Sei sulla pagina 1di 18

Microbiologia (temp)

TOSSINE BATTERICHE

TOSSINE BATTERICHE

Antonio Nenna

(temp) TOSSINE BATTERICHE TOSSINE BATTERICHE Antonio Nenna Le tossine batteriche si classificano in base alla loro

Le tossine batteriche si classificano in base alla loro attività:

- tipo1 o membrane-damaging, causano la formazione di pori (RTZ, CFT) o hanno attività enzimatica (PLC)

- tipo2 o membrane-acting (ST)

- tipo3 o intracellular-acting, entrano mediante endocitosi (TeNT, BoNT, DT, Stx, LT) o T3SS (Exo)

mediante endocitosi (TeNT, BoNT, DT, Stx, LT) o T3SS (Exo) Si distinguono due tipologie di tossine

Si distinguono due tipologie di tossine batteriche:

- endotossine (lipide A del lipopolisaccaride), solo per i gram-negativi

- esotossine (proteine rilasciate nell’ambiente extracellulare dal batterio patogeno)

Microbiologia (temp)

TOSSINE BATTERICHE

ESOTOSSINE

Antonio Nenna

Proteine solubili secrete dai batteri gram-positivi e gram-negativi durante la fase di crescita esponenziale. Sono funzionalmente simili ad enzimi, poichè sono proteine, possono essere denaturate dal calore e hanno azione specifica. Sono superantigeni: possono causare una forte risposta immunitaria poichè possono sti- molare la proliferazione dei linfocitiT tramite interazione con MHC2; ciò conduce alla produzione di IL1 e TNF che causano il danno associato con queste tossine.

Le tossine sono instabili: nel tempo perdono la loro azione tossica, ma mantengono i siti antigenici.

I tossoidi sono tossine che hanno perso la loro azione tossica, ma mantengono i siti antigenici e la capacità

di evocare una risposta immunitaria. La formazione di tossoidi avviene mediante trattamento delle tossine

con formalina, iodio, pepsina o chetoni, e serve per immunizzare artificialmente l’ospite (vaccino). Molte tossine sono formate da due porzioni: la subunitàA (responsabile dell’attività enzimatica della tossi- na) e la subunitàB (responsabile dell’aggancio all’ospite e nel trasferimento della subunitàA attraverso la membrana). La subunitàA è attiva solo quando si distacca dalla subunitàB.

I geni che codificano per tossine sono localizzati generalmente su plasmidi o batteriofagi, quindi la coniuga- zione o la trasduzione possono muovere questi elementi genetici tra differenti batteri, aumentando il po- tenziale patogeno.

Ci sono due meccanismi di ingresso della tossina nella cellula.

- entrata diretta: la subunitàB si lega allo specifico recettore e induce la formazione di un poro nella mem-

brana attraverso cui viene traslocata la subunitàA

- endocitosi mediata da recettore: dopo l’endocitosi, l’abbassamento del pH nell’endosoma causa la disso-

ciazione delle due subunità, e la subA esplica la sua funzione, e la subB viene riciclata sulla superficie cellu- lare.

Le subunità delle tossine vengono riarrangiate in differenti modi:

- A-B o A-5B indica che le subunità sono sintetizzate separatamente e associate da legami non covalenti

- A/B indica che le subunità vengono separate da taglio proteolitico

- A+B indica che le subunità sono sintetizzate e secrete in modo separato, e interagiscono sulla c. bersaglio

Le tossine che si legano al colesterolo sono espresse dai batteri gram-positivi (streptococcus pneumoniae,

streptococcus pyogenes, listeria monocytogenes, clostridium perfringens, clostridium tetani, bacillus ce- reus).

clostridium perfringens, clostridium tetani, bacillus ce- reus). variazioni di architettura delle AB tossine

variazioni di architettura delle AB tossine

Microbiologia (temp) Esempi di esotossine

TOSSINE BATTERICHE

Antonio Nenna

tossina

 

batterio

attività

fattore edematoso (EF) A 1 B bacillus anthracis è una adenilato ciclasi che aumenta i livelli in- tracellulari di cAMP e permette la formazione di acquaporine sulle membrane, causando emolisi

 

ed

edema

t.

letale (LF)

A 2 B

bacillus anthracis

proteasi Zn-dipendente verso MAPK, induce il rilascio di citochine e causa morte cellulare

enterotossina colerica (CT),

A5B

vibrio cholerae,

ADP-ribosilazione della proteinaG stimolatoria

t.

termolabile di E. coli (LT)

escherichia coli

dell’adenilato ciclasi, con attivazione permanen- te e aumento del cAMP nell’intestino, inserzio-

 

di acquaporine, secrezione di acqua ed elet- troliti, diarrea

ne

t.

termostabile di E. coli (ST) A5B escherichia coli stimola la guanilato-ciclasi, aumento cGMP, at- tivazione della protein-chinasiG (PKG), secre- zione di acqua ed elettroliti, diarrea

t.

di Shiga (Stx)

A5B shigella dysenteriae taglio enzimatico di 28S rRNA, inattivazione del-

 

la

subunità 60S del ribosoma, inibizione della

sintesi proteica

t.

botulinica (BoT) AB clostridium botulinum proteasi Zn-dipendente per la sinaptobrevina che inibisce la trasmissione neuromuscolare nella placca motrice dei motoneuroni, inibisce il rilascio di ACh dai motoneuroni periferici, para-

 

lisi

flaccida

t.

tetanica (TeT) AB clostridium tetani proteasi Zn-dipendente per la sinaptobrevina che inibisce la trasmissione neuromuscolare nei neuroni inibitori di Renshaw, inibisce il rilascio

 

di

glicina dagli interneuroni inibitori, paralisi

spastica

t.

