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tra

ENOLOGIA
contents
Osservazioni sull'espressione di alcuni parametri della composizione del mosto e del vino vii
Prefazione alla prima edizione ix Prefazione alla seconda edizione xiii
1 Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti d'uva e del vino
2 Biochimica della fermentazione alcolica e vie metaboliche dei lieviti enologici
3 Condizioni di sviluppo del lievito
4 Batteri dell'acido lattico
5 Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
6 Sviluppo dei batteri dell'acido lattico nel vino
7 batteri dell'acido acetico
8 L'uso dell'anidride solforosa nel trattamento del mosto e del vino
9 Prodotti e metodi che integrano l'effetto dell'anidride solforosa 10 L'uva e la sua maturazione
11 Trattamenti di raccolta e pre-fermentazione
12 Vinificazione in rosso
13 Vinificazione in bianco
14 Altri metodi di vinificazione
Indice
 Osservazioni sull'espressione di alcuni parametri di Mosti e
composizione del vino
UNITÀ
Vengono utilizzate esclusivamente unità del sistema
metrico di lunghezza (m), volume (l) e peso (g). La
conversione di unità metriche in unità imperiali (pollici,
piedi, galloni, libbre, ecc.) Può essere trovata nel
seguente lavoro enologico: Principi e pratiche di
vinificazione, R.B. Boulton, V.L. Singleton, L.F. Bisson e
R.E. Kunkee, 1995, The Chapman & Hall Enology
Library, New York.
ESPRESSIONE DI ACIDITÀ TOTALE E ACIDITÀ
VOLATILE
Sebbene le normative CE raccomandino l'espressione
dell'acidità totale in peso equivalente di acido tar-
tarico, l'usanza francese è di dare questa espressione
in peso equivalente di acido solforico. Il in Francia non
è stata adottata un'espressione più corretta in
milliequivalenti per litro. L'espressione dell'acidità
totale e volatile nel peso equivalente dell'acido
solforico è stata utilizzata prevalentemente in questi
lavori. In alcuni casi è stato indicato il peso
corrispondente in acido tartarico, spesso utilizzato in
altri paesi. Utilizzando il peso del milliequivalente dei
vari acidi, la tabella sottostante permette la
conversione da un'espressione all'altra. Più in
particolare, per convertire dall'acidità totale espressa
in H2SO4 alla sua espressione in acido tartarico,
aggiungere metà del valore al valore originario (4 g / l
H2SO4 → 6 g / l acido tartarico). Nell'altra direzione
deve essere sottratto un terzo del valore.
I francesi continuano anche ad esprimere acidità
volatile in peso equivalente di acido solforico.
Più in generale, in altri paesi, l'acidità volatile è
espressa in acido acetico. Raramente è espresso in
milliequivalenti per litro. La tabella seguente consente
anche una semplice conversione da un'espressione
all'altra. L'espressione nell'acido acetico è di circa il
20% superiore rispetto all'acido solforico.
VALUTARE LA CONCENTRAZIONE DI ZUCCHERI
DEI MOSTI
Questa misurazione è importante per monitorare la
maturazione dell'uva, la cinetica di fermentazione e, se
necessario, determinare l'eventuale necessità di
zuccheraggio.
Questa misura è sempre determinata dall'analisi fisica,
densimetrica o rifrattometrica. L'espressione dei risultati
può essere data secondo diverse scale: alcune sono usate
raramente, cioè grado Baume ́ e grado Oechsle.
Attualmente esistono due sistemi (Sezione 10.4.3):
- 1. La gradazione alcolica potenziale (titolo alcolometrico
o TAP, in francese) dei mosti può essere letta
direttamente sull'attrezzatura, che viene graduata
utilizzando una scala corrispondente a 17,5 o 17 g / l di
zucchero per 1% di volume di alcol . Oggi, la CE
raccomanda di utilizzare 16,83 g / l come fattore di
conversione. Il "mustimeter" è un densimetro contenente
due scale graduate: una esprime la densità e l'altra
fornisce una lettura diretta del TAP. Esistono diversi
metodi che variano in precisione per calcolare il TAP da
una lettura di densità. Questi metodi tengono conto di
vari elementi della composizione del mosto (Boulton et
al., 1995).
2. Il grado Brix esprime la percentuale di zucchero in
peso. Moltiplicando il grado Brix per 10 si ottiene il peso
dello zucchero in 1 kg, ovvero poco meno di 1 litro, di
mosto. Una tabella di conversione tra grado Brix e TAP
esiste nella sezione 10.4.3 di questo libro. 17 gradi Brix
corrispondono a un TAP approssimativo del 10% e 20
gradi Brix corrispondono a un TAP di circa il 12%.
All'interno della fascia alcolica più rilevante per l'enologia,
il grado Brix può essere moltiplicato per 10
e poi diviso per 17 per ottenere un'approssimazione
abbastanza buona del TAP.
In ogni caso la determinazione del Brix o TAP di un mosto
è approssimativa. Innanzitutto non è sempre possibile
ottenere un campione rappresentativo di uva o mosto da
analizzare. In secondo luogo, sebbene le misurazioni
fisiche, densimetriche o rifrattometriche siano
estremamente precise ed esprimano rigorosamente la
concentrazione zuccherina di una miscela di zucchero e
acqua, queste misurazioni sono influenzate da altre
sostanze rilasciate nel campione dall'uva e da altre fonti.
Inoltre, le concentrazioni di queste sostanze sono diverse
per ogni campione di uva o mosto d'uva. Infine, il tasso di
conversione dello zucchero in alcol (circa 17-18 g / l) varia
e dipende dalle condizioni di fermentazione e dalle
proprietà del lievito. L'uso diffuso di ceppi di lievito
selezionati ha abbassato il tasso di conversione dello
zucchero.
Misurazioni utilizzando la spettrometria visibile e
ultravioletta.
 Osservazioni sull'espressione di alcuni parametri di Mosti e
composizione del vino

La misurazione della densità ottica, assorbanza, è

ampiamente utilizzata per determinare il colore del
vino (Volume 2, Sezione 6.4.5) e la concentrazione di
composti fenolici totali (Volume 2, Sezione 6.4.1). In
questi lavori, la densità ottica è indicata come OD, OD
420 (giallo), OD 520 (rosso), OD 620 (blu) o OD 280
(assorbimento nello spettro ultravioletto) per indicare
la densità ottica alle lunghezze d'onda indicate.
L'intensità del colore del vino è espressa come:
CI = OD 420 + OD 520 + OD 620,
Oppure è talvolta espresso in una forma più
semplificata: CI = OD 420 + OD 520.
La tinta è espressa come:
T = OD 420 OD 520
La concentrazione di composto fenolico totale è
espressa da OD 280.
I metodi di analisi sono descritti nel Capitolo 6 del
Manuale di Enologia Volume 2, The Chemistry of Wine.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
1.1 INTRODUZIONE L'uomo produce pane e
bevande fermentate dall'inizio della storia
documentata. Eppure il ruolo dei lieviti nella
fermentazione alcolica, in particolare nella
trasformazione dell'uva in vino, fu chiaramente
stabilito solo a metà dell'Ottocento. Gli antichi
spiegavano l'ebollizione durante la fermentazione (dal
latino fervere, bollire) come reazione tra sostanze che
entrano in contatto tra loro durante la pigiatura. Nel
1680, un commerciante di tessuti olandese, Antonie
van Leeuwenhoek, osservò per la prima volta i lieviti
nel mosto di birra usando un microscopio da lui
progettato e prodotto. Tuttavia, non ha stabilito una
relazione tra questi corpuscoli e la fermentazione
alcolica. Fu solo alla fine del diciottesimo secolo che
Lavoisier iniziò lo studio chimico della fermentazione
alcolica. Gay-Lussac continuò la ricerca di Lavoisier nel
secolo successivo.
Già nel 1785 Fabroni, uno scienziato italiano, fu il
primo a fornire un'interpretazione della composizione
chimica del fermento responsabile della
fermentazione alcolica, che descrisse come una
sostanza vegetale-animale. Secondo Fabroni, questo
materiale, paragonabile al glutine della farina, si
trovava in appositi otricoli, in particolare sull'uva e sul
grano, e la fermentazione alcolica avveniva quando
veniva a contatto con lo zucchero del mosto. Nel
1837, un fisico francese di nome Charles Cagnard de
La Tour dimostrò per la prima volta che il lievito era
un organismo vivente. Secondo le sue scoperte, era in
grado di moltiplicarsi e apparteneva al regno vegetale;
le sue attività vitali erano alla base della fermentazione
dei liquidi
contenenti zucchero. Il naturalista tedesco Schwann
confermò la sua teoria e dimostrò che il calore e
alcuni prodotti chimici erano in grado di fermare la
fermentazione alcolica. Ha chiamato il lievito di birra
zucker-pilz, che significa zucchero fungo -
Saccharomyces in latino. Nel 1838, Meyen usò per la
prima volta questa nomenclatura.
Questo punto di vista vitalista o biologico del ruolo dei
lieviti nella fermentazione alcolica, ovvio per noi oggi,
non fu prontamente supportato. Liebig e alcuni altri
chimici organici erano convinti che le reazioni
chimiche, non l'attività cellulare vivente, fossero
responsabili della fermentazione dello zucchero. Nei
suoi famosi studi sul vino (1866) e sulla birra (1876),
Louis Pasteur diede definitiva credibilità al punto di
vista vitalista della fermentazione alcolica.
Ha dimostrato che i lieviti responsabili della
fermentazione spontanea del mosto d'uva o del pigiato
provenivano dalla superficie dell'uva; ha isolato diverse
razze e specie. Ha anche concepito l'idea che la natura
del lievito che svolge la fermentazione alcolica potrebbe
influenzare le caratteristiche gustative del vino. Ha anche
dimostrato l'effetto dell'ossigeno sull'assimilazione dello
zucchero da parte dei lieviti. Louis Pasteur ha dimostrato
che il lievito produceva prodotti secondari come il
glicerolo oltre all'alcol e all'anidride carbonica.
Dal momento che Pasteur, i lieviti e la fermentazione
alcolica hanno stimolato una notevole quantità di ricerca,
facendo uso dei progressi in microbiologia,
biochimica e ora genetica e biologia molecolare.
Nella tassonomia, gli scienziati definiscono i lieviti come
funghi unicellulari che si riproducono per gemmazione e
fissione binaria. Alcuni funghi pluricellulari hanno uno
stadio unicellulare e sono anche raggruppati con lieviti. I
lieviti formano un gruppo complesso ed eterogeneo che
si trova in tre classi di funghi, caratterizzati dalla loro
modalità di riproduzione: i funghi sac (Ascomycetes), i
funghi club (Basidiomycetes) e i funghi imperfetti
(Deuteromycetes). I lieviti presenti sulla superficie dell'uva
e nel vino appartengono agli Ascomiceti e ai
Deuteromiceti. Le spore aploidi o ascospore della classe
degli Ascomiceti sono contenute nell'ascus, un tipo di
sacco costituito da cellule vegetative. I lieviti asporiferi,
incapaci di riproduzione sessuale, sono classificati con i
funghi imperfetti.
In questo primo capitolo verranno discussi la morfologia,
la riproduzione, la tassonomia e l'ecologia dei lieviti d'uva
e del vino. La citologia è lo studio morfologico e
funzionale dei componenti strutturali della cellula (Rose e
Harrison, 1991).
I lieviti sono il più semplice degli eucarioti. La cellula di
lievito contiene involucri cellulari, un citoplasma con vari
organelli e un nucleo circondato da una membrana e che
racchiude i cromosomi. (Figura 1.1). Come tutte le cellule
vegetali, la cellula di lievito ha due involucri cellulari: la
parete cellulare e la membrana. Lo spazio periplasmatico
è lo spazio tra la parete cellulare e la membrana. Il
citoplasma e la membrana costituiscono il protoplasma. Il
termine protoplasto o sphaeroplast designa una cellula la
cui parete cellulare è stata rimossa artificialmente.
Gli involucri cellulari di lievito svolgono un ruolo
essenziale: contribuiscono al successo della
fermentazione alcolica e rilasciano alcuni costituenti che
si aggiungono alla composizione del vino risultante. Per
sfruttare queste proprietà, l'enologo o l'enologo deve
avere una profonda conoscenza di questi organelli.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
1.2 LA PARETE DELLA CELLULA
1.2.1 Il ruolo generale della parete cellulare
Negli ultimi 20 anni, i ricercatori (Fleet, 1991; Klis,
1994; Stratford, 1999; Klis et al., 2002) hanno
notevolmente ampliato la nostra conoscenza della
parete cellulare del lievito, che rappresenta il 15-25%
del peso a secco del cellula. Consiste essenzialmente
di polisaccaride. È un involucro rigido, ma dotato di
una certa elasticità. La sua prima funzione è
proteggere la cellula. Senza la sua parete, la cellula
scoppierebbe sotto la pressione osmotica interna,
determinata dalla composizione dell'ambiente della
cellula. I protoplasti immersi in acqua pura vengono
immediatamente lisati in questo modo. L'elasticità
della parete cellulare può essere dimostrata ponendo
i lieviti, presi durante la loro fase logaritmica, in una
soluzione ipertonica (NaCl). Il loro volume cellulare
diminuisce di circa il 50%. La parete cellulare appare
più spessa ed è quasi a contatto con la membrana.Le
cellule riacquistano la loro forma iniziale dopo essere
state reinserite in un mezzo isotonico.
Eppure la parete cellulare non può essere considerata
una "armatura" inerte e semirigida. Al contrario, è un
organello dinamico e multifunzionale. La sua
composizione e le sue funzioni si evolvono durante la
vita della cellula, in
risposta a fattori ambientali. Oltre al suo ruolo
protettivo, la parete cellulare conferisce alla cellula la
sua particolare forma attraverso la sua organizzazione
macromolecolare. È anche il sito delle molecole che
determinano alcune interazioni cellulari come l'unione
sessuale, la flocculazione e il fattore killer, che saranno
esaminati in dettaglio più avanti in questo capitolo
(Sezione 1.7). Infine, un certo numero di enzimi,
generalmente idrolasi, sono collegati alla parete
cellulare o situati nello spazio periplasmatico. I loro
substrati sono sostanze nutritive dell'ambiente e le
macromolecole della parete cellulare stessa, che viene
costantemente rimodellata durante la morfogenesi
cellulare.
1.2.2 La struttura chimica e la funzione dei
costituenti parietali
La parete cellulare del lievito è costituita da due
costituenti principali: β-glucani e mannoproteine.
La chitina rappresenta una piccola parte della sua
composizione. Il lavoro più minuzioso sulla parete
cellulare del lievito è stato eseguito sul Saccharomyces
cerevisiae, il principale lievito responsabile della
fermentazione alcolica del mosto d'uva.
Il glucano rappresenta circa il 60% del peso secco della
parete cellulare di S.cerevisiae. Può essere frazionato
chimicamente in tre categorie:
1. Il β-1,3 glucano fibroso è insolubile in acqua, acido
acetico e alcali. Ha pochissimi rami. I punti di diramazione
coinvolti sono collegamenti β-1,6. Il suo grado di
polimerizzazione è 1500.
Al microscopio elettronico, questo glucano appare
fibroso. Assicura la forma e la rigidità della parete
cellulare. È sempre collegato alla chitina.
2. Il β -1,3 glucano amorfo, con circa 1500 unità di
glucosio, è insolubile in acqua ma solubile in alcali. Ha
pochissimi rami, come il precedente glucano. Oltre a
questi pochi rami, è costituito da un piccolo numero di
legami glicosidici β-1,6. Ha un aspetto amorfo al
microscopio elettronico. Conferisce alla parete cellulare la
sua elasticità e funge da ancoraggio per le
mannoproteine. Può anche costituire una sostanza di
riserva extraprotoplasmatica.
3. Il β-1,6 glucano è ottenuto da glucani insolubili in alcali
mediante estrazione in acido acetico. Il prodotto
risultante è amorfo, solubile in acqua e ampiamente
ramificato da legami β-1,3 glicosidici. Il suo grado di
polimerizzazione è 140. Collega insieme i diversi
costituenti della parete cellulare. È anche un sito
recettore per il fattore killer. Il β -1,3 glucano fibroso
(insolubile in alcali) risulta probabilmente
dall'incorporazione della chitina sul β-1,3 glucano amorfo.
Le mannoproteine costituiscono il 25-50% della parete
cellulare di S. cerevisiae. Possono essere estratti
dall'intera cellula o dalla parete cellulare isolata con
metodi chimici ed enzimatici. I metodi chimici fanno uso
della sterilizzazione in autoclave in presenza di alcali o di
una soluzione tampone citrato a pH 7. Il metodo
enzimatico libera le mannoproteine digerendo il glucano.
Questo metodo non denatura la struttura delle
mannoproteine quanto i metodi chimici. La zimoliasi,
ottenuta dal batterio Arthrobacter luteus, è il preparato
enzimatico più spesso utilizzato per estrarre le
mannoproteine parietali di S. cerevisiae.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
Questo complesso enzimatico è efficace
principalmente per la sua attività β-1,3 glucanasi.
L'azione dei contaminanti proteasi nella zimoliasi si
combina con la suddetta attività di liberazione delle
mannoproteine. Glucanex, un'altra preparazione
industriale della β-glucanasi, prodotta da un fun- gus
(Trichoderma harzianum), ha recentemente
dimostrato di possedere attività endo- ed eso-β-1,3 e
endo-β -1,6-glucanasi ( Dubourdieu e Moine, 1995).
Queste attività facilitano anche l'estrazione delle
mannoproteine della parete cellulare della cellula di S.
cerevisiae. Le mannoproteine di S. cerevisiae hanno
un peso molecolare compreso tra 20 e 450 kDa. Il loro
grado di glicosilazione varia. Alcuni che contengono
circa il 90% di mannosio e il 10% di peptidi sono
ipermannosilati.
Sono descritte quattro forme di glicosilazione ma non
necessariamente esistono contemporaneamente in
tutte le mannoproteine. Il mannosio delle
mannoproteine può costituire catene corte e lineari
con da uno a cinque residui.
Sono legati alla catena peptidica da legami O-glicosilici
sui residui di serina e treonina. Questi collegamenti
glicosidici della catena laterale sono α-1,2 e α-1,3. La
parte glucidica della mannoproteina può anche essere
un polisaccaride. È legato a un residuo di asparagina
della catena peptidica da un legame N-glicosilico.
Questo collegamento consiste in una doppia unità di
N-acetilglucosamina (chitina) legata in β -1,4. Il
mannano legato in questo modo all'asparagina
comprende una regione di attacco composta da una
dozzina di residui di mannosio e una catena esterna
altamente ramificata composta da 150 a 250 unità di
mannosio.
La regione di attacco oltre il residuo di chitina è
costituita da uno scheletro di mannosio legato in α-1,6
con rami laterali che possiedono uno, due o tre
residui di mannosio con legami α-1,2 e / o α-1,3.
Anche la catena esterna è costituita da uno scheletro
di unità di mannosio legate in α-1,6. Questa catena
porta brevi catene laterali costituite da residui di
mannosio legati in α-1,2 e un mannosio terminale in
α-1,3. Alcune di queste catene laterali possiedono un
ramo attaccato da un legame fosfodiestere. Un terzo
tipo di glicosilazione è stato descritto più
recentemente.
Può essere presente nelle mannoproteine, che
costituiscono la parete cellulare del lievito.
È costituito da una catena di glucomannano
contenente essenzialmente residui di mannosio legati
La natura del punto di attacco glicano-peptide non è
ancora chiara, ma potrebbe essere un legame asparaginil-
glucosio. Questo tipo di glicosilazione caratterizza le
proteine liberate dalla parete cellulare dall'azione di una
β-1,3 glucanasi. Pertanto, in vivo, la catena del
glucomannano può comprendere anche residui di
glucosio legati in β-1,3.
Il quarto tipo di glicosilazione delle mannoproteine del
lievito è l'ancora glicosil-fosfatidil-inositolo (GPI). Questo
attaccamento tra il gruppo carbossilico terminale della
catena peptidica e un fosfolipide di membrana consente a
certe mannoproteine, che attraversano la parete
cellulare, di ancorarsi nella membrana plasmatica. La
regione di attacco è caratterizzata dalla seguente
sequenza: etanolamina-fosfato- 6-mannosio-α-1,2-
mannosio-α-1,6-mannosio-α-1,4- glucosamina-α-1 , 6-
inositolo-fosfolipide.
