metilazione o in sequenze ricche di basi C e G.
B-Dna con passo=3,4 nm rappresenta la forma pi comune nelle cellule
eucariotiche.
-Nucleoside= zucchero pi base azotata con un legame beta-N-glucosidica tra:
*C anomerico del 2-deossi-ribosio *N-1 della base pirimidiniche *N-9 della base
puriniche. Del legame beta-N-glucosidico possiamo avere una conformazione
Sin delle purine nel Z-Dna (le pirimidine resta anti); e una conformazione Anti
nel normale DNA destrogiro.
NB nel processo di denaturazione esso risulta reversibile, a differenza delle
proteine, se il raffreddamento avviene lentamente. Avviene alla temperatura di
melting, che dipende dalla composizione nucleotidica: se la molecola ricca di
C-6 pi alta perch dobbiamo rompere pi legami.
-Forma: circolare nei batteri plasmidi e virus; superavvolta dove LK=Twist +
writhe (negativamente nelle cellule eucariotiche).
LK= linking number
Twist= avvolgimento, numero di volte che un filament gira intorno allaltro
Writhe: superavvolgimento, avvolgimento della doppia elica lungo lasse
longitudinale (numeo di incroci).
Le forme di Dna superavvolto possono essere: *Pectonemico, con asse
longitudinle avvolto su se stesso (nei nostro cromosomi) *spirale, con asse
longitudinale avvolto intorno alla proteina.
NB il rilassamento del Dna con Dnasi I rimuove i superavvolgimenti. Le
topoisomerasi sono degli enzimi utili negli eventi di trascrizione e replicazione
del Dna, decatenano e districano il Dna.
Le topoisomerasi II funzionano ad ATP tagliano nettamente tutti e due i
filamenti del Dna e permettono il passaggio di un tratto di elica integra
attraverso il taglio e risaldatura del taglio. Per saldare si ha il gruppo OH sul
legame fosfo-tirosina. Le topoisomerasi II cambiano pertanto il numero di
legame di 2 unit per volta.
Le topoisomerasi I funzionano senza ATP, agiscono su un singolo filamento
effettuando un taglio detto nick che permette il passaggio del filamento integro
attraverso il nick che verr poi saldato. Meccanismo di azione: una sua tirosina
va a legarsi al fosfato dove stato indotto il taglio, c una dilatazione, poi il
taglio e il cambiamento.
Le topoisomerasi generano topoisomeri di DNA, che differiscono per il linking
numer. Essi si posso separare mediante elettroforesi.
2.Rna
Molecola a singolo filamento ottenuta per trascrizione dal DNA, dove un
filamento di DNA viene trascritto in un filamento di RNA complementare.

Diverso dal Dna per il ribosio e luracile (senza un gruppo metilico al C5) al
posto del deossiribosio e della timina.
Il singolo filamento pu avvolgersi su se stesso (e formare strutture secondarie,
terziarie e quaternarie) e avere tratti a doppia elica appaiando le basi della
stessa catena. Questo appaiamento non continuo ma c solo fra zone di
complementariet.
-struttura a gemma: quando c un solo nucleotide non complementare si
forma una singola protrusione
-struttura ad ansa: numero maggiore di nucleotidi non complementari
-a fiorami: numero ancora maggiore di nucleotidi non complementari. Quando
si formano, si creano zone consensus che fanno si che possa legarsi le proteine.
Ci sono anche appaiamenti non canonici, oltre a A U e C G (es- G U) che
formano TETRALOOP, quando ci sono 4 nucleotidi specifici.
-pseudonodi: sono coinvolti nel controllo dellespressione genica.
N B lappaiamento non canonico d vita ad una struttura che pi simile allADna, con un solco maggiore pi stretto, minore specificit.
Tipologia di Rna
-Rna codificante (4%)pre-mRna->m-Rna
-Rna funzionale: Pre-rRNA->rRNA (qui si lega la ricina e d morte- 0,2 mg
letale-sub maggiore del ribosoma segmento sarcina-ricina)
Pre-tRna->tRna (20 specifici per i 20 amminoacidi)
Sn-Rna, RNA, miRNA, siRNA (tutti microRna la cui funazione
: *funzione regolatoria sullespressione genica, nellembrione soprattutto
*sono presente anche nel sangue circolante e potrebbe essere biomarcatore
*sono coinvolti in patologie con difetti del differenziamento.
Influenza di ph e temperatura: TEMPERATURA, se maggiore di quella
ambientale, lRNa si denatura
PH, determina la configurazione dellRna
Per ricercare molecole a fini terapeutici si sintetizzano RNA fino a 100
nucleotidi con sequenze che interagiscono con determinate proteine.
1lisi della cellula
2 cromatografia: si utilizzano colonne ecomatografiche con dentro una matrice
solida di SEPADEX formata da piccole sferette che lasciano uno spazio detto
spazio escluso. Praticamente si va a frammentare la cellula nei suoi costituenti
che attraversano questi spazi grazie a una soluzione tampone che mantiene
costante il pH. Prima metto la miscela, poi introduco gradualmente la fase
mobile e recupero le sostanze in frazioni diverse. Si divide in: *a esclusione
molecolare, forma frazione a seconda della grandezza. *Di affinit, alle sfere
aderisce un anticorpo che reagisce con una specifica molecola. Se vogliamo un
particolare RNA, mettiamo il DNA complementare sulle sferette cos otterremo
lRNA di nostro interesse. Se vogliamo che si distacchi, bisogna alterare il pH o
la forza ionica.
3 PCR per lamplificazione del campione. Ottengo quindi degli aptameri,
molecole di RNA tridimensionale con appaiamenti canonici e non canonici che
interagiscono con determinate proteine OVEREXPRESSED

4 test della sopravvivenza dellaptamero in circolazione (per controllare se


viene attaccato dalle ribonucleasi). Per assicurare la sopravvivenza:
*NANOTRAIN=legame tra aptamero e deossirubicina *associazione con micelle.
NB lRNA facilmente idrolizzato in acido a caldo in NaOH a freddo.
RIBOZIMI=molecole di RNA con attivit catalitica
Es. -ribozima con capacit di legare legami fosfodisterici su altri RNA
-Ribosoma: catalasi del legame peptidico
-trasformazione patologica della proteina primaria
Nellipotesi del mondo a RNA ribozimi e ribosomi sono i fossili di una vita
passata basata su RNA, i cui ruoli furono poi affidati a DNA e proteine.
Propriet: *autoduplicazione *catalisi di semplici reazioni chimiche * formazione
del legame peptidico ad opera dei ribosomi=proteine+ 2 filamenti di rRna
Strategia Selex: 1selezione di Rna affine al ligando-2 lo isolo-3 lo amplifico con
PCR- RNA con sequenza casuale- si torna a 1.
3.La struttura del genoma
Cellule procariotiche:
*dimensioni-1micron
*assetto cromosico-aploide
*DNA nucleoide in ununica copia-circolare
*Numero di geni 500-6000
*densit genica 800-1000
*introni assente
*Proteine associate-si (in particolare plasmidi, proteine circolari utilizzate
tramite clonaggio per studiarne il DNa;
Funzione accessorie dei plasmidi: *produzione o resistenza a antibiotici, a
metalli pesanti, a raggi UV * utilizzo di fonti di carbonio insolite o fissazione di
azoto inorganico nel suolo * produzione di proteine in grado di uccidere i batteri
*virulenza).
Cellule eucariotiche:
*dimensioni 10 micron
*assetto cromosomico n 2n xn
*DNa lineare
*proteine associate si
*numero di geni maggiore o uguale a 30000
*densit 9,37
*numero di basi corredo aploide 3 miliardi
*lunghezza 4 metri
*numero di introni varabile
Funzioni delle proteine associate: *condensazione, protezione del DNA (i legami
fosfodiesterici sono molto fragili), espressione genica. Se manca questo ruolo
alcuni geni possono essere attivati quando non dovrebbero e diventano
oncogeni.