difterica (DT),

AB

corynebacterium diphteriae,

ADP-ribosilazione del fattore di allungamento dei ribosomi (EF2), con inibizione della sintesi proteica

t.

di pseudomonas (Exo)

pseudomonas aeruginosa

t.

della pertosse (BT) A5B bordetella pertussis ADP-ribosilazione della proteinaG inibitoria dell’adenilato ciclasi, blocca l’inibizione dell’adenilato ciclasi, aumento cAMP, diminu- zione della attività fagocitica

t.

della pertosse (DNT) A5B bordetella pertussis deaminazione di Rho, Rac e Cdc42, inibizione della attività GTPasica, stimolo costitutivo per la riorganizzazione del citosheletro

enterotossina

 

staphylococcus aureus

superantigene, attivazione massiva del sistema immunitario, vomito

stafilococcica

 

t.

della sindrome da shock

staphylococcus aureus

superantigene, infiammazione, febbre, shock

tossico (TSST)

 

t.

della scarlattina

staphylococcus aureus

superantigene, reazione eritematosa locale

t.

del clostridium (Tcd)

clostridium difficile

glicosilazione di Rho, Rac e Cdc42, inibizione della attività GTPasica, diarrea e morte cellulare

t.

della peste (Yop)

yersinia pestis

esibizione di una proteina ad attività GTPasica, inibizione di Rho, blocco della fagocitosi, impe- disce la sintesi di citochine, apoptosi

t.

della pasteurella (PMT)

pasteurella multocida

rilascio di IP 3 , stimolazione della PLC e della PKC, riarrangiamenti del citoscheletro

Microbiologia (temp)

TOSSINE BATTERICHE

ENDOTOSSINE

Antonio Nenna

L’endotossina è il lipideA del lipopolisaccaride (LPS), cioè una parte della membrana esterna dei batteri gram-negativi escherichia, salmonella, shigella, pseudomonas, neisseria, haemophilus. Normalmente il LPS partecipa in molte funzioni essenziali alla crescita e sopravvivenza batterica, e attiva il complemento me- diante la via alternativa come via patogenetica preferenziale. Le endotossine rimangono associate alla membrana esterna fino alla disgregazione del batterio, che può accadere per autolisi, lisi esterna o digestione fagocitica. Rispetto alle esotossine, le endotossine sono meno potenti e meno specifiche nella loro azione, poichè non agiscono enzimaticamente. Sono termostabili, ma possono essere degradate da superossidi e perossidi. Le endotossine, sebbene fortemente antigeniche, non possono essere convertite in tossoidi.

 

endotossine

esotossine

natura chimica

lipopolisaccaride

proteina

peso

10 kDa

100-1000 kDa

relazione con il batterio

membrana esterna

extracellulare

termostabile

si

no

antigenico

si

si

tossoidi

no

si

virulenza

bassa

alta

specificità

bassa

alta

attività enzimatica

no

si

pirogenicità

si

no

LIPOPOLISACCARIDE

Il LPS è una molecola complessa di 10 kDa con variabile composizione chimica tra le specie. E’ formata da:

- lipideA: componente lipidica, contiene la regione che si ancora alla membrana esterna. E’ formata da un

dimero si N-Ac-glucosammina (NAG) con 6 o 7 acidi grassi saturi attaccati direttamente o tramite un legame estere. La struttura è molto conservata nei gram-negativi. E’ la componente tossica del LPS. Il lipideA si lega alla superficie dei macrofagi causando il rilascio di citochine che mediano i danni dell’endotossina.

- coreR: è connesso alla sesta posizione di un NAG e consiste di una breve catena di zuccheri, contenente

KDO (uno zucchero unico che si ricerca per l’identificazione dell’endotossina). E’ comune tra i membri di uno stesso genere, ma differente tra generi diversi.

- antigeneO: è un polisaccaride connesso al coreR, ed è formato da ripetizioni oligosaccaridiche di 3-5 zuc-

cheri, e le varie catene possono raggiungere le 40 ripetizioni. L’antigeneO è molto più lungo del coreR e forma i domini idrofili del LPS. E’ il maggiore determinante antigenico, contenendo gli zuccheri di-desossi- esosi. L’antigeneO, sebbene non tossico, può fungere da determinante della virulenza poichè permette,

tramite la sua lunghezza e la sua idrofilia, di consegnare il lipideA in ambiente idrofilico; inoltre, la lunga ca- tena previene la risposta dell’ospite (soprattutto tramite il complemento), che causerebbe la lisi. L’antigeneO funziona da adesina verso la superficie target. La produzione di citochine (IL1, IL6, IL8, TNF, PAF) stimola la sintesi di prostaglandine e leucotrieni, che sono mediatori potenti dello shock settico che accompagna la tossicità da endotossina. Inoltre si hanno:

- attivazione del complemento (C3a e C5a causano rilascio di 5HT, causando vasodilatazione e chemiotassi dei neutrofili, che aumenta l’infiammazione)

- attivazione della coagulazione (trombosi, CID)

- plasmina (fibrinolisi e emorragia, ipotensione, shock)

Microbiologia (temp)

TOSSINE BATTERICHE

Tossicità delle tossine batteriche, riferite a LD50 (ovvero la dose letale per il 50% del campione)

Antonio Nenna

batterio

malattia

azione

tossicità per mg (espressa come LD50)

clostridium

botulismo

paralisi flaccida

1,200,000 (cavia)

botulinum

clostridium

tetano

paralisi spastica

1,200,000 (cavia)

tetani

cardiotossico

clostridium

gangrena gassosa

necrosi

200 (topo)

perfringens

emolisi

clostridium

gangrena gassosa

emolisi

50,000 (topo)

septicum

staphylococcus

infezione piogena

necrosi

50 (topo)

aureus

emolisi

streptococcus

scarlattina

emolisi

0,5 (topo)

pyogenes

rash

pasteurella

peste

necrosi

25 (topo)

pestis

shigella

dissenteria

emorragia

1,200,000 (coniglio)

dysenteriae

paralisi

1,200,000 (coniglio) dysenteriae paralisi meccanismo di azione della tossina termostabile ST di E.

