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La topologia del DNA

Nelle molecole lineari di DNA, poiché le terminazioni sono libere, il numero di avvolgimenti di un
filamento attorno all'altro filamento può essere variato mediante la rotazione reciproca. Ma se le
estremità della molecola sono legate covalentemente l'una all'altra a formare una struttura circolare,
il numero di volte che un filamento gira attorno all'altro filamento non può cambiare. Questo DNA
circolare covalentemente chiuso viene indicato come una struttura topologicamente definita. Anche
le molecole di DNA lineari presenti nei cromosomi eucariotici sono sottoposte a costrizioni
topologiche per via dell'estrema lunghezza della molecola che viene ridotta attraverso la formazione
della cromatina e l'interazione con altri componenti cellulari. Se torniamo a considerare le proprietà
topologiche dei DNA circolari covalentemente chiusi (cccDNA), possiamo definire con il termine
linking number, o numero di legame topologico, il numero di volte che un filamento deve essere
passato attraverso l'altro filamento affinché le due catene possano separarsi l'una dall'altra. Questo
parametro, il linking number è la somma di due componenti geometriche, il twist (avvolgimento) ed
il writhe (superavvolgimento). Il primo è semplicemente il numero di volte che un filamento gira
intorno all'altro filamento. Se consideriamo un cccDNA con struttura planare, cioè che giace su un
piano, il linking number è uguale al twist. In questo caso il numero di twist può essere facilmente
determinato contando il numero di volta che i due filamenti si incrociano su se stessi. Il modo in cui
i due filamenti si incrociano (twist) in una doppia elica destrogira è definito positivo: in questo caso
il linking number avrà un valore positivo. Però i cccDNA normalmente non hanno una
conformazione planare, ma presentano generalmente delle tensioni torsionali che impongono
all'asse longitudinale della doppia elica di incrociarsi su se stessa, a volte anche ripetutamente,
determinando così una struttura tridimensionale. Questo incrocio viene definito writhe.
Quest'ultimo può presentarsi in due forme diverse: una, la così detta interwound o writhe
plectonemico, in cui l'asse longitudinale della doppia elica è avvolto su se stesso; l'altra forma è un
toroide o spirale in cui l'asse longitudinale è avvolto come attorno ad un cilindro e normalmente si
ha quando il DNA si avvolge attorno ad una proteina. Quindi, il numero di writhe (Wr) rappresenta
il numero di incroci dell'asse longitudinale su se stesso e/o il numero di spirali nel cccDNA. Esiste
una sola limitazione: la somma del numero di twist (Tw) e del numero di writhe (Wr) deve essere
sempre uguale al linking number (Lk): Lk = Tw + Wr. Ad esempio, se consideriamo un cccDNA
privo di superavvolgimenti (che abbiamo definito rilassato) il suo twist corrisponde a quello del
DNA in forma B in condizioni fisiologiche (circa 10,5 paia di basi per giro d'elica). Il linking
number (Lk) di questo DNA è indicato dal simbolo Lk0. Lk0 per questo DNA è pari al numero
delle paia di basi contenute nel DNA diviso 10,5. Per un cccDNA di 10500 paia di basi Lk sarà
uguale a +1000 (il segno è positivo poiché il DNA è avvolto in senso destrogiro). Gli eventuali
superavvolgimenti presenti su un cccDNA non rilassato, invece, possono essere rimossi con
l'enzima Dnasi I, che idrolizza uno, o pochi, legami fosfodiesterici in ciascuna molecola. Una volta
che il DNA è stato interrotto, ovvero si forma un nick (per nick si intende l'interruzione di un
legame fosfodiesterico su un solo filamento della doppia elica) esso non è più topologicamente
costretto e i due filamenti possono liberamente ruotare l'uno rispetto all'altro. Se il nick viene
riparato, il cccDNA sarà rilassato ed avrà un Lk uguale a Lk0. La quantità di superavvolgimenti di
un cccDNA è come la differenza esistente fra Lk e Lk0: questa differenza viene chiamata differenza
linking: Δlk = Lk – Lk0. Se il Δlk di un cccDNA è diverso da zero la molecola è sottoposta a
torsione e quindi si presenta superavvolta, se è minore si zero è superavvolto negativamente se
invece è maggiore di zero la molecola è superavvolta positivamente. Poiché, però, Δlk e Lk0 sono
dipendenti dalla lunghezza del DNA, è più semplice esprimere il superavvolgimento della molecola
come densità di superelica a cui viene assegnato il simbolo σ ed è definita come: σ = Δlk/Lk0. Le
molecole di DNA circolare sia batteriche che eucariotiche sono normalmente superavvolte
negativamente con un valore di σ di circa -0,06. In questo modo, nei DNA superavvolti la
separazione dei due filamenti è più favorita piuttosto che nel DNA rilassato. Il DNA nel nucleo
delle cellule eucariotiche è compattato in piccole particelle conosciute come nucleosomi in cui la