Il genoma umano formato da: 1. Geni e sequenze correlate ai geni 2.DNA


intergenico.
1. Comprende geni e sequenze correlate (introni, frammenti genici,
pseudogeni)
2. Comprende sequenze altamente ripetute e altre regioni intergeniche
(microsatelliti e sequenze uniche di DNA: regioni regolatrici, miRNA). I
microsatelliti sono caratteristici di ciascuna persona.
Gene: unit ereditaria che ha: *una regione a monte (zona regolatrice) *regioni
codificanti *regioni non codificanti.
Splicing: rimozione delle regioni non codificanti e assemblaggio di quelle
codificanti.
Pseudogeni: geni privi di introni ricavati per trascrittasi inversa.
Gene funzionale TRAMITE SPLICING E TRASCRIZIONE Rna TRAMITE
TRASCRIZIONE INVERSA DNA AVVIENE POI REINTEGRAZIONEPseudogene
Cromosomi: 50%DNA + 50% proteine (divise 90% istoni e 10% proteine non
istoniche HMG)= cromatina che sui condensa in mitosi e meiosi per la corretta
segregazione. Leucromatina risulta meno condensata e ha attivit
trascrizionale; leterocromatina pi condensata e non presenta attivit
trascrizionale.
Componente fondamentale: nucleosoma (a forma di chela)=core istonico (8
istoni di 4 tipi, H2A H2B H3 e H4) + DNA (147 coppie di basi). Due nucleosomi
adiacenti sono uniti da DNA linker (20-60 coppie di basi).
*Gli istoni legano porzioni di Dna che non stanno facendo trascrizione,
replicazione e ricombinazione.
*sono il 90% delle proteine del Dna
*hanno cariche positive per associarsi al Dna, basiche con 20% tra arginina e
lisina
*sono codificate per far avvenire la trascrizione
*tipologie: H1 (lega il Dna) H2A H2B, H3 e H4(queste ultime due sono per
lassemblaggio ordinato), H5. Prima il tetramero H3 H4 poi H2A H2B. Divisione
semiconservativa met vecchi e met nuovi.
*le code N-terminali sporgono allesterno del nucleosoma e posso subire
modificazioni post-trasduzionali che modificano la funzione del nucleosoma
(acetilazione, metilazione e fosforilazione).
Struttura del nuclesoma:
1 interazione core istonico-Dna= priva di specificit, si formano 140 legami a
idrogeno con gli atomi che ossigeni dei legami fosfodiesterici per lo pi del
solco minore (133) che del solco maggiore (solo 7). N.b. grazie alle cariche
basiche degli istoni che mascherano le cariche negativa del fosfato si pu
avere avvicinamento.
IMPORTANTE: interazione tra istone H1-Dna Linker: produce un maggiore
compattamento del Dna. Si forma la fibra da 30 nm (modello a solenoide o a
zig zag) con il contributo delle code N-terminali degli istoni che mediano le
interazioni (legami a H) tra nucleosomi adiacenti.
La fibra da 30 nm un primo impacchettamento ma non sufficiente: ulteriore
compattamento si ha grazie allo SCAFFOLD NUCLEARE, una struttura proteica
di cui fanno parte le topoisomerasi II e le proteine SMC per la formazione di
anse. La regolazione dellinterazione core istonico-Dna avviene grazie ai

complessi di rimodellamento nucleosomico (con richiesta di ATP). Quindi i


nucleosomi non sono fissi: si posizionano specificamente (soprattutto quelle nei
siti che controllano la trascrizione) e ci avviene grazie a: *tratti del Dna
intrinsicamente curvi *proteine
2Alterazioni della funzione della cromatina per modificazioni post traduzionali
della coda N-terminale
Le modificazioni della coda N terminale formano un codice riconosciuto da
proteine regolatrici dellespressione genica. Esse sono:
*acetilazione su lisine, rende la cromatina trascrizionalmente attiva
ATTIVAZIONE
*fosforilazione su serine ATTIVAZIONE
*metilazione su lisine REPRESSIONE arginina ATTIVAZIONE
*aggiunta di proteine (es. ubiquitinazione) R/A
*cambiamenti strutturali degli amminoacidi (es isomerizzazione) della prolina
R/A
Le proteine regolatrici poi hanno:
*BROMODOMINI che interagiscono con code acetilate
*CROMODOMINI che interagiscono con code metilate
Gli enzimi responsavili delle modificazione sono: *acetiltransferasi e deacetilasi
*metiltransferasi e demetilasi (dunque i complessi di rimodellamento e le
modificazione post-traduzionali agiscono per modulare laccessibilit alla
cromatina.
REPLICAZIONE E ASSEMBLAGGIO DEI NUCLEOSOMI
Replicazione vecchi istoni in entrambi i cromosomi duplicati i tetrameri H3:H4
e i dimeri H2A:H2B sono o tutti nuovi o quelli parentalidistribuzione tale da
permettere la trasmissione dello stato della cromatina ad entrambe le molecole
di DnaAssemblaggio=processo spontaneo che richiede fattori portati dagli
istoni con cariche - : PCNA CAF-1 NAP-1.
4.Replicazione mutabilit e riparo del Dna
3 meccanismi erano inizialmente possibili:
- Modalit dispersiva, con alternanza di pezzetti di molecola parentale a
molecola neosintetizzata
- Modalit semiconservativa, i due filamenti si separano e ciascuno funge
da stampo, cos da avere due molecole di DNA ciascuna formata da un
filamento parentale e da uno ex novo
- Modalit conservatrice, la molecola parentale ridotta e le molecole
nuove sono sintetizzate ex novo.
Nella cellula si verifica il modello semiconservativo: vennero utilizzati per
dimostrarlo nucleotidi con N(15), pi pesante del solido N (14). Dopo la
replicazione, il campione veniva centrifugato con cloruro di cesio e si otteneva
un campione omogeneo. Dopo la 2 replicazione e nuova centrifugazione, si
ottenevano 2 tipi di molecole di Dna con peso molecolare diverso. Ci perch la
centrifugazione aumenta la velocit con la quale le molecole pi pesanti
precipitano. Tanto pi le molecole sono piccole tanto pi grandi saranno i campi
centrifughi da analizzare.
CENTRIFUGA: continui rotoli in cui inserire il materiale da analizzare fatti di
titanio affinch siano resistenti al calore. Esistono centrifughe da banco, da