meccanismo di azione della tossina termostabile ST di E. coli per aumentare i livelli di cGMP

di azione della tossina termostabile ST di E. coli per aumentare i livelli di cGMP tossine

tossine di E. coli enteropatogeni

Microbiologia (temp) TOSSINE BATTERICHE Antonio Nenna

CLASSIFICAZIONE DELLE TOSSINE BATTERICHE ASSOCIATE A DIARREA

- azione citotonica (vibrio cholerae, escherichia coli LT e ST (LT = Vibrio cholerae), bacillus cereus, aeromo- nas), non sono presenti granulociti nelle feci

- azione citotossica (shigella, clostridium perfringens / difficile, staphylococcus aureus, salmonella), sono

presenti granulociti nelle feci (tramite colorazione con blu di metilene o ricerca di lattoferrina mediante il leucotest)

MECCANISMI MOLECOLARI DELLA CITOTOSSICITA’ DELLE TOSSINE ADP-RIBOSILANTI Le tossine possono essere enzimi (proteasi) o tossineAB, e alcune di queste sono ADP-ribosilanti. Ci sono poi glicosilazioni, deaminazioni, acetilazioni, ecc. Le tossine vengono inoltre classificate in esoenzimi, tossi- ne che vengono rilasciate mediante sistemi di secrezione, tossine formanti pori, superantigeni. Il frammentoA contiene il dominio catalitico, mentre il frammentoB contiene un dominio di traslocazione (T) che facilita la traslocazione del frammentoA all’interno del citoplasma della cellula ospite, e un dominio recettoriale (R) che si lega allo specifico recettore sulla membrana citoplasmatica dell’ospite. Le ADP-ribosiltrasferasi catalizzano il trasferimento di ADP-ribosio dal NAD alla proteina dell’ospite, e ven- gono rilasciate mediante T3SS. Quando l’ospite è attaccato sul fattore di allungamento EF2, come nella tossina difterica, l’attacco avviene sul “difteramide”, una istidina modificata post-traduzionalmente. Il fattore citotossico necrotizzante (RhoGAP) deamina una molecola di glutammato dalla Rho-GTPasi dell’ospite, causando attivazione costitutiva di Rho (proteina che allinea i residui catalitici delle proteineG per facilitare l’idrolisi del γP del GTP all’interno della proteinaG), con aumento della polimerizzazione di ac- tina.

Microbiologia (temp)

TOSSINE BATTERICHE

TOSSINA DELLA DIFTERITE

Antonio Nenna

Prodotta da corynebacterium diphteriae (actinobatteri, alto contenuto CG, parete con acidi glicolici, simile

al bacillus tuberculosis), la tossina della difterite è una esotossina di tipo AB (B è antirecettore, A penetra

nella cellula). E’ prodotta come un unico polipeptide precurcore di 60 kDa, che viene attivato dal taglio della tripsina, in presenza di zolfo (che agisce da agente riducente). La tossina entra nella cellula target diretta- mente o tramite endocitosi mediata da recettore (proteina che lega l’eparina), e i frammenti di separano per la rottura del ponte disolfuro intercatena. La subunitàA catalizza la ADP-ribosilazione del fattore di al- lungamento dei ribosomi (EF2), utilizzando NAD come substrato (da dove toglie ADP-ribosio per legarlo all’elongation factor).

Nel 1913, Schick creò un test cutaneo per valutare l’immunizzazione da difterite. La tossina causa una rea- zione infiammatoria quando viene iniettata in maniera transcutanea; dopo 48 h, un test positivo (reazione infiammatoria) indica che il paziente è suscettibile all’infezione, mentre un test negativo (assenza di in- fiammazione) indica immunità (presenza di anticorpi che neutralizzano la tossina). Nel 1929, Ramon con- verte la tossina in tossoide mediante trattamento con formaldeide, creando il vaccino anti-difterite. Nel 1951, Freeman dimostrò che i ceppi patogeni di C. diphtheriae sono lisogenici, poichè infettati da un fago, mentre quelli non patogeni non sono lisogenici; quindi, il gene per la tossicità doveva essere trasportato da un batteriofago. Nel 1960 Pappenheimer dimostrò che la tossina inibisce la sintesi proteica bloccando il tra- sferimento di tRNA sul ribosoma.

La

difterite è una malattia del tratto respiratorio superiore caratterizzata da faringite, febbre e formazione

di

pseudomembrane sulle tonsille e sul faringe; può sviluppare verso una patologia sistemica. La lesione

può portare a necrosi del tratto respiratorio superiore, che causa perdite di plasma sanguigno e formazione

di coaguli di fibrina che si dispongono a formare pseudomembrane sugli organi colpiti. I batteri rimangono

nel tessuto infettato, ma producono tossine che possono raggiungere la via ematica, e causare problemi in cuore, reni, surreni, fegato e milza. E’ generalmente una malattia pediatrica, con formazione di risposta immunitaria per tutta la vita.

La patogenesi della difterite include due fenomeni distinti:

- invasione del tessuto, con colonizzazione e proliferazione batterica (non si conosce il meccanismo)

- tossigenesi, produzione batterica della tossina; causa la morte della cellula per l’inibizione della sintesi

proteica; la tossina non è l’unico fattore di virulenza, poichè è importante una bassa concentrazione di fer-

ro

e la presenza di un fago lisogenico sul cromosoma batterico. Normalmente, i geni del fago sono repressi

da

una proteina batterica, e il repressore è attivato dal ferro. Le tossine sono sintetizzate solo da batteri li-

sogenici in condizioni di mancanza di ferro (il ferro è un corepressore per la tossina). Il fago contiene i geni strutturali per la tossina.