doppia elica è avvolta per circa due giri attorno ad un nucleo proteico. Questo tipo di avvolgimento
non è altro, dal punto di vista geometrico, che un toroide o spirale che si avvolge con un andamento
levogiro. Il linking number di questi superavvolgimenti può essere cambiato solamente provocando
una interruzione dei legami fosfodiesterici di almeno una delle due catene del DNA. Una categoria
di enzimi, conosciuti come topoisomerasi, sono in grado di introdurre una rottura del singolo o del
doppio filamento del DNA in modo temporaneo. Le topoisomerasi appartengono a due classi
principali: le topoisomerasi II permettono di cambiare il numero di legami di due unità per volta
determinando una rottura temporanea dei due filamenti del DNA attraverso la quale può passare un
tratto di elica integra, prima che il taglio venga risaldato. Le topoisomerasi I, invece, permettono di
cambiare il numero di legame di un'unità per volta. Esse producono una rottura a singolo filamento
della doppia elica, permettendo in questo modo al filamento integro di passare attraverso la rottura
dell'altro prima che il nick venga eliminato. Il taglio della molecola di DNA avviene quando un
residuo di tirosina presente nel sito catalitico dell'enzima attacca un legame fosfodiesterico
dell'impalcatura della molecola di DNA bersaglio. Questo attacco causa una rottura del DNA in
seguito alla formazione di un legame covalente tra la topoisomerasi e un terminale fosfato del nick
e la tirosina. L'altra estremità del nick, che termina con un gruppo OH, è tenuta molto saldamente
dall'enzima. Il legame fosfo-tirosina conserva l'energia che viene liberata dall'idrolisi del legame
fosfodiesterico. Di conseguenza, il DNA può essere risaldato semplicemente tornando indietro nella
reazione: il gruppo OH esistente al terminale del nick attacca il legame fosfo-tirosina riformando il
legame fosfodiesterico del DNA. In maniera più dettagliata, dopo aver effettuato il taglio, la
topoisomerasi è sottoposta ad un grande cambiamento strutturale che crea un'apertura sul filamento
tagliato, con l'enzima che si pone a ponte sull'interruzione. Il secondo filamento di DNA non
tagliato passa quindi attraverso l'apertura e si lega ad un sito interno simile ad un incavo della
proteina. Avvenuto il passaggio, si ha un secondo cambiamento di struttura a carico del complesso
topoisomerasi-DNA che porta indietro le estremità del filamento interrotto. La saldatura del
filamento avviene, come dicevo prima, con l'intervento del gruppo OH sul legame fosfo-tirosina.
Dopo questa reazione, l'enzima può aprirsi un'ultima volta per rilasciare il DNA. Comunque, sia i
procarioti che gli eucarioti posseggono topoisomerasi I e II che sono in grado di rimuovere i
superavvolgimenti presenti sulle molecole di DNA. In aggiunta, però, i procarioti posseggono una
speciale topoisomerasi II conosciuta come DNA girasi che introduce, invece di rimuovere,
superavvolgimenti negativi. La DNA girasi è responsabile del superavvolgimento negativo dei
cromosomi dei procarioti.
Le molecole di DNA circolari covalentemente chiuso aventi la stessa lunghezza ma linking number
differente sono chiamate topoisomeri. Anche se i topoisomeri hanno la stessa grandezza molecolare
possono essere separati l'uno dall'altro per elettroforesi su gel di agarosio. La base di questa
separazione è che più elevato è il numero di writhe più compatta è la struttura del cccDNA. Ma più
compattata è la molecola, più veloce è la sua migrazione attraverso la matrice del gel. Di
conseguenza, un cccDNA completamente rilassato migra molto più lentamente di un suo
topoisomero fortemente superavvolto. Un altro metodo per visualizzare il DNA superavvolto è
l'utilizzo dell'etidio, un catione formato da più anelli aromatici che avendo una struttura planare
riesce a scivolare e intercalarsi tra le coppie di basi impilate l'una sull'altra del DNA. Poiché esso è
fluorescente quando esposto alla luce ultravioletta, l'etidio viene utilizzato come colorante per per
visualizzare il DNA. Quando, però, lo ione etidio si intercala fra due coppie di basi, causa al DNA
uno srotolamento della doppia elica di 26° riducendo di conseguenza il twist. Quindi, in un DNA
circolare diminuendo il twist automaticamente si aumenterà il writhe, poiché il linking number non
cambia (Lk = Tw + Wr). In altre parole, all'aggiunta dell'intercalante avremo un DNA più rilassato.
Se la quantità di etidio aumenta, il numero di superavvolgimenti potrà raggiungere lo zero;
aumentando ancora la quantità di etidio Wr diventerà maggiore di zero ed il DNA
conseguentemente diventerà superavvolto positivamente. Naturalmente l'etidio modificherà anche,
come ben si può capire, la migrazione elettroforetica.