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DIVISIONE CELLULARE

DIVISIONE CELLULARE
Noi sappiamo che nella maggior parte dei batteri il cromosoma è circolare ed é unico; vi ho già
illustrato le eccezioni a questa norma. Le Borrelie – ad esempio – hanno un cromosoma lineare e
ripartito. Le Brucelle hanno due nucleoidi … così come il Vibrio Colera … etc.

Non ci deve sfuggire che le Borrelie probabilmente hanno un sistema genetico diverso rispetto agli
altri batteri.

Una delle caratteristiche del nucleoide è che l'origine e il termine di replicazione sono esattamente
l'uno opposto all'altro.

REPLICAZIONE BATTERICA
L'inizio della replicazione é in una zona precisa, che si chiama oriC, 250 paia di basi con dei pizzi
di 9 paia di basi (Dna Boxes). Essi sono siti di attacco per la DnaA, enzima che inizia la
replicazione.
DnaA si lega alla sequenza di consenso 5'-TTATCCAC-3'.
DnaA é anche un'ATP-asi, ovvero scinde l'ATP per prendere energia. In tutti i grandi meccanismi
viene sfruttato l'ATP per produrre energia.
Lo stato di legame del Nucleotide binding site con l'ATP é uno degli elementi fondamentali per la
replicazione. Vicino alle DNA boxes c'é, sul cromosoma batterico, una zona chiamata DUE (DNA-
unwinding element) composta da 13 paia di basi.
Ci sono anche regioni che possiamo sorvolare.

La DUE, lega la DnaA quando è legata all'ATP – le altre dna boxes legano indipendentemente la
DnaA – é una zona essenziale per l'apertura del DNA, per il “melting” dei due filamenti.
Quando la DnaA con l'ATP si lega al cromosoma si ha un'apertura alla testa di questa deposizione
di dnaA, a questo punto entrano DnaB e DnaC, che continuano questo melting di Dna essenziale
per il processo di replicazione.

In altre specie batteriche ci sono altre differenze, questo modello é stato studiato su E. Coli.
Importante anche il modello studiato sul Bacillo Subtilis.
Perché dopo DnaA entra in funzione DnaB? Perché il dominio ammino-terminale del filamento di
Dna interagisce con DnaB. DnaA aiuta DnaB a legarsi.

L'attività ATP-asica è in un altro dominio, mentre il quarto dominio della DnaA si lega alle Dna
Boxes che abbiamo visto.
Abbiamo detto che il dominio quarto di DnaA si lega a oriC laddove ci sono le Dna Boxes binding
site.
La DnaA ha un'arginina nel suo dominio che é fondamentale per il legame con il DnaA (si parla di
loop basica);
che vuol dire questo? Attraverso studi di cristallografia contemporanea di dominio IV legato al
DNA si capisce che la sequenza che si lega alla DnaA é nella loop helix-turn-helix.
Cos'è che attiva la DnaA ad agire? → è l'attività ATP-asica.

Ci sono dei meccanismi di regolazione? Certamente, ci sono. Sarebbe strano che non ci fossero, e
allora cosa possiamo regolare? A livello del DNA si fa in modo che la DnaA non si leghi o si blocca
direttamente l'enzima: quindi durante la replicazione c'é questo oriC liberato che lega DnaA, se

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continuasse a legarsi la replicazione continuerebbe → c'é dunque un meccanismo in grado di


regolare i legami DnaA-oriC.

MECCANISMI DI REGOLAZIONE

Meccanismo di Sequestro dell’origine:


oriC ha 11 siti GATC che sono dispersi sia in DUE e DnaA-box.
Queste sequenze sono normalmente metilate sull'adenina da parte di Dam metil-transferasi;
comunque, immediatamente dopo il passaggio della forcella di replicazione, i nuovi GATC possono
essere trovati in uno stato di transiente emimetilazione.
La proteina SeqA ha un'alta affinità per le GATC emimetilate e si lega, impedendo dunque il
legame di DnaA con oriC.

SeqA forma un dimero stabile e anche interazioni dimero-dimero.

E' un fenomeno quantitativo: durante la vita della cellula.

