Microbiologia DIVISIONE BATTERICA Antonio Nenna

DIVISIONE BATTERICA
Il nucleoide non è una struttura omogenea, ma
simile a una spugna marina; la trascrizione quindi
non può avvenire all’interno del nucleoide, ma sui
prolungamenti (escrescenze) che si estendono in
direzione radiale verso il citoplasma.

INIZIO DELLA REPLICAZIONE NEI BATTERI

La corretta trasmissione del materiale genetico
richiede la precisa coordinazione e regolazione
della replicazione cromosomica. Nel clessico
modello del replicone, le proteine iniziatrici
controllano l’inizio della replicazione mediante
specifiche regioni cromosomiche, chiamate
“origini di replicazione”. Nei batteri la regolazione
maggiore è data dalla proteina iniziatrice DnaA
(una ATPasi).
Il cromosoma batterico tipicamente contiene una sola zona di origine della replicazione, chiamata OriC.
Questo meccanismo è strutturalmente simile a quello presente negli archea.
OriC in E. coli è formato da 250 bp, e contiene ripetizioni multiple di frammenti da 9 bp, chiamati DnaA-box,
che sono specifici siti di legame per la proteina iniziatrice DnaA. DnaA si lega con massima affinità alla
sequenza consenso 5’-TTATCCAC-3’ del DnaA-box. Inoltre, DnaA si può legare ad altre regioni con sequenze
consenso differenti, chiamate siti-I, che si trovano in maniera dispersa intorno ad OriC.
Adiacente a DnaA-box e siti-I è presente il DUE (AT-rich DNA-unwinding element), che contiene una terza
categoria di sequenze che legano DnaA: gli ATP-DnaA-box.
L’interazione tra DnaA e OriC permette di assemblare il complesso di inizio replicazione. DnaA rimane
legato a tre siti DnaA-box, interagendo con altri siti durante il ciclo replicativo. Quando DnaA si localizza su
OriC, forma polimeri (visibili al microscopio elettronico) per facilitare il legame di DUE (che divide il doppio
filamento in due singoli filamenti), che permette di caricare l’elicasi e il macchinario di replicazione.
Dopo lo srotolamento di DUE, un’altra importante funzione di DnaA è reclutare la DnaB elicasi; il caricatore
dell’elicasi, DnaC, è necessario per questa operazione.
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DnaA (della famiglia delle AAA, ATPasi associate ad attività cellulare) è formata da quattro domini:
1) N-term, media l’interazione con l’elicasi DnaB e facilita la polimerizzazione
2) connessione
3) attività ATP-asica (necessaria per formare il complesso della nucleoproteina)
4) C-term, sequenza di legame con il DNA (per OriC); sono necessari due elementi per il funzionamento
DnaA-signature-sequence, permette di riconoscere il DnaA-box; si trova nella piega di una sequenza
helix-turn-helix (HLH), all’interno del solco maggiore del DNA
ansa basica, con un residuo di arginina per legarsi al DNA, all’interno del solco minore del DNA

L’interazione ad alta affinità tra DnaA e DnaA-box localizza DnaA in OriC; l’interazione con ATP-DnaA-box, di
bassa affinità, permette a DnaA di formare un polimero che permette l’interposizione di DUE.

Sia OriC che DnaA sono soggette a controllo regolatorio. Il processo di “sequestro dell’origine” assicura che
le origini appena replicate siano temporaneamente impossibilitate a iniziare un altro ciclo di duplicazione;
l’autoregolazione di DnaA limita sia la disponibilità che l’attività del fattore di inizio. Questo schema di
controllo regola l’assemblaggio di DnaA su OriC, la durata del legame e la dissoluzione del complesso.

OriC contiene 11 siti GATC all’interno dell’array di DUE. Queste sequenze sono normalmente tutte metilate
in adenina dalla DAM-metiltrasferasi; dopo il passaggio della forca di replicazione, i nuovi siti GATC si
trovano in maniera transiente in stato emimetilato. La proteina SeqA si lega alle sequenze emimetilate e
permette il requestro per impedire la re-iniziazione della duplicazione.
Sia SeqA che DnaA formano dimeri disposti a filamento, che aiuta il legame con il DNA. Per la DnaA, lo stato
filamentoso aiuta a superare la differenze di struttura nell’origine di replicazione tra i differenti batteri. Per
la SeqA, lo stato filamentoso permette il requestro rapido di nuovi OriC.