pavimento e ultracentrifughe. Successivamente ad omogenizzazione (rottura


delle cellule), la centrifugazione permette di separare acidi nucleici e proteine o
ad es. Dna e Rna. Si sottopone il campione a forza centrifuga e si ottengono 2
frazioni: pellet, sul fondo; sopranatante.
REPLICAZIONE:
1. Denaturazione: per separare il DNA nei suoi due filamenti (con Dna
elicasi), un processo necessario perch le Dna polimerasi abbiano
linnesco (primer) a doppio filamento.
2. Sintesi, la quale richiede: 4 desossinucleotidi trifosfati, enzimi, complesso
innesco-stampo.
necessario che avvenga la reazione tra il 3OH e lalfa fosfato(uno dei tre
gruppi fosfato, insieme a beta e gamma, numerati a partire dallOH 9) che
procede in direzione 53.
Si verifica lappaiamento delle basi. il deltaG di questa reazione 0 ma la
liberazione dei gruppi fosfati, dissociati a pirofosfato, ha deltag molto
negativo.
Oltre a consentire la polimerizzazione, la Dna polimerasi controlla il processo
e ha attivit esonucleasica.
Controllo del processo:
-la Dna polimerasi non distingue tra i 4 nucleotidi, ma riconosce la geometria
dei legami C:G e T:A. Soltanto le basi complementari posizionano: *il 3OH
sullinnesco * il fosfato alfa a una distanza utile per lattacco nucleofilo.
-discrimina tra nucleotidi e ribonucleotidi
Attivit esonucleasica: rimuove il nucleotide errato e unisce quello giusto.
STRUTTRA DELLA DNA POLIMERASI
-palmo: foglietto beta contenente gli elementi del sito catalitico mg e zn (2+),
ha ruolo nel coordinamento della conformazione delle proteine
-dita: trattengono nella giusta posizione il dNTP, curvano lo stampo per esporre
al sito solo la prima base, si aprono dopo la formazione del legame
fosfodiesterico per consentire lo spostamento del complesso di una coppia di
basi
-pollice: stabilizza il complesso enzima-substrato aumentando il numero di
nucleotidi che possono essere aggiunti.
n.b. le interazioni sono dinamiche, la Dna polimerasi a scivolare lungo lo
stampo.
Caratteristiche: processivit(capacit dellenzima di polimezzare n nucleotidi
nellunit di tempo), stadio limitante (legame della prima polimerasi al
complesso stampo-innesco, attivit esonucleasica (se viene incorporata una
base errata diminuisce laffinit per il sito catalitico, questi vengono rimossi
(DELETE KEY) e si ripristina laffinit cosicch continui la replicazione.
Meccanismo dazione: i due filamenti sono replicati contemporaneamente.
Vengono separati e i punti di inizio della replicazione sono detti forche di
replicazione. La DNA POLIMERASI funziona solo in direzione 5 3.
Sul filamento 53 ,detto leading strand, la sintesi pi veloce perch c solo
un innesco;
sul filamento 3 5, detto lagging strand, ci sono pi inneschi e la replicazione
pi lenta.

La polimerasi sintetizza in maniera discontinua e si formano frammenti di


OKAZAKI poi saldati. La dna polimerasi richiede un innesco che fornisca il 3
OH, prodotto dalle PRIMASI (rna polimerasi che sintetizzano rna primer che si
legano al dna in maniera random, quindi non sono sequenze specifiche, vanno
dunque a ibridare in maniera random.
Prima dellinnesco necessaria la separazione dei due filamenti, grazie alla
Dna elicasi (omoesamero che circonda ad anello un signolo filamento di Dna
che con lenergia dellATP va in direzione 5 3 o viceversa).
Attenzione! Il Dna a singolo filamento un pericolo a causa delle nucleasi: ci
sono delle proteine SSB che si legano al Dna non perch riconoscono sequenze
specifiche, ma perch riconoscono il singolo filamento, con un legame
cooperativo che favorisce lassociazione di altre proteine.
Lapertura del Dna e la replicazione possono portare a superavvoglimenti
positivi che devono essere rimossi: mentre nei procarioti (DNA circolare) serve
un taglio, negli eucarioti richiede lincremento della topoisomerasi II.
N.B. si parla di Dna elicasi nei procarioti e di MCM 2-7 negli eucarioti; si parlla di
SSB nei procarioti e di proteine RPA negli eucarioti.
TIPOLOGIE DI POLIMERASI
Nei procarioti sono almeno 5, negli eucarioti sono almeno 15: alfa fornisce
linnesco, delta per la replicazione del filamento lagging, epsilon per la
replicazione del filamento guida.
Le polimerasi differiscono per la processivit: dopo un tot. di nucleotidi
(SWITCHING) vengono sostituiti da altre polimerasi. La processivit
aumentata dalle proteine sliding clamp, collocate da un complesso caricatore
della sliding clamp dietro la DNA polimerasi, sono formate da 6 subunit che
circondano un anello delle dimensioni esatte del doppio filamento di Dna. Dopo
poche basi la polimerasi tende a staccarsi ma intervengono queste proteine
che lo posizionano.
C simultaneit nella replicazione: grazie al complesso della DNA polimerasi
oloenzima 3 i filamenti lagging leading possono essere replicati insieme.
formato da:
*3 core della DNA polimerasi III
*2 proteine
*5 proteine gamma (complesso caricatore della sliding camp) carica lo sliding a
livello del primer pi vicino.
*sliding camp
Al filamento 3 5 quando completata la sintesi di un frammento di Okazaki la
Dna polimerasi si stacca.
Dei core della polimerasi:
*un core associato al filamento guida
*un core associato al filamento discontinuo
*un core, libero, pu sintetizzare un nuovo primer per un nuovo filamento di
Okazaki. La dna polimerasi si lega al primer pi vicino e comincia la sintesi di
un nuovo filamento.
NB quando si forma la forcella di replicazione? Quando incontra unaltra che si
muove in direzione opposta.
Linterazione tra oloenzima e dna elicasi aumenta lattivit elicasica. Lelicasi
stimola lattivit della primasi.

MODELLO DEL REPLICONE per linizio della replicazione. Nel genoma ci sono
sequenze altamente metilate e ricche in A-T che sono quindi facilmente apribili.
Nel cromosoma ci sono pi siti di replicazione a seconda delle fasi del ciclo
cellulare.
Replicone: tratto di Dna compreso fra due forche di replicazione. Esso
comprende:
*replicatore (intero set di sequenze di Dna in grado di dirigere linizio della
replicazione=
*iniziatore (proteina che riconosce il replicatore e attiva linizio della
replicazione reclutando le altre proteine necessarie.
Inizio della replicazione nei procarioti: proteine iniziatrici legano il dsDna,
avviene la rottura dei legami a H, poi forcelle di replicazione. Il sito di origine
completamente metilato, poi inizia la replicazione e il sito emimetilato e si
lega la proteina SegA che rende lorigine di replicazione refrattaria, poi di
nuovo tutta metilata e non pi refrattaria e altre replicazioni.
Inizio della replicazione negli eucarioti: regioni diverse del cromosoma sono
duplicate nei momenti diversi della fase S. loridne? Dipende dalla struttura
della cromatina.
TELOMERASI: ribonucleoproteina che aggiunge al terminale 3 dei filamenti di
Dna. Sequenze ripetitive di Dna non codificante TTAGGG. Nel filamento lagging
quando si formato lultimo primer a Rna, il filamento di Dna verrebbe
accorciato ad ogni replicazione e ci evitato dalla telomerasi.
Non richiede innesco perch usa frammenti di Rna propri per lelongazioni
complementari alla sequenza telomerica per generare lo stampo-innesco. 7
*la telomerasi allunga il terminale 3 del telomero
*la parete allungata, senza stampo, pu funzionare per la sintesi di un
frammenti di Okazaki
*con la riparazione del frammento il telamero viene esteso
*la telomerasi si stacca perch ci sono proteine concentrate che delimitano il
Dna e che creano anse (LOOP) per proteggere il cromosoma.
CLONAGGIO
Utilizzato per identificare i repliconi nelle cellule procariotiche. Richiede:
*polimerasi (RNA DNA)
*nucleasi( endonucleasi che digeriscono il DNA allinterno, esonucleasi che
digeriscono il DNA allestremit)
*ligasi
*enzimi di restrizione (riconoscono sequenze di DNA e li digeriscono) sono
presenti tre classi:
1 sono sequenze indipendenti, hanno attivit di restrizione e metilazione della
stessa molecola
2 riconoscono sequenze specifiche, attivit di restrizione e metilazione su
molecole distinte
3 tagliano lontano dal sito di riconoscimento, attivit di restrizione e
metilazione sulla stessa molecola
In particolare, la classe II riconoscono sequenze specifiche a 6 coppie di basi
che tagliano in 3 modi:
*ECOR1: riconosce GAATTC; forma lestremit sporgente al 5
*BAMH1: riconosce CTTAAG; forma estremit 3 sporgente
*ECOR5: forma estremit blunt (determina un taglio netto)