Meccanismo di Sottrazione della DnaA:


Si hanno locus non-oriC che hanno alta affinità per DnaA. Le sequenze datA, fanno si che DnaA
venga sottratta a oriC. Delezioni di datA mostrano eccessiva attività replicativa.

Meccanismo RIDA:
Altro evento di controllo é Regulatory Inactivation of DnaA (RIDA) stimola direttamente
l'idrolisi di ATP da parte di DnaA dopo che l'iniziatore ha iniziato il melting della zona DUE.
Questa attività è importante, come mutazioni difettive delle ATP-asi hanno mostrato: si ha un
eccesso, anche qui, di attività replicativa.
Hda: homologous to DnaA è un'enzima fondamentale per il RIDA, così come la subunità sliding-
clamp di DNA polimerasi III.
La polimerasi si lega dove già c'é il clamping, cioé l'apertura del filamento di Dna. In questo punto
si lega Hda. Sappiamo che batteri deficenti di Hda hanno un fenotipo di sovrainiziazione simile a
quelle che sono difettive per l'attività atp-asica.
Hda é un ATP-asi o per lo meno ha una sequenza simile alle ATP-asi, é un'AAA-ATP-asi

Non si sa come agisce Hda.

In Bacillussubtilis, YabA è un analogo: c'é questo meccanismo “esogeno”, quantitativo, che


permette la regolazione dell'inizio della replicazione.
Si tratta di un fenomeno quantitativo in equilibrio.

Ci sono anche famose proteine fisse che si occupano più della struttura replicativa anzicché
funzionale.

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TERMINAZIONE DELLA REPLICAZIONE


“al termine della replicazione c'è la vita.”

La forcella di replicazione va a una buona velocità, 1000nps e dato che sappiamo che la
duplicazione avviene bidirezionalmente sappiamo che si incontra 30 minuti dopo in una regione
opposta a oriC. Questa regione è stata chiamata Ter.
Cos'è che ferma la replicazione? Un semplicione potrebbe dire che si scontrano le due forcelle e si
ferma, ma non si incontrano realmente!
Esiste una proteina di termine, che in E. Coli si chiama Tus (termination utilization substance) e in
B. subtilis RTP (replication terminator protein). La loro interazione porta alla sospensione della
replicazione.

La sintesi del Dna nella forcella di replicazione è mediata dal replisoma, assemblaggio di
numero proteine che collaborano nella replicazione del DNA.
DnaA e DnaB sono esempio di parte del repli soma, così come la replicasi e altri enzimi.

L'origine della replicazione è stata studiata per la prima volta nei plasmidi: il plasmide coniugativo
R.
R6K, in un mutante di questo mostrò due origini alfa e beta e un singolo termine.
La replicazione iniziava in alfa, proseguiva fino a termine. Anche in beta avveniva la stessa cosa.
E' un punto fisicamente riscontrabile.
Nel 1977, fu notata l'evidenza per un sito per la terminazione in E. Coli. Louarn cambiò la
posizione dell'inizio di replicazione integrando dei plasmidi R in vari punti del cromosoma del
mutante sensibile alla temperatura con una mutazione in dnaA, il gene che codifica la DnaA.
Ma la domanda é: Coli si comporta come il plasmide o no? E' stato dimostrato di si.
1987: terminus di Coli é costituito da loci separati (TerA, TerB... fino a TerE), bloccano la
replicazione o in uno o in un altro punto, in maniera polare.
La cosa interessante é studiare queste sequenze Ter:
23 paia di basi, ci sono 6 GC seguite da una regione a 13 paia di basi altamente conservate.

Perché terminano lì? Ci sono sequenze specifiche, ma perché? Qual è il meccanismo del termine?

Potrebbe esserci una loop particolare o altro … bisogna capire perché si blocca la replicazione. Già
negli '80 si sospettava che ci fosse una proteina. Studi di delezione attorno a TerA e TerB
dimostravano che in uno c'era.

La Proteina Tus: termination unitation substance

La proteina autrice della terminazione é la proteina Tus, codificata da una sequenza vicina ai siti
Ter. L'interazione Tus-Ter blocca la prosecuzione della forcella di replicazione.
Il gene tus è a 11 paia di basi di TerB.
La stessa proteina codificata dai geni tus riduce la sua stessa trascrizione (legandosi a TerB che è
sovrapposta a tus).
Tus si sovrappone su tutti i siti Ter, ma in particolare TerB.
Meccanismo di Arresto: il complesso tra proteina tus e TerB blocca l'azione dell'elicasi, quindi di
DnaB, che precede tutto il replisoma. In una maniera polare, secondo l'orientamento di azione.
Il filamento in ritardo si ferma comunque fino a 82 basi prima di Ter. E non si sa perché.