Il controllo dell’attività della DnaA avviene mediante stimolo (autoregolazione) e inibizione (RIDA, situata
sul caricatore della pinza, stimola l’idrolisi dell’ATP della DnaA dopo il legame con DUE; YabA in B. subtilis
che interagisce con la DnaA).
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INIZIO DELLA REPLICAZIONE
La replicazione inizia ad OriC e procede bidirezionalmente, creando due forcelle di replicazione che entrano
nel DNA dalla stessa origine. Le forcelle si muovono intorno al cromosoma circolare a 1000 bp/s e quindi
dopo circa 40 minuti raggiungono il lato opposto di OriC.
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TERMINAZIONE DELLA REPLICAZIONE
Al lato opposto di OriC si trovano i siti di terminazione (Ter), che creano una trappola per la forcella di
replicazione e permettono di entrare ma non di lasciare la sequenza di terminazione. L’interazione tra la
proteina terminatrice della replicazione (Tus, termination utilization substance) e Ter genera l’arresto della
forcella.

La sequenza Ter è formata da 23 bp con resisui conservati di GC, seguiti da una regione core di 13 bp con
sostituzioni. La sequenza è asimmetrica, speculare all’asimmetria della forcella. La forcella di replicazione
che arriva da sinistra è bloccata mentre quella che arriva da destra passa normalmente; la sequenza core è
associata con il sito di bloccaggio della forca, preceduto da una regione ricca di AT.

La proteina Tus p codificata da un gene situato 11 bp downstream a TerB. La sequenza di ShineDalgarno del
promotore si sovrappone a TerB: la proteina Tus regola l’espressione del proprio gene legandosi alla
sequenza TerB e bloccando l’inizio della trascrizione.

Il complesso Tus-Ter blocca l’azione della DNA elicasi (DnaB). Nel normale processo di replicazione, DnaB è
di fronte al replisoma; è un enzima omoesamerico che srotola il DNA a doppio filamento di fronte alla
DNApolIII, la replicasi che sintetizza contemporaneamente entrambi i filamenti; DnaB è associata
fisicamente al replisoma tramite la subunità γ.
In presenza del complesso Tus-Ter, la sintesi del DNA è alterata fino a 4 bp prima della sequenza ricca in GC
nel sito TerB; il filamento guida viene escluso dal canale della DnaB.
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CITOCHINESI BATTERICA
E. coli: processo di costrizione cellulare; il peptidoglicano, funzionando da esoscheletro della cellula
batterica, deve essere sintetizzato per il processo di divisione (azione degli antibiotici).
B. subtilis: crescita del setto di divisione.

Molte proteine sono implicate nella divisione cellulare, molte delle quali sono della famiglia Fts, che sono
ancorate alla membrana citoplasmatica e il loro dominio principale aggetta nel citoplasma o nel periplasma.
L’assemblaggio del divisoma inizial con il posizionamento dell’anello di FtsZ al centro della cellula,
stabilizzato da FtsA e ZipA; poi, altre proteine Fts vengono reclutate, formando diversi subassemblaggi.

FtsZ è una GTPasi simile alla tubulina mentre FtsI è la PBP3. I componenti della sintesti del peptidoglicano
quindi non importanti per la divisione cellulare. La sintesi del PG specifica per la divisione inizia allo stesso
tempo del posizionamento di FtsZ intorno al centro della cellula, suggerendo una connessione tra la
polimerizzazione citoplasmatica di FtsZ e la sintesi periplasmatica di peptidoglicano.
Il meccanismo contrattile basato sul complesso di actina-miosina sembra improbabile nei batteri, poichè
non sono state trovate analoghe proteine motrici. Visto che il diametro del divisoma di E. coli diminuisce
durante la divisione, deve avvenire la depolimerizzazione di FtsZ; ciò è dovuto alla proteina EzrA, che
controlla la depolimerizzazione.
La formazione dell’anello FtsZ coincide con il termine della replicazione del cromosoma, e la segregazione
dei cromosomi segue la depolimerizzazione di FtsZ. La localizzazione del piano di divisione è direttamente
correlata alla posizione intracellulare del cromosoma batterico.
Le proteine Min, se mutate, producono minicellule prive di DNA. E. coli contiene tre potenziali siti di
divisione, uno al centro e due ai poli. La combinazione di MinC e MinD inibisce la polimerizzazione di FtsZ al
potenziale sito di divisione, a meno che MinE sia presente (la polimerizzazione di FtsZ è inibita da MinCD, e
l’inibizione è rimossa da MinE). Quindi MinE impedisce l’inibizione della polimerizzazione di FtsZ al centro
della cellula, infatti un anello di MinE è stato osservato al centro della cellula indipendentemente dall’anello
FtsZ. L’assemblaggio di FtsZ è quindi soggetto a una doppia regolazione negativa.
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La replicazione del cromosoma batterico
circolare inizia dall’origine di replicazione e
procede in maniera bidirezionale, fino a
raggiugnere il punto opposto, chiamato
terminazione. Il caricamento della DnaA su
OriC causa uno srotolamento localizzato, e
questo processo viene continuato dalla
DNAelicasi. Lo srotolamento dell’origine di
replicazione permette l’assemblaggio del
complesso di replicazione del DNA, il
replisoma. L’effetto “bobina” del filamento
nascente fornisce la forza motrice per la
segregazione del DNA. Questa azione di
spinta è coadiuvata dalla azione di tiraggio
dovuta alla condensazione del DNA
neoformato ad opera delle proteine SMC.
Altri fattori, come il sistema Par, sono
importanti per la direzionalità di
movimento del cromosoma, cioè spingere i
filamenti verso i poli della cellula.