Una C-fosfolipasi specifica del fosfatidil inositolo e quindi
in grado di realizzare questa scissione è stata dimostrata
nello S. cerevisiae (Flick e Thorner, 1993). Diverse
mannoproteine di tipo GPI sono state identificate nella
parete cellulare di S. cerevisiae.
La chitina è un polimero lineare di N-acetilglucosamina
legata in β-1,4 e generalmente non si trova in grandi
quantità nelle pareti cellulari del lievito. In S. cerevisiae, la
chitina costituisce l'1–2% della parete cellulare e si trova
per la maggior parte (ma non esclusivamente) nelle zone
cicatriziali delle gemme. Queste zone sono un tipo di
cratere rialzato facilmente visibile sulla cellula madre al
microscopio elettronico. Questa cicatrice chitinica si
forma essenzialmente per assicurare l'integrità della
parete cellulare e la sopravvivenza cellulare. I lieviti trattati
con la poliossina D, un antibiotico che inibisce la sintesi
della chitina, non sono vitali; scoppiano dopo il
germogliamento.
La presenza di lipidi nella parete cellulare non è stata
chiaramente dimostrata. È vero che le pareti cellulari
preparate in laboratorio contengono alcuni lipidi (2 - 15%
per S. cerevisiae) ma è molto probabile la contaminazione
da parte dei lipidi della membrana citoplasmatica,
adsorbiti dalla parete cellulare durante il loro isolamento.
La parete cellulare può anche adsorbire i lipidi dal suo
ambiente esterno, in particolare i diversi acidi grassi che
attivano e inibiscono la fermentazione. La chitina è
collegata alla parete cellulare o si trova nello spazio
periplasmatico. Uno degli enzimi più caratteristici è
l'invertasi (β-fruttofuranosidasi).
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
Questo enzima catalizza l'idrolisi del saccarosio in
glucosio e fruttosio. È una mannoproteina
termostabile ancorata a un β-1,6 glucano della parete
cellulare. Il suo peso molecolare è 270000 Da.
Contiene circa il 50% di mannosio e il 50% di proteine.
La fosfatasi dell'acido periplasmico è ugualmente una
mannoproteina.
Altri enzimi periplasmatici che sono stati notati sono
β-glucosidasi, α-galattosidasi, melibiase, trehalase,
aminopeptidase ed esterase. Le pareti cellulari di
lievito contengono anche endo- ed eso-β -glucanasi (β
- 1,3 e β-1,6). Questi enzimi sono coinvolti nel
rimodellamento della parete cellulare durante la
crescita e il germogliamento delle cellule. La loro
attività è al massimo durante la fase logaritmica
esponenziale della popolazione e diminuisce
notevolmente in seguito. Tuttavia, le cellule in fase
stazionaria e persino i lieviti morti contenuti nelle
fecce conservano ancora l'attività delle β-glucanasi
nelle loro pareti cellulari diversi mesi dopo il
completamento della fermentazione.
Questi enzimi endogeni sono coinvolti nell'autolisi
della parete cellulare durante l'affinamento dei vini
sulle fecce. Questo metodo di invecchiamento sarà
trattato nel capitolo sulla vinificazione in bianco.
1.2.3 Organizzazione generale della parete
cellulare e fattori che influenzano la sua
composizione
La parete cellulare di S. cerevisiae è costituita da uno
strato esterno di mannoproteine. Queste
mannoproteine sono collegate a una matrice di β-1,3
glucano amorfo che ricopre uno strato interno di
β-1,3 glucano fibroso. Lo strato interno è collegato a
una piccola quantità di chitina (Figura 1.4). Il β-1,6
glucano probabilmente funge da cemento tra i due
strati. La rigidità e la forma della parete cellulare sono
dovute alla struttura interna del glucano fibroso β-1,3.
La sua elasticità è dovuta allo strato amorfo esterno.
La struttura intermolecolare delle mannoproteine
dello strato esterno (legami idrofobici e legami
disolfuro) determina ugualmente la porosità della
parete cellulare e l'impermeabilità alle macromolecole
(pesi molecolari inferiori a 4500). Questa
impermeabilità può essere influenzata trattando la
parete cellulare con alcuni agenti chimici, come il β-
mercaptoetanolo. Questa sostanza provoca la rottura
dei legami disolfuro, distruggendo così la rete
intermolecolare tra le catene mannoproteiche.
La composizione della parete cellulare è fortemente
influenzata dalle condizioni nutritive e dall'età cellulare.La
proporzione di glucano nella parete cellulare aumenta
rispetto alla quantità di zucchero nel mezzo di coltura.
Alcune carenze (ad esempio, nel mesoinositolo)
determinano anche un aumento della proporzione di
glucano rispetto alle mannoproteine. Le pareti cellulari
delle cellule più vecchie sono più ricche di glucani e di
chitina e meno fornite di mannoproteine. Per questo
motivo sono più resistenti agli agenti fisici ed enzimatici
utilizzati per degradarli. Infine, la composizione della
parete cellulare è profondamente modificata da
alterazioni morfogenetiche (coniugazione e sporulazione).
1.3 LA MEMBRANA PLASMATICA
1.3.1 Composizione e organizzazione chimica
La membrana plasmatica è una barriera altamente
selettiva che controlla gli scambi tra la cellula vivente e il
suo ambiente esterno. Questo organello è essenziale per
la vita del lievito. Come tutte le membrane biologiche, la
membrana plasmatica del lievito è costituita
principalmente da lipidi e proteine. La membrana
plasmatica di S. cerevisiae contiene circa il 40% di lipidi e il
50% di proteine. Glucani e mannani sono presenti solo in
piccole quantità (diversi per cento).
I lipidi della membrana sono essenzialmente fosfolipidi e
steroli. Sono molecole anfifiliche, cioè che possiedono
una parte idrofila e una idrofobica. I tre principali
fosfolipidi (Figura 1.5) della membrana plasmatica del
lievito sono la fosfatidiletanolammina (PE), la
fosfatidilcolina (PC) e il fosfatidilinositolo (PI) che
rappresentano il 70-85% del totale. La fosfatidilserina (PS)
e il difosfatidilglicerolo o cardiolipina (PG) sono meno
prevalenti. Gli acidi grassi liberi e l'acido fosfatidico sono
frequentemente riportati nell'analisi della membrana
plasmatica. Probabilmente sono artefatti di estrazione
causati dall'attività di alcuni enzimi di degradazione dei
lipidi.
Gli acidi grassi dei fosfolipidi di membrana contengono un
numero pari (da 14 a 24) di atomi di carbonio.
I più abbondanti sono gli acidi C16 e C18. Possono essere
saturi, come l'acido palmitico (C16) e l'acido stearico (C18),
o insaturi, come l'acido oleico (C18, doppio legame in
posizione 9), l'acido linoleico (C18, due doppi legami nelle
posizioni 9 e 12) e acido linolenico (C18, tre doppi legami
nelle posizioni 9, 12 e 15).
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
Tutti i fosfolipidi di membrana condividono una
caratteristica comune: possiedono una parte polare o
idrofila costituita da un alcool fosforilato e una parte
non polare o idrofobica comprendente due catene di
acidi grassi più o meno parallele. In un mezzo
acquoso, i fosfolipidi formano spontaneamente film
bimolecolari o un doppio strato lipidico a causa della
loro caratteristica anfifilica. I doppi strati lipidici sono
strutture cooperative ma non covalenti.Sono
mantenuti in posizione da interazioni reciprocamente
rinforzate: interazioni idrofobiche, forze attrattive di
van der Waals tra le code degli idrocarburi, interazioni
idrostatiche e legami idrogeno tra le teste polari e le
molecole d'acqua.L'esame delle sezioni trasversali
della membrana plasmatica di lievito al microscopio
elettronico rivela una classica struttura a doppio
strato lipidico con uno spessore di circa 7,5 nm.
La superficie della membrana appare scolpita da
pieghe, soprattutto durante la fase stazionaria.
Tuttavia, il significato fisiologico di questo carattere
anatomico rimane sconosciuto. La membrana
plasmatica ha anche una depressione sottostante
sulla cicatrice del germoglio. L'ergosterolo è lo sterolo
primario della membrana plasmatica del lievito. In
quantità minori, esistono anche 24 (28)
deidroergosterolo e zimosterolo. Gli steroli sono
prodotti esclusivamente nei mitocondri durante la
fase di log dei lieviti. Come per i fosfolipidi, gli steroli a
membrana sono anfipatici. La parte idrofila è
costituita da gruppi idrossilici in C-3. Il resto della
molecola è idrofobo, specialmente la coda flessibile
dell'idrocarburo.
La membrana plasmatica contiene anche numerose
proteine o glicoproteine che presentano un'ampia
gamma di pesi molecolari (da 10.000 a 120.000). Le
informazioni disponibili indicano che l'organizzazione
della membrana plasmatica di una cellula di lievito
assomiglia al modello a mosaico fluido. Questo
modello, proposto per le membrane biologiche da
Singer e Nicolson (1972), consiste in soluzioni
bidimensionali di proteine e lipidi orientati.
Alcune proteine sono incorporate nella membrana;
sono chiamate proteine integrali.
Interagiscono fortemente con la parte non polare del
doppio strato lipidico. Le proteine periferiche sono
legate al precedente da legami idrogeno. La loro
posizione è asimmetrica, sul lato interno o esterno
della membrana plasmatica.
Le molecole di proteine e lipidi di membrana,
costantemente in movimento laterale, sono in grado di
diffondersi rapidamente nella membrana.
Alcune delle proteine della membrana di lievito sono state
studiate in modo più approfondito. Questi includono
l'adenosina trifosfatasi (ATPasi), i soluti (zuccheri e amino
acidi) trasportano proteine ed enzimi coinvolti nella
produzione di glucani e chitina della parete cellulare.
Il lievito possiede tre ATPasi: nei mitocondri, nel vacuolo e
nella membrana plasmatica. La membrana plasmatica
ATPasi è una proteina integrale con un peso molecolare
di circa 100 Da. Catalizza l'idrolisi dell'ATP che fornisce
l'energia necessaria per il trasporto attivo dei soluti
attraverso la membrana.Contemporaneamente, l'idrolisi
dell'ATP crea un efflusso di protoni verso l'esterno della
cellula. La penetrazione di amminoacidi e zuccheri nel
lievito attiva i sistemi di trasporto di membrana chiamati
permeasi.
La permeasi amminoacidica generale (GAP) contiene tre
proteine di membrana e garantisce il trasporto di un
numero di amminoacidi neutri. La coltivazione di lieviti in
presenza di un nutriente a base di azoto facilmente
assimilabile come l'ammonio reprime questa permeasi.
La composizione della membrana in acidi grassi e la sua
proporzione in steroli ne controllano la fluidità. Le catene
idrocarburiche degli acidi grassi del doppio strato
fosfolipidico di membrana possono essere in uno stato
rigido e ordinato o in uno stato relativamente disordinato
e fluido. Nello stato rigido, alcuni o tutti i legami di
carbonio degli acidi grassi sono trans. Allo stato fluido,
alcuni dei legami diventano cis. Il passaggio dallo stato
rigido allo stato fluido avviene quando la temperatura sale
oltre la temperatura di fusione. Questa temperatura di
transizione dipende dalla lunghezza delle catene di acidi
grassi e dal loro grado di insaturazione. Le catene
rettilinee di idrocarburi degli acidi grassi saturi
interagiscono fortemente. Queste interazioni si
intensificano con la loro lunghezza. La temperatura di
transizione aumenta quindi con l'allungamento delle
catene degli acidi grassi. I doppi legami degli acidi grassi
insaturi sono generalmente cis, dando una curvatura alla
catena idrocarburica.
Questa curvatura rompe l'ordinato impilamento delle
catene di acidi grassi e abbassa la temperatura di
transizione. Come il colesterolo presente nelle cellule dei
mammiferi, anche l'ergosterolo è un regolatore
fondamentale della fluidità di membrana nei lieviti.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
L'ergosterolo viene inserito nel doppio strato
perpendicolarmente alla membrana. Il suo gruppo
idrossile si unisce, mediante legami idrogeno, alla
testa polare del fosfolipide e la sua coda idrocarburica
è inserita nella regione idrofobica del doppio strato.
Gli steroli di membrana si intercalano tra i fosfolipidi.
In questo modo inibiscono la cristallizzazione delle
catene di acidi grassi a basse temperature. Al
contrario, riducendo il movimento di queste stesse
catene per ingombro sterico, regolano un eccesso di
fluidità della membrana all'aumentare della
temperatura.
1.3.2 Funzioni della membrana plasmatica
La membrana plasmatica costituisce una barriera
idrofobica stabile tra il citoplasma e l'ambiente
esterno alla cellula, grazie ai suoi fosfolipidi e steroli.
Questa barriera presenta una certa impermeabilità ai
soluti in funzione delle proprietà osmotiche.
Inoltre, attraverso il suo sistema di permeasi, la
membrana plasmatica controlla anche gli scambi tra la
cellula e il mezzo. Il funzionamento di queste proteine
di trasporto è fortemente influenzato dalla sua
composizione lipidica, che influenza la fluidità della
membrana. In un modello ambientale definito,
l'integrazione di fosfolipidi di membrana con acidi
grassi insaturi (oleico e linoleico) ha favorito la
penetrazione e l'accumulo di alcuni amminoacidi
nonché l'espressione della permeasi amminoacidica
generale (GAP), (Henschke e Rose, 1991). D'altra parte,
gli steroli di membrana sembrano avere un'influenza
minore sul trasporto degli amminoacidi rispetto al
grado di insaturazione dei fosfolipidi. La produzione di
acidi grassi insaturi è un processo ossidativo e
richiede l'aerazione del terreno di coltura all'inizio
della fermentazione alcolica. In condizioni di
vinificazione semianaerobica, la quantità di acidi grassi
insaturi nell'uva, o nel mosto d'uva, favorisce
probabilmente i meccanismi di trasporto a membrana
degli acidi grassi.
I sistemi di trasporto degli zuccheri attraverso la
membrana sono lungi dall'essere completamente
chiariti. Esistono, tuttavia, almeno due tipi di sistemi di
trasporto: un sistema ad alta affinità e uno a bassa
affinità (dieci volte meno importante) (Bisson, 1991). Il
sistema a bassa affinità è essenziale durante la fase
logaritmica e la sua attività diminuisce durante la fase
stazionaria.
Il sistema ad alta affinità è, al contrario, represso da alte
concentrazioni di glucosio, come nel caso del mosto d'uva
(Salmon et al., 1993). La quantità di steroli nella
membrana, in particolare l'ergosterolo, nonché il grado di
insaturazione dei fosfolipidi di membrana favoriscono la
penetrazione del glucosio nella cellula. Ciò è
particolarmente vero durante le fasi di stazionamento e
declino. Questo fenomeno spiega l'influenza
determinante dell'aerazione sul buon esito della
fermentazione alcolica durante la fase di moltiplicazione
dei lieviti.
La presenza di etanolo, in un mezzo di coltura, rallenta la
velocità di penetrazione dell'arginina e del glucosio nella
cellula e limita l'efflusso di protoni risultante dall'attività
dell'ATPasi di membrana (Alexandre et al., 1994;
Charpentier, 1995). Allo stesso tempo, la presenza di
etanolo aumenta la sintesi dei fosfolipidi di membrana e
la loro percentuale in acidi grassi insaturi (soprattutto
oleici). La temperatura e l'etanolo agiscono in sinergia per
influenzare l'attività dell'ATPasi di membrana. La quantità
di etanolo necessaria per rallentare l'efflusso di protoni
diminuisce all'aumentare della temperatura. Tuttavia,
questa modifica dell'attività dell'ATPasi di membrana da
parte dell'etanolo potrebbe non essere l'origine della
diminuzione della permeabilità della membrana
plasmatica in un mezzo alcolico. Il ruolo dell'ATPasi di
membrana nella resistenza del lievito all'etanolo non è
stato chiaramente dimostrato.
La membrana plasmatica produce anche glucano e
chitina della parete cellulare. Sono coinvolti due enzimi di
membrana: la β-1,3 glucanasi e la chitina sintetasi. Questi
due enzimi catalizzano la polimerizzazione del glucosio e
della N-acetil-glucosamina, derivati dalle loro forme
attivate (uridina difosfati - UDP). Le mannoproteine sono
prodotte essenzialmente nel reticolo endoplasmatico.
Vengono quindi trasportati da vescicole che si fondono
con la membrana plasmatica e depositano il loro
contenuto all'esterno della membrana.
Infine, alcune proteine di membrana agiscono come
recettori cellulari specifici. Consentono al lievito di reagire
a vari stimoli esterni come gli ormoni sessuali o i
cambiamenti nella concentrazione di nutrienti esterni.
L'attivazione di queste proteine di membrana innesca la
liberazione di composti come l'adenosina monofosfato
ciclico (cAMP) nel citoplasma. Questi composti servono
come messaggeri secondari che innescano altre reazioni
intercellulari.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
Le conseguenze di questi meccanismi cellulari nel
processo di fermentazione alcolica meritano ulteriori
studi.
1.4 IL CITOPLASMO EI SUOI ORGANELLI
Tra la membrana plasmatica e la membrana nucleare,
il citoplasma contiene una sostanza citoplasmatica di
base, o citosol. Gli organelli (reticolo endoplasmatico,
apparato del Golgi, vacuolo e mitocondri) sono isolati
dal citosol mediante membrane.
1.4.1 Cytosol
Il citosol è una soluzione tamponata, con un pH
compreso tra 5 e 6, contenente enzimi solubili,
glicogeno e ribosomi.
Sono presenti la glicolisi e gli enzimi di fermentazione
alcolica (capitolo 2) nonché la trealasi (un enzima che
catalizza l'idrolisi del trealosio). Il trealosio, un
disaccaride di riserva, anche citoplasmatico, assicura
la vitalità del lievito durante le fasi di disidratazione e
reidratazione mantenendo l'integrità della membrana.
La fase di latenza precede la fase di log in un mezzo
contenente zucchero. È caratterizzato da una rapida
degradazione del trealosio legata ad un aumento
dell'attività della trealasi.
Questa attività è di per sé strettamente correlata ad
un aumento della quantità di cAMP nel citoplasma.
Questo composto è prodotto da un enzima di
membrana, l'adenilato ciclasi, in risposta alla
stimolazione di un recettore di membrana da parte di
un fattore ambientale.
Il glicogeno è la principale sostanza di riserva glucidica
del lievito. Il glicogeno animale ha una struttura simile.
Si accumula durante la fase stazionaria sotto forma di
granuli sferici di circa 40 μm di diametro.
Quando osservato al microscopio elettronico, il
citoplasma del lievito appare ricco di ribosomi. Queste
minuscole granulazioni, costituite da acidi ribonucleici
e proteine, sono il centro della sintesi proteica. Uniti ai
polisomi, diversi ribosomi migrano per la lunghezza
dell'RNA messaggero. Lo traducono simultaneamente
in modo che ognuno produca una catena
polipeptidica completa.
1.4.2 Il reticolo endoplasmatico, l'apparato del
Golgi e i Vacuoli
Il reticolo endoplasmatico (ER) è un sistema a doppia
membrana che divide il citoplasma. È collegato alla
membrana citoplasmatica e alla membrana nucleare. È, in
un certo senso, un'estensione di quest'ultimo. Sebbene
meno sviluppato nei lieviti che nelle cellule esocrine di
eucarioti superiori, l'ER ha la stessa funzione. Assicura
l'indirizzamento delle proteine sintetizzate dai ribosomi
attaccati. È un dato di fatto, i ribosomi possono essere
liberi nel citosol o legati al pronto soccorso. Le proteine
sintetizzate dai ribosomi liberi rimangono nel citosol, così
come gli enzimi coinvolti nella glicolisi. Quelli prodotti nei
ribosomi legati al pronto soccorso hanno tre possibili
destinazioni: il vacuolo, la membrana plasmatica e
l'ambiente esterno (secrezione).La presenza di una
sequenza segnale (una particolare catena di amminoacidi)
all'estremità N-terminale della proteina neoformata
determina l'associazione dei ribosomi inizialmente liberi
nel citosol con l'ER. La proteina sintetizzata attraversa la
membrana ER tramite un processo di trasporto attivo
chiamato traslocazione. Questo processo richiede l'idrolisi
di una molecola di ATP. Dopo aver raggiunto lo spazio
interno dell'ER, le proteine subiscono alcune modifiche
tra cui la necessaria asportazione del peptide segnale da
parte della peptidasi segnale. In molti casi subiscono
anche una glicosilazione.