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CITOCHINESI

Dopo aver visto inizio e termine, adesso veniamo a tutto il fenomeno della replicazione.
Siamo partiti la volta scorsa e anche in altre occasioni dalla divisione della cellula, dalla citochinesi.
Siamo partiti dal peptidoglicano che nel Coli (gram -) costringe mentre nei gram + e nei cocchi vi è
un avanzamento dei setti che poi si incontrano. Ci chiediamo, dato che devono esserci due nuclei
che poi si dividono: cos'è che impedisce che l'avanzamento dei setti non interferisca con la
divisione del cromosoma?

Vediamolo a livello macroscopico, se noi andiamo a vedere la cellula procariotica: la fase S e la


fase M del ciclo cellulare sono un'identica fase. E il tutto avviene in un'ora.
Non in tutti i batteri però, il micobatterium tuberculosis ha un ciclo cellulare di 12 ore, va molto più
calmo e tranquillo.

DIFFERENZE TRA GRAM + E GRAM -

In Coli c'é questa costrizione, e il fatto che si dica così mi lascia perplesso perché al microscopio è
così, noi vediamo che dove c'era FtsZ c'è proprio una costrizione. In Stafilococcus Aureus, gram+
si ha un avanzamento di setti che poi si fondono. Almeno, per quanto riguarda i foglietti esterni
possiamo dire che ci sia una certa differenza.
La sintesi del peptidoglicano è indispensabile per la costrizione, però, al punto di divisione si
assemblano sempre numerose proteine. Avevamo già parlato di divisoma ed elongasoma. Le
proteine si possono localizzare al punto di divisione e usando mutanti eccetera ormai conosciamo
una buona parte del fenomeno e le proteine coinvolte.
Sappiamo che ci sono proteine che permettono l'assemblaggio delle altre e altre proteine tipo FtsK,
che in realtà è una PBP che da luogo alla formazione del peptidoglicano.
FtsZ invece da proprio la localizzazione del punto di divisione, iniziando proprio tutta la
divisione. L'anello di FtsZ è proprio il punto iniziale della divisione, grazie anche al reclutamento
di altre proteine che daranno luogo al divisoma. Il numero di queste proteine quant'é? Circa un
migliaio per ogni FtsZ. Un centinaio o ciascuna per le altre proteine. L'anello dunque è fatto da FtsZ
e altre proteine.

RUOLO DI FtsZ NELLA CITOCHINESI

FtsZ é una GTP-asi, prende energia dai legami fosfato ad alta energia. In vivo, se si mettono
insieme varie molecole di FtsZ si formano polimeri filamentosi simili alla tubulina.
In realtà queste strutture tubulari non si trovano negli eukarioti in vivo.
La sintesi del peptidoglicano é specifica del divisoma.

Vi è un legame tra l'anello di FtsZ e la sintesi del peptidoglicano nel punto di divisione.
Cos'è che divide alla fine?A dir la verità non lo sappiamo. Però si sa che ci sono proteine di
dipartizione dei cromosomi: non si sono ancora trovate le proteine responsabili della divisione
cellulare.
Secondo Dicuonzo i murosomi di S. Aureus sono vescicole prodotte da idrolasi che poi idrolizzano
il peptidoglicano e separano le cellule.

Vi è un apparato di ripartizione dei due cromosomi che abbiamo prodotto. Ed è un apparato


piuttosto complicato. Il primo suggerimento viene dal fatto che l'origine (oriC) del cromosoma é

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duplicato ed è dinamico, e lo stesso avviene in Ter. A un certo punto della divisione le origini si
staccano – hanno posizioni opposte – invece Ter rimane centrale, là dove avverrà la divisione.