Quindi i fattori che contribuiscono al

movimento dei cromosomi sono differenti:
il replisoma (macchinario per la
replicazione del DNA) è localizzato al
centro della cellula (R); le regioni OriC
appena duplicate (O) migrano rapidamente
verso i poli opposti della cellula; la forza
motrice per il movimento è la
polimerizzazione del DNA ad opera del
replisoma stazionario. Altre proteine, come
MukB o SMC, sono importanti per il
partizionamento dei cromosomi: queste
proteine disassemblano il DNA per
permettere il passaggio della forcella di
replicazione e riassemblano le regioni
appena duplicate del genoma. Questa attività genera condensazione, e in collaborazione con il movimento
di OriC, causano lo spostamento del DNA parentale e neosintetizzato verso i poli opposti della cellula. Il
completamento della replicazione vede la presenza della regione terminale al centro della cellula, e i dimeri
di DNA sono scissi da XerCD tramite una reazione stimolata da FtsK; quindi la divisione cellulare e la
segregazione cromosomica sono appaiati. Anche il ruolo delle proteine Par è importante nel
partizionamento del DNA, poichè anomalie impediscono la formazione dell’anello di FtsZ.
Se il rapporto ParA / ParB aumenta, viene inibita la divisione cellulare.
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ASSEMBLAGGIO DEL DIVISOMA
In E. coli, i componenti del divisoma sono reclutati al centro della cellula in base a una precisa gerarchia che
predice la modalità di assemblaggio. Negli anni ’60, alcuni batteri mutanti non riuscivano a duplicarsi poichè
producevano cellule filamentose ad alte temperature; queste mutazioni permisero l’identificazione di geni
fts (filamentation thermosensitive), i cui prodotti sono essenziali per la divisione cellulare. Questi mutanti si
replicano e segregano i cromosomi normalmente, ma non riescono a dividersi e quindi acquisiscono un
fenotipo filamentoso.

FtsZ
La proteina FtsZ è la più abbondante della famiglia, e si localizza al centro della cellula. E’ una GTPasi che
forma una struttura a forma di anello, chiamato anelloZ. Le 15000 copie di FtsZ per cellula sono sufficienti a
formare un anello composto da più filamenti. L’anelloZ è utilizzato come zattera per l’assemblaggio degli
altri componenti del divisoma. E’ conservato tra tutti i batteri, ad eccezione di Chlamidia. Analogamente
alla tubulina, FtsZ polimerizza utilizzanto GTP, e l’anelloZ è una struttura estremamente dinamica, poichè i
monomeri passano dal citoplasma all’anello circa ogni 10 secondi. FtsZ è soggetta a rapido assemblaggio e
disassemblaggio, permettendo alla cellula di regolare rapidamente la formazione dell’anelloZ.
Due proteine servono a stabilizzare FtsZ: FtsA e ZipA. Se entrambe sono mutate, non si forma l’anelloZ.
Queste proteine riconoscono FtsZ mediante il dominio C-term e servono a legarlo alla membrana.

MinCDE
Tre proteine, codificate tutte dall’operone MinCDE, cooperano per formare un sistema oscillatorio
autogestito. MinD è una ATPasi e interagisce con MinC per formare un inibitore di FtsZ associato alla
membrana. L’attività di MinE restringe il complesso MinCD ai poli della cellula, quindi permettendo che la
divisione cellulare avvenga solo al centro della cellula. MinCD oscilla tra i poli della cellula circa ogni minuto:
si assembla da un lato, e poi questa struttura a cappuccio perde subunità fino a sparire; allo stesso tempo,
si assembla dall’altro lato e il ciclo ricomincia. MinE forma una struttura circolare che causa la retrazione
del complesso MinCD. In assenza di MinE, si perde il comportamento oscillatorio del sistema, e MinCD si
forma su tutta la membrana, inibendo la divisione cellulare. Il sistema è differente per i diversi batteri.
MinCDE è capace di stabilire un’oscillazione sull’asse maggiore della cellula, riconoscendo anche piccole
asimmetrie nella iniziale cellula sferica generata dalla divisione cellulare dei bastoncelli; quindi è capace di
riconoscere l’asse maggiore della cellula, definendo il piano di divisione cellulare.