Esistono numerosi enzimi di restrizione che riconoscono n basi con una


frequenza di taglio pari a 1.
Per studiare un certo frammento 4^n di DNA:
1. Digeriamo il dna e il plasmide(frammento circolare di DNA) con lo stesso
enzima di restrizione
2. Con le ligasi costruiamo un nuovo plasmide
3. La cellula batterica deve essere messa a contatto con il plasmide e deve
inglobarlo grazie a shock termico
4. La cellula posta in una cultura dove solo le cellule del plasmide con il
replicatore possono crescere
5. Purificazione del Dna
CONTROLLO DELLA REPLICAZIONE
Deve avvenire una sola volta per ciclo cellulare.
-fase G1: lelicasi caricata sul replicatore grazie a:
*iniziatore ORC che si lega al replicatore
* CDC6 e CDT1, caricatore delle elicasi, assemblano 6 subunit
*MCM 2-7 elicasi
Non c per attivazione
-fasi S G2 M:
*inibizione del caricamento di nuove elicasi
*attivazione delle elicasi caricate grazie alle cicline CDK e DDK che fosforilano
lelicasi
TERMINAZIONE DELLA REPLICAZIONE
In un cromosoma circolare si formano due anelli concatenati che vengono
separati dalle topoisomerasi II.
Nel cromosoma lineare il filamento lagging necessita della telomerasi
TELOMERO: allestremit del cromosoma sono sequenze non codificanti
contenenti un centinaio di ripetizioni della sequenza TTAGGG. Si accorciano con
la senescenza perch c un numero limitato di divisioni possibili (CPD)
dopodich la cellula va in apoptosi. Se manca il controllo di p53 o p16
(oncosoppressori) la cellula pu diventare immortale.
Patologie correlate: discheratosi= invecchiamento precoce dovuto ad assenza
dellattivit telomerasica; neoplasia: aumento dell80 o 90% dellattivit
telomerasica associata a mutazione di p53
MUTAZIONI: tutti i possibili cambiamenti che possono alterare la sequenza del
DNA
*puntiforme=alterazione di un singolo nucleotide, si divide in:
-transizioni, scambio purina purina o pirimidina pirimidina, non comportano
molti cambiamenti
-trasversione, scambio purina pirimidina
Le cause possono essere: errori nella replicazione, lesioni al DNA causate da
agenti chimici o radiazioni (idrolisi, deaminazione, ossidazione, raggi uv),
spontanee.
Mismatch: se una mutazione inizialmente sfugge, si creano appaiamenti
sbagliati. Interagiscono le proteine MUTS, MUTL, MUTH e vari enzimi, mentre le
telomerasi riparano il danno.

Idrolisi: sulla citosina avviene deaminazione e si forma uracile


Sulla guanina avviene rimozione e si forma deossiribosio
Sulla 5 metilcitosina avviene deaminazione e si forma timina
Alchilazione: sulla guanina causa alterazione dellossigeno 6 o dei due N
Ossidazione: agenti ionizzantiguanina che con radicali liberi forma
oxoguanina e si appaia A/C
Irradiazione: con raggi UV (*uva modificazioni indirette del DNA *uvb sono i pi
pericolosi perch sono maggiormente assorbiti dal DNA *uvc sono i pi energici
ma assorbiti dallo strato di O3, danno modificazioni simili agli UVB, inoltre
inducono la formazione di dimeri di pirimidine tra residui adiacenti.
Sostanze mutagene:
*analoghi delle basi azotate
*sostanze intercalanti (inserzioni e delezioni)
Come riconoscerle? Con il test di Ames(RETROMUTAZIONI)
Si usa la salmonella di tipo his che necessita dellistidina. Se hanno una
mutazione per listidina, vengono messi in coltura in un brodo di Sali e peptone
e al centro si pone una piastra con agar e un mutageno. Se questo ha
realmente effetto, in confronto ad una coltura dove il mutageno non cera,
avremo crescite di colonie molto pi fitte vicino al dischetto perch i batteri
hanno riacquistato la capacit di produrre istidina.
Come quantificare il Dna danneggiato? Con il COMET ASSAY
Durante lesperimento il Dna assume laspetto di una cometa: la testa il Dna
intatto, la coda il Dna danneggiato. anche detta tecnica a singola cellula: la
cellula inglobata nellagarosio e subisce lisi, il Dna marcato con la
fluorescenza e si sottopone a elettroforesi.
Il danno al Dna comporta evoluzione di meccanismi complessi per il riparo. Il
danno al Dna comporta: 1.alterazione di replicazione o trascrizione
2.mutazione.
Sistemi di riparazione:
-attivit esonucleasi 3 5 della Dna polimerasi (proofreading)
-sistemi di riparazione diretta (solo procarioti): 1. Fotoriattivazione tramite
fotolisi, enzima attivato dalla luce che ripara i dimeri di pirimidina 2.rimozione
del metile, tramite metil-transferasi
-escissione di base: rimuove la regione danneggiata producendo un gap che
viene riempito con nuova sintesi di Dna (1.una glicosidasi altera specifiche basi
che riconosce la posizione sbagliata 2.una endossidasi taglia la porzione in
eccesso. Nel caso non funzioni la glicosidasi c la GLICOSIDASI DI SICUREZZA
che ripara gli OXO-6, che riconosce la distorsione del Dna. Questo sistema nei
procarioti comprende 11 polipeptidi mentre negli eucarioti sono circa 25
polipeptidi. In particolare c una distorsione e le subunit UvrA e UvrB si
assemblano sul Dna e favoriscono la polimerasi elicasica. Si rimuove il
frammento e poi interviene la sintesi tramite Dna polimerasi.
PATOLOGIE CORRELATE: xeroderma pigmentoso (gene xPAC), anemia di
Fanconi, cancro del colon non poliposico (gene APC)
-TFIIH proteina fattore di trascrizione che riparano il Dna aprendolo a livello
della mutazione