La tossina difterica è una tossina bivalente, sintetizzata come singola catena polipeptidica contenente il

frammentoA (attivo) e il frammentoB (legame). La tossina si lega a un recettore specifico (HB-EGF, proteina legante l’eparina del fattore di crescita dell’epidermide) e penetra nelle cellule mediante endocitosi recet- toriale. L’acidificazione dell’endosoma causa il dispiegamento delle proteine e la fuoriuscita dal vacuolo. Il frammentoA, nel citoplasma, diviene attivo e trasferisce ADP-ribosio dal NAD al fattore di allungamento EF2, che inibisce la funzione della sintesi proteica; l’attacco di ADP-ribosio avviene su un unico residuo di histidina, chiamato “diftamide”.

Prodotta da Corynebacterium diphtheriae, un batterio gram-positivo anaerobio facoltativo, è responsabile della difterite respiratoria e cutanea. La tossina (DT) è l’unico fattore di virulenza secreto (non c’è l’endotossina visto che il batterio è gram-positivo) e la dose letale è 0,1 μg. Dalla tossina è stato estratto un tossoide, sul quale si basa l’attuale vaccino per la difterite, efficace e sicuro.

La tossina è secreta come polipeptide da 535 aa; il dominio N-term rappresenta il frammentoA, mentre il

dominio C-term rappresenta il frammentoB (funzionalmente diviso in recettoreR e traslocatoreT). La tossi-

na viene attivata dalle cellule eucariotiche mediante una proteasi, rimanendo connessa da un ponte disol-

Microbiologia (temp) TOSSINE BATTERICHE

furo, e poi viene endocitata. L’adicificazione dell’endosoma, tramite vATPasi attivano le “daghe della mor- te” del traslocatoreT, che sposta il frammentoA dal vacuolo al citoplasma, dove catalizza la ADP- ribosilazione del EF2 per inibire la sintesi proteica.

Antonio Nenna

Il recettore per la tossina diftericaè la proteina HB-EGF (heparin-binding epidermal growth factor), e l’affinità di legame è aumentata da CD9. EF2 è una proteina trasportatrice che idrolizza GTP, essenziale per l’allungamento della sintesi proteica, poichè trasporta il tRNA-aminoacido sul ribosoma 80S. EF2 riceve ADP-ribosio su una istidina modificata post-traduzionalmente chiamata diftamide. Questa modifica è conservata e presente dagli archea agli uo- mini, ma assente nei batteri, costituendo un meccanismo protettivo per i batteri (non viene inattivata la EF- G batterica poichè non possiede diftamide). L’eliminazione della diftamide causa la mancanza di attività della tossina sulla cellula ospite. EF2 con ADP-ribosio sul diftamide causa una interazione anormale codone-anticodone nell’areaP del ribo- soma, causando mutazioni frameshift che distruggono le proteine.

anormale codone- anticodone nell’areaP del rib o- soma, causando mutazioni frameshift che distruggono le proteine.

Microbiologia (temp)

TOSSINE BATTERICHE

TOSSINA DI PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Antonio Nenna

Pseudomona aeruginosa è un batterio gram-negativo patogeno opportunistico associato a infezioni ospe- daliere multiresistenti, incluse polmonite, UTI, ferite chirurgiche e sepsi in individui immunocompromessi. A differenza della difterite, non sono presenti vaccini.

La colonizzazione è facilitata da numerosi fattori: falgello, pili, adesine, fattori secreti (emolisine, lipasi, Inoltre, produce ExoA, ExoS, ExoT, ExoU e ExoY. Le tossine secrete mediante T3SS sono mantenute in con- formazione dallo chaperone Chap. ExoY: adenilato ciclasi, aumenta cAMP e causa modifiche del citoscheletro ExoU: fosfolipasi, genera tossicità acuta ExoT, ExoS: RhoGAP (proteina attivante la RhoGTPasi) e dominio ADP-ribosiltransferasico

L’attività ADP-ribosiltrasferasica di ExoS dipende dalla presenza di FAS, un fattore attivante, ed è diretta verso Ras, inibendo la trasduzione del segnale della via Ras-Rap-Map-MapK, causando morte necrotica del- la cellule.

struttura e meccanismo di azione di ExoS

del segnale della via Ras-Rap-Map-MapK, causando morte necrotica del- la cellule. struttura e meccanismo di azione
del segnale della via Ras-Rap-Map-MapK, causando morte necrotica del- la cellule. struttura e meccanismo di azione

Microbiologia (temp)

TOSSINE BATTERICHE

Antonio Nenna

L’attività ADP-ribosiltrasferasica di ExoT è diretta verso le proteine regolatorie delle chinasi (Crk); se modifi- cate, sono incapaci di interagire con altre proteine, e questo blocca le vie di segnalazione di Rac e Rap, im- pedendo la fagocitosi e promuovendo l’apoptosi. Meccanismi simili sono utilizzati che da Yersinia YopH (downregulation della fagocitosi mediata da Crk) e Shigella flexneri (attiva la famiglia Abl delle tirosin china- si per facilitare l’invasione batterica tramite l’inattivazione della fagocitosi dovuta a Crk).