Quello che sappiamo con certezza é che i due cromosomi alla fine si staccano e vanno in due cellule
diverse. In quel punto – in cui c'era il cromosoma – si ha l'assemblaggio di ftsZ e quindi la
formazione del peptidoglicano e la divisione. E' esattamente il punto in cui a un certo momento
ci sono due Ter, al centro della cellula.
Poiché i confini del nucleoide e le oriC duplicate hanno distanza costante ai due poli della cellula
che si allunga, i termini devono essere allontanati l'uno dall'altro. Non è così ovvio e devono essere
per forza staccati i due Ter.
Forse per la membrana perché ci sono interazioni con la membrana o magari ci sono elementi
citoplasmatici che se ne occupano.

Se usiamo per l'esperimento dei batteri che hanno proteine FtsZ temperature-sensibili scopriamo
che FtsZ ha un ruolo in tutto questo.
Forse anche l'envelope, il peptidoglicano, gioca un ruolo importante in questo. Sia che noi mutiamo
FtsZ o la PBP3 che produce il peptidoglicano abbiamo un ritardo della separazione del
cromosoma, questo suggerisce che tutto il macchinario del divisoma contribuisce alla ripartizione
dei cromosomi.
Contribuisce? Si, ma non siamo certi che siano i protagonisti principali.
D'altra parte, FtsZ è associato alla membrana.

FtsK, in E. Coli, è una proteina importante che presenta un dominio C-terminale fondamentale
nella segregazione del DNA.
Il dominio N-terminale serve per la localizzazione al centro della cellula.
Il dominio C-terminale di FtsK riassembla in B. subtilis la proteina SpoIIIE (si chiama Spo perché
sul subtilis si studia la formazione di spore) che é necessario per trasferire la spora di Dna alla
cellula madre.

Condensazione del DNA: qui ci sono di mezzo proteine molto importanti, le proteine SMC
(structural mantenance of chromosomes (SMC) proteins, ma sono solo nei procarioti.
Ma la proteina MukB è un analogo negli Eucarioti.

LE PROTEINE MIN E IL LORO RUOLO

Le proteine MinC, MinD e MinE sono proteine molto importanti che hanno acquistato il prefisso
Min perché quando mutate, la divisione porta alla produzione di cellule senza DNA.
La combinazione MinCD inibisce la polimerizzazione di FtsZ se non é presente anche MinE.
Quindi la presenza di MinE è un'inibizione dell'inibitore MinCD che porta dunque alla
polimerizzazione di FtsZ.

In E. Coli, laddove si divide si forma l'anello di FtsZ deve esserci che MinCD si localizzi ai poli,
anche se qualche volta al centro: perché? L'inibizione risulta quindi importante, MinCD
praticamente fa un lavoro di oscillazione per inibire una precoce divisione finché non arriva MinE
che permette la polimerizzazione del divisoma. Dunque permette la progressione della replicazione
del DNA.

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GENERAZIONE DEL CROMOSOMA MONOMERICO: PARTIZIONE

Dunque il cromosoma si è replicato e deve esserci un sistema che li fa dividere: dif.


Una delezione di dif impedisce la separazione dei dimeri, e questo cosa provoca? Un'induzione di
una risposta che si chiama S.O.S. E si ha la filamentazione del battere.
E non solo, il battere diventa anche meno vitale e muore.

Topoisomerasi: Unlinking The Circles


L'allontanamento dei due cromosomi e il loro posizionamento nelle cellule figlie.
C'è un sistema deputato a questo (ma deputato anche ad altro), é il cosiddetto “sistema Par” =
partition.
Si è scoperto andando a cercare mutanti difettivi per questa caratteristica, e si è visto che in questo
caso si aveva un difetto negli enzimi topoisomerasi.
La topoisomerasi Par1 e così via sono molto più attive delle girasi.
Vi sono vari sistemi che fanno si che i 2 cromosomi vengono ripartiti nelle due cellule: era un
fenomeno già riscontrato nei plasmidi.
In B. Subtilis, c’è lo stesso sistema.