-Riparazione per giunzione diretta delle estremit non omologhe mediante il


sistema NHEJ. Sistema utilizzato quando c la doppia rottura del filamento.
SINTESI DI TRANSLESIONE
Polimerasi di translesione: interviene al posto della polimerasi in quando si
incontra una lesione.
Ipotesi sul meccanismo dazione:
*sostituzione: quando si incontra la lesione, la polimerasi III con le sue proteine
si stacca, interviene la polimerasi di translesione, e poi sostituita dalla
polimerasi III
*riempimento: la polimerasi III salta quando incontra la lesione. Il buco
colmato dalla polimerasi di translesione.
Se questi meccanismi di riparazione non riparano il danno, la mutazione
persiste:
*nella cellula germina viene ereditata dalla progenie
*nelle cellule somatiche vengono ereditate da tutte le cellule che da esse
derivano per mitosi. Possono anche rendere le cellule cancerogene.
MUTAZIONI:
-piccola scala: 1.sostituzione 2.delezione 3.inserzione
-grande scala: 1.anormalit cromosomiche
Classificazione:
1.a seconda della cellula interessata( germinale o somatica)
2.a seconda dellentit (*puntiforme*genica*cromosomica*genomica)
3.a seconda dellorigine (*spontanea *indotta)
4.a seconda delleffetto
Mutazioni puntiformi:
-silenti: sostituzioni di una base che non determina variazioni nella sequenza
amminoacidica
-missenso: sostituzione di una base che determina variazioni della sequenza
amminoacidica ( patologica se la nuova tripletta codifica per un AA molto
diverso!)
-nonsenso: sostituzione di una base che determina la codifica per un codone di
stop (si forma una proteina incompleta)
-frameshift: inserzione o delezione tale che il numero di un nucleotide non sia
pi divisibile per 3 e si abbia uno slittamento della cornice di lettura (si forma
una proteina anomala che ha solo la porzione iniziale corrispondente
alloriginale e generalmente tronca)
-spicing: si verificano a livello delle giunzioni di splicing (*nelle sequenze ESE,
inclusioni di introni nellmRNA *esclusione di esoni dellmRNA
n.b. regioni hot spot: ho un elevata frequenza di ricombinazione (crossingover).
Regioni di Dna ripetitivo che possono indurre inserzioni o delezioni.
DIAGNOSTICA MOLECOLARE=rilevamento di mutazioni patogene in DNA RNA e
proteine per facilitare la diagnosi e la terapia.
Es. FTR gene modificato nella fibrosi cistica
PIX gene modificato nellemofilia.

*applicazioni: trattamento precoce, riduce la mortalit, riduce i trattamenti non


necessari, studio delle predisposizioni, diagnosi prenatale, tipizzazione del Dna.
Elettroforesi bidimensionale: per la separazione di miscele proteiche
complesse:
1. Taglio del Dna con enzima di restrizioni
2. Separazione del Dna nella 1 dimensione (grandezza)
3. Separazione del Dna nella 2 dimensione (grandezza e forma)
4. Trasferimento del Dna su nitrocellulosa
5. Marca il Dna proveniente da siti che rappresentano potenziale origine
delle replicazioni
*tecniche di base: enzimi di restrizione, determinazione di sequenze
nucleotidiche, ibridazione degli acidi nucleici, PCR, trascrittomica, proteomica
Dna purificato. Dove prelevarlo? Siero (plasma senza fibrinogeno, fattore VIII V
e protrombina), plasma, sangue utero, cellule buccale e cervicale, saliva,
liquido cerebrospinale, tessuti. Come ottenerlo? Rottura della cellula. Come?
Metodi blandi (lisi osmotica, freeze-thaw ovvero congelamento e
scongelamento, lisi con detergenti, lisi enzimatica, sonicazione ovvero
emissione di ultrasuoni, french-press ovvero lapplicazione di pressioni su
cellule batteriche e vegetali, mortaio e pestello prima le cellule in N liquido a
-195 e poi rotte con il pestello, omogenizzatori per le cellule soffici).
Ecco il processo: rottura delle cellule-centrifugazione per rompere tutto tranne
il Dna-trattamento con fenolo o proteasi per rimuovere le proteine-raccolta
della fase acquosa e aggiunta di enzimi per rimuovere lRNA-precipitazione
degli acidi nucleici con etanolo, centrifugazione, risospensione e
quantizzazione.
SPETTROFOTOMETRIA
Tecnica utilizzata per lanalisi degli acidi nucleici: qualitativa se ci sono
contraminazioni o quantitativa.
Meccanismo: da una sorgente luminosa la luce convogliata verso un
contenitore (cuvetta). Luce trasmessa: luce iniziale-luce assorbita(acidi
nucleici-picco di assorbanza di 260 nm o proteine-picco di assorbanza 280
nm).
POLIMORFISMI= mutazioni con frequenza maggiore dell1% in una popolazione.
Locus polimorfico= locus per il quale esistono pi alleli, ciascuno dei quali
presente in una popolazione con frequenza maggiore di quella attesa. Se
lallele ha frequenza minore dell1% si parla di variante rara e non
polimorfismo.
-polimorfismi di restrizione: una mutazione determina abolizione o creazione di
un sito per lenzima di restrizione. La digestione con lenzima genera quindi
frammenti di Dna diversi. Si pu verificare su uno o entrambi gli alleli
(polimorfismi biallelici)
-polimorfismi di singoli nucleotidi: variazioni di singole coppie di basi presente
un numero elevato nel genoma. Sono marcatori genetici e sono causa a volte
di polimorfismi di restrizione. (polimorfismi biallelici)

-polimorfismi di ripetizione: ci sono sequenze ripetute che contengono un


numero variabile di ripetizione. Possono essere: *minisatelliti *microsatelliti.
(polimorfismi multiallelici)
PCR
Sfrutta il sistema naturale di sintesi del DNA amplificando il campione in
maniera logaritmica raddoppiando ad ogni amplificazione il DNA stampo.
Amplicone: segmento di DNA (fino a 15-20mila basi) che viene delimitato da
due primers
Componenti:
volume di reazione (10-50 ml)
DNA (10-100 ng)
Taq polimerasi
dNTP
tampone: sale di tris + Mg
h2o stabile fino ad arrivare al volume di reazione
meccanismo:
1.sottoponiamo una molecola di Dna a T 95 gradi per 10 min e ho
denaturazione del Dna e delle proteine. In soluzione sono presenti i primers ma
a queste temperature non riconoscono il Dna
2.la temperatura abbassata tale che T<T dei primers. Abbiamo
annealing=riconoscimento tra primers e i filamento di Dna
3. la temperatura portata a 72 gradi e abbiamo massima attivit della taq
polimerasi che polimerizza il filamento complementare
Dopo il primo ciclo, diminuiscono i tempi.
Sts: sequenza corta di Dna che si trova solo una volta in un genoma. Si pu
localizzare con la PCR per orientarsi nel mapping del genoma.
Es. EMOCROMATOSI EREDITARIA: malattia autosomica recessiva che riguarda il
gene HFE che causa aumento del Fe; ci comporta alterazione dei potenziali
redox delle cellule cirrosi epatica (danni ingenti agli epatociti)
Mutazione del gene HFE: sito di restrizione anomalo, 2 possibili (SNAB1 BCL1)
Es. Test di paternit: i soggetti imparentati hanno gli stessi polimorfismi di
ripetizione. Ottengono ampliconi mediante primers che riconoscono particolare
regioni VNTR compreso tra due enzimi di restrizione e dopo amplificazione
sottopongo allazione degli enzimi di restrizioni.
5.Trascrizione
ESPRESSIONE GENICA: modalit mediante la quale sono prodotti gli RNA e le
proteine che determinano le funzioni cellulari e definiscono lidentit cellulare.
Controllata mediante: *trascrizione *maturazione dellRNA *traduzione
*modificazioni post-traduzionali
Proteoma: insieme delle proteine in un tessuto o nella cellula
Trascrittoma: insieme degli Rna trascritti in un tipo cellulare
CARATTERISTICHE DELLA TRASCRIZIONE
1. Non richiede lo stampo