MipZ
Esistono organismi che non possiedono il sistema MinCDE ma riescono a dividersi al centro della cellula, e
questo suggerisce l’esistenza di altri meccanismi di regolazione. MipZ è una ATPasi che interagisce con la
proteina ParB e si lega a un sito (ParS) vicino OriC. Questo complesso si posiziona al polo “vecchio” della
cellula in replicazione. L’inizio della replicazione genera due segmenti ParS, che vengono subito raggiunti da
ParB-MipZ. Nella seguente segregazione, uno di questi segmenti rimane nella posizione originale, mentre
l’altra copia si muove attraverso la cellula verso il polo opposto. MipZ agisce come un inibitore della
polimerizzazione di FtsZ.

MreB
MreB è una proteina del citoscheletro, equivalente procariotico dell’actina. Il gene fu identificato in E. coli
come quel gene che permette di mantenere la forma a bastoncello della cellula, infatti MreB e omologhi
sono presenti nei bastoncelli ma mancano nei cocchi. Inoltre è importante per la segregazione dei
cromosomi (poichè lega le sequenze vicino OriC) e aiuta il targeting di proteine dirette ai poli cellulari (con
l’eccezione delle proteine MinCDE)
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SELEZIONE DEL SITO DI FORMAZIONE DEL DIVISOMA
Prima di dividersi, è importante per la cellula scegliere il sito dove avverrà la divisione, determinando la
posizione dell’anelloZ: ciò è garantito da due processi.
1) “nucleoid occlusion”: tendenza dell’anelloZ di formarsi in regioni prive di DNA [inibizione della
formazione di FtsZ dovuta alla presenza del nucleoide, mediata dalle proteine Noc e SlmA]
2) “Min proteins”: inibizione dell’anelloZ in regioni prive di DNA ai poli della cellula *la delezione di queste
proteine causa la formazione dell’anelloZ nei poli e la produzione di minicellule prive di DNA+
Quindi queste due strategie garantiscono che l’anelloZ si formi solo in regioni prive di DNA al centro della
cellula dopo la segregazione dei cromosomi.
Inoltre il sistema SOS viene attivato in caso di danni al DNA, e recluta una proteina inibente la settazione
(SulA) che impedisce la formazione dell’anelloZ e quindi impedisce la formazione del setto di divisione,
inibendo la divisione cellulare.

Alcuni batteri non si dividono al centro della cellula, come gli sporigeni (il setto di divisione si trova al polo
cellulare). Inoltre si producono più spore per ogni batterio, con la formazione di setti multipli interni di
divisione. Il primo evento è comunque la formazione dell’anelloZ ad entrambi i poli della cellula, ma solo
uno di questi verrà utilizzato per formare il setto di divisione per le spore. Due fattori sono necessari per
indurre la formazione del duplice anelloZ: un aumento della concentrazione di FtsZ (mediato dall’aumento
della trascizione del fene Fts all’inizio della sporulazione) e la proteina Spo2E (una fosfatasi che interagisce
con FtsZ e serve alla compartimentazione dell’espressione genica durante la sporulazione).
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CITOCHINESI
Quando la cellula si divide, l’anelloZ si costringe generando direttamente la forza per la citochinesi, in modo
analogo all’interazione tra actina e miosina negli eucarioti. La citochinesi avviene in due momenti, e FtsZ è
necessaria per entrambi (se il gene Fts è spostato su temperature non permissive, l’anelloZ scompare e
tutte le altre proteine coinvolte nella citochinesi vengono degradate, e il setto smette di invaginarsi):
1) formazione di una piccola invaginazione nel sito del setto di divisione
2) ispessimento del setto di divisione

I cocchi come S. aureus sintetizzano nuovo cell wall all’equatore. La graduale costrizione di quest’anello
genera i due nuovi poli delle cellule figlie. Quindi la sintesi del cell wall al centro della cellula è sufficiente a
guidare la divisione dei cocchi.
I bastoncelli, al contrario, utilizzano due differenti modi di divisione. Nella fase di allungamento, il nuovo
cell wall è inserito in maniera diffusa sulle pareti laterali; ad un momento specifico, il cell wall viene
allungato solo sul setto di divisione. Qui avviene il bivio tra le due modalità di divisione: i bastoncelli gram-
positivi (B. subtilis) sintetizzano il setto tra le due cellule figlie e si liberano perchè delle autolisine erodono
il rivestimento di mureina; i bastoncelli gram-negativi (E. coli) si dividono per costrizione degli strati del cell
wall (analogamente ai cocchi).
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riassunto degli eventi maggiori nella divisione di una cellula batterica