Le glicoproteine del lievito, in particolare le
mannoproteine strutturali, parietali o enzimatiche,
contengono catene laterali glucidiche (Sezione 1.2.2).
Alcuni di questi sono legati all'asparagina da legami N-
glicosidici. Questo legame oligosaccaridico è costruito
all'interno dell'ER mediante l'aggiunta sequenziale di
zuccheri attivati (sotto forma di derivati UDP) a un
trasportatore lipidico idrofobo chiamato dolicolfosfato.
L'intera unità viene trasferita in un unico pezzo su un
residuo di asparagina della catena polipeptidica. Il
dolicolfosfato viene rigenerato.
L'apparato di Golgi è costituito da una pila di sacche di
membrana e vescicole associate. È un'estensione del
pronto soccorso. Le vescicole di trasferimento
trasportano le proteine emesse dal pronto soccorso alle
sacche dell'apparato di Golgi. L'apparato del Golgi ha una
duplice funzione. È responsabile della glicosilazione delle
proteine, quindi le ordina in modo da indirizzarle
attraverso vescicole specializzate nel vacuolo o nella
membrana plasmatica.
Una sequenza peptidica N-terminale determina la
direzione delle proteine verso il vacuolo. Questa
sequenza è presente nei precursori di due enzimi
orientati verso i vacuoli nel lievito: Y carbossipeptidasi e A
proteinasi.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
Le vescicole che trasportano le proteine della
membrana plasmatica oi granuli di secrezione, come
quelle che trasportano l'invertasi periplasmatica, sono
ancora le destinazioni predefinite.
Il vacuolo è un organello sferico, da 0,3 a 3 μm di
diametro, circondato da una singola membrana. A
seconda dello stadio del ciclo cellulare, i lieviti hanno
uno o più vacuoli. Prima di germogliare, un grande
vacuolo si divide in piccoli vasi. Alcuni penetrano sul
nascere. Altri si riuniscono all'estremità opposta della
cellula e si fondono per formare uno o due grandi
vacuoli. La membrana vacua o tonoplasto ha la stessa
struttura generale (mosaico fluido) della membrana
plasmatica ma è più elastica e la sua composizione
chimica è alquanto diversa. È meno ricco di steroli e
contiene meno proteine e glicoproteine ma più
fosfolipidi con un più alto grado di insaturazione.
Il vacuolo contiene alcune delle idrolasi cellulari, in
particolare Y carbossipeptidasi, proteasi A e B, I
aminopeptidasi, X-propil-dipeptidilamminopeptidasi e
fosfatasi alcalina. A questo proposito, il vacuolo di
lievito può essere paragonato a un lisosoma di una
cellula animale. Le proteasi vacuolari svolgono un
ruolo essenziale nel turn-over delle proteine cellulari.
Inoltre, la proteasi A è indispensabile nella
maturazione di altre idrolasi vacuolari. Asportano una
piccola sequenza peptidica e quindi converte le forme
precursori (proenzimi) in enzimi attivi. Le proteasi
vacuolari autolizzano anche la cellula dopo la sua
morte. L'autolisi, durante l'affinamento del vino bianco
sui propri lieviti, può influire sulla qualità del vino e
dovrebbe riguardare l'enologo.
I vacuoli hanno anche una seconda funzione
principale: immagazzinano i metaboliti prima del loro
utilizzo. Infatti, contengono un quarto del pool di
aminoacidi della cellula, inclusa molta arginina e S-
adenosil metionina. In questo organello sono presenti
anche cristalli di potassio, adenina, isoguanina, acido
urico e polifosfato. Questi sono coinvolti nella
fissazione degli amminoacidi di base. Permeasi
specifiche assicurano il trasporto di questi metaboliti
attraverso la membrana vacuolare. Un'ATPasi legata al
tonoplast fornisce l'energia necessaria per il
movimento dei composti immagazzinati contro il
gradiente di concentrazione. È diverso dall'ATPasi
della membrana plasmatica, ma produce anche un
efflusso protonico.
L'ER, l'apparato di Golgi e i vacuoli possono essere
considerati come diversi componenti di un sistema
interno di membrane, chiamato vacuoma, che partecipa
al flusso di glicoproteine da espellere o immagazzinare.
1.4.3 I mitocondri
Distribuiti nella periferia del citoplasma, i mitocondri (mt)
sono organelli sferici oa forma di bastoncello circondati
da due membrane. La membrana interna è altamente
piegata per formare creste. L'organizzazione generale dei
mitocondri è la stessa delle piante superiori e delle cellule
animali. Le membrane delimitano due compartimenti: lo
spazio interno della membrana e la matrice. I mitocondri
sono dei veri organelli respiratori per i lieviti.
Nell'aerobiosi, la cellula di S. cerevisiae contiene circa 50
mitocondri. Nell'anaerobiosi, questi organelli degenerano,
la loro superficie interna diminuisce e le creste
scompaiono.
L'ergosterolo e gli acidi grassi insaturi integrati nei terreni
di coltura limitano la degenerazione dei mitocondri
nell'anaerobiosi. In ogni caso, quando le cellule formate
nell'anaerobiosi vengono poste nell'aerobiosi, i mitocondri
riacquistano il loro aspetto normale. Anche nel mosto
d'uva aerato, l'elevata concentrazione zuccherina reprime
la sintesi degli enzimi respiratori. Di conseguenza, i
mitocondri non funzionano più. Questo fenomeno, la
repressione catabolica del glucosio, sarà descritto nel
Capitolo 2.
Le membrane mitocondriali sono ricche di fosfolipidi,
principalmente fosfatidilcolina, fosfatidilinositolo e
fosfatidiletanolamina (Figura 1.5). La cardiolipina
(difosfatidilglicerolo), in minoranza nella membrana
plasmatica (Figura 1.4), è predominante nella membrana
mitocondriale interna. Gli acidi grassi dei fosfolipidi
mitocondriali sono in C16: 0, C16: 1, C18: 0, C18: 1.
Nell'aerobiosi predominano i residui insaturi. Quando le
cellule crescono in anaerobiosi, senza integratori lipidici, i
residui saturi a catena corta diventano predominanti;
cardiolipina e fosfatidiletanolamina diminuiscono mentre
aumenta la proporzione di fosfatidilinositolo.
Nell'aerobiosi, la temperatura durante la fase logaritmica
della cellula influenza il grado di insaturazione dei
fosfolipidi, più saturi al diminuire della temperatura.
Le membrane mitocondriali contengono anche steroli,
oltre a numerose proteine ed enzimi (Guerin, 1991). Le
due membrane, interna ed esterna, contengono enzimi
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
coinvolti nella sintesi di fosfolipidi e steroli. La capacità
di sintetizzare quantità significative di lipidi,
caratteristica dei mitocondri del lievito, non è limitata
da mutazioni da deficit respiratorio o dalla
repressione catabolica del glucosio.
La membrana esterna è permeabile alla maggior
parte dei piccoli metaboliti provenienti dal citosol
poiché contiene porina, una proteina transmembrana
da 29 kDa che possiede un grande poro. Il porino è
presente nei mitocondri di tutti gli eucarioti così come
nella membrana esterna dei batteri. Lo spazio
intermembrana contiene adenilato chinasi, che
garantisce l'interconversione di ATP, ADP e AMP. La
fosforilazione ossidativa avviene nella membrana
mitocondriale interna. La matrice, invece, è il centro
delle reazioni del ciclo degli acidi tricarbossilici e
dell'ossidazione degli acidi grassi.La maggior parte
delle proteine mitocondriali sono codificate dai geni
del nucleo e sono sintetizzate dai polisomi liberi del
citoplasma. I mitocondri, tuttavia, dispongono anche
di un proprio macchinario per la sintesi proteica. In
effetti, ogni mitocondrio possiede una molecola
circolare da 75 kb (kilobase pair) di AND a doppia elica
e ribosomi. Il mtDNA è estremamente ricco di basi A
(adenina) e T (timina). Contiene alcune dozzine di geni,
che codificano in particolare per la sintesi di alcuni
pigmenti ed enzimi respiratori, come il citocromo be
diverse sottounità della citocromo ossidasi e del
complesso ATP sintetasi. Alcune mutazioni che
interessano questi geni possono far sì che il lievito
diventi resistente a determinati inibitori mitocondriali
specifici come l'oligomicina. Questa proprietà è stata
applicata nella marcatura genetica dei ceppi di lievito
del vino. Alcuni mutanti mitocondriali sono carenti
respiratori e formano piccole colonie su terreni agarici
solidi. Questi mutanti "petit" non vengono utilizzati
nella vinificazione perché è impossibile produrli
industrialmente mediante la respirazione.
1.5 IL NUCLEO
Il nucleo del lievito è sferico. Ha un diametro di 1 - 2
mm ed è appena visibile utilizzando un microscopio
ottico a contrasto di fase. Si trova vicino al vacuolo
principale nelle cellule non proliferanti. L'involucro
nucleare è costituito da una doppia membrana
attaccata al pronto soccorso. Contiene molti pori
effimeri, la loro posizione cambia continuamente.
Questi pori consentono lo scambio di piccole proteine
tra il nucleo e il citoplasma.
Contrariamente a quanto accade negli eucarioti superiori,
l'involucro nucleare del lievito non viene disperso durante
la mitosi. Nella parte basofila del nucleo, il nucleolo a
forma di mezzaluna può essere visto utilizzando un
metodo di colorazione specifico per il nucleo. Come in
altri eucarioti, è responsabile della sintesi dell'RNA
ribosomiale. Durante la divisione cellulare, il nucleo del
lievito contiene anche fili fusiformi rudimentali composti
da microtubuli di tubulina, alcuni discontinui e altri
continui.
I microtubuli continui sono allungati tra i due corpi polari
del fuso (SPB).
Questi corpuscoli sono permanentemente inclusi nella
membrana nucleare e corrispondono ai centrioli degli
organismi superiori. I microtubuli citoplasmatici partono
dai corpi dei poli del fuso verso il citoplasma.
C'è poco DNA nucleare nei lieviti rispetto agli eucarioti
superiori - circa 14.000 kb in un ceppo aploide. Ha un
genoma quasi tre volte più grande di quello
dell'Escherichia coli, ma il suo materiale genetico è
organizzato in veri cromosomi. Ognuno contiene una
singola molecola di DNA lineare a doppia elica associata a
proteine di base note come istoni. Gli istoni formano la
cromatina che contiene unità ripetitive chiamate
nucleosomi. I cromosomi del lievito sono troppo piccoli
per essere osservati al microscopio.
L'elettroforesi in campo pulsato (Carle e Olson, 1984;
Schwartz e Cantor, 1984) permette la separazione dei 16
cromosomi in S. cerevisiae, le cui dimensioni variano da
200 a 2000 kb. Questa specie ha un polimorfismo
cromosomico molto ampio. Questa caratteristica ha reso
l'analisi del cariotipo uno dei criteri principali per
l'identificazione dei ceppi di S. cerevisiae (Sezione 1.9.3).
La comunità scientifica ha quasi stabilito la sequenza
completa del DNA cromosomico di S. cerevisiae. In futuro,
questa conoscenza dettagliata del genoma del lievito
costituirà uno strumento potente, tanto per
comprenderne la fisiologia molecolare quanto per
selezionare e migliorare i ceppi di vinificazione. I
cromosomi del lievito contengono relativamente poche
sequenze ripetute.
La maggior parte dei geni è presente solo in un singolo
esempio nel genoma aploide, ma i geni dell'RNA
ribosomiale sono altamente ripetuti (circa 100 copie).
Il genoma di S. cerevisiae contiene elementi trasponibili, o
trasposoni, in particolare, elementi Ty (lievito trasposone).
Questi comprendono una regione ε centrale (5,6 kb)
incorniciata da una sequenza ripetuta diretta chiamata
sequenza δ (0,25 kb). Le sequenze δ hanno la tendenza a
ricombinarsi, con conseguente perdita della regione
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
centrale e di una sequenza δ. Di conseguenza, ci sono
circa 100 copie della sequenza δ nel genoma del
lievito. Il codice degli elementi Ty per particelle di
retrovirus non infettive. Questo retrovirus contiene
RNA messaggero Ty e una trascrittasi inversa in grado
di copiare l'RNA in DNA complementare. Quest'ultimo
può reinserirsi in qualsiasi sito del cromosoma.
L'escissione casuale e l'inserimento di elementi Ty nel
genoma del lievito possono modificare i geni e
svolgere un ruolo importante nell'evoluzione del
ceppo.
Solo un plasmide, chiamato plasmide da 2 μm, è stato
identificato nel nucleo del lievito. È una molecola
circolare di DNA, contenente 6 kb e ci sono 50-100
copie per cellula. La sua funzione biologica non è
nota, ma è uno strumento molto utile, utilizzato dai
biologi molecolari per costruire plasmidi artificiali e
trasformare geneticamente i ceppi di lievito.
1.6 RIPRODUZIONE E CICLO BIOLOGICO DEL
LIEVITO
Come altri lieviti sporiferi appartenenti alla classe degli
Ascomiceti, S. cerevisiae può moltiplicarsi
asessualmente per moltiplicazione vegetativa o
sessualmente formando ascospore. Per definizione, i
lieviti appartenenti ai funghi imperfetti possono
riprodursi solo per moltiplicazione vegetativa.
1.6.1 Moltiplicazione vegetativa
La maggior parte dei lieviti subisce una moltiplicazione
vegetativa mediante un processo chiamato
germogliamento. Alcuni lieviti, come le specie
appartenenti al genere Schizosaccha- romyces, si
moltiplicano per fissione binaria.
La Figura 1.11 rappresenta il ciclo di vita di S.
cerevisiae suddiviso in quattro fasi: M, G1, S e G2. M
corrisponde alla mitosi, G1 è il periodo che precede S,
che è la sintesi del DNA e G2 è il periodo prima della
divisione cellulare. Non appena il germoglio emerge,
all'inizio di S, la scissione dei corpi polari del fuso (SPB)
può essere osservata nella membrana nucleare
mediante microscopia elettronica. Allo stesso tempo, i
microtubuli citoplasmatici si orientano verso la
gemma emergente. Questi microtubuli sembrano
guidare numerose vescicole che compaiono nella
zona di germogliamento e sono coinvolte nel
rimodellamento della parete cellulare.
Man mano che la gemma diventa più grande, iniziano ad
apparire microtubuli nucleari interrotti. I microtubuli più
lunghi formano il fuso mitotico tra i due SPB. Alla fine di
G2, il nucleo inizia a spingere e separarsi per penetrare
nel bocciolo. Alcuni mitocondri passano anche con alcuni
piccoli vacuoli nel bocciolo, mentre un grande vacuolo si
forma sull'altro polo della cellula.
L'espansione di quest'ultimo sembra spingere il nucleo
sul nascere. Durante la mitosi, il nucleo si estende al
massimo e la cellula madre si separa dalla cellula figlia.
Questa separazione avviene solo dopo la costruzione
della parete cellulare di separazione e il deposito di un
anello di chitina sulla cicatrice del germoglio della cellula
madre. Il movimento dei cromosomi durante la mitosi è
difficile da osservare nei lieviti, ma un collegamento
microtubulo-centromero deve guidare i cromosomi. Nel
mosto d'uva la durata del germogliamento è di circa 1 - 2
ore. Di conseguenza, la popolazione delle cellule
raddoppia durante la fase di log del lievito durante la
fermentazione.
Non sono note le condizioni naturali in cui sporulano i
lieviti del vino selvatico e la frequenza di questo
fenomeno. In laboratorio, l'agar o il mezzo liquido
convenzionalmente utilizzato per provocare la
sporulazione ha una base di acetato di sodio (1%). In S.
cerevisiae, l'attitudine alla sporulazione varia
notevolmente da ceppo a ceppo. I lieviti enologici, sia
selvatici che selezionati, non sporulano facilmente e
quando lo fanno producono spesso spore non vitali.
La meiosi nei lieviti e negli eucarioti superiori (Figura 1.13)
ha alcune somiglianze. Diverse ore dopo il trasferimento
delle cellule vegetative diploidi in un mezzo di
sporulazione, l'SPB si divide durante la replicazione del
DNA della fase S. Un corpo denso (DB) appare
simultaneamente nel nucleo vicino al nucleolo. Il DB
evolve in complessi sinaptonemici - strutture che
consentono l'accoppiamento e la ricombinazione di
cromosomi omologhi. Dopo 8-9 ore nel mezzo di
sporulazione, i due SPB si separano e il fuso inizia a
formarsi. Questa fase è chiamata metafase I della meiosi.
In questa fase, i cromosomi non sono ancora visibili.
Quindi, mentre la membrana nucleare rimane intatta,
l'SPB si divide. Nella metafase II, un secondo fuso mitotico
si allunga mentre la parete cellulare dell'ascospora inizia a
formarsi. Germogli nucleari, citoplasma e organelli
migrano nelle ascospore. A questo punto l'edificazione
della parete cellulare è completata.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
Il mandrino quindi scompare quando viene raggiunta
la divisione.
Posizionate in condizioni favorevoli, cioè terreni
nutritivi arricchiti di zucchero, le ascospore
germinano, rompendo la parete cellulare dell'ascus, e
iniziano a moltiplicarsi. In S. cerevisiae, le cellule
aploidi hanno due tipi di accoppiamento: a e α.
L'ascus contiene due ascospore a e due ascospore α
(Figura 1.14). Segno a (MATa) le cellule producono un
feromone sessuale a. Questo peptide composto da 12
aminoacidi è chiamato fattore sessuale a. Allo stesso
modo, le cellule del segno α producono il fattore
sessuale α, un peptide composto da 13 aminoacidi. Il
fattore a, emesso dalle cellule MATa, arresta la
moltiplicazione delle cellule MATα in G1.
Reciprocamente, il fattore α prodotto dalle cellule α
arresta il ciclo biologico di una cellula.
L'accoppiamento sessuale avviene tra due cellule del
segno sessuale opposto. La loro agglutinazione
consente la fusione cellulare e nucleare e fa uso di
glicoproteine parietali e agglutinine ae α.
La cellula diploide vegetativa che si forma (a / α) non
può più produrre feromoni sessuali ed è insensibile
alla loro azione; si moltiplica germogliando.
Alcuni ceppi, da una coltura monosporica, possono
essere mantenuti in uno stato aploide stabile. Il loro
segno sessuale rimane costante per molte
generazioni. Sono eterothallic.
Altri cambiano segno sessuale durante una divisione
cellulare. Le cellule diploidi compaiono nei discendenti
di un ascospore. Sono omotallici e hanno un gene HO
che inverte il segno sessuale con una frequenza
elevata durante la divisione vegetativa.Questo
passaggio (Figura 1.15) avviene nella cellula madre
nella fase G1 del ciclo biologico, dopo il primo
germogliamento ma prima della fase di replicazione
del DNA. In questo modo, un segno α ascospore S si
divide per produrre due cellule α (S e la prima cellula
figlia, F1). Durante la successiva divisione cellulare, S
produce due cellule (S e F2) che sono diventate
cellule. Allo stesso modo, la cellula F1 produce due
cellule α dopo la prima divisione e due cellule a
durante la sua seconda gemmazione. I ceppi di
laboratorio che sono carenti o privi del gene HO
hanno un segno sessuale stabile. L'eterotallismo può
quindi essere considerato il risultato di una mutazione
del gene HO o di geni che ne controllano il
funzionamento (Herskowitz et al., 1992).
La maggior parte dei ceppi di vinificazione selvatici e
selezionati che appartengono alla specie S. cerevisiae
sono diploidi e omotallici. È anche vero per quasi tutti i
ceppi che sono stati isolati nei vigneti della regione di
Bordeaux. Inoltre, recenti studi condotti da Mortimer et
al. (1994) nei vigneti californiani e italiani hanno
dimostrato che la maggior parte dei ceppi (80%) sono
omozigoti per il carattere HO (HO / HO); l'eterozigosi (HO
/ ho) è in minoranza. I ceppi eterotallici (ho / ho) sono rari
(meno del 10%).