2. La sintesi avviene a partire solo dal filamento senso letto in direzione 5


3
3. LRNA neosintetizzato ( costituita da ribonucleotidi e non rimane adeso
ma si stacca
4. Sul filamento stampo possono agire+Rna polimerasi
5. La trascrizione meno precisa della replicazione e si formano pi errori.
N.B. caratteristiche dellRna:
*singolo filamento con ribosio e uracile
*idrolizzabile mando a caldo o un NaOH a freddo
*assorbono la luce a 260 nm
*assume strutture secondarie
Tipologie
-specie stabili (4 tipi di rRna, tRna
-specie labili (pre-mRna e mRna)
*Rrna, tRNA,mRNA
*SnRNA, nucleare
*SnoRNA, nucleolare
*SiRNA, interferenti
*StRNA, temporali
RNA POLIMERASI: 1 nei procarioti, 3 negli eucarioti. Elevata conservazione.
Nelle RNA polimerasi ci sono subunit altamente conservate (V VI VIII X) e sono
essenziali. Le altre subunit hanno un ruolo accessorio e sono non essenziali.
-polimerasi I: nucleolo geni codificanti per RNA ribosomiali
-polimerasi II: nucleo, geni codificanti per RNA nucleare (SnRNA) e proteine.
-pol III: geni codificanti per tRNA, SnRNA, rRNA
-pol mitocondriali e cloroplastiche
Struttura a chela= in quella procariotica vi un core (contenente il macchinario
di trascrizione) si lega senza specificit al DNA acido che affine allenzima
(basico). Il fattore sigma media il legame al promotore. Quella eucariotica
possiede pi fattori detti insieme GTF
Fasi della trascrizione:
1. Inizio
a) La RNA polimerasi si lega al promotore (sequenze di Dna) che d inizio
alla sintesi in direzione 53 N.B. monodirezionale perch solo un
filamento funge da stampo!
b) Si formano i primi legame fosfodiesterici
In questa fase si sintetizzano 10 nt di RNA, per la RNA polimerasi si
stacca: solo se tutto ok essi si riattacca
2. Allungamento: la polimerasi si lega ancora pi saldamente allRNA. Essa
inoltre svolge e riavvolge il DNA, funziona da correttore tramite due
editing: *pirofosfolitico che rimuove solo un nucleotide, *idrolitico
rimuove pi nucleotidi.
3. La polimerasi si ferma e rilascia lRNA prodotto
Promotore: si lega alla polimerasi grazie al fattore sigma che ha 4 regioni di cui
*la regione 2 stabilizza
*regione 4 fa il legame (HELIX TURN HELIX)

Cosa ? Regione di DNA con sequenze consensus


Es. promotore pi semplice: 3 sequenze consensus a una distanza conservata:
*una a -10 basi dallinizio della trascrizione
*una a -3s e una tra -40 e -60 ELEMENTO UPSTREAM
n.b. non richiesto un primer, serve interazione tra polimerasi-ribonucleotidi di
inizio (adenina)
1. Inizio abortivo (3 modelli per linizio abortivo: *passaggio transiente: la
polimerasi serve lungo il Dna *a bruco: la porzione anteriore
dellenzima serve lungo il DNA, poi c una regione flessibile grazie alla
quale la regione posteriore resta sul promotore
*accartocciamento:lenzima resta fermo e tira dietro di s il DNA)
durante il quale vengono sintetizzati frammenti di RNA pi corti di 10
nucleotidi che vengono rilasciati ma la polimerasi non si dissocia dallo
stampo.
2. Allungamento: si ha quando si riesce a sintetizzare un frammento
maggiore di 10 nt
3. Distacco del fattore sigma che si lega al promotore alla sequenza tra -10
e -35
MODELLI DI INIZIO DELLA TRASCRIZIONE:
*passaggio transiente
*a bruco
*accartocciamento
Terminazione della trascrizione indotta da sequenze detti terminatori
-RHO indipendenti: sequenza palindromica di 20 nt (causa una struttura
stem-loop che a sua volta causa la rottura del complesso di allungamento) +
8 coppie di A-T (che causano legami A-U molto deboli). La struttura stemloop e i legami A U causano il distacco dallo stampo
-RHO dipendenti: proteina esamerica ad anello che utilizza lATP. Si lega
allRNA, ha attivit elicasica e lo stacca dal DNA.
Differenze con gli eucarioti: in pi hanno fattori GTF e il DNA associato a
nucleosomi
Purificazione delle proteina:
*omogenizzazione
*centrifugazione per precipitare organelli ecc.
*introduzione di enzimi che degradano ci che non ci interessa
*colpiscono la luce, se il picco di assorbanza=280 nm il composto puro.
POLIMERASI I-> PROMOTORE I (Rrna)
POLIMERASI II->PROMOTORE II (mRNA)
POLIMERASI III-> PROMOTORE III tRNA+microRNA
Promotore di classe I: 2 elementi con
*una spaziatura
*UCE
*promotore centrale

1.UCE lega UBF e SL1 che reclutano la polimerasi sul promotore centrale->la
polimerasi I riconosce il genere precursore dellRNA-> questo gene ha un
livello di espressione molto alto
2.il promotore I trascrive un RNA precursore che contiene 3 pezzi dellrRNA:
-45s
-lestremit S viene rimossa-> precursore 41s
-precursore 41 s viene scisso in: *precursore 20 s->rRNA 18 s e precursore
32 s->rRNA 5,8
NB pi polimerasi si legano per ottenere pi RNA
Nucleolo:sede del processo. Si trova nel nucleo in corrispondenza dei siti
cromosomici detti NOR contenenti i precursori dellrRNA.
Promotore di classe II: riconosciuti dalla pol II che contiene
-subunit centrale RPB1,2,3 (RBP1 contenente DOMINIO CTD ha una forma
sia fosforilata responsabile dellallungamento, e una non fosforilata che si
lega al promotore allinizio)
-subunit comuni: RPB5,6,8,10,12 presenti in tutte e 3 le polimerasi
-subunit non essenziali
Le polimerasi II trascrivono i geni che codificano per proteine
Struttura= promotore base di 70 bp che contiene alcuni elementi tra:
-BRE
-TATA BOX (sequenza consensus=TATAAA posizione=25-30basi a monte
ne prive=geni omeotici,houskeeping e associati allo sviluppo del sistema
immunitario)
-INR iniziatore(sequenza consensus PyPyAN(T/A)PyPy di cui A rappresenta il
punto di inzio della trascrizione ed N un nucleotide qualsiasi)
-DPE elementi promotori a valle (sequenza consensus= G (A/T) CG
posizione=30 basi a valle lega=TPIID insieme a INR)
ELEMENTI A MONTE GC BOX (sequenza consensus=ricca di GC posizione=
a monte di TATA BOX funzione= aumentano lattivit dei promotori)
SEQUENZE REGOLATORIE:
-enhancers: sequenze indipendenti dalla posizione. Sono ripetizioni di 72
basi distanti anche 20000 dal promotore incrementando la trascrizione
-silencers: silenziano la trascrizione
-UAS
ELEMENTO A MONTE------BRETATA-------INR---DPE
COMPLESSO DI PREINIZIO
Fattori generali di trascrizione + polimerasi legati al promotore=complesso di
preinizio
Funzioni del GTF: 1.aumentano la polimerasi a legarsi al promotore 2.a
separare il DNA 3.a passare alla fase di allungamento
COMPLESSO DI PREINIZIO DI CLASSE II= polimerasi II (TFIIA TFIIB,D,E,F,H) e in
ordine si legano DABFEH. TFIIAD-> riconoscimento di Tata BOX che d un