ExoA: l’esotossinaA dello P. aeruginosa è praticamente invertita rispetto alla tossina difterica, ma non con- tiene il ponte disolfuro: il dominio N-term rappresenta il frammentoB (con R e T), il dominio C-term rappre- senta il frammentoA. Il recettore è una proteina correlata al recettore per LDL, e l’endocitosi porta la tossi- na verso il reticolo endoplasmatico e da qui si libera nel citoplasma

Microbiologia (temp)

TOSSINE BATTERICHE

CLOSTRIDIUM

Antonio Nenna

I clostridi sono bastoncelli gram-positivi, sporigeni, con metabolismo fermentativo (butirrato, acetato, bu- tanolo, acetone, CO 2 , H 2 ). Non crescono in condizioni aerobiche (sono anaerobi), e le cellule vegetative so- no uccise dall’esposizione a O 2 , sebbene le spore possano sopravvivere. Producono molti enzimi extracellu- lari che degradano macromolecole; infatti i clostridi sono importanti nei cicli della biodegradazione. La loro virulenza deriva unicamente dalle tossine prodotte.

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

C. PERFRINGENS: causa ferite e infezioni chirurgiche che portano alla gangrena gassosa. Produce emolisine,

enzimi extracellulari (proteasi, lipasi, collagenasi, alimentare). Tossine di clostridium perfrigens (labili all’ossigeno)

e una enterotossina (importante nell’avvelenamento

)

tossina

target

azione

A

membrana

fosfolipasiC

B

membrana

formazione del canale

E

membrana

formazione del canale

I

actina

ADP-ribosilazione

K

matrice

collagenasi

L

matrice

proteasi

M

matrice

ialuronidasi

perfringolisina

colesterolo

formazione di canale (RTX)

Nan

membrana

sialidasi

formazione di canale (RTX) Nan membrana sialidasi meccanismo di azione della perfringolisinaO di C.

meccanismo di azione della perfringolisinaO di C. perfringens: una concentrazione alta di tossina (vicino al focus infettivo) causa citolisi; come la concentrazione diminuisce, gli effetti sono minori e includono inibi- zione dei fagociti

Antonio Nenna

CLOSTRIDIUM DIFFICILE C. DIFFICILE: è la principale causa della diarrea da antibiotici e della relativa colite pseudomembranosa. Vengono prodotte due tossine: la tossinaA è una enterotossina (accumulo di fluidi nell’intestino) e la tossi- naB è una tossina citopatica, estremamente letale. C. difficile è la principale causa di diarrea associata ad uso di antibiotici. Le due tossine maggiori, TcdA e TcdB, possono essere rinvenute in ELISA nelle feci dei pazienti.

Microbiologia (temp)

TOSSINE BATTERICHE

feci dei pazienti. Microbiologia (temp) TOSSINE BATTERICHE TcsH: tossina emorragica TcsL: tossina letale Tcnα:

TcsH: tossina emorragica TcsL: tossina letale Tcnα: tossina alfa, è caratteristica poichè utilizza UDP-N-Ac-glucosammina e non UDP-glucosio come sub- strato per la glicosilazione.

TcdA e TcdB sono glucosil-trasferasi che inattivano Rho, Rac e Cdc42 utilizzando UDP-glucosio come dona- tore. Sono codificate da una regione cromosomica e sono espresse nella fase di crescita esponenziale e nel- la fase stazionaria. Se iniettate, causano colite pseudomembranosa, accumulo di fluidi, infiammazione e diarrea. Il dominio C-term di TcdA e TcdB contiene corte ripetizioni di oligopeptidi (CROPs), che servono all’interazione e al legame con il recettore. TcdB è simile a TcsL, e ciò spiega la cross-reattività degli antisie- ri; le differenze maggiori si hanno nel dominio N-term, responsabile della specificità del substrato. TcdA è simile a TcsH. Quindi l’attività enzimatica è codificata dal dominio N-term, mentre l’attività recettoriale è dovuta al dominio C-term tramite i CROPs. Le sequenze CROP variano in lunghezza fino a 50 aa, ma conten- gono triadi di consenso idrofile, che indicano le regioni esposte al solvente; queste regioni sono simili alle

regioni di Streptococcus mutans, dove fungono da proteine che legano zuccheri. TcdA e TcdB sono entram- bi codificati dallo stesso locus di patogeneticità di 19,6 kb; i locus sono vicini e trascritti nella stessa direzio- ne; oltre a queste due tossine, sono presenti altri tre ORF (open reading frame) che contribuiscono alla re- golazione della produzione di tossina e al rilascio:

- TcdC è downstream a TcdA e viene trascritto nella direzione opposta delle due tossine, e la sua espressio-

ne è alta all’inizio della fase esponenziale e diminuisce quando la colonia si trova nella fase stazionaria; ciò

suggerisce che TcdC funziona come regolatore negativo della produzione di tossine.

- TcdD è upstream a TcdB, ed è espresso in parallelo con i geni delle tossine, poichè aumenta l’espressione

dei promotori dei geni delle tossine; inoltre è analogo ai regolatori positivi di tetano (TetR) e botulino

(BotR); TcdD è un fattore sigma alternativo della RNA polimerasi che si attiva in risposta a segnali ambienta-

li; è quindi un regolatore positivo dell’espressione delle tossine.

- TcdE è tra TcdA e TcdB, è facilita il riascio delle tossine tramite modifiche di permeabilità della membrana

cellulare. Quindi l’espressione di TcdA e TcdB è dimiuita da TcdC (regolatore negativo), aumentata da TcdD (regolatore positivo) e facilitata nel rilascio da TcdE (funzione canale). In condizioni di assenza di biotina, la crescita di C. diffice è ridotta, e in questa condizione di stress viene stimolata la produzione di tossine. TcdA e TcdB sono dirette verso la famiglia Ras di piccole GTPasi, modificandole per glicosilazione; questa modificazione irreversibile inattiva queste piccole proteine regolatorie, causando alterazioni nella trasdu- zione del segnale. Il dominio N-term è enzimatico, il dominio C-term è recettoriale.

Per esplicare il loro effetto citotossico, le tossine devono essere internalizzate nell’ospite tramite endocitosi

e richiedono l’acidificazione dell’endosoma per entrare nel citosol. Il legame con il recettore è il primo pas-

so della virulenza: la tossina lega il disaccaride Gal-NacGlc presente su molte cellule (infatto il trattamento

con la galattosidasi riduce il legame di TcdA). TcdB può intossicare molte cellule, quindi il suo recettore de- ve essere ubiquitario.

Microbiologia (temp)

TOSSINE BATTERICHE

Antonio Nenna

Microbiologia (temp) TOSSINE BATTERICHE Antonio Nenna L’effetto finale delle tossine è la modificazione del

L’effetto finale delle tossine è la modificazione del citoscheletro, che scatena la morte cellulare. Ciò avviene perchè le tossine trasferiscono glucosio (glicosilazione) da UDP-glucosio ad alcune proteine GTPasiche (Rho, Rac, Cdc42). Quindi le tossine sono delle glucosil-trasferasi capaci di inattivare piccole GTPasi nelle cellule infettate. Rho regola la formazione di fibre da stress, la motilità e l’adesione. Rac e Cdc42 sono implicate nella forma- zione di filopodi e lamellipodi (estensioni strutturali che permettono il movimento delle cellule) Rho è un regolatore primario dell’actina del citoscheletro, ed è trovato in tutte le cellule eucariotiche; dopo la sintesi, viene modificata e attaccata al versante citoplasmatico della membrana plasmatica, per esercita- re la attività GTPasica. Nell’alternanza tra le forme con GTP (attiva) e con GDP (inattiva) si regola l’attività dell’actina, tramite proteine intermedie. Lo scambio tra GDP e GTP è dovuto a fattori citiplasmatici; la Rho- GTP attivata (intrinsecamente e tramite proteine GTPasi-attivanti) idrolizza GTP, rimuovendo il γP e tornan- do nello stato inattivo. Rac e Cdc42 hanno meccanismi analoghi. Impedire la trasduzione di Rho con le pro- teine effettrici altera la struttura del citoscheletro. La glicosilazione operata da Tcd su Rho, Rac o Cdc42 impedisce il legame con GTP o blocca l’interazione con le proteine effettrici a valle, bloccano la trasduzione del segnale. TcdA e TcdB alterano dal signaling intracellulare all’ultrastruttura, causando morte cellulare. La perdita di integrità strutturale è dovuta alla diminuzione di F-actina nelle cellule, che causa modifiche della superficie e dei microfilamenti, come la rottura delle giunzioni intercellulari. Rho, Rac e Cdc42 regolano inoltre il ciclo cellulare, come le fosfolipasi; con l’infezione, il conseguente au- mento della permeabilità della membrana aumenta lo stato infiammatorio (osservato nella colite pseudo- membranosa). Inoltre, le tossine possono anche stimolare l’apoptosi, poichè l’inattivazione di Rho causa l’attivazione della caspasi3, componente chiave della cascata apoptotica. TcdA inoltre stimola la produzione di citochine, che contribuisce all’infiammazione nella colite pseudo- membranosa; la tossina, tramite la via NFkB, attiva IL8 e causa la produzione di ROS ad opera degli entero- citi, che aumenta lo stato infiammatorio.

TOSSINE BATTERICHE

CLOSTRIDIUM TETANI C. TETANI: è l’agente eziologico del tetano. Produce spore terminali all’interno di uno sporangio terminale, da cui la somiglianza con le bacchette di tamburo. Sebbene sia gram-positivo di struttura, può colorarsi in modo differente in base alla fase vitale. Il tetano è altamente fatale negli uomini (mortalità fino all’80%). La malattia è causata dalla tossina (“tetanospasmina”) prodotta dalla riattivazione delle spore che entrano in una ferita. Si utilizza il tossoide per l’immunizzazione della popolazione. Si presenta con spasmi e rigidità muscolare, fino alla paralisi dei muscoli respiratori. Il segno patognomonico del “trisma” (lockjaw) è dovuto allo spasmo del massetere. Il tetano neonatale causa la metà dei morti di tetania. Si distinguono 11 specie di tetano in base agli antigeni presenti sui flagelli, e differiscono nella capacità di produrre la tossina. La te- tanospasmina è codificata da un plasmide, è prodotta dalle cellule in crescita esponenziale e rilasciata nella lisi cellulare (germinazione della spora). Il batterio sintetizza la tossina tetanica come catena polipeptidica da 150 kDa (tossina progenitrice) che è tagliata da una proteasi batterica in una catena pesante (frammen- toB, 100 kDa) e in una catena leggera (frammentoA, 50 kDa), che rimangono connessi da un ponte disolfu- ro. La proteasi è trovata in tutte le colture di C. tetani. Il frammentoB si lega al recettore, mentre il fram- mentoA media l’azione enzimatica (come sempre). La tossina è termolabile, e viene distrutta con tratta- mento a 56° per 5’, ed è labile all’ossigeno. La tossina purificata è rapidamente convertita a tossoide a 0° in presenza di formalina. La tetanospasmina inizialmente si lega ai terminali nervosi periferici, ed è trasportata all’interno dell’assone, fino ai gangliosidi degli interneuroni presinaptici; blocca il rilascio di neurotrasmetti- tore inibitorio (glicina) che permette il feedback negativo sul motoneurone, tramite il taglio proteolitico della sinaptobrevina2. La guarigione dalla malattia usualmente non conferisce immunità; la profilassi im- munitaria è svolta con il tossoide tetanico, tramite tre iniezioni.

Microbiologia (temp)

Antonio Nenna

TOSSINE BATTERICHE

CLOSTRIDIUM BOTULINUM C. BOTULINUM: è un bastoncello anaerobio che forma spore sub-terminali (a differenza delle spore termi- nali del C. tetani). Essendo diffuso variamente, spesso si trova nel tratto intestinale di uccelli, mammiferi e pesci. Le tossine sono di sette tipi differenti (A-G), acquisite mediante fagi o plasmidi. Nel botulismo alimen- tare il batterio è ingerito con il cibo; la tossina è assorbita dal duodeno e dal digiuno, e passa verso il flusso sanguigno, attraverso il quale raggiunge le sinapsi neuromuscolari; la tossina si lega al terminale presinapti- co e blocca il rilascio di ACh, che è rischiesto per l’attivazione della placca neuromuscolare. La tossina botu- linica è una tossina preformata, quindi agisce rapidamente, e la malattia è una intossicazione (non una infe- zione), ed è simile all’avvelenamento con stafilococco. Il botulismo alimentare deriva dal cibo non cotto contenente spore; l’ambiente anaerobico del cibo in scatola può aumentare la produzione di spore. I sin- tomi classici iniziano 18-36 h dopo l’ingestione, con debolezza, vertigini e secchezza delle mucose, con rari nausea e vomito. Le complicanze neurologiche sono: visione confusa, difficoltà nella deglutizione, difficoltà nella parola, paralisi flaccida discendente e paralisi respiratoria. Il botulismo infantile può stabilirsi poichè la flora intestinale è ancora assente, e quindi il clostridio può vegetare come normale flora batterica; la for- mazione di spore causa la malattia (tra cui la SIDS, sudden infant death syndrome). La tossina botulinica è simile nella funzione a quella tetanica, ma ne differisce poichè è diretta verso cellule differenti. Colpisce il terminale presinaptico dei motoneuroni, impedendo il rilscio di ACh, e causa la caratteristica paralisi flacci- da. Viene sintetizzata e matura allo stesso modo della tossina tetanica, e anche il target è analogo (sinapto- brevina2). Dopo il taglio proteolitico, la sinapsi è danneggiata in modo irreparabile, ed è quindi necessaria la formazione di una nuova sinapsi. La tossina botulinica può essere trasformata in tossoide, ed esistono antitossine efficaci nel botulismo acuto. Il botulismo può essere prevenuto mediante adeguate pratiche di sterilizzazione. Le spore sopravvivono alla bollitura (100° ad 1 atm) ma sono uccise dall’autoclave. I cibi con- tenenti bolle gassose (dovute alla fermentazione dei clostridi, principalmente CO 2 ) non devono essere aper- ti o assaggiati.

Microbiologia (temp)

Antonio Nenna

analogie e differenze tra tossina tetanica e tossina botulinica

aper- ti o assaggiati. Microbiologia (temp) Antonio Nenna analogie e differenze tra tossina tetanica e tossina

Microbiologia (temp)

TOSSINE BATTERICHE

BACILLUS ANTHRACIS

Antonio Nenna

Il bacillus anthracis è un bastoncello gram-positivo sporigeno aerobio/anaerobio facoltativo. L’antrace è una malattia degli animali erbivori domestici; gli uomini si infettano incidentalmente quando mangiano carne infetta o lavorano il pellame degli animali. Si distinguono due forme di antrace:

- antrace cutaneo: acquisito tramite lesioni cutanee o mucose (ferite) che vengono inoculate con spore; le

spore germinano e formano un caratteristico edema gelatinoso sulla superficie, che evolve in papula dopo 12-36 h, che evolve in vescicola e poi in pustola, che porta ad un’ulcera necrotica che permette la dissemi- nazione dell’infezione, con setticemia. L’essudato linfatico sopraggiunge in 7 giorni; se avviene l’invasione del circolo sanguigno, la setticemia è fatale.

- antrace respiratorio: dovuta a inalazione di polvere contenente spore; la malattia si presenta con febbre e dolore toracico, e progredisce rapidamente in patologia sistemica emorragica; fatale se non trattata.

L’azione della tossica antracica non è chiara, ma sembra coinvolgere la diminuzione dell’ossigeno disponibi- le, con shock, aumento della permeabilità vascolare, insufficienza respiratoria e insufficienza cardiaca. L’azione della tossina è scatenata dalla diminuzione della CO 2 nell’organismo rispetto all’ambiente. Il bacillo è l’unico a possedere una capsula di amminoacidi (D-glutammato polimerizzato), invece di lipidi, che impe-

disce l’azione del complemento. Questa capsula è prodotta solo da alcune colonie, ed è responsabile del diverso aspetto in coltura. Oltre alla capsula, il batterio produce tre differenti tossine, ognuna delle quali è termolabile e di peso 80 kDa:

- PA, protective antigen: riduce gli anticorpi circolanti; è la subunitàB della tossina completa (per il recetto- re) e permette l’aggancio di due differenti subunitàA (EF e LF)

- EF, edema factor: necessario per produrre edema; è una adenilato ciclasi (simile alla bordetella pertussis);

l’aumento di cAMP altera la permeabilità e genera edema; inoltre ingolfa i macrofagi tramite la deplezione delle riserve di ATP che servono al burst respiratorio che segue la fagocitosi

- LF, lethal factor: è essenziale per l’effetto letale della tossina dell’antrace; è una proteasi Zn-dipendente che stimola la produzione di citochine in macrofagi e linfociti. (il dimero EF+LF, senza PA, è inattivo, poichè la tossina non riesce ad entrare nelle cellule)

La tossina è quindi di tipo A-B, e PA è il frammentoB che lega alternativamente EF o LF come frammentoA. Quindi la virulenza del bacillus anthracis è dovuta a:

- capsula amminoacidica formata da poli-D-glutammato

- componente EF della esotossina

- componente LF della esotossina

Microbiologia (temp)

TOSSINE BATTERICHE

COLERA

Antonio Nenna

Il colera è una grave malattia diarroica causata dal Vibrio cholerae, batterio gram-negativo isolato da Kock

nel 1883. La carica batterica necessaria è molto alta (a differenza della shigella, con carica batterica bassa).