Organizzazione Spaziale del cromosoma


Perchè vi sia il funzionamento del sistema Par, bisogna che ci sia un'organizzazione spaziale del
cromosoma. Esso, per quanto compattato con proteine istone-simili, tende a occupare gran parte del
volume cellulare. Una buona parte del cromosoma sta in posti specifici della cellula. I procarioti
non hanno il nucleo, ma il loro cromosoma non fluttua.
Ci siamo già detti che quando i bacilli gram+ sporano, c'è un cromosoma che va in una cellula
molto piccola, che poi diverrà spora. Devono esserci meccanismi specifici di localizzazione e
organizzazione molto precisi. C'è una riproduzione asimmetrica e il cromosoma deve entrare in una
cellula molto più piccola. E come avviene?
C'é una proteina, SpoIIIE che assembla il cromosoma nella prespora. Qui si ha un fatto strano:
durante la formazione della pre-spora, la fase precedente alla spora finale, dov'é il cromosoma? Qui
avviene una delle cose che non dovrebbe avvenire. Il setto incontra il cromosoma. Nel caso della
spora il setto incontra il cromosoma e infatti, si ha che quando si hanno delle mutazioni nel gene
SpoIIIE non si ha passaggio di cromosoma nelle prespore e quindi non si ha sporulazione completa.

E' molto probabile che sia questa proteina che sposta il cromosoma, quindi ha azione di
spostamento del DNA, dalla cellula alla prespora.
Un'altra cosa che é stata determinata è che la regione di DNA che per prima si localizza nella
prespora é proprio oriC.
Il gene per SpoIIIE è espresso costitutivamente e la proteina per cui codifica è una proteina con
attività ATP-asica e anche attività di binding protein.
FtsK – omologo dell'SpoIII – nei batteri che non sporificano, probabilmente è l'omologo che
trascina il cromosoma nei due poli, uno da una parte e uno da un altro, nei batteri non sporigeni.
Dunque si considera che queste siano le proteine che nei batteri non sporigeni danno luogo alla
localizzazione dei cromosomi ai due poli. Quello che fin'ora abbiamo visto é che per prima si sposta
oriC e c'é una proteina speciale che agisce intorno al setto.
Dove finisce oriC e Ter? Pensiamo che il cromosoma nello spostarsi sia orientato in un certo modo,
con vari sistemi. Si va a determinare che nella cellula inattiva della replicazione i due poli dei due
cromosomi sono localizzati ai poli opposti della cellula.

Prima che la replicazione ricominci, l'origine (oriC) si muove da un polo verso il punto presuntivo
della metà della cellula in cui ci sarà il setto. Dopo la replicazione una delle origini, delle oriC, si
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muove verso un polo, mentre l'altra rimane al centro.


Le formazioni presenti in Coli, sono localizzate al bordo del polo prossimale del nucleoide.

Quindi una sola copia migra nel potenziale punto di divisione: secondo alcuni autori c'é un
movimento del Ter verso la parte centrale della cellula. Questo vale solo nelle cellule in attiva
replicazione. Il movimento non è chiarissimo (quindi non ve lo chiedo).

Esiste un meccanismo preciso per cui le cose devono avvenire.


C'è anche un'azione delle proteine di condensamento, ma questa la lasciamo ai nostri rispettivi
autori, e invece andiamo all'ultimo punto di tutto il discorso, ovvero il legame tra divisione
cellulare e replicazione.
La divisione dei cromosomi richiede la divisione cellulare. Questo che cosa vuol dire? Fu scoperto
che non è la mancanza della divisione della cellula che risulta in un'incapacità di risolvere il dimero
del cromosoma, bensì è necessaria la proteina SpoIII o FtsK perché ciò avvenga. FtsK in E. Coli, si
localizza al setto durante la divisione cellulare. Quindi non ha solo una funzione sul cromosoma.

Come al solito abbiamo detto che come SpoIII è un ATP-Asi, lo è anche FtsK. Quindi va a cercare
l'energia in ATP e la fornisce alla propria azione.
La stressa cosa avviene in Bacillus Subtilis: ci sono regolazioni dell'apparato di allontanamento
costituito sicuramente da FtsK, e dalle topoisomerasi. Queste sono le molecole che intervengono
con certezza nella separazione dei cromosomi. Parlare di apparato mitotico é un'esagerazione.
In tutto questo, cosa succede? Perché si ha questa ripartizione? E come si salva il cromosoma dal
setto e che rapporti ci sono tra setto e cromosoma? Andiamo velocemente perché alcune cose le
abbiamo già viste in precedenza.

DIVISOMA
FtsZ lo conosciamo molto bene, quello che dobbiamo dirci con tranquillità è che c'è un fenomeno
per cui in qualche modo l'azione di proteine di polarizzazione e le proteine di segregazione (FtsK,
Par, SpoIII) deve essere correlata al setto, se no questo va a interferire. SpoIII interviene sia sul
setto che sulla separazione dei cromosomi. Quindi anche FtsK farà sicuramente la stessa cosa.
Però c'é qualcosa che salva il cromosoma dal procedere del setto, e qualcosa che fa si che i due
cromosomi vadano uno da una parte e una dall'altro.
Deve esserci una polarizzazione. Il sistema MIN: quando é mutato provoca la produzione di cellule
mini, piccole, perché il punto di setto si è messo in un punto in cui non si ha una divisione
equivalente bensì una divisione asimmetrica.

Quello che localizza il punto di setto é, da un lato, la localizzazione di FtsZ.

Se c'è Min noi sappiamo che FtsZ si può localizzare. MinCD oscilla tra i due poli, e l'azione é
inibita da MinE.
C'è un lato che non viene coperto, si tratta delle parti laterali, verso la membrana non polare della
cellula batterica, deve esserci qualcosa che difende il nucleoide. Si parla di “nucleoid occlusion”.

1. Nucleoid Occlusion é il meccanismo per cui il FtsZ si va a porre dove non c'é DNA.

2. Sistema Min

NUCLEOID OCCLUSION

Ci sono proteine che proteggono il nucleoide e fanno si che quando si ha la produzione di due
nucleoidi si abbia solo una zona in cui sia possibile il posizionamento del setto. Quando la cellula si
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allunga, si ha che la zona di occlusione non è solo dove c'é il nucleoide ma anche a livello del Cell-
Wall. Ci sono delle proteine ben precise che svolgono questo ruolo, in E. Coli e in B. Subtilis.
Ambedue le proteine proteggono il nucleoide.

Come ricordate in Coli avviene tutto con una costrizione a livello dell'anello FtsZ, e nel bacillo
Subtilis si ha l'avanzamento nei due setti. In Stafilococcus Aureus é ancora incerto, anche se
sappiamo che lì c'è il discorso dei murosomi e la divisione della cellula.
Ci sono proteine MinCD ed E → selezione del sito
proteine legate alla formazione dell'anello Z → FtsZ, K, ZipA
e proteine che intervengono tardivamente.

Quando si ha un mutante di MinCD si possono avere invece che un anello solo, vari anelli FtsZ.

L'allungamento, quindi l'elongasoma serve per allungare i batteri che si allungano (bacilli gram+ e
-) e alcuni cocchi a uovo (ovococchi ma non tutti).

Una cosa molto recente che si è visto é che FtsZ effettivamente è filamentoso, e forma
probabilmente dei ciuffi di filamenti che si intersecano l'uno all'altro. Il problema é appunto come si
forma sto anello di FtsZ. Innanzitutto si polimerizza, dopodiché (ipotesi) ci sono dei sistemi per
cui si legano i vari ciuffi a formare sti filamenti.
Il problema della costrizione riguarda appunto i ciuffi dei filamenti di FtsZ. Ricordate che FtsZ è
una proteina che come al solito lega non ATP bensì GTP. Le altre proteine che collaborano sono
Min, e l'interazione dei vari tipi di molecole serve per dare luogo alla fine a tutto il fenomeno.
Cosa succede quando si ha il disaccoppiamento di tutto questo? → si ha la filamentazione perché?
Perché non si ha la filamentazione del setto, quindi si ha un cellulone che diventa poco vitale. Ce lo
siamo detti pure per l'azione di un antibiotico che agisce sulla PBP3 che funziona proprio su questo.
Questo come vi ho detto si può vedere in emocoltura di sangue di pazienti che già fanno antibiotici.
Quindi anche in coltura può dare questo fenomeno.

FtsZ ormai è stabilito che forma dei filamenti e non dei tubuli. E questo solo per ricordarvi che
invece c'é quell'altra proteina di allungamento MreB che é fondamentale. MreB da luogo
all'elongasoma con una certa differenza di proteine che collaborano.

“ogni tanto di domenica mi vengono le idee un po' violente nei vostri confronti”
(cit.)

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Vito Pinzone

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