ripiegamento del DNA TFIIA B F E legame al sito di inizio


>dissociazione che richiede ATP

TFIIH-

NORTHERN BLOT: identifica lRNA per studiare lespressione genica


1.denaturazione
2.elettroforesi per frazionare il DNA
3.trasferimento su membrana di Nylon sfruttando la capillarit
4.ibridazione con una sequenza di DNA complementare allRNA
5.visualizzazione
Il complesso di preinizio stato dimostrato con GEL SHIFT.
Se un DNA deve migrare in un gel esso sar pi lento se associato a proteine.
Quindi:
1.marco il DNA con un isotopo radioattivo
2.lo mescola con un estratto proteico
3. lo associo a un anticorpo
4.faccio migrare in gel e quindi: a) la corsa rallentata se la proteina si associa
al DNA b)la corsa ulteriormente rallentata dallanticorpo che permette per di
identificare la proteina
Il complesso di preinizio stato dimostrato con FOOTPRINTING: permette di
identificare la precisa sequenza di DNA a cui la proteina si lega
SOUTHERN BLOT: tecnica usata per rilevare la presenza di specifiche sequenze
di DNA
WESTERN BLOT: tecnica usata per identificare proteine.
-TFIID: complesso proteico formato da TAFII e TBP (che interagisce tramite il C
terminale con TATA BOX nel solco minore, fa aprire il solco minore e piega TATA
di 80 gradi)
-TFIIB: due domini: *N-terminale che interagisce con la polimerasi e *Cterminale che interagisce con TBP. Tbp avvolge il DNA intorno a TBFIIBC cos
che TFIIBN posizioni la polimerasi sul sito di inizio.
-TFIIH: ultimo ad associarsi al complesso di preinizio, lo si trova in due modi:
*4 subunit, con attivit chinasica che va a fosforilare il CTD
*5 subunit con attivit DNA elicasica e ATPasica
La polimerasi 2 non fosforilata si unisce al complesso di preinizio, quando
fosforilata pu fare lallungamento.
Esso poi tramite idrolisi di ATP porta a dissociazione dei frammenti.
N.B. nel Dna eucoriatico impacchettato in nucleosomi servono altri componenti:
*Il complesso del mediatore: con funzione di assemblaggio e rimodellamento
della cromatina
*Proteine regolatrici della trascrizione
*Enzimi che rimodellano la cromatina come il complesso fact (SSRP1 SPT16)
che srotola i nucleosomi davanti alla Polimerasi II e li ricostruisce dietro di essi
ALLUNGAMENTO
Richiede:
-allontanamento del mediatore e dei fattori di inizio
-reclutamento dei fattori di allungamento
Entrambe le azioni avvengono grazie alla fosforilazione del CTD.
I fattori di allungamento sono:

*famiglia ELL (eliminazione di pauese temporanee


*TFIIF
*TFIIS (eliminazione di pause temporanee e correzione
*PTEFb: fosforila il CTD
N.b. il CTD prima fosforilato sulla serina S, poi fosforilata sulla serina 2.
TERMINAZIONE
*Modello a siluro: tutti i geni trascritti dal pol II presentano a valle un SEGNALE
di POLIADENILAZIONE. Quando Pol II lo incontra continua la trascrizione di una
sequenza che non va incontro a capping. Questa parte non fa parte della
proteina: il CAP protegge lestremit 5 mentre laltra tagliata dalla
ribonucleasi.
*Modello allosterico: dopo la trascrizione del segnale di poliadenilazione la Pol II
cambia conformazione e perde processivit.
PROCESSING DELLRNA
La maturazione comprende:
*CAPPING 5
*SPLICING
*POLIADENILAZIONE
Tutti questi processi richiedono fattori di cui alcuni sono reclutati da fattori di
allungamento
-capping: aggiunta di una base guaninica mediante legame 5-5
permettenndo:
*aumenti della traducibilit perch la proteina che si lega al cap immetta
lingresso dellRNA nel ribosoma
*facilita la traslocazione dal nucleo al citoplasma
*aumenta lefficacia dello splicing.
Quando? Quando lRNA lungo 20/40 nt, tra inizio e allungamento. Come? A)
lRNA trifosfatasi rimuove il fosfato allestremit 5 B) la guaniltranseferasi
aggiunge GTP idrolizzato a GMP liberando pirofosfato e forma il legame 5 5 C)
la metiltransferasi trasferisce il metile dalla 5-adenosilmetilamina alla guanina
in posizione 7.
Pi metilazione avvengono, pi cap ci saranno.
-poliadenilazione:
1. raggiungimento del sito di poliadenilazione che forma trascritti poliadenilati
Funzioni: protezione (attacco del 3 5 esonucleasi) e aumento traducibilit
LRNA trascritto in eccesso dopo la poliadenilazione verr rimosso
2.Reclutati da CTD due fattori: CPSF e CStF (sul segnale vengono reclutati CPSF
CStF->reclutano altre proteine->taglio dellRNA-> aggiunta della poli A (poli A
polimerasi)
3. lRNA maturo viene rilasciato dallRNA polimerasi
REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE:
-attivatore e repressore: proteine che legano il DNA in prossimit dei geni che
devono regolare e regolano lespressione genica. A che livello? Al livello del
promotore e della sequenza regolatrice (nelluomo sono presenti pi sequenze
regolatrici distanti anche molto dal gene interessato)
-attivatore trascrizionali: stimolano o inibiscono la trascrizione e forniscono il
livello a cui trascrivere legando: *enhancers *siti di regolazione

Struttura: 3 DOMINI
1.DOMINIO DI LEGAME AL DNA -> tipologie:
*moduli contenenti zinco (grazie allo zinco hanno una forma che si adatta al
solco maggiore del DNA):
a.dita di zinco: sono formate da un filamento b antiparallelo contenente
cisterne e da un alfa elica (contenente istidina). Cisteina e istidina sono
coordinate dallo zinco e formano il dito, e pi dita di un modulo prendono
contatto con le basi del DNA e separano i filamenti
b.GAL4(lievito) controlla geni coinvolti nel metabolismo del galattosio. Essa
contiene zinco ma non forma dita
c.GRE
N.B. recettori ormonali:
1.di membrana: meno porzioni extracellulari, pi porzioni transmembrana, pi
porzione intracellulari
2.nucleari: dominio C terminale di interazione con il ligando + dominio di
interazione con il DNA + dominio N terminale. Dei nucleari conosciamo tre tipi:
a) tipo I: citoplasma, ormoni steroidei, glucorticoidi essi cambiano
conformazione, vanno nel nucleo e si legano come omodimeri al DNA
b)tipo II: ormoni tiroidei essi formano dimeri con RXR e si legano sia in
presenza che in assenza del ligando (se c agiscono da attivatori, se non c
agiscono da repressori)
*omeodomini:
*dimini beta ZIP
*domini BHLH
2.DOMINIO DI ATTIVAZIONE TRASCRIZIONALE
3.DOMINIO DI DIMERIZZAZIONE
Funzione: indicano cambiamenti allosterici delle proteine dellapparato
trascrizionale ed dimostrato con immunoprecipitazione della cromatina. Le
proteine sono fissate al DNA con formaldeide, il DNA viene frammentato con
sonicazione, viene usato un anticorpo specifico per la proteina coniugato ad
una resina->immunoprecipitazione del frammento del DNA. Il DNA
amplificato con PCR e poi sequenziato.
6.Splicing
Formazione dellRNA maturo per rimozione degli introni e concatenazione degli
esoni.
Esoni: porzione di un gene che entra nellmRNA maturo. Non implica una
regione codificante (contiene regioni per la regolazione dellespressione genica
dette regioni 5 non tradotte)
Introni: siti di regolazione che devono essere rimossi con lo splicing
MECCANSIMO:
La precisa rimozione delle sequenze introniche dipende dalla presenza di
specifiche sequenze che segnano le estremit degli introni: i siti di splicing al 5
e al 3:
sito di splicing 5: allestremit 5 dellesone ho A-G, allestremit dellintrone
ho GU (A-G) AGU

sito di splicing al 3: tratto di 3 pirimidine A, G agli introni, allestremit


dellesone ho G
AG(esone)GU A/G AGU
A/G= A
G

(introne)

3(pir)AG----G(esone)

punto di
ramificazione

(introne

La rimozione degli introni richiede due successive reazioni di


transesterificazione:
1. Si rilascia lesone a 5 e lestremit 5 dellintrone viene unita alla A nel
punto di ramificazione. Lintrone rimosso contiene una struttura detta
LARIAT(cappio) cos la reazione irreversibile e lintrone pu essere
degradato
2. Lintrone viene liberato e i due esoni si concatenano
SPLICEOSOMA: complesso ribonucleoproteico di 5 RNA e 150 proteine
SnRNA (RNA proprio dello spliceosoma,
U1+U2+U3+U4+U5+U6)+proteine=SNRNP il quale: riconoscono il sito di
splicing al 5 e il punto di ramificazione, avvicinano questi due siti e catalizzano
la transesterificazione. Come agiscono?
U1 U6-> legano le sequenze di splicing
SnRNP U2-> spiazza la proteina legante il punto di ramificazione BBP, lega il
punto di ramificazione, espone la A
U4 U6 U5-> avvicinano i siti
U4-> lascia il complesso
U2+U6-> COMPLESSO C (1 reazione)
U5-> 2 rezione
TIPOLOGIE di splicing:
-Pre-mRNA nucleari: hanno uno splicing catalizzato da spliceosoma, diffusione>mRNA per la trascrizione
-Introni del gruppo II: dove (geni di organelli, geni di eucarioti, geni di
procarioti) come (2 transesterificazioni A al punto di ramificazione) catalisi
(auto splicing)
-Introni del gruppo I: dove (rRNA, geni degli organelli, geni dei procarioti) come
(2 transesterificazioni, una G libera catalizza la prima trans) catalisi
(autosplicing)
SPLICING ALTERNATIVO: meccanismo per generare trascritti diversi e quindi
proteine diverse:
*costitutivo, produce sempre isoforme diverse
*regolato, produce isoforme tessuto specifiche e diverse in risposta a stimoli
Regolazione:
-attivatori a) dominio RRM, legame allRNA b)dominio RS (arg+ser), media le
interazioni con le altre proteine dello spliceosoma
-repressori
Ipotesi del rimescolamento degli esoni->produce proteine differenti

Editing dellRNA:meccanismo post-trascrizionale per modificare linformazione


contenuta nel trascritto e dare proteine con funzioni diverse. Come?
Deaminazione della citosina, inserzione/delezione di uridine (nucleoside)
DOPO TRASCRIZIONE, SPLICING, SPLICING ALTERNATIVO ED EDITING DELLRNA,
esso pu essere trasportato fuori dal nucleo.
7.Rna regolatori
Regolazione dellespressione genica a livello trascrizionale e post-trascrizionale.
Piccoli RNA:
-SiRNA: rna interferenti
-miRNA rna temporali
-SnoRNA rna nucleolari
-SnRNA rna nucleari
MICRO-RNA->regolano lespressione genica in maniera sequenza-specifica,
permettono la regolazione temporale dello sviluppo e la regolazione della
fisiologia cellulare
Mi-RNA e SnRNA hanno unorigine comune: precursore (enzima DICER)>singolo filamente di RNA (legame con)-> RISC-> va allmRNA interessato e da
qui differiscono:
1. Mi RNA (reversibile) lega lmRNA con limperfezioni e blocca la
trascrizione
2. siRNA (irreversibile) lega lmRNA perfettamente e lo etichetta per la
degradazione
SITI DI TARGER DEL miRNA-> sito binding al 3 intranslated
I microRNA possono regolare anche 1000 geni diversi: hanno dei siti target che
per sono difficilmente riconosciuti perch il legame non perfetto. Il tipo di
legame : 7 basi, salto 1-2 nucleotidi, 7-8 basi ecc.
8.La biologia di sistema
Omics=analisi completa del sistema biologico, sono approcci sperimentali.
Include: microarray di DNA e proteine e spettrometria di massa ecc.
-Genomica: insieme di tecniche che consentono di avere una versione
completa di ci che avviene nella cellula al livello di DNA. Include:
a)TRASCRITTOMICA (attivit dei geni ed espressione di RNA) b) GENOMICA
FUNZIONALE (funzione dei geni) c) GENOMICA STRUTTURALE sequenziamento
del DNA
-Proteomica: identificazione delle proteine e definizione della loro struttura,
forma e attivit e come interagiscono tra loro
-Metabolomica: interazione tra le varie biomolecole prodotti del metabolismo
(nucleotidi, AA, zuccheri e lipidi)
-Farmacogenomica: i farmaci hanno effetti diversi su persone diverse a causa di
varianti polimorfiche
-Nutrigenomica: rapporto tra alimentazione e regolazione del genoma
-Tossicogenomica: ricerca tossicologica su farmaci e tossine
Microarray: insieme di frammenti di DNA complementare al gene considerato e
immobilizzato su una griglia (supporto solido)

Se qualcosa induce variazioni dellespressione genica, queste si riflettono


sullRNA che dar una determinata proteina. Con questa tecnica possono
individuare il gene responsabile del diabete anche senza conoscere il pattern
coinvolto, perch possa analizzare in un solo esperimento tutto il genoma.
1. Si purifica lRNA: a) di controllo (ad esempio da un polmone sano) b)di
campione (ad esempio un polmone con tumore)
2. Si fa la marcatura fluorescente con trascrittasi inversa che produce DNA
complementare
3. I due RNA (DNA) sono messi sullarray dove abbiamo messo in posizioni
specifiche il DNA
4. LRNA convertito in DNA si lega ai filamenti complementari sullarray
(IBRIDAZIONE)
5. Lavaggio per eliminare tutto ci che non si legato
6. Larray inserito nello scanner per acquisire limmagine prima delle
molecole marcate con un fluoroforo e poi di quelle marcate con altro. Le
due immagini vengono sovrapposte: * se lRNA espresso nel campione da
un gene aumentato, avremmo uno spot verde *se non c variazione,
lo spot dar giallo perch entrambe le molecole hanno la stessa
probabilit di legare il DNA sul supporto *se c minore espressione
genetica (down regulation) predomina il rosso
Applicazioni:
-stabilire il numero di copie del genoma
-scoprire modificazione epigenetiche (metilazione)
-scoprire il ruolo dellinterazione DNA-fattori trascrizionali
-scoprire il ruolo dei microRNA
Anche in terapia per verificare il perch di diverse reazioni alla terapia da parte
di pazienti affetti dalla leucemia: cos si associato ad ogni paziente
lappropriato trattamento (lRNA stato prelevato dai linfociti)
La misura dellRNA trascritto determina il profilo di espressione genica
CHIP ON CHIP: precipitano il DNA-binding proteins e il DNA che legano
Ruolo dei microRNA :
- Importanti nello sviluppo degli organismi
- Sono diversamente espressi nei tessuti
- Hanno un ruolo in oncogenesi e in processi virali