La trasmissione avviene anche mediante acqua o cibo contaminati, ma è principalmente orofecale (poichè

si tratta di una malattia adattata all’uomo). Attualmente, la 7^ epidemia di colera si trova ad Haiti, con ori- gine nella regione del Gange (Bangladesh). Il biotipo attuale (El Tor) si distingue per la produzione di emoli- sina. Una persona normale dopo un’ora di malattia diventa ipotesa e può morire anche dopo 2 o 3 ore (in media, 12 h) per insufficienza renale. La malattia si presenta con diarrea abbondante (fino a 16L/die), cau- sata dalla attività della tossina colerica, che attiva la adenilato ciclasi negli enterociti, causando l’espressione di acquaporine che riversano acqua nel lume intestinale. La perdita di fluidi causa disidrata- zione, anuria, acidosi e shock. La diarrea è caratterizzara da frammenti epiteliali e muco (diarrea ad acqua

di riso). La perdita di potassio, che causa ipokaliemia, può portare arresto cardiaco. Il tasso di mortalità è di

oltre il 50%. La variazione antigenica è fondamentale per l’epidemiologia del colera, e tramite l’antigeneO si distinguono 140 sierotipi, quasi tutti non virulenti. Si distinguono tre sierotipi:

- Ogawa, con antigeni A e B

- Inaba, con antigeni A e C

- Hikojima, con antigeni A, B e C

La tossina colerica è una tossina preformata e viene iniettata mediante T3SS negli enterociti.

La tossina colerica attiva la adenilato ciclasi nelle cellule dell’epitelio intestinale mediante ADP- ribosilazione, causando aumento dei livelli di cAMP, con secrezione di acqua ed elettroliti nel lume intesti- nale. L’effetto dipende dall’interazione con il recettore, il ganglioside GM1 presente sulla superficie degli enterociti. Il batterio produce una invasina, la neuroaminidasi, che può degradare il ganglioside, permet- tendo al batterio di entrare nella cellula. La tossina è formata da 5 frammentiB di 11500 Da, un frammen- toA1 da 23500 Da e un frammentoA2 da 5500 Da che collega A1 con B. Dopo l’ingresso nella cellula, A1 tra- sferisce ADP-ribosio dal NAD ad una proteina regolatoria dell’adenilato ciclasi, che viene attivata in maniera costitutiva e non può essere inattivata da un’altra proteina inibitoria. Visto che l’idrolisi del GTP presente sulla adenilati ciclasi non può avvenire, l’enzima rimane continuamente attivo, trasformando ATP in cAMP.

rimane continuamente attivo, trasformando ATP in cAMP. Quindi l’effetto netto della tossina è causare cAMP,

Quindi l’effetto netto della tossina è causare cAMP, prodotto in maniera abnormemente alta, che stimola le cellule a pompare cloro nel lume intestinale. Acqua e altri elettroliti (sodio) seguono il cloro, per gradiente osmotico ed elettrico. Quindi le cellule contenenti la tossina pompano acqua, causando diarrea, perdita di elettroliti e disidratazione.

Antonio Nenna

Escherichia coli produce una tossina termolabile (LT) che è molto simile alla tossina colerica nella struttura

e nella modalità di azione. Il DNA che codifica per LT è di un plasmide, mentre quello per la tossina colerica

TOSSINE BATTERICHE

Microbiologia (temp)

è di un cromosoma.

Molte caratteristiche del vibrione del colera sono importanti nel determinare colonizzazione: questi inclu- dono adesine, neuraminidase, motilità, chemiotassi e produzione di tossine. Il batterio è resistente

all’acidità gastrica e ai sali biliari, tramite la secrezione di numerosi enzimi (proteasi,

cosa intestinale è mediata dalla fimbria, che si trova al polo della cellula. Questa fimbria si chiama pilus-tcp (toxin coregulated pili), perchè l’espressione di questi pili è strettamente correlata all’espressione della tos- sina; il pilus serve anche come meccanismo di propulsione, oltre che di chemiotassi. Inoltre, l’adesione è dovuta a emagglutinine e altri fattori di colonizzazione, che aumentano la forza di interazione con gli ente- rociti.

L’aderenza alla mu-

).

L’enterotossina colerica è prodotta dal gene Ctx (CtxA per frammentoA, CtxB per frammentoB; entrambi sullo stesso operone). Il mRNA di Ctx ha due siti di legame per i ribosomi, uno upstream di CtxA e uno up- stream di CtxB, che viene espresso in modo molto maggiore (fino a 7 volte di più); ciò giustifica la struttura A5B della tossina. Il frammentoA non è intrinsecamente attivo, ma deve essere tagliato nei frammenti A1 e A2, uniti da legame disolfuro. Quando B si lega al recettore GM1, A1 è rilasciata per riduzione del ponte di- solfuro e viene attivata. La trascrizione dell’operone CtxAB è regolata da molti segnali: temperatura, pH e osmolarità. Ctx e Tcp sono regolati in parallelo, dagli stessi segnali. ToxR è una proteina transmembrana, che dimerizza e si lega all’operatore di CtxAB, attivando la trascrizio- ne. ToxS è una proteina sensore che fosforila, e quindi converte, ToxR permettendo di dimerizzare e attiva- re il DNA. ToxT, attivata da ToxR, è una proteina citoplasmatica che funziona da attivatore dell’operone Tcp per la formazione del pilus.