Abbiamo fatto le stesse osservazioni per i ceppi di lievito
isolati nella regione di Bordeaux. Ad esempio, il ceppo
F10 abbastanza prevalente nelle fermentazioni spontanee
in alcune escrescenze bordolesi è HO / HO. In altre
parole, le quattro spore emesse da un ascus danno
diploidi monoparenti, in grado di formare aschi quando
posti in una coltura pura. Questa omozigosi generalizzata
per il carattere HO dei ceppi vinicoli selvatici è
probabilmente un fattore importante nella loro
evoluzione, secondo il fenomeno di rinnovamento del
genoma proposto da Mortimer et al. (1994) (Figura 1.16),
in cui la continua moltiplicazione di un ceppo di lievito nel
suo ambiente naturale accumula danni eterozigoti al
DNA. Alcune mutazioni a crescita lenta o perdita
funzionale di alcuni geni riducono il vigore del ceppo nello
stato eterozigote. La sporulazione, tuttavia, produce
cellule aploidi contenenti diverse combinazioni di questi
caratteri eterozigoti. Tutte queste spore diventano cellule
diploidi omozigoti con una serie di genotipi a causa
dell'omozigosi del carattere HO. Alcuni diploidi che si
dimostrano più vigorosi di altri col tempo soppianteranno
i genitori e quelli meno vigorosi.
Questo modello molto allettante è confermato dalle
caratteristiche dei ceppi di vinificazione selvatici analizzati.
In questi, il tasso di vitalità delle spore è la funzione
inversa del tasso di eterozigosi per un certo numero di
mutazioni. I ceppi completamente omozigoti presentano
la più alta vitalità e vigore delle spore.
In conclusione, la sporulazione dei ceppi in condizioni
naturali sembra indispensabile. Assicura la loro crescita e
le prestazioni fermentative. Con questo in mente, la
conservazione di ceppi selezionati di lieviti secchi attivi
come starter di lievito dovrebbe essere messa in
discussione. Potrebbe essere necessario rigenerarli
periodicamente per eliminare eventuali mutazioni dal loro
genoma che potrebbero diminuirne il vigore.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
1.7 IL FENOMENO KILLER
1.7.1 Introduzione
Alcuni ceppi di lievito, noti come ceppi killer (K),
secernono tossine proteiche nel loro ambiente che
sono in grado di uccidere altri ceppi sensibili (S). I
ceppi killer non sono sensibili alla loro tossina ma
possono essere uccisi da una tossina che non
producono. I ceppi neutri (N) non producono una
tossina ma sono resistenti. L'azione di un ceppo killer
su un ceppo sensibile è facile da dimostrare in
laboratorio su un terreno di coltura agar a pH 4,2–4,7
a 20 ° C. Il ceppo sensibile viene inoculato nella massa
di agar prima che si solidifichi; quindi il ceppo da
testare viene inoculato in strisce sul terreno
solidificato. Se si tratta di un ceppo killer, una zona
chiara in cui il ceppo sensibile non può crescere
circonda le strisce di inoculo (Figura 1.17). Questo
fenomeno, il fattore killer, è stato scoperto in S.
cerevisiae, ma ceppi killer esistono anche in altri
generi di lieviti come Hansenula, Candida, Kloeckera,
Hanseniaspora, Pichia, Torulopsis, Kluyveromyces e
Debaryomyces. I lieviti killer sono stati classificati in 11
gruppi in base alla reazione di sensibilità tra i ceppi,
nonché alla natura e alle proprietà delle tossine
coinvolte. Il fattore killer è un modello di interazione
cellulare mediato dalla tossina proteica escreta. Ha
dato origine a molte ricerche fondamentali (Tipper e
Bostian, 1984; Young, 1987).
Barre (1984, 1992), Radler (1988) e Van Vuuren e
Jacobs (1992) hanno descritto le implicazioni
tecnologiche di questo fenomeno per i lieviti enologici
e il processo di fermentazione.
1.7.2 Fisiologia e genetica del fenomeno killer
I determinanti del fattore killer sono sia citoplasmatici
che nucleari. In S. cerevisiae, il fenomeno killer è
associato alla presenza di particelle di RNA a doppio
filamento, particelle simili a virus (VLP), nel citoplasma.
Sono nella stessa categoria dei micovirus non infettivi.
Esistono due tipi di VLP: M e L. Il genoma M (1.3 - 1.9
kb) codifica per la tossina K e per il fattore di immunità
(R). Il genoma L (4,5 kb) codifica per una RNA
polimerasi e il capside proteico che incapsula i due
genomi.I ceppi killer (K + R +) secernono la tossina e
ne sono immuni. Le cellule sensibili (K− R−) non
possiedono M VLP ma la maggior parte di loro ha L
VLP.
I due tipi di particelle virali sono necessari affinché la
cellula di lievito esprima il fenotipo killer (K + R +), poiché il
micovirus L è necessario per il mantenimento del tipo M.
Esistono tre tipi di attività killer nei ceppi di S. cerevisiae.
Corrispondono alle tossine K1, K2 e K3 codificate,
rispettivamente, da M1, M2 e M3 VLP (1.9, 1.5 e 1.3 kb,
rispettivamente). Secondo Wingfield et al. (1990), i tipi K2
e K3 sono molto simili; M3 VLP è il risultato di una
mutazione di M2 VLP. I ceppi K2 sono di gran lunga i più
diffusi nei ceppi di S. cerevisiae incontrati nel vino. I ceppi
neutri (K − R +) sono insensibili a una data tossina senza
essere in grado di produrla. Possiedono M VLP di
dimensioni normali che codificano solo per il fattore di
immunità. O non producono tossine o sono inattivi a
causa di mutazioni che interessano l'RNA di tipo M.
Molti geni cromosomici sono coinvolti nel mantenimento
e nella replicazione delle particelle di RNA L e M, nonché
nella maturazione e nel trasporto della tossina prodotta.
La tossina K1 è una piccola proteina composta da due
sottounità (9 e 9,5 kDa). È attivo e stabile in un intervallo
di pH molto ristretto (4,2-4,6) ed è quindi inattivo nel
mosto d'uva. La tossina K2, una glicoproteina da 16 kDa,
prodotta da ceppi omotallici di S. cerevisiae incontrati nel
vino, è attiva a pH 2.8 e 4.8 con un'attività massima
compresa tra 4.2 e 4.4. È quindi attivo al pH del mosto
d'uva e del vino.
Le tossine K1 e K2 attaccano le cellule sensibili legandosi
a un recettore situato nella parete cellulare, un β -1,6
glucano. Due geni cromosomici, KRE1 e KRE2 (resistente
ai killer), determinano la possibilità di questo
collegamento. Il gene kre1 produce una glicoproteina
parietale che ha un'attività β-1,6 glucan sintetasi. I mutanti
kre1 sono resistenti alle tossine K1 e K2 perché sono
carenti di questo enzima e privi di un recettore del
glucano β-1,6. Il gene KRE2 è anche coinvolto nella
fissazione delle tossine al recettore parietale; anche i
mutanti kre2 sono resistenti. La tossina legata a un
recettore del glucano viene quindi trasferita a un sito
recettore di membrana mediante un meccanismo che
necessita di energia. Le cellule nella fase logaritmica sono
quindi più sensibili all'effetto killer rispetto alle cellule
nella fase stazionaria.Quando la membrana plasmatica
delle cellule sensibili è esposta alla tossina, manifesta
gravi alterazioni funzionali dopo una fase di latenza di
circa 40 minuti. Queste alterazioni includono
l'interruzione del trasporto accoppiato di amminoacidi e
protoni, l'acidificazione del contenuto cellulare e la
fuoriuscita di potassio e ATP.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
La cellula muore in 2 - 3 ore dopo il contatto con la
tossina a causa del suddetto danno, dovuto alla
formazione di pori nella membrana plasmatica.
L'effetto killer si esercita esclusivamente sui lieviti e
non ha alcun effetto su esseri umani e animali.
1.7.3 Il ruolo del fenomeno killer nella
vinificazione
A seconda degli autori e delle regioni viticole studiate,
la frequenza del carattere killer varia molto tra i ceppi
di vinificazione selvatici isolati sull'uva o nel mosto
d'uva in fermentazione. In un lavoro di Barre (1978)
che studiava 908 ceppi selvatici, 504 controllavano il
carattere killer K2, 299 erano sensibili e 95 neutri.
Cuinier e Gros (1983) hanno riportato un'alta
frequenza (65–90%) di ceppi K2 nei vigneti della
regione del Mediterraneo e del Beaujolais, mentre
nessuno dei ceppi analizzati a Tourraine ha
manifestato l'effetto killer. Nella regione di Bordeaux, il
carattere killer K2 è estremamente diffuso. In uno
studio condotto nel 1989 e nel 1990 sull'ecologia di
ceppi autoctoni di S. cerevisiae in diverse vasche di
mosto rosso in un vigneto di Pessac-Le ́ognan, tutti i
ceppi isolati hanno manifestato un'attività killer K2,
circa 30 differenziati per cariotipo (Frezier, 1992).
Rossini et al. (1982) hanno riportato una frequenza
estremamente varia (12–80%) di ceppi killer K2 nelle
fermentazioni spontanee nelle cantine italiane. Alcuni
ceppi killer K2 sono stati isolati anche nell'emisfero
meridionale (Australia, Sud Africa e Brasile).
D'altra parte, la maggior parte dei ceppi killer isolati in
Giappone presentavano la caratteristica K1. La
maggior parte delle ricerche sul carattere killer dei
lieviti enologici riguarda la specie S. cerevisiae.
Esistono poche informazioni sull'effetto killer delle
specie sensibili all'alcol che essenzialmente
costituiscono la microflora dell'uva. Heard e Fleet
(1987) hanno confermato le osservazioni di Barre
(1980) e non hanno stabilito l'esistenza dell'effetto
killer a Candida, Hanseniaspora, Hansenula e
Torulaspora. Tuttavia, alcuni ceppi killer di
Hanseniaspora uvarum e Pichia kluyveri sono stati
identificati da Zorg et al. (1988).
Barre (1992) ha studiato l'attività e la stabilità della
tossina killer K2 in condizioni enologiche (Figura 1.18).
La tossina killer ha manifestato solo un'attività
pronunciata sulle cellule nella fase logaritmica. Le
cellule nella fase stazionaria erano relativamente
insensibili.
La quantità di etanolo o SO2 nel vino ha
praticamente nessun effetto sull'attività della tossina
killer. D'altra parte, viene rapidamente distrutto dal calore,
poiché la sua emivita è di circa 30 minuti a 32 ° C. Inoltre
è rapidamente inattivato dalla presenza di composti
fenolici ed è facilmente adsorbito dalla bentonite.
La letteratura scientifica ha riportato una varietà di
risultati sul ruolo del fattore killer nella competizione tra i
ceppi durante la fermentazione del mosto d'uva. In un
esempio fornito da Barre (1992), le cellule killer inoculate
al 2% possono soppiantare completamente il ceppo
sensibile durante la fermentazione alcolica del mosto. In
altri lavori, il rapporto lievito killer / lievito sensibile in
grado di influenzare l'impianto di lieviti sensibili nella
vinificazione varia tra 1/1000 e 100/1, a seconda
dell'autore. Questa notevole discrepanza può essere
probabilmente attribuita alla velocità di impianto e
fermentazione dei ceppi presenti. Il fenomeno killer
sembra più importante per interferire con la concorrenza
quando il ceppo killer si impianta rapidamente e il ceppo
sensibile lentamente. Nella situazione opposta, sarebbe
necessaria un'elevata percentuale di lieviti killer per
eliminare la popolazione sensibile. Alcuni autori hanno
osservato fermentazioni spontanee dominate da ceppi
sensibili nonostante una proporzione non trascurabile di
ceppi killer (2–25%). A Bordeaux, abbiamo sempre
osservato che alcuni ceppi sensibili si impiantano nella
fermentazione del vino rosso, nonostante una forte
presenza di lieviti killer nella microflora selvatica (ad
esempio, 522M, un lievito secco attivo starter). Nella
vinificazione in bianco, anche il lievito neutro VL1 e ceppi
sensibili come EG8, un ceppo a crescita lenta, si
impiantano con successo. La popolazione wild killer non
sembra competere con un lievito delicato e quindi non è
una causa importante di difficoltà di fermentazione nelle
applicazioni della vita reale.The high frequency of killer
strains among the indigenous yeasts in many viticultural
regions confers little advantage to the strain in terms of
implantation capacity. In other words, this character is not
sufficient to guarantee the implan- tation of a certain
strain during fermentation over a wild strain equally
equipped. On the other hand, under certain conditions,
inoculating with a sensi- tive strain will fail because of the
killer effect of a wild population. Therefore, the resistance
to the K2 toxin (killer or neutral phenotype) should be
included among the selection criteria of enologi- cal
strains. The high frequency of the K2 killer character in
indigenous wine yeasts facilitates this strategy.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
Un mezzo che contiene la tossina esercita una
pressione selettiva su un ceppo enologico sensibile.
Le varianti stabili sopravvivono a questa pressione di
selezione e possono essere ottenute in questo modo
(Barre, 1984). Questa è la strategia più semplice per
ottenere un ceppo enologico killer. Tuttavia, lo
sviluppo della genetica molecolare e della
biotecnologia consente agli scienziati di costruire
ceppi enologici modificati per contenere uno o più
caratteri killer. La citoduzione può ottenere queste
modifiche. Questo metodo introduce determinanti
citoplasmatici (mitocondri, plasmidi) emessi da un
ceppo killer in un ceppo enologico sensibile senza
alterare il cariotipo del ceppo enologico iniziale. Seki
et al. (1985) hanno utilizzato questo metodo per
rendere killer il ceppo 522M K2. Con un'altra strategia,
nuovi lieviti possono essere costruiti integrando il
gene della tossina nei loro cromosomi. Boone et al.
(1990) sono stati in grado di introdurre il carattere K1
nei ceppi di vinificazione K2 in questo modo. Il
carattere killer K1 tra i lieviti enologici è raro, quindi
l'interesse enologico di quest'ultima applicazione è
limitato. L'acquisizione di ceppi caratteriali multi-killer
presenta pochi vantaggi enologici. I ceppi selezionati
sensibili e gli attuali ceppi killer K2 possono già essere
impiantati senza problemi. D'altra parte, la diffusione
in natura di questi ceppi multi-killer di nuova
acquisizione potrebbe presentare un rischio non
trascurabile. Questi ceppi potrebbero influenzare
negativamente la popolazione della microflora
naturale, sebbene abbiamo appena iniziato a
inventariare la sua diversità e a sfruttare le sue
potenzialità tecnologiche. Sarebbe dannoso non
essere più in grado di selezionare i lieviti selvaggi
perché sono stati soppiantati nel loro ambiente
naturale da ceppi geneticamente modificati, una
trasformazione che non ha alcun interesse enologico.
1.8 CLASSIFICAZIONE DELLE SPECIE DI LIEVITO
1.8.1 Osservazioni generali
Come accennato nell'introduzione di questo capitolo, i
lieviti costituiscono un vasto gruppo di funghi
unicellulari, tassonomicamente eterogenei e molto
complessi.La prima classificazione di Hansen all'inizio
di questo secolo distingueva solo tra lieviti sporiferi e
asporiferi. Da allora, la tassonomia del lievito ha
stimolato una considerevole ricerca.
Questa ricerca è stata raggruppata in lavori successivi
creando progressivamente la classificazione oggi
conosciuta. L'ultimo trattato enologico dell'Università di
Bordeaux (Ribe ́reau- Gayon et al., 1975) era basato sulla
classificazione di Lodder (1970). Tra questa monografia e
la precedente classificazione (Lodder e Kregger-Van Rij,
1952), la designazione e la classificazione dei lieviti erano
già profondamente cambiate. In questo libro, le ultime
due classificazioni di Kregger-Van Rij (1984) e Barnett et
al. (2000) sono di interesse. Questi contengono
cambiamenti ancora più significativi nella delimitazione di
specie e genere rispetto alla sistematica precedente.
Secondo l'attuale classificazione, i lieviti appartenenti ad
Ascomiceti, Basidiomiceti e funghi imperfetti
(Deuteromiceti) sono suddivisi in 81 generi, a cui
appartengono 590 specie. Tenendo conto della sinonimia
e delle razze fisiologiche (varietà della stessa specie), a
partire dal XIX secolo sono stati utilizzati almeno 4000
nomi di lieviti. Fortunatamente, solo 15 specie di lievito
esistono sull'uva, sono coinvolte come agenti di
fermentazione alcolica nel vino e sono responsabili delle
malattie del vino. La tabella 1.1 elenca le due famiglie a
cui appartengono i lieviti enologici: Saccharomycetaceae
negli Ascomiceti (sporiferi) e Cryptococcaceae nei
Deuteromiceti (asporiferi).
Quattordici generi a cui appartengono una o più specie di
lieviti d'uva o di vino non sono elencati nella tabella 1.1.
1.8.2 Evoluzione dei principi generali della tassonomia dei
lieviti e della delimitazione delle specie
La tassonomia del lievito (dal greco taxi: mettere in
ordine) e la tassonomia di altri microrganismi per quella
materia, include la classificazione e l'identificazione. La
classificazione raggruppa gli organismi in taxa in base alle
loro somiglianze e / o ai loro legami con un antenato
comune. Il taxon di base è la specie. Una specie può
essere definita come un insieme di ceppi che hanno in
comune un certo numero di caratteri morfologici,
fisiologici e genetici. Questo gruppo di caratteri costituisce
la descrizione standard della specie. L'identificazione
confronta un organismo sconosciuto con individui già
classificati e nominati che hanno caratteristiche simili.
I tassonomi hanno innanzitutto delimitato le specie di
lievito utilizzando criteri morfologici e fisiologici. Le prime
classificazioni si basavano sulle differenze fenotipiche tra i
lieviti: forma e dimensione delle cellule, formazione di
spore, caratteri culturali, fermentazione e assimilazione di
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
diversi zuccheri, assimilazione dei nitrati, fabbisogno
dei fattori di crescita, resistenza alla cicloemimide.Il
trattato sull'enologia di Ribe ́reau- Gayon et al. (1975)
hanno descritto dettagliatamente l'uso di questi
metodi sui lieviti enologici.
Da allora, sono stati proposti molti kit diagnostici
rapidi e pronti per l'uso per determinare la risposta
del lievito a diversi test fisiologici. Lafon-Lafourcade e
Joyeux (1979) e Cuinier e Leveau (1979) hanno
progettato il sistema API 20 C per l'identificazione dei
lieviti enologici. Contiene otto test di fermentazione,
10 test di assimilazione e un test di resistenza alla
cicloesimide. Per un'identificazione più completa, il
sistema API 50 CH contiene 50 substrati per la
fermentazione (sotto paraffina) e per i test di
assimilazione. Heard e Fleet (1990) hanno sviluppato
un sistema che utilizza i diversi test elencati nel lavoro
di Barnett et al. (1990).A causa del numero
relativamente limitato di specie di lievito
significativamente presenti sull'uva e nel vino, questi
test fenotipici identificano senza difficoltà le specie di
lievito enologico in alcuni generi. Alcune specie
possono essere identificate osservando le cellule in
crescita al microscopio. Piccole cellule apiculate, con
piccole forme simili a limone, designano la specie
Hanseniaspora uvarum e la sua forma imperfetta
Kloeckera apiculata (Figura 1.19). Saccharomycodes
ludwigii è caratterizzato da cellule apiculate molto più
grandi (10-20 μm). Poiché la maggior parte dei lieviti si
moltiplica per gemmazione, il genere
Schizosaccharomyces può essere riconosciuto per la
sua riproduzione vegetativa per fissione binaria
(Figura 1.20). Nella tassonomia moderna, questo
genere contiene solo la specie Schizosacch. pombe.
Infine, il germogliamento della Candida stellata
(precedentemente nota come Torulopsis stellata)
avviene a forma di stella.
Secondo Barnett et al. (1990), le caratteristiche
fisiologiche elencate nella tabella 1.2 possono essere
utilizzate per distinguere tra i principali lieviti d'uva e di
vino. Tuttavia alcuni di questi caratteri (ad esempio, i
profili di fermentazione degli zuccheri) variano
all'interno della specie e sono persino instabili per un
dato ceppo durante la moltiplicazione vegetativa. I
tassonomi si sono resi conto che non potevano
differenziare le specie basandosi esclusivamente su
criteri di discontinuità fenotipica. Hanno
progressivamente stabilito una delimitazione fondata
sulla definizione biologica e genetica di una specie.
progressivamente stabilito una delimitazione fondata
sulla definizione biologica e genetica di una specie. In
teoria, una specie può essere definita come una raccolta
di ceppi interfertili i cui ibridi sono essi stessi fertili, in
grado di produrre spore vitali.
Questa definizione biologica incontra diversi problemi
quando applicata ai lieviti. Prima di tutto, un gran numero
di lieviti (deuteromiceti) non sono in grado di riprodursi
sessualmente. In secondo luogo, molti lieviti Ascomy-
cetes sono omotallici; I test di ibridazione sono
particolarmente esigenti e difficili per l'identificazione di
routine. Infine, alcuni ceppi di lievito enologico hanno
scarsa o nessuna attitudine alla sporulazione, il che rende
ancora più difficile l'uso dei criteri di infertilità del ceppo.
Per superare queste difficoltà, i ricercatori hanno
sviluppato negli ultimi 15 anni una tassonomia molecolare
basata sui seguenti test: ricombinazione del DNA; la
somiglianza della composizione della base del DNA; la
somiglianza degli enzimi; caratteristiche ultrastrutturali; e
la composizione della parete cellulare. I test di
ricombinazione del DNA si sono dimostrati efficaci per
delimitare le specie di lievito. Misurano le percentuali di
ricombinazione del DNA nucleare denaturato (mono-
filamento) di diversi ceppi. Un tasso di ricombinazione
elevato tra due ceppi (80-100%) indica che appartengono
alla stessa specie. Una bassa percentuale di
ricombinazione (meno del 20% delle sequenze in
comune) significa che i ceppi appartengono a specie
diverse e molto distanti. I tassi di combinazione tra questi
estremi sono più difficili da interpretare.
1.8.3 Classificazioni successive
del Genere Saccharomyces e la posizione dei lieviti
enologici nella classificazione attuale
A causa di molti cambiamenti nella classificazione e nella
nomenclatura dei lieviti dall'inizio degli studi tassonomici, i
nomi dei lieviti enologici e le loro posizioni nella
classificazione sono spesso cambiati. Ciò ha
inevitabilmente portato a una certa confusione per
enologi ed enologi. Anche i lavori enologici più recenti
(Fleet, 1993; Delfini, 1995; Boulton et al., 1995) utilizzano
diversi epiteti (cerevisiae, bayanus, uvarum, ecc.) Associati
al nome del genere Saccharomyces per designare i lieviti
responsabili. per la fermentazione alcolica. Sebbene
ancora in uso, questa terminologia enologica non è più
precisa per designare le specie attualmente delimitate dai
tassonomi.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
L'evoluzione della classificazione delle specie per il
genere Saccharomyces dall'inizio degli anni '50
(Tabella 1.3) ha creato questa differenza tra la
designazione dei lieviti enologici e l'attuale
tassonomia. Dando uno sguardo più da vicino a
questa evoluzione, è possibile comprendere l'origine
delle differenze.
In Lodder e Kregger-Van Rij (1952), i nomi cerevisiae,
oviformis, bayanus, uvarum, ecc. Si riferivano a un
certo numero delle 30 specie del genere
Saccharomyces. - E 'stato rilevato che nel vino sono
state trovate due principali specie di fermentazione: S.
cerevisiae (precedentemente chiamata ellipsoideus) e
S. oviformis. Quest'ultimo è stato riscontrato
soprattutto verso la fine della fermentazione ed è
stato considerato più resistente all'etanolo. La
differenza nella loro capacità di fermentare il
galattosio ha distinto le due specie. S. cerevisiae (Gal
+) ha fermentato galattosio, mentre S. oviformis (Gal-)
no. Secondo gli stessi autori, la specie S. bayanus si
trovava raramente nei vini. Sebbene possedesse gli
stessi caratteri fisiologici di fermentazione e
assimilazione dello zucchero di S. oviformis, le sue
cellule erano più allungate, la sua fermentazione era
più lenta e aveva un comportamento particolare nei
confronti dei fattori di crescita. La specie S. uvarum è
stata identificata nel vino da molti autori. Differiva da
cerevisiae, oviformis e bayanus perché poteva
fermentare il melibio.
Nella successiva edizione di Lodder (Lodder 1970), il
numero di specie del genere Saccharomyces è
aumentato da 30 a 41. Alcune specie
precedentemente raggruppate con altri generi sono
state integrate nel genere Saccharomyces. Inoltre,
diversi nomi di specie furono considerati sinonimi e
scomparvero del tutto. Questo è stato il caso di S.
oviformis, che è stato spostato nella specie bayanus. Il
trattato di Ribe ́reau-Gayon et al. (1975) ritenevano,
tuttavia, che la distinzione tra oviformis e bayanus
fosse di interesse enologico a causa delle diverse
caratteristiche tecnologiche di questi due lieviti.
Tuttavia, all'inizio degli anni '80 la maggior parte dei
lavori enologici aveva abbandonato il nome oviformis
e lo aveva sostituito con bayanus. Questo cambio di
nome ha dato inizio alla confusione che esiste
attualmente.La nuova classificazione di Kregger-Van
Rij (1984), basata sul lavoro di Yarrow sulle percentuali
di base di guanina e citosina nel DNA del lievito, ha
portato a un altro importante cambiamento nella
denominazione della specie Saccharomyces.
Solo sette specie continuarono ad esistere, mentre 17
nomi divennero sinonimi di S. cerevisiae. Alcuni autori li
consideravano razze o varietà fisiologiche della specie S.
cerevisiae. Come per la classificazione precedente, queste
razze di S. cerevisiae erano differenziate per il loro profilo
di utilizzo dello zucchero (Tabella 1.4). Tuttavia, questo
metodo di classificazione non era altro che una
tassonomia artificiale senza significato biologico. Gli
enologi presero l'abitudine di aggiungere il nome varietale
a S. cerevisiae per designare i lieviti enologici: S. cerevisiae
var. cerevisiae, var. bayanus, var. uvarum, var. cheva- lieri,
ecc. Inoltre, due specie, bailii e rosei, sono state rimosse
dal genere Saccharomyces e integrate in un altro genere
per diventare rispettivamente Zygosacharomyces bailii e
Torulaspora delbrueckii.
L'ultima classificazione del lievito (Barnett et al., 2000) si
basa sui recenti progressi della genetica e della
tassonomia molecolare - in particolare, i test di
ricombinazione del DNA riportati da Vaughan Martini e
Martini (1987) e gli esperimenti di ibridazione
tra i ceppi (Naumov, 1987). Ha nuovamente gettato in
confusione la delimitazione delle specie del genere
Saccharomyces. Le specie ora sono 10 e sono divise in tre
gruppi (Tabella 1.3). Le specie S. cerevisiae, S. bayanus, S.
paradoxus e S. pastorianus non possono essere
differenziate tra loro da test fisiologici ma possono essere
delimitate misurando il grado di omologia del loro DNA
(Tabella 1.5). Formano il gruppo Saccharomyces sensu
stricto. S. pastorianus ha sostituito il nome S.
carlsbergensis, che veniva dato ai ceppi di lievito di birra
usati per la fermentazione inferiore (lager) e fino ad ora
inclusi nella specie cerevisiae. La specie di S. paradoxus,
recentemente delimitata, comprende ceppi inizialmente
isolati da essudati di alberi, insetti e suolo (Naumov et al.,
1998). Potrebbe costituire l'antenato comune naturale di
altre tre specie di lievito coinvolte nel processo di
fermentazione. Una recente analisi genomica (Redzepovic
et al., 2002) ha identificato un'alta percentuale di S.
paradoxus nella microflora croata dell'uva. La presenza di
questa specie in altri vigneti nel mondo e le sue proprietà
enologiche meritano sicuramente ulteriori
approfondimenti. Un secondo gruppo, Saccharomyces
sensu largo, è costituito dalle specie exiguus, castelli,
servazzi e unisporus. Il terzo gruppo è costituito solo dalla
specie kluyveri. Solo il primo gruppo comprende specie di
interesse enologico: S. cerevisiae, S. bayanus e,
possibilmente, S. paradoxus, se è dimostrata la sua
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
idoneità alla vinificazione.
Questa nuova classificazione ha creato molta
confusione nella lingua relativa all'epiteto bayanus.
Per i tassonomi, S. bayanus è una specie distinta da S.
cerevisiae. Per enologi ed enologi, bayanus (ex
oviformis) designa una razza fisiologica di S. cerevisiae
che non fermenta galattosio e possiede una
resistenza all'etanolo più forte di Saccharomyces
cerevisiae var. cerevisiae.Valutando l'infertilità dei
ceppi (un criterio fondamentale di delimitazione delle
specie), Naumov et al. (1993) hanno dimostrato che la
maggior parte dei ceppi che fermentano il melibio
(Mel +) isolati nel vino e fino ad ora classificati come S.
cerevisiae var. uvarum, appartengono alla specie S.
bayanus. Alcuni ceppi, tuttavia, possono essere
incrociati con un riferimento S. cerevisiae per
produrre discendenti fertili. Sono quindi attaccati a S.
cerevisiae. Questi risultati confermano, ma comunque
messi in prospettiva, i lavori passati di Rossini et al.
(1982) e Bicknell e Douglas (1982), basati su test di
ricombinazione del DNA. Le percentuali di
ricombinazione del DNA sono basse tra i ceppi
uvarum e cerevisiae testati, ma sono elevate tra questi
stessi ceppi uvarum e il ceppo di S. bayanus (CBS
380). In altre parole, la maggior parte dei ceppi
enologici precedentemente chiamati uvarum
appartengono alla specie S. bayanus. Questa
relazione, tuttavia, non è completa. Alcuni
Saccharomyces Mel + presenti nelle fermentazioni
spontanee dell'uva appartengono a cerevisiae.
I lieviti che gli enologi chiamano comunemente S.
cerevisiae var. bayanus, precedentemente S. ovi-
formis, sono stati studiati per determinare se
appartengono a
alla specie bayanus o alla specie cerevisiae, come la
maggior parte dei ceppi di uvarum. In questo caso, la
loro designazione porta solo a confusione.
Tutti i risultati della tassonomia molecolare sopra
presentati mostrano che le precedenti classificazioni
fenotipiche, basate su criteri di identificazione
fisiologica, non sono nemmeno adatte a delimitare il
piccolo numero di specie fermentative del genere
Saccharomyces presenti in enologia. Inoltre, gli
specialisti conoscono da tempo l'instabilità delle
proprietà fisiologiche dei ceppi di Saccharomyces.
Rossini et al. (1982) hanno riclassificato un migliaio di
ceppi dalla collezione di lieviti dell'Istituto di
Microbiologia dell'Agricoltura dell'Università di Perouse.
Durante questa ricerca, hanno osservato che 23 dei 591
ceppi di S. cerevisiae conservati su malto agar hanno
perso la capacità di fermentare il galattosio. Ventitre ceppi
"divennero" bayanus, secondo la classificazione di Lodder
(1970). Hanno scoperto ancora più frequentemente che,
nel tempo, i ceppi acquisivano la capacità di fermentare
determinati zuccheri. Ad esempio, 29 dei 113 ceppi di
Saccharomyces oviformis sono diventati in grado di
fermentare il galattosio, "diventando" cerevisiae. Secondo
questi autori, questa instabilità fisiologica è una proprietà
specifica dei ceppi del gruppo Saccharomyces sensu
stricto. Nella stessa raccolta, non sono stati osservati
cambiamenti evidenti nei profili di fermentazione in 150
ceppi di Sacharomyces rosei (oggi Torulaspora
delbrueckii) o in 300 ceppi di Kloeckera apiculata. I metodi
genetici sono quindi indispensabili per identificare i lieviti
del vino. Tuttavia, le misure della percentuale di
ricombinazione del DNA oi test di infertilità tra ceppi
omotallici, una tecnica lunga e meticolosa, non sono
pratici per i controlli microbiologici di routine.
L'amplificazione dei segmenti del genoma mediante la
reazione a catena della polimerizzazione (PCR) è un
metodo più rapido e semplice che si è recentemente
dimostrato uno strumento eccellente per la
discriminazione delle specie di lievito del vino.
1.8.4 Delimitazione di specie vinicole di S. cerevisiae
e S. bayanus mediante PCR
Dalla sua scoperta da parte di Saiki et al. (1985), la PCR è
stata spesso utilizzata per identificare diverse specie di
piante e batteri. Questa tecnica consiste nell'amplificare
enzimaticamente uno o più frammenti genici in vitro. La
reazione si basa sull'ibridazione di due oligonucleotidi che
inquadrano una regione bersaglio su un DNA o stampo a
doppia elica. Questi oligonucleotidi hanno sequenze
diverse
e sono complementari alle sequenze di DNA che
inquadrano il filamento da amplificare. La Figura 1.21
illustra le diverse fasi del processo di amplificazione. Il
DNA viene prima denaturato ad alta temperatura (95 ° C).
La miscela di reazione viene quindi raffreddata ad una
temperatura compresa tra 37 e 55 ° C, consentendo
l'ibridazione di questi oligonucleotidi sui filamenti
denaturati. I filamenti fungono da primer da cui una DNA
polimerasi consente l'aggiunta fase per fase di unità
desossiribonucleotidiche nella direzione 5 '- 3'.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
La DNA polimerasi (Figura 1.22) richiede quattro
desossiribonucleoside-5 ′ trifosfati (dATP, dGTP, dTTP,
dCTP). Si forma un legame fosfodiestere tra l'estremità
3′-OH del primer e il fosforo più interno del
desossiribonucleoside attivato; il pirofosfato viene così
liberato. Il filamento appena sintetizzato viene formato
sul modello modello. Un enzima termoresistente, la
TAQ DNA polimerasi, è derivato dal batterio
termoresistente Thermus aquaticus. Consente un
gran numero di cicli di amplificazione (25 - 40) in vitro
senza dover aggiungere la DNA polimerasi dopo ogni
denaturazione. In questo modo, il frammento di DNA
amplificato durante il primo ciclo funge da stampo per
i cicli successivi. Di conseguenza, ogni ciclo successivo
raddoppia il frammento di DNA target, amplificato di
un fattore da 105 a 106 durante 25-30 cicli di
amplificazione.
Hansen e Kielland-Brandt (1994) hanno proposto
l'amplificazione PCR del gene MET 2 per differenziare
tra S. cerevisiae e S. bayanus, lavorando sui tipi di
ceppo delle specie cerevisiae e bayanus e su un
ceppo della varietà S. uvarum. Questo gene, che
codifica per la sintesi dell'omoserina acetiltransferasi,
ha sequenze differenti nelle due specie. Una parte del
gene viene inizialmente amplificata utilizzando due
oligonucleotidi complementari delle sequenze che
delimitano il frammento da amplificare. L'amplificato
ottenuto, circa 600 b.p, è della stessa dimensione per i
ceppi delle specie cerevisiae e bayanus testati, nonché
per l'isolato denominato S. uvarum. Diverse
endonucleasi di restrizione, che riconoscono
determinate sequenze di DNA specifiche, digeriscono
quindi il frammento amplificato. La Figura 1.23
fornisce un esempio della modalità di azione
dell'endonucleare di restrizione EcoRI. Questo enzima
riconosce le sequenze di basi GAATTC e taglia nella
posizione indicata dalle frecce. L'elettroforesi viene
utilizzata per separare i frammenti ottenuti. Di
conseguenza, può essere apprezzato il polimorfismo
della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP). I
profili di restrizione ottenuti differiscono tra cerevisiae
e bayanus. Sono identici per i tipi di ceppo bayanus e
uvarum testati.Questa tecnica PCR – RFLP associata al
gene MET2 è stata sviluppata e adattata per un'analisi
rapida. Le cellule intere vengono semplicemente
riscaldate in acqua (95 ° C), 10 minuti prima
dell'amplificazione. Vengono utilizzati solo due enzimi
di restrizione: EcoRI e PstI (Masneuf et al., 1996a, b).
L'amplificatore MET 2 (580 bp) viene tagliato in due
frammenti (369 e 211 bp) da EcoRI a S. cerevisiae.
La restrizione PstI crea due frammenti per il tipo di ceppo
S. bayanus. EcoRI non taglia l'amplificato MET2 di S.
bayanus, né il PstI taglia l'amplificato di S. cerevisiae
(Figura 1.24). Masneuf (1996) ha dimostrato che S.
paradoxus può essere identificato con questo metodo. Il
suo gene MET2 amplificat produce un frammento delle
stesse dimensioni delle altre due specie. Questo, tuttavia,
non è tagliato da EcoRI o PstI, ma piuttosto da Mae III.
Applicando questa tecnica relativamente semplice e
veloce a diversi ceppi enologici di S. uva-rum studiati da
Naumov et al. (1993), i ceppi attaccati alla specie bayanus
mediante test di ibridazione hanno dimostrato
chiaramente di presentare lo stesso profilo caratteristico
del bayanus (due bande dopo restrizione con PstI,
nessuna restrizione con EcoRI). D'altra parte, i ceppi di
uvarum inclusi nella specie cerevisiae, secondo i test di
ibridazione, hanno effettivamente un profilo di restrizione
caratteristico di S. cerevisiae (Figura 1.25 e Tabella 1.6). La
delimitazione delle specie cerevisiae e bayanus con questi
due metodi ha prodotto risultati identici per i 12 ceppi
analizzati.Questo tipo di analisi PCR - RFLP del gene MET 2
è stato esteso a diversi ceppi di lieviti selezionati
disponibili in commercio e attualmente utilizzati nella
vinificazione. A seconda della loro capacità di fermentare
il galattosio, i professionisti del vino in tutto il mondo
chiamano ancora questi ceppi cerevisiae o bayanus
(Tabella 1.7). Per tutti questi ceppi, sono state ottenute le
caratteristiche del profilo di restrizione della specie S.
cerevisiae.
Allo stesso modo è stata determinata la specie di 82 ceppi
indigeni di Saccharomyces isolati nei vini in fermentazione
e sull'uva (Tabella 1.8). Per gli otto ceppi Gal + Mel- e per i
47 ceppi Gal-Mel- analizzati, chiamati rispettivamente
cerevisiae e bayanus dagli enologi, i profili di restrizione
del gene MET2 amplificat sono caratteristici della specie S.
cerevisiae. Risultati simili sono stati ottenuti per 2 ceppi di
chevalieri che fermentano galattosio ma non maltosio
(Ma−), così come per il ceppo capensis (Gal− Ma−). La
maggior parte dei ceppi Mel +, fino ad ora chiamati
uvarum, (11 su 12 per gli isolati di Sauternes e 11 su 11
per gli isolati di Sancerre), appartengono alla specie S.
bayanus. Eppure alcuni Mel + sono S. cerevisiae (un
ceppo di Sauternes e due ceppi della collezione
Lallemand). Riassumendo, la classificazione dei principali
lieviti enologici (Sezione 1.8.3) ha attraversato tre fasi.
Inizialmente sono state previste diverse specie separate:
S. cerevisiae, S. bayanus e / o S. oviformis e S. uvarum.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
La DNA polimerasi (Figura 1.22) richiede quattro
desossiribonucleoside-5 ′ trifosfati (dATP, dGTP, dTTP,
dCTP). Si forma un legame fosfodiestere tra l'estremità
3′-OH del primer e il fosforo più interno del
desossiribonucleoside attivato; il pirofosfato viene così
liberato. Il filamento appena sintetizzato viene formato
sul modello modello. Un enzima termoresistente, la
TAQ DNA polimerasi, è derivato dal batterio
termoresistente Thermus aquaticus. Consente un
gran numero di cicli di amplificazione (25 - 40) in vitro
senza dover aggiungere la DNA polimerasi dopo ogni
denaturazione. In questo modo, il frammento di DNA
amplificato durante il primo ciclo funge da stampo per
i cicli successivi. Di conseguenza, ogni ciclo successivo
raddoppia il frammento di DNA target, amplificato di
un fattore da 105 a 106 durante 25-30 cicli di
amplificazione.
Hansen e Kielland-Brandt (1994) hanno proposto
l'amplificazione PCR del gene MET 2 per differenziare
tra S. cerevisiae e S. bayanus, lavorando sui tipi di
bayanus e / o S. oviformis e S. uvarum.
Successivamente, si pensava che tutti questi
appartenessero a un'unica specie: S. cerevisiae.
L'attuale classificazione identifica tre specie distinte
sulla base di dati biologici molecolari: S. cerevisiae, S.
bayanus e S. paradoxus. Poiché i ceppi di S. bayanus
utilizzati nella vinificazione appartengono
esclusivamente alla varietà S. uvarum (o sottospecie),
il resto di questo Manuale considererà solo due
specie di lieviti enologici, S. cerevisiae e S. uvarum. Il
coinvolgimento di S. paradoxus nella microflora di
fermentazione dell'uva deve ancora essere
confermato.
Infine, la PCR-RFLP associata al gene MET2 può essere
utilizzata per dimostrare l'esistenza di ibridi tra le
specie S. cerevisiae e S. bayanus. Questo metodo è
stato utilizzato per dimostrare l'esistenza (Masneuf et
al., 1998) di un tale ibrido naturale (ceppo S6U var.
Uvarum) tra i lieviti secchi commercializzati da
Lallemand Inc. (Montreal, Canada).
Ciolfi (1992, 1994) ha isolato questo lievito in una
cantina italiana. È stato selezionato per alcune
proprietà enologiche, in particolare l'attitudine a
fermentare a basse temperature, la bassa produzione
di acido acetico e la capacità di preservare l'acidità del
mosto. I profili di restrizione del gene MET2 di questo
ceppo di EcoRI e PstI, costituiti da tre bande, sono
identici (Figura1.26). Oltre al frammento amplificato si
ottengono due bande caratteristiche di S. cerevisiae
con EcoRI e due bande caratteristiche della specie S.
bayanus con PstI.
Le bande non sono artefatti dovuti ad un'impurità nel
ceppo, perché l'amplificazione del gene MET2 effettuata
su subcloni (ottenuti dalla moltiplicazione di cellule uniche
isolate da un micromanipolatore) produce risultati
identici. Inoltre, dopo la sporulazione del ceppo in
laboratorio, 10 tetradi sono stati ugualmente isolati da un
micromanipolatore dopo la digestione della parete
cellulare dell'ascus. Nessuna delle 40 ascospore
analizzate potrebbe germogliare. La non vitalità delle
ascospore concorda con l'ipotesi che questo ceppo sia un
ibrido interspecifico. Hansen del laboratorio Carlsberg
(Danimarca) ha sequenziato due degli alleli del gene MET2
da questo ceppo. La sequenza di uno degli alleli è identica
a quella del gene MET2 di S. cerevisiae, ad eccezione di un
nucleotide. La sequenza dell'altro allele è del 98,5% simile
a quella di S. bayanus. La presenza di questo allele è
quindi probabilmente dovuta a una croce
interspecifica.Ricerche recenti (Naumov et al., 2000b)
hanno dimostrato che il ceppo S6U è, in effetti, un ibrido
interspecifico tetraploide. Infatti, la percentuale di
germinazione delle spore di 24 tetradi, isolate mediante
micromanipolatore, era molto alta (94%), mentre sarebbe
stata molto bassa per un ibrido interspecifico diploide
“normale”.
I cloni monospore in questa prima generazione (F1) erano
tutti in grado di sporulare, mentre nessuna delle
ascospore delle tetrade di seconda generazione era
vitale. La natura ibrida dei cloni monospore prodotti da F1
è stata confermata dalla presenza dei geni S. cerevisiae e
S. uvarum MET2, identificati mediante PCR / RFLP. Infine,
la misurazione del contenuto di DNA per cellula
utilizzando la stima della citometria a flusso ha
confermato che i discendenti di S6U erano diploidi
interspecifici e che S6U stesso era un allotetraploide.
Natu- ral S. cerevisiae / S. Gli ibridi uvarum sono stati
isolati su uva e mosti a fermentazione spontanea in
Alsazia (Lejeune e Masneuf, risultati inediti).
Diversi altri metodi che utilizzano PCR / RFLP sono stati
applicati alla tipizzazione di Saccharomyces stesso. I
frammenti amplificati erano sequenze di DNA ribosomiale
(DNAr) (Guillamon et al., 1998; Nguyen et al., 2000).
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
1.9 IDENTIFICAZIONE DEI VARI DI LIEVITO DI VINO
1.9.1 Principi generali
Le principali specie di lievito coinvolte nella
fermentazione del mosto d'uva, in particolare S.
cerevisiae, comprendono un numero molto elevato di
ceppi con svariate proprietà tecnologiche. I ceppi di
lievito coinvolti durante la vinificazione influenzano la
velocità di fermentazione, la natura e la quantità dei
prodotti secondari formati durante la fermentazione
alcolica e le caratteristiche aromatiche del vino. La
capacità di differenziare i diversi ceppi di S. cerevisiae
è richiesta per i seguenti ambiti: lo studio ecologico
dei lieviti selvatici responsabili della fermentazione
spontanea del mosto d'uva; la selezione dei ceppi che
presentano le migliori qualità enologiche; controlli di
produzione e commercializzazione; la verifica
dell'impianto di lieviti selezionati utilizzati come lievito
madre; e la costituzione e il mantenimento di raccolte
di lieviti selvatici o selezionati. Bouix et al. (1981)
(citato in Van Vuuren e Van Der Meer, 1987) ha
condotto la ricerca iniziale sulla differenziazione
infraspecifica all'interno di S. cerevisiae. Hanno tentato
di distinguere i ceppi mediante analisi elettroforetica
delle loro proteine esocellulari e successivamente
(1987) hanno utilizzato la separazione delle proteine
intracellulari. Altri team hanno proposto di identificare
i ceppi mediante l'analisi degli acidi grassi a catena
lunga mediante gascromatografia (Tredoux et al.,
1987; Augustyn et al., 1991; Bendova et al., 1991;
Rozes et al., 1992). Sebbene queste diverse tecniche
differenzino tra alcuni ceppi, sono inconfutabilmente
meno discriminanti dei metodi di differenziazione
genetica. Essi anche
presentano l'inconveniente maggiore di dipendere
dallo stato fisiologico dei ceppi e dalle condizioni
colturali, che devono essere sempre identiche.
Alla fine degli anni '80, grazie allo sviluppo della
genetica, alcune tecniche di biologia molecolare
furono applicate con successo per caratterizzare i
ceppi di lievito del vino. Si basano sul polimorfismo
clonale del DNA mitocondriale e genomico di S.
cerevisiae. Questi metodi genetici sono indipendenti
dallo stato fisiologico del lievito, a differenza delle
precedenti tecniche basate sull'analisi dei
sottoprodotti del metabolismo.
1.9.2 Analisi del DNA mitocondriale
Il mtDNA di S. cerevisiae ha due proprietà notevoli: è
estremamente polimorfo, a seconda del ceppo; ed è
stabile (muta molto poco) durante la moltiplicazione
vegetativa. Le endonucleasi di restrizione (come EcoR5)
tagliano questo DNA in siti specifici. Questo processo
genera frammenti di dimensioni variabili che sono pochi e
possono essere separati mediante elettroforesi su gel di
agarosio.
Aigle et al. (1984) applicarono per la prima volta questa
tecnica ai lieviti di birra. Dal 1987 è utilizzato per la
caratterizzazione di ceppi enologici di S. cerevisiae
(Dubourdieu et al., 1987; Hallet et al., 1988).
L'estrazione del mtDNA comprende diverse fasi. I
protoplasti ottenuti dalla digestione enzimatica delle
pareti cellulari vengono lisati in un tampone ipotonico. Il
mtDNA viene quindi separato dal DNA cromosomico
mediante ultracentrifugazione in un gradiente di cloruro
di cesio, in presenza di bisbenzimide che funge da agente
intercalante fluorescente. Questo agente amplifica la
differenza di densità tra cromosomico e mtDNA. Il mtDNA
ha una quantità elevata di paia di basi di adenina e timina
per le quali la bisbenzimide ha una forte affinità. Infine, il
mtDNA viene purificato mediante un'estrazione a base di
fenolcloroformio e una precipitazione a base di
etanolo.Defontaine et al. (1991) e Querol et al. (1992)
hanno semplificato questo protocollo separando i
mitocondri dagli altri costituenti cellulari prima di estrarre
il DNA. In questo modo, hanno evitato la fase di
ultracentrifugazione. I detriti cellulari grossolani vengono
eliminati dal lisato di lievito mediante centrifugazione a
1000 g. Il supernatante viene nuovamente iniettato a
1500 g per ottenere i mitocondri. I mitocondri vengono
quindi lisati in un tampone adatto per liberare il DNA.
A differenza dei ceppi di birra industriale analizzati da
Aigle et al. (1984), che hanno lo stesso profilo di
restrizione del mtDNA, il che implica che sono di origine
comune, i ceppi di lievito enologico hanno una grande
diversità di mtDNA. Questo metodo distingue tra la
maggior parte dei lieviti selezionati utilizzati nella
vinificazione così come i ceppi selvatici di S. cerevisiae
trovati nelle fermentazioni spontanee (Figura 1.27).
Questa tecnica è molto discriminante e non troppo
costosa, ma è lunga e richiede diverse manipolazioni
complesse. È utile per la caratterizzazione sottile di un
piccolo numero di ceppi. Anche l'efficacia
dell'inoculazione può essere verificata con questo
metodo.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
Per verificare un'inoculazione, viene prelevato un
campione durante o verso la fine della fermentazione
alcolica. In laboratorio, le fecce vengono poste in un
mezzo di coltura liquido. Viene confrontato il profilo di
restrizione del mtDNA di questa biomassa totale e del
ceppo starter del lievito. Se il profilo di restrizione del
campione non ha bande soprannumerarie rispetto al
profilo di ceppo starter di lievito, lo starter di lievito è
stato correttamente impiantato, con una precisione
del 90%. Infatti, nel caso di una miscela binaria, il
ceppo minoritario deve rappresentare circa il 10%
della popolazione totale da rilevare (Hallet et al.,
1989).
1.9.3 Analisi del cariotipo
S. cerevisiae ha 16 cromosomi con una gamma di
dimensioni tra 250 e 2500 Kb. Il suo DNA genomico è
molto polimorfico; quindi è possibile differenziare i
ceppi delle specie in base alla distribuzione per
dimensione dei loro cromosomi. L'elettroforesi a
campo di impulso viene utilizzata per separare i
cromosomi di S. cerevisiae e consente il confronto dei
cariotipi dei ceppi. Questa tecnica utilizza due campi
elettrici orientati in modo diverso (da 90 a 120 gradi).
Gli elettrodi posti ai lati dell'apparato applicano i
campi alternativamente (Figura 1.28).
L'utente può definire la durata della corrente elettrica
che verrà applicata in ogni direzione (impulso). Ad
ogni cambio di direzione del campo elettrico, le
molecole di DNA si riorientano. I cromosomi più
piccoli si riorientano più rapidamente di quelli più
grandi (Figura 1.29).
Blondin e Vezhinet (1988), Edersen et al. (1988) e
Dubourdieu e Frezier (1990) hanno applicato questa
tecnica per identificare i ceppi di lieviti enologici. La
preparazione del campione è relativamente facile. I
lieviti vengono coltivati in un mezzo liquido, raccolti
durante la fase di log, e poi posti in sospensione in
una soluzione di agarosio calda che viene versata in
uno stampo diviso per formare piccoli tappi. La figura
1.30 fornisce un esempio di identificazione dei ceppi
di S. cerevisiae isolati da un mosto d'uva in
fermentazione spontanea da
Fig. 1.30. Esempio di profilo elettroforetico (campo
pulsato) dei cariotipi del ceppo di S. cerevisiae
questo metodo. Vezhinet et al. (1990) hanno
dimostrato che l'analisi del cariotipo può distinguere
tra
i ceppi di S. cerevisiae anche o meglio dell'uso dei profili di
restrizione del mtDNA. Inoltre, l'analisi del cariotipo è
molto più rapida e facile da usare rispetto all'analisi del
mtDNA. Nel caso di studi ecologici sulla microflora di
fermentazione spontanea, l'elettroforesi dei cromosomi a
campo pulsato è ampiamente utilizzata oggi per
caratterizzare i ceppi di S. cerevisiae (Frezier e
Dubourdieu, 1992; Versavaud et al., 1993, 1995).
Attualmente sono disponibili pochissime ricerche sul
polimorfismo cromosomico in altre specie di lieviti d'uva e
di vino. Naumov et al. (1993) hanno suggerito che i
cariotipi di S. bayanus e S. cerevisiae possono essere
facilmente distinti. Altri autori (Vaughan-Martini e Martini,
1993; Masneuf, 1996) hanno confermato i suoi risultati.
Infatti, una banda cromosomica specifica appare
sistematicamente in S. bayanus. Inoltre, ci sono solo due
cromosomi le cui dimensioni sono inferiori a 400 kb in S.
bayanus ma generalmente più in S. cerevisiae, in tutti i
ceppi che abbiamo analizzato.
Specie diverse dal Saccharomyces, in particolare lieviti
apiculati (Hanseniaspora uvarum, Kloeckera apiculata),
sono presenti sull'uva e talvolta si trovano all'inizio delle
fermentazioni. Queste specie hanno meno cariotipi
polimorfi e meno bande che in Sacharomyces. Versavaud
et al. (1993) hanno differenziato tra ceppi di specie di
lievito apicolato e Candida famata utilizzando
endonucleasi di restrizione in siti rari (Non I e Sfi I). Le
endonucleasi tagliano i cromosomi in un numero limitato
di frammenti, che sono stati poi separati mediante
elettroforesi a campo pulsato.
1.9.4 Analisi del profilo di restrizione del DNA
genomico associata all'ibridazione del DNA
mediante sonde specifiche (impronte digitali)
Il genoma del lievito contiene sequenze di DNA che si
ripetono da 10 a 100 volte, come le sequenze δ o Y1 dei
telomeri cromosomici. La distribuzione, o più
specificamente, il numero e l'ubicazione di questi
elementi, ha una certa variabilità intraspecifica. Questa
impronta genetica viene utilizzata per identificare i ceppi
(Pedersen, 1986; Degre et al., 1989).
I lieviti vengono coltivati in mezzo liquido. I campioni
vengono prelevati durante la fase di log, come nelle
tecniche precedenti. L'intero DNA viene isolato e digerito
mediante endonucleasi di restrizione. I frammenti
generati vengono separati mediante elettroforesi su gel di
agarosio
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
e quindi trasferiti su una membrana di nylon
(Southern, 1975). Si utilizzano sonde radioattive
complementari (sequenze nucleotidiche prese da
elementi δ e Y1) per ibridare con frammenti aventi
sequenze omologhe. Il risultato fornisce un profilo di
ibridazione contenente diverse bande.
L'impronta genetica è un metodo più complicato e
coinvolto dell'mtDNA o dell'analisi del cariotipo.
Tuttavia, è senza dubbio il metodo di identificazione
del ceppo più discriminante e può anche discriminare
troppo bene. Ha correttamente indicato piccole
differenze tra ceppi strettamente correlati. Nella
regione di Bordeaux, infatti, sono stati riscontrati cloni
di S. cerevisiae isolati da fermentazioni spontanee in
diverse cantine che hanno lo stesso cariotipo e lo
stesso profilo di restrizione del mtDNA. Tuttavia i loro
profili di ibridazione differiscono a seconda dell'origine
del campione (Frezier, 1992). Questi ceppi,
probabilmente discendenti dello stesso ceppo madre,
hanno quindi subito piccole modificazioni casuali,
mantenute durante la moltiplicazione vegetativa.
1.9.5 Reazione a catena di polimerizzazione (PCR)
associata a sequenze δ
Questo metodo consiste nell'utilizzare la PCR per
amplificare determinate sequenze del genoma del
lievito (Sezione 1.8.4),
che si verifica tra gli elementi δ ripetuti, la cui distanza
di separazione non supera un certo valore (1 kb). Ness
et al. (1992) e Masneuf e Dubourdieu (1994) hanno
sviluppato questo metodo per caratterizzare i ceppi di
S. cerevisiae. L'amplificazione viene eseguita
direttamente su cellule intere. Sono semplicemente
riscaldati per rendere permeabili gli involucri cellulari. I
frammenti di amplificazione risultanti vengono
separati in base alla loro dimensione mediante
elettroforesi in gel di agarosio e visualizzati mediante
fluorescenza ultravioletta (Figura 1.31).
L'analisi del profilo PCR associata alle sequenze δ può
distinguere tra la maggior parte dei ceppi di lievito
secco attivi (ADY) di S. cerevisiae utilizzati nella
vinificazione (Figura 1.32): 25 dei 26 ceppi di lievito
commerciale selezionati analizzati. Lavalle ́e et al.
(1994) hanno anche osservato un eccellente potere
discriminante con questo metodo durante l'analisi di
ceppi commerciali prodotti industrialmente da
Lallemand Inc. (Montreal, Canada). Inoltre, questo metodo
consente l'identificazione di 25-50 ceppi al giorno; è la più
rapida delle diverse tecniche di identificazione dei ceppi
attualmente disponibili.Quando viene utilizzato per
l'identificazione di ceppi indigeni in una data regione
viticola, tuttavia, sembra essere meno discriminante
rispetto all'analisi del cariotipo. I profili PCR dei lieviti
selvaggi isolati in una data posizione spesso appaiono
simili. Hanno diverse bande costanti e solo un piccolo
numero di bande discriminanti variabili. Alcuni ceppi
hanno lo stesso profilo di amplificazione PCR pur avendo
cariotipi diversi. In un dato luogo, il polimorfismo
testimoniato dalla PCR associata alle sequenze δ è meno
importante di quello dei cariotipi. Questo metodo è
quindi complementare ad altri metodi per caratterizzare i
ceppi di vinificazione. La PCR consente una rapida specie
primaria di popolazione indigena. L'analisi del cariotipo
raffina questa discriminazione.
I ceppi di S. bayanus non possono essere distinti con
questa tecnica perché il loro genoma contiene solo pochi
elementi Ty. Infine, per la sua praticità e rapidità, la PCR
associata alle sequenze δ facilita la verifica dell'impianto di
lievito madre utilizzato nella vinificazione. Le analisi
vengono effettuate sull'intera biomassa derivata dalle
fecce, preventivamente posta in mezzo liquido in una
coltura di laboratorio. I profili di amplificazione ottenuti
vengono confrontati con i profili di ceppo di lievito
inoculato. Sono identici a un impianto riuscito e diversi se
l'inoculazione fallisce. La Figura 1.33 fornisce esempi di
impianti riusciti (lieviti B e C) e non riusciti (lieviti A, D ed E).
I ceppi contaminanti hanno un profilo di amplificazione
diverso rispetto allo starter del lievito. La soglia di
rilevazione di un ceppo contaminante è stata studiata in
laboratorio analizzando una miscela di due ceppi in
proporzioni variabili.
Nell'esempio fornito nella Figura 1.34, il ceppo
contaminante viene facilmente rilevato all'1%. Nelle
fermentazioni in cantina, tuttavia, diversi ceppi autoctoni
minoritari possono coesistere con il ceppo inoculato.
Quando il mosto in fermentazione o le fecce vengono
analizzati mediante PCR, la velocità di impianto del lievito
è almeno del 90% quando i profili di amplificazione delle
fecce e del lievito madre sono identici.
Alla luce di varie ricerche, diversi metodi di analisi del DNA
dovrebbero essere combinati per identificare i ceppi di
lievito del vino.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
1.9.6 PCR con microsatelliti
I microsatelliti sono unità ripetute in tandem di brevi
sequenze di DNA (1-10 nucleotidi), cioè nella stessa
direzione e disperse in tutto il genoma dell'eucariote
(Field and Wills, 1998). Il numero di ripetizioni di motivi
è estremamente variabile da un individuo all'altro,
rendendo queste sequenze di dimensioni altamente
polimorfe. Queste regioni sono facilmente
identificabili, grazie alla sequenza completa del
genoma di S. cerevisiae, disponibile su Internet nel
Saccharomyces Genome Database. Sono state
elencate circa 275 sequenze, principalmente
dinucleotidi AT e trinucleotidi AAT e AAC (Perez et al.,
2001). Inoltre, queste sequenze sono marcatori allelici,
trasmessi alla prole in modo mendeliano. Di
conseguenza, questi sono marcatori genetici ideali per
identificare specifici ceppi di lievito, rendendo
possibile non solo la distinzione tra i ceppi, ma anche
la loro disposizione in gruppi correlati. Questa tecnica
ha molte applicazioni nell'uomo: test di paternità,
medicina legale, ecc. In viticoltura, questo metodo di
identificazione molecolare è già stato applicato ai
vitigni di Vitis vinifera (Bowers et al., 1999).
La tecnica consiste nell'amplificare la regione del
genoma contenente questi microsatelliti, quindi
analizzare la dimensione della porzione amplificata a
un livello di dettaglio di un nucleotide mediante
elettroforesi su gel di acrilammide. Questo varia di un
certo numero di paia di basi (circa 8 - 40) da un ceppo
all'altro, a seconda del numero di volte che il motivo
viene ripetuto. Un ceppo di lievito può essere
eterozigote per un dato locus, dando due frammenti
di DNA amplificati di dimensioni diverse.
Using 6 microsatellites, Perez et al. (2001) were able to
identify 44 differ- ent genotypes within a population of
51 strains of S. cerevisiae used in winemaking. Other
authors (Gonzalez et al., 2001; Hennequin et al.,
2001)have shown that the strains of S. cerevisiae used
in winemaking are weakly heterozygous for the loci
studied. However, interstrain variability of the
microsatellites is very high. The results are expressed
in numerical values for the size of the microsatellite in
base pairs or the number of rep- etitions of the motifs
on each allele. These digital data are easy to interpret,
unlike the karyotype images on agarose gel, which are
not really compa- rable from one laboratory to
another. Microsatel- lite analysis has also been used
to identify
the strains of S. uvarum used in winemaking (Masneuf
and Lejeune, unpublished). As the S. uvarum and S.
cerevisiae microsatellites have different amplifi- cation
primers, this method provides an additional means of
distinguishing between these species and their hybrids.In
future, this molecular typing method will cer- tainly be a
useful tool in identifying winemaking yeast strains,
ecological surveys, and quality con- trol of industrial
production batches.Finally, another technique has
recently been proposed for identifying Saccharomyces
strains with PCR by amplifying introns of the COX1
mitochondrial DNA gene, which varies in number and
position in different strains. It is possible to amplify either
purified DNA or fermenting must. This technique has
been used to monitor yeast development during
fermentation (Lopez et al., 2003).
1.10 ECOLOGY OF GRAPE AND WINE YEASTS
1.10.1 Succession of Grape and Wine Yeast Species
Until recently, a large amount of research focused on the
description and ecology of wine yeasts. It concerned the
distribution and succession of species found on the grape
and then in wine during fermentation and conservation
(Ribe ́ reau- Gayon et al. 1975; Lafon-Lafourcade 1983).Lo
studio ecologico delle specie di lieviti d'uva e di vino
rappresenta una notevole quantità di ricerca. De Rossi
inizia la sua ricerca negli anni Trenta (De Rossi, 1935).
Castelli (1955, 1967) ha perseguito l'ecologia del lievito nei
vigneti italiani. Peynaud e Domercq (1953) e Domercq
(1956) pubblicarono i primi risultati sull'ecologia dei lieviti
enologici in Francia. Hanno descritto non solo le specie
trovate sull'uva e durante la fermentazione alcolica, ma
anche la contaminazione di lieviti e malattie. Tra le
numerose pubblicazioni su questo tema a partire dagli
anni '60 nelle regioni viticole di tutto il mondo, si
segnalano i seguenti lavori: Brechot et al. (1962), Minarik
(1971), Barnett et al. (1972), Park (1975), Cuinier e
Guerineau (1976), Soufleros (1978), Belin (1979, 1981),
Poulard et al. (1980), Poulard e Lecocq (1981), Bureau et
al. (1982), Rossini et al. (1982).
I lieviti sono diffusi in natura e si trovano nei suoli, sulla
superficie dei vegetali e nel tratto digerente degli animali.
Il vento e gli insetti li diffondono. Sono distribuiti
irregolarmente sulla superficie del vitigno; presenti in
piccole quantità sulle foglie, sul fusto e sugli acini acerbi,
colorano la buccia dell'uva durante la maturazione. Le
osservazioni al microscopio elettronico a scansione
hanno
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
identificato la posizione dei lieviti sull'uva. Raramente
si trovano sul fiore, ma si moltiplicano
preferenzialmente sugli essudati rilasciati da
microlesioni in zone situate intorno all'apparato
stomatico. Anche la Botrytis cinerea e le spore dei
batteri dell'acido lattico e acetico si sviluppano in
prossimità di queste fratture peristomatiche (Figura
1.35).
Il numero di lieviti sull'acino, appena prima della
vendemmia, è compreso tra 103 e 105, a seconda
della situazione geografica del vigneto, delle
condizioni climatiche durante la maturazione, dello
stato sanitario della vendemmia e dei trattamenti
antiparassitari applicati al la vite. Le popolazioni di
lievito più abbondanti si ottengono in condizioni
climatiche calde (latitudini più basse, temperature
elevate). Trattamenti insetticidi e alcuni trattamenti
fungicidi possono contribuire alla rarefazione della
microflora autoctona dell'uva. I risultati quantitativi
disponibili su questo argomento, tuttavia, sono pochi.
Dopo la raccolta, il trasporto e la frantumazione del
raccolto, il numero di cellule in grado di formare
colonie su un terreno agar raggiunge generalmente
106 cellule / ml di mosto.
Il numero di specie di lievito significativamente
presenti sull'uva è limitato. Vi si trovano
essenzialmente lieviti a metabolismo rigorosamente
ossidativo, che appartengono al genere Rhodotorula e
poche specie sensibili all'alcol. Tra queste ultime, le
specie apiculate (Kloeckera apiculata e la sua forma
sporifera Hanseniaspora uvarum) sono le più comuni.
Costituiscono fino al 99% dei lieviti isolati in alcuni
campioni di uva. Di solito si trovano ma in proporzioni
minori: Metschnikowia pulcherrima, Candida famata,
Candida stellata, Pichia membranefaciens, Pichia
fermentans, Hansenula anomala. Tutte le ricerche
confermano l'estrema rarità di S.cerevisiae sull'uva.
Eppure questi lieviti non sono del tutto assenti. La loro
esistenza non può essere provata spargendo mosto
diluito su terreno solido preparato in condizioni
asettiche, ma la loro presenza sull'uva può essere
provata analizzando la microflora fermentativa
spontanea di campioni di uva posti in sacchi sterili, poi
pigiati asetticamente e vinificati in laboratorio in
l'assenza di ogni contaminazione. Le uve rosse e
bianche della regione di Bordeaux sono state trattate
in questo modo. A metà fermentazione nella maggior
parte dei casi, S. cerevisiae rappresentava la quasi
totalità dei lieviti isolati. In alcuni rari casi, nessun lievito di
questa specie si è sviluppato e lieviti apiculati hanno
iniziato la fermentazione.
Indagini ecologiche condotte presso la Facoltà di Enologia
di Bordeaux dal 1992 al 1999 (Naumov et al., 2000a)
hanno dimostrato la presenza di lieviti S. uvarum sulle uve
e nei mosti bianchi a fermentazione spontanea della Valle
della Loira, Juranc ̧on e Sauternes . La frequenza della
presenza di questa specie accanto a S. cerevisiae varia dal
4 al 100%. In una tenuta in Alsazia, sono stati identificati
ceppi di S. uvarum sull'uva, nella pressa e nei tini, dove
rappresentavano fino al 90% dei lieviti coinvolti durante la
fermentazione in due anni consecutivi (Lejeune, lavoro
inedito). Più recentemente, Naumov et al. (2002) hanno
mostrato che S. uvarum, identificato sull'uva e nella
fermentazione del mosto, era coinvolto nella produzione
del vino Tokay.L'adattamento di S. uvarum a temperature
relativamente basse (6 - 10 ° C) spiega certamente la sua
presenza in alcune nicchie ecologiche: vigneti
settentrionali, vendemmie tardive e fermentazione
spontanea “fredda” dei vini bianchi. Al contrario, questo
ceppo è sensibile alle alte temperature e non è stato
riscontrato nelle fermentazioni spontanee dei vini rossi
Bordeaux.
Recenti osservazioni riportano anche la presenza naturale
di S. cerevisiae / S. ibridi uvarum sull'uva e nelle cantine
dove sono presenti entrambe le specie (Lejeune, opera
inedita).
Tra due vendemmie, i muri, i pavimenti,
l'attrezzatura e talvolta anche la cantina
l'edificio è colonizzato da persone sensibili all'alcol
specie precedentemente citate. I produttori di vino
credono, tuttavia, che le fermentazioni spontanee sono
maggiori difficile da avviare in serbatoi nuovi che in
serbatoi che sono già stati utilizzati. Questa osservazione
empirica
porta a supporre che S. cerevisiae possa
sopravvive anche in cantina tra due vendemmie.
Inoltre, questa specie è stata trovata in proporzioni non
trascurabili nei fermentatori di legno di alcuni di
i migliori vigneti di Bordeaux durante la vendemmia,
appena prima che fossero riempiti.Nelle prime ore di
fermentazioni spontanee, i primi serbatoi riempiti hanno
una microflora molto simile a quella dell'uva. C'è una
grande percentuale di lieviti apiculati e M. pulcherrima.
Dopo circa 20 ore si sviluppa S. cerevisiae e convive con i
lieviti d'uva.
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
Questi ultimi scompaiono rapidamente all'inizio della
fermentazione spontanea. Nella vinificazione in rosso
nella regione di Bordeaux, non appena la densità del
mosto scende al di sotto di 1.070 - 1.060, i campioni di
colonia ottenuti spargendo il mosto diluito su un
terreno solido generalmente isolano esclusivamente
S. cerevisiae (da 107 a 108 cellule / ml).
Questa specie svolge un ruolo essenziale nel processo
di fermentazione alcolica. Le condizioni ambientali
influenzano la sua selezione. Questa pressione di
selezione è esibita da quattro parametri principali:
anaerobiosi; solfatazione di mosto o uva; la
concentrazione di zucchero; e la crescente presenza
di etanolo. Nella vinificazione in cui non viene utilizzata
anidride solforosa, come i vini bianchi per la
produzione di alcolici, è ancora presente la microflora
dominante dell'uva. È ampiamente presente all'inizio
della fermentazione alcolica (Figura 1.36). Anche in
questo tipo di vinificazione la presenza di lieviti
apiculati è pressoché inesistente a metà
fermentazione alcolica.Durante la vinificazione in
bianco secco, la separazione delle vinacce dopo la
pressatura unita alla chiarifica per travaso riduce
fortemente le popolazioni di lieviti, almeno nei primi
giorni di vendemmia. La popolazione di lievito di un
grave travaso deve raramente superare 104-105
cellule / ml.
A pochi giorni dall'inizio della vendemmia, i lieviti
alcogenei di S. cerevisiae contaminano il materiale di
raccolta, i macchinari per il trasporto dell'uva e
soprattutto l'attrezzatura per il ricevimento della
vendemmia, la pigiatrice e il torchio. Per questo
motivo è già largamente presente al momento del
riempimento delle vasche (circa il 50% dei lieviti isolati
durante i rimontaggi di prima omogeneizzazione di
una vasca a bacca rossa).
Le fermentazioni vengono avviate più rapidamente nel
corso della campagna di vinificazione a causa di
questa maggiore percentuale di S. cerevisiae. Spesso,
infatti, le ultime vasche riempite completano le
fermentazioni prima delle prime. Allo stesso modo, la
svinatura statica nella vinificazione in bianco secco
diventa sempre più difficile da realizzare, anche a
basse temperature, dalla seconda settimana di
vendemmia in poi, soprattutto nelle annate calde.
L'intero impianto inocula il mosto con una consistente
popolazione di lieviti alcogene. E 'pertanto fortemente
consigliata la disinfezione
settimanale generale delle pompe, delle tubazioni, dei
torchi, delle vasche di travaso, ecc.
Durante la parte finale della fermentazione alcolica (la
fase di declino del lievito), la popolazione di S. cerevisiae
diminuisce progressivamente pur rimanendo superiore a
106 cellule / ml. In condizioni di vinificazione favorevoli,
caratterizzate da un rapido e completo esaurimento degli
zuccheri, nessun'altra specie di lievito compare in modo
significativo a fine fermentazione. In cattive condizioni, i
lieviti alterati possono contaminare il vino. Una delle
contaminazioni più frequenti e pericolose è dovuta allo
sviluppo del Brettanomyces intermedius, responsabile di
gravi difetti olfattivi (Volume 2, Sezione 8.4.5).
Nelle settimane che seguono il completamento della
fermentazione alcolica, le popolazioni vitali di S. cerevisiae
calano rapidamente, scendendo al di sotto di qualche
centinaio di cellule / ml. In molti casi, altre specie di lievito
(lieviti alterati) possono svilupparsi nei vini durante
l'invecchiamento o la conservazione in bottiglia. Alcuni
lieviti hanno un metabolismo ossidativo dell'etanolo e
formano un velo sulla superficie del vino, come il Pichia o
la Candida, o anche certi ceppi di S. cerevisiae, ricercati
nella produzione di vini speciali. Rabboccando
regolarmente, si può prevenire lo sviluppo di questi lieviti
del metabolismo respiratorio. Alcuni altri lieviti, come
Brettanomyces o Dekkera, possono svilupparsi in
anaerobiosi, consumando tracce di zuccheri che sono
stati fermentati in modo incompleto o non da S.
cerevisiae. La loro popolazione può raggiungere 104-105
cellule / ml in un vino rosso contaminato in cui la
fermentazione alcolica è altrimenti completata
normalmente. Queste contaminazioni possono verificarsi
anche nella bottiglia. I lieviti di rifermentazione possono
svilupparsi notevolmente nei vini dolci o botritizzati
durante l'invecchiamento o la conservazione in bottiglia; il
Le principali specie trovate sono Saccharomycodes
ludwigii, Zygosaccharomyces bailii, e anche alcuni ceppi di
S. cerevisiae particolarmente resistenti all'etanolo e
all'anidride solforosa.
1.10.2 Recenti progressi nello studio dell'ecologia
dei ceppi di S. cerevisiae
Lo studio ecologico della diversità clonale dei lieviti, ed in
particolare di S. cerevisiae durante la vinificazione, è stato
per lungo tempo inconcepibile a causa della mancanza di
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
mezzi per distinguere tra loro i ceppi di lievito. Tale
ricerca è diventata possibile con lo sviluppo di metodi
di identificazione dei ceppi di lievito molecolare
(Sezione 1.9). Questa sezione si concentra sui recenti
progressi in questo campo.
La fermentazione alcolica del mosto o dell'uva è svolta
essenzialmente da una sola specie di lievito, S.
cerevisiae. Pertanto, la comprensione della diversità
clonale all'interno di questa specie è molto più
importante per l'enologo delle indagini sulla
microflora dell'uva parzialmente o non fermentativa.
L'analisi in questa sezione dei ceppi di S. cerevisiae in
condizioni pratiche di vinificazione, in particolare,
intende rispondere alle seguenti domande:
• La fermentazione spontanea è condotta da un
ceppo dominante, da un piccolo numero o da un
numero molto elevato di ceppi?
• È possibile dimostrare l'esistenza di una successione
di ceppi durante la fermentazione alcolica? In caso
affermativo, qual è la loro origine: uva, materiale di
raccolta o attrezzature per la cantina?
• Durante la vinificazione e di anno in anno nella
stessa cantina o anche nello stesso vigneto, la
fermentazione alcolica spontanea viene svolta dagli
stessi ceppi?
• La pratica dell'inoculo con ceppi selezionati può
modificare la microflora selvatica di un vigneto?
Durante recenti ricerche (Dubourdieu e Frezier 1990;
Frezier 1992; Masneuf 1996), sono stati prelevati molti
campioni di microflora di lievito in vigna e in cantina
da partite di vini bianchi e rossi a fermentazione
spontanea o inoculati con lieviti secchi attivi. Da
questa ricerca, condotta su diverse migliaia di ceppi
selvatici di S. cerevisiae, si possono trarre diverse
conclusioni.
Nella maggior parte dei casi, un piccolo numero di
ceppi maggiori (da uno a tre) che rappresentano fino
al 70-80% delle colonie isolate, effettua le
fermentazioni spontanee dei vini rossi e bianchi
secchi. Questi ceppi dominanti si trovano in
proporzioni comparabili in tutti i fermentatori della
stessa cantina dall'inizio alla fine della fermentazione
alcolica. Questo fenomeno è illustrato dall'esempio
riportato in Figura 1.37, che descrive la microflora
autoctona di diverse vasche di mosto rosso in un
vigneto di Pessac-Le ́ognan nel 1989. I ceppi di S.
cerevisiae, in possesso di diversi cariotipi, sono
identificati da un codice alfanumerico comprendente
l'iniziale del vigneto, il numero della
vasca, l'ora del prelievo, il numero della colonia isolata e
l'anno del campione. Due ceppi, FzIb1 (1989) e FzIb2
(1989), si incontrano in tutti i serbatoi durante l'intero
processo di fermentazione alcolica.
Anche la fermentazione spontanea dei vini bianchi secchi
nello stesso vigneto viene svolta dagli stessi ceppi di lieviti
dominanti in tutte le botti.
L'ordine di riempimento delle cisterne e il vitigno incidono
poco sulla composizione clonale delle popolazioni di S.
cerevisiae spontaneamente presenti in cantina. La pratica
quotidiana dei rimontaggi del mosto di uve rosse con
mezzi di pompaggio utilizzati per tutte le vasche
garantisce probabilmente la disseminazione degli stessi
ceppi in cantina. Nella vinificazione in bianco,
l'installazione del torchio svolge lo stesso ruolo di un
inoculatore.
Inoltre, nella Figura 1.37, tutti i ceppi analizzati sono killer
K2. I due ceppi dominanti non fermentano il galattosio
(fenotipo Gal-). La loro prima denominazione era quindi S.
oviformis o S. cerevisiae (razza bayanus) nelle
classificazioni precedenti. Domercq (1956) ha osservato
una percentuale minore di S. oviformis nella microflora
spontanea delle fermentazioni della regione di Bordeaux
negli anni '50 (un quinto all'inizio della fermentazione a un
terzo alla fine). Nella microflora fermentativa autoctona
dei mosti bordolesi sono stati selezionati nel tempo alcuni
ceppi di S. cerevisiae Gal- che dominano dall'inizio della
fermentazione alcolica. Le cause di questo cambiamento
nella microflora rimangono sconosciute. D'altra parte, non
è stato osservato un aumento sistematico della
proporzione di ceppi Gal durante la fermentazione del
vino bianco rosso o secco (Tabella 1.9). Nei vini dolci
botritizzati di Sauternes, la successione dei ceppi è più
netta.Lo stesso ceppo maggiore si incontra
frequentemente per più annate consecutive nello stesso
vigneto in serbatoi di mosto di uve rosse a fermentazione
spontanea. Nel 1990, uno dei ceppi principali era lo
stesso dell'anno precedente nel serbatoio del mosto di
uve rosse del vigneto Fz. Tuttavia, apparvero altri ceppi
che non erano stati isolati nel 1989.
Quando vengono prelevati campioni sterili di uva, pressati
sterilmente, solfitati a livello di vinificazione e fermentati in
laboratorio in contenitori sterili, in alcuni campioni
esistono uno o più ceppi dominanti responsabili delle
fermentazioni spontanee in cantina. Questi ceppi sono
quindi presenti in vigna.
In pratica, probabilmente iniziano a moltiplicarsi non
appena le uve arrivano in cantina. A pochi giorni dalla
vendemmia, infestano le attrezzature della cantina che a l
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino
loro volta garantiscono un inoculo sistematico del
raccolto di uva fresca.
La presenza ogni anno dello stesso ceppo dominante
nel vigneto non è sistematica (Tabella 1.10). Nel
vigneto Fz, il ceppo FzIb2-89 non è stato isolato nel
1991 sebbene fosse presente in alcuni campioni di
vigneto nel 1990, 1992 e 1994. Nel 1993, un altro
ceppo si è rivelato dominante nelle fermentazioni
spontanee di campioni di uva sterile.
La microflora spontanea di S. cerevisiae sembra
fluttuare. Allo stato attuale, i fattori coinvolti in questa
fluttuazione non sono stati identificati. In un dato
vigneto, la fermentazione spontanea non viene svolta
sistematicamente dagli stessi ceppi ogni anno; la
specificità del ceppo non esiste e quindi non partecipa
alle caratteristiche del vigneto. Le osservazioni
ecologiche non confermano la nozione di lievito
specifico per vigneto. Inoltre, alcuni ceppi autoctoni,
dominanti in un dato vigneto, sono stati trovati in altri
vigneti vicini o lontani. Ad esempio, il ceppo FzIb2-89,
isolato per la prima volta in un vigneto di Pessac-L e ́
ognan, fulateridenti fi nnon solo nella fermentazione
spontanea di vini bianchi e rossi secchi di altri vigneti
della stessa denominazione, ma anche in cantine
relativamente distanti lontano come il Me ́doc. Da
allora questa varietà è stata selezionata e
commercializzata con il nome di Zymaflore F10.
In alcuni casi (Figura 1.38), le popolazioni di S.
cerevisiae con una grande diversità clonale effettuano
la fermentazione spontanea del mosto. Molti ceppi
coesistono. Le loro proporzioni variano dall'inizio alla
fine della fermentazione e da una cantina all'altra.
Nella regione di Bordeaux, questa diversità causa
lentezza
fermentazioni e talvolta anche fermezze bloccate.
Nessun ceppo è in grado di affermarsi. D'altra parte, la
presenza di un piccolo numero di ceppi dominanti
caratterizza generalmente fermentazioni spontanee
complete e rapide. Questi ceppi dominanti si trovano
dall'inizio alla fine della fermentazione.
In condizioni normali di vinificazione in rosso, l'inoculo
dei primi serbatoi in una cantina influenza la
microflora selvatica dei serbatoi non inoculati. I ceppi
usati per inoculare le prime vasche si trovano
frequentemente in maggioranza in queste ultime. La
Figura 1.39 fornisce un esempio che confronta la
microflora di un serbatoio
di Merlot da Pomerol, inoculato con un ceppo di lievito
secco attivo (522M) il primo giorno della raccolta, con un
serbatoio non inoculato riempito successivamente.
Dall'inizio della fermentazione alcolica, il ceppo
selezionato viene impiantato con successo nel serbatoio
inoculato. Anche nel serbatoio non inoculato, lo stesso
ceppo viene impiantato in modo uguale per tutta la
fermentazione. È quindi difficile selezionare i ceppi
selvatici dominanti nelle vasche di vinificazione in rosso,
quando alcune vasche sono state inoculate.Una precoce
e massiccia inoculazione del mosto, tuttavia, consente il
successo dell'impianto di diversi lieviti selezionati in più
vasche della stessa cantina (Figura 1.40).
Nella vinificazione in bianco l'inoculo raramente influenza
la microflora delle fermentazioni spontanee nelle cantine.
Si osservano per la maggior parte ceppi indigeni
dominanti in botti non inoculate di vino bianco secco in
fermentazione, mentre nella stessa cantina altri lotti sono
stati inoculati con lieviti selezionati differenti. L'assenza di
rimontaggi probabilmente ostacola la diffusione degli
stessi lieviti in tutte le botti in fermentazione. Questa
situazione permette di confrontare tra loro e con i ceppi
indigeni di un dato vigneto il comportamento
fermentativo e l'interesse enologico di diversi ceppi
selezionati. Le botti vengono riempite con lo stesso
mosto; alcuni vengono inoculati con il lievito da
confrontare. Un campione della biomassa viene prelevato
a metà fermentazione. L'impianto desiderato viene quindi
verificato mediante PCR associata a sequenze δ. Grazie
alla facilità d'uso di questo metodo, è possibile raccogliere
in cantina informazioni sulle caratteristiche dei ceppi
selezionati e sulla loro influenza sulla qualità del vino.
Vezhinet et al. (1992) e Versavaud et al. (1995) hanno
anche studiato la diversità clonale della microflora di
lievito in altri vigneti. I loro risultati confermano il carattere
policlonale delle popolazioni fermentative di S. cerevisiae.
La nozione di ceppi dominanti (da uno a due per
fermentazione) è evidente nel lavoro svolto nella regione
della Charentes. Come nella Champagne e nella Valle
della Loira, alcuni ceppi della regione della Charentes si
trovano per diversi anni consecutivi nella stessa cantina.
La presenza di questi ceppi dominanti sull'uva è stata
confermata prima di qualsiasi contatto con le attrezzature
della cantina durante diverse vendemmie.
Perché alcuni ceppi di S. cerevisiae emessi da una
popolazione molto eterogenea diventano dominanti
durante la fermentazione spontanea? Perché possono
 1.Citologia, tassonomia ed ecologia dei lieviti
d'uva e del vino

essere trovati più anni di seguito nella stessa vigna e
cantina? Nonostante il loro interesse pratico, queste
domande non sono state studiate spesso e non ci
sono risposte definitive. Sembra che questi ceppi
inizino rapidamente e completino la fermentazione
alcolica e abbiano una buona resistenza all'anidride
solforosa (fino a 10 g / hl). Inoltre, durante le
inoculazioni miste in laboratorio di etanolo all'8% o
mosti non fermentati, questi ceppi diventano
rapidamente dominanti quando posti in presenza di
altri ceppi selvatici non dominanti di S. cerevisiae
isolati all'inizio e alla fine di fermentazione.
Questo argomento merita ulteriori ricerche. Senza
dubbio, sarebbe interessante confrontare le
caratteristiche genetiche di dominante e non
dominante
lieviti e loro grado di eterozigosi. Considerando la
teoria del rinnovamento del genoma di Mortimer et al.
(1994) (Sezione 1.6.2), i ceppi dominanti sono forse
più omozigoti dei ceppi non dominanti.
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 2. Biochimica della fermentazione alcolica e
vie metaboliche dei lieviti enologici
2.1 INTRODUZIONE
La sintesi del materiale vivente è endergonica,
richiedendo il consumo di energia. Le piante
clorofilose, chiamate fototrofi, raccolgono l'energia
solare. Alcuni batteri traggono energia dall'ossidazione
dei minerali: sono chemolitotrofi. Come la maggior
parte degli animali e dei batteri, i funghi, compreso il
lievito, sono chemioorganotrofi: traggono la loro
energia necessaria dalla degradazione dei nutrienti
organici.
In un organismo in crescita, l'energia prodotta dalle
reazioni di degradazione (catabolismo) viene trasferita
alla catena di reazioni di sintesi (anabolismo).
Conforme alle leggi della termodinamica, energia
fornito dal degrado di un supporto è solo
parzialmente trasformato in opera; questa si chiama
energia libera (il resto viene dissipato sotto forma di
calore). Parte di questa energia gratuita può essere
utilizzata per il trasporto, il movimento o la sintesi.
Nella maggior parte dei casi, il trasportatore di energia
libero specifico per i sistemi biologici è l'adenosina
trifosfato (ATP). Questa molecola è ricca di energia
perché la sua unità trifosfato contiene due legami
fosfoanidridici (Figura 2.1). L'idrolisi dell'ATP in
adenosina difosfato (ADP) si traduce nella liberazione
di una grande quantità di energia libera (7,3 kcal /
mol). La biosintesi e il trasporto attivo dei metaboliti
fanno uso di energia libera.In questa reazione, G ′ ◦ quasi universale nei sistemi biologici. La delucidazione
è il cambiamento nell'energia libera. L'ATP è
considerato "il denaro universale dell'energia gratuita
nei sistemi biologici" (Stryer, 1992). In realtà, la crescita
dei microrganismi o, in questo caso, la crescita dei
lieviti è direttamente correlata alla quantità di ATP
fornita dalle vie metaboliche utilizzate per degradare
un substrato. È indirettamente correlato alla quantità
di substrato degradato.
Nella cellula vivente, ci sono due processi che
producono ATP: fosforilazione a livello di substrato e
fosforilazione ossidativa. Entrambi questi percorsi
esistono nei lieviti enologici.
La fosforilazione a livello di substrato può essere
aerobica o anaerobica. Durante l'ossidazione per
perdita di elettroni, si forma un legame estere-
fosforico. È un legame ricco di energia tra il carbonio
ossidato del substrato e una molecola di fosfato
inorganico. Questo legame viene quindi trasferito
all'ADP mediante transfosforilazione, formando così
ATP.
Questo processo avviene durante la glicolisi.
La fosforilazione ossidativa è un processo aerobico. La
produzione di ATP è legata al trasporto di elettroni ad una
molecola di ossigeno da parte della catena respiratoria
citocromica. Questa molecola di ossigeno è l'accettore
finale degli elettroni. Queste reazioni si verificano nei
mitocondri.
Questo capitolo descrive le principali reazioni biochimiche
che avvengono durante la fermentazione del mosto d'uva
da parte dei lieviti del vino. Copre il metabolismo dello
zucchero, cioè la biochimica della fermentazione alcolica e
il metabolismo dell'azoto. Composti volatili contenenti
zolfo e meccanismi di formazione di fenoli volatili saranno
discussi nel Volume 2, Capitolo 8 nella sezione
riguardante i difetti olfattivi. L'influenza dei lieviti sugli
aromi varietali del vino sarà trattata nel Volume 2,
Capitolo 7.
2.2 PERCORSI DI DEGRADAZIONE DELLO ZUCCHERO
A seconda delle condizioni aerobiche, il lievito può
declassare gli zuccheri utilizzando due vie metaboliche:
fermentazione alcolica e respirazione. Questi due
processi iniziano allo stesso modo, condividendo il
comune tronco della glicolisi.
2.2.1 Glicolisi
Questa serie di reazioni, trasformando il glucosio in
piruvato con la formazione di ATP, costituisce una via
delle diverse fasi della glicolisi è intimamente associata
alla nascita della moderna biochimica. Il punto di partenza
fu la fortunata scoperta da parte di Hans e Eduard
Buchner, nel 1897, della fermentazione del saccarosio da
parte di un estratto di lievito acelulare. Studiando le
possibili applicazioni terapeutiche per i loro estratti di
lievito, i Buchner scoprirono che lo zucchero utilizzato per
conservare il loro estratto di lievito veniva rapidamente
fermentato in alcool. Diversi anni dopo, Harden e Young
dimostrarono che era necessario aggiungere fosfato
inorganico all'estratto di lievito acellulare per assicurare
una velocità di fermentazione del glucosio costante.
L'esaurimento del fosfato inorganico durante la
fermentazione in vitro li ha portati a credere che fosse
incorporato in un fosfato di zucchero. Hanno anche
osservato che l'attività dell'estratto di lievito era dovuta a
un componente non dializzabile, denaturabile con il
calore, e un componente dializzabile termostabile. Hanno
chiamato questi due componenti "zymase" e "cozymase".
 2. Biochimica della fermentazione alcolica e
vie metaboliche dei lieviti enologici
Oggi, la zimasi è nota per essere una serie di enzimi e
la cozimasi è composta dai loro cofattori, dagli ioni
metallici e dall'ATP. La descrizione completa della
glicolisi risale agli anni Quaranta, grazie in particolare
ai contributi di Embden, Meyerhoff e Neuberg.
Per questo motivo, la glicolisi è spesso chiamata via
Embden-Meyerhoff.
Il trasporto del mosto esoso (glucosio e fruttosio)
attraverso la membrana plasmatica attiva un
complesso sistema di trasportatori proteici non
completamente spiegato (Sezione 1.3.2). Questo
meccanismo facilita la diffusione dei mosti esosi nel
citoplasma, dove vengono rapidamente metabolizzati.
Poiché il soluto si muove nella direzione del gradiente
di concentrazione, dal mezzo esterno concentrato al
mezzo interno diluito, non è un sistema di trasporto
attivo che richiede energia.
Successivamente, la glicolisi (Figura 2.2) viene eseguita
interamente nel citosol della cellula. Comprende un
primo stadio che converte il glucosio in fruttosio 1,6-
bifosfato, richiedendo due molecole di ATP. Questa
stessa trasformazione comprende tre fasi: una
fosforilazione iniziale del glucosio in glucosio 6-fosfato,
l'isomerizzazione di quest'ultimo in fruttosio 6-fosfato
e una seconda fosforilazione che forma fruttosio 1,6-
bifosfato. Queste tre reazioni sono catalizzate
rispettivamente da esochinasi, fosfoglucosio isomerasi
e fosfoglucochinasi.
Saccharomyces cerevisiae possiede infatti due
esochinasi (PI e PII) capaci di fosforilare il glucosio e il
fruttosio. L'esochinasi PII è essenziale ed è attiva
prevalentemente durante la fase di log del lievito in un
mezzo con un'alta concentrazione di zucchero.
L'esochinasi PI, parzialmente repressa dal glucosio,
non è attiva fino alla fase stazionaria (Bisson, 1991).
Sono stati isolati ceppi mutanti privi di
fosfoglucoismerasi. La loro incapacità di svilupparsi
con il glucosio suggerisce che la glicolisi è l'unica via
catabolica del glucosio nel Sacharomyces cerevisiae
(Caubet et al., 1988). La via ossidativa del pentoso
fosfato, attraverso la quale alcuni organismi utilizzano
gli zuccheri, serve solo come mezzo per sintetizzare il
ribosio 5-fosfato, incorporato negli acidi nucleici e nel
nicotinammide-adenina dinucleotide fosfato ridotto
(NADPH) in Saccharomyces.
Il secondo stadio della glicolisi forma glicerina-aldeide 3-
fosfato. Sotto l'azione catalitica dell'aldolasi, il fruttosio
1,6-bifosfato viene scisso formando due isomeri triosio
fosfato:
diidrossiacetone fosfato e gliceraldeide 3-fosfato. La
trioso fosfato isomerasi catalizza l'isomerizzazione di
questi due composti. Sebbene all'equilibrio la forma
chetonica sia più abbondante, la trasformazione del
fosfato diidrossiacetone in gliceraldeide 3-fosfato è
rapida, poiché questo composto viene continuamente
eliminato dalle conseguenti reazioni di glicolisi. In altre
parole, una molecola di glucosio porta alla formazione di
due molecole di gliceraldeide 3-fosfato.
La terza fase della glicolisi comprende due passaggi che
recuperano parte dell'energia dal gliceraldeide 3-fosfato
(G3P). Inizialmente, GA3P viene convertito in 1,3-
bifosfoglicerato (1,3-BPG). Questa reazione è catalizzata
dalla gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi. È
un'ossidazione accoppiata a una fosforilazione a livello di
substrato. La nicotinamide-adenina dinucleotide (NAD +)
è il cofattore della deidrogenazione. In questa fase, è nella
sua forma ossidata; la nicotinamide è la parte reattiva
della molecola (Figura 2.3). Contemporaneamente, viene
stabilito un legame ricco di energia tra il carbonio
ossidato del substrato e il fosfato inorganico. Il NAD +
accetta due elettroni e un atomo di idrogeno persi dal
substrato ossidato. Successivamente, la
fosfogliceratochinasi catalizza il trasferimento del gruppo
fosforile dell'acilfosfato dall'1,3-BPG all'ADP; si formano 3-
fosfoglicerato e ATP.
L'ultima fase della glicolisi trasforma il 3-fosfoglicerato in
piruvato. La fosfogliceromutasi catalizza la conversione
del 3-fosfoglicerato in 2-fosfoglicerato. L'enolasi catalizza
la disidratazione di quest'ultimo, formando
fosfoenolpiruvato. Questo composto ha un alto
potenziale di trasferimento del gruppo fosforile. Con la
fosforilazione dell'ADP si formano acido piruvico e ATP; la
piruvato chinasi catalizza questa reazione. In questo
modo, la glicolisi crea quattro molecole di ATP. Due
vengono immediatamente utilizzate per attivare una
nuova molecola di esoso, e il guadagno netto della glicolisi
è quindi di due molecole di ATP per molecola di esoso
metabolizzato. Questa fase segna la fine del tronco
comune della glicolisi; Seguono fermentazione alcolica,
fermentazione gliceropiruvica o respirazione, a seconda
delle varie condizioni.
2.2.2 Fermentazione alcolica
Il potere riducente del NADH, prodotto dalla glicolisi, deve
essere trasferito a un accettore di elettroni per rigenerare
il NAD +.
 2. Biochimica della fermentazione alcolica e
vie metaboliche dei lieviti enologici
Nella fermentazione alcolica, non è il piruvato ma
piuttosto l'acetaldeide, il suo prodotto di
decarbossilazione, che funge da accettore di elettrone
terminale. Rispetto alla glicolisi, la fermentazione
alcolica contiene due ulteriori reazioni enzimatiche, la
prima delle quali (catalizzata dalla piruvato
decarbossilasi), decarbossilata acido piruvico.
Il cofattore è la tiamina pirofosfato (TPP) (Figura 2.4).
TPP e piruvato formano un composto intermedio. Più
precisamente, l'atomo di carbonio situato tra l'azoto e
lo zolfo del ciclo tiazolico TPP è ionizzato. Forma un
carbanione, che si combina facilmente con il gruppo
carbonile piruvato. Il secondo passaggio riduce
l'acetaldeide in etanolo mediante NADH. Questa
reazione è catalizzata dall'alcol deidrogenasi il cui sito
attivo contiene uno ione Zn2 +.S. cerevisiae piruvato
decarbossilasi (PDC) comprende due isoenzimi: una
forma principale, PDC1, che rappresenta l'80%
dell'attività decarbossilasi, e una forma minore, PDC5,
la cui funzione rimane incerta.
Da un punto di vista energetico, la glicolisi seguita
dalla fermentazione alcolica fornisce al lievito due
molecole di ATP per molecola di glucosio degradato, o
14,6 kcal / mol di glucosio fermentato biologicamente
utilizzabili. Da un punto di vista termodinamico, la
variazione di energia libera durante la degradazione di
una mole di glucosio in etanolo e CO2 è di −40 kcal. La
differenza (25,4 kcal) viene dissipata sotto forma di
calore.
2.2.3 Fermentazione gliceropiruvica
In presenza di solfiti (Neuberg, 1946), la
fermentazione del glucosio da parte dei lieviti produce
quantità equivalenti di glicerolo, anidride carbonica e
acetaldeide nella sua forma bisulfitica. Questa
fermentazione gliceropiruvica avviene nel modo
seguente. Poiché l'acetaldeide combinata con il solfito
non può essere ridotta in etanolo, il diidrossi-acetone-
1-fosfato diventa l'accettore di elettroni terminale. È
derivato dall'ossidazione del gliceraldeide 3-fosfato e
ridotto a glicerolo 3-fosfato, che è esso stesso
defosforilato in glicerolo. Questo meccanismo è stato
utilizzato per la produzione industriale di glicerolo. In
questa fermentazione, vengono prodotte solo due
molecole di ATP per ogni molecola di esoso
degradato. L'ATP è necessario per attivare il glucosio
nella prima fase della glicolisi (Figura 2.5). La
fermentazione gliceropiruvica, il cui guadagno netto di
ATP è nullo, non fornisce energia biologicamente
assimilabile per i lieviti.
La fermentazione gliceropiruvica non avviene in modo
univoco in un ambiente altamente sulfitico. All'inizio della
fermentazione alcolica del mosto d'uva, l'inoculo è
costituito da lieviti inizialmente coltivati in presenza di
ossigeno. La loro piruvato decarbossilasi e alcol
deidrogenasi sono debolmente espresse. Di
conseguenza, l'accumulo di etanale è limitato. La
riossidazione del NADH non coinvolge l'etanale, ma
piuttosto il diidrossiacetone. Si formano glicerolo, piruvato
e alcuni prodotti di fermentazione secondaria.
Questi prodotti secondari sono derivati del piruvato,
inclusi, ma non limitato a, succinato e diacetile.
2.2.4 Respirazione
Quando lo zucchero viene utilizzato dalle vie respiratorie,
l'acido piruvico (originato dalla glicolisi) subisce una
decarbossilazione ossidativa in presenza del coenzima A
(CoA) (Figura 2.6) e NAD +. Questo processo genera
anidride carbonica, NADH e acetil-CoA:
piruvato + CoA + NAD + →
acetile CoA + CO2 + NADH + H +
Il sistema enzimatico della piruvato deidrogenasi catalizza
questa reazione. Si svolge all'interno dei mitocondri. La
tiamina pirofosfato (TPP), la lipoamide e la flavina-adenina
dinucleotide (FAD) partecipano a questa reazione e
servono come cofattori catalitici.
L'unità acetilica emessa dal piruvato viene attivata sotto
forma di acetil CoA. Le reazioni del ciclo dell'acido citrico,
chiamato anche ciclo degli acidi tricarbossilici e ciclo di
Krebs (Figura 2.7), ossidano completamente l'acetil CoA in
CO2. Queste reazioni si verificano anche nei mitocondri.
Questo ciclo inizia con la condensazione di un'unità
acetilica a 2 atomi di carbonio con un composto a 4 atomi
di carbonio, ossalacetato, per produrre un acido
tricarbossilico con 6 atomi di carbonio: acido citrico.
Quattro reazioni di ossidazione - riduzione rigenerano
l'ossalacetato. La via ossidativa decarbossila l'isocitrato,
un isomero del citrato, in α-chetoglutarato. L'isocitrato
deidrogenasi catalizza questa reazione. L'α-
chetoglutarato, un composto di 5 atomi di carbonio,
subisce una decarbossilazione ossidativa per diventare
succinato dall'α-chetoglutarato deidrogenasi.In queste
due reazioni, NAD + è l'accettore di idrogeno. La fumarato
deidrogenasi è responsabile della riduzione del succinato
in fumarato; FAD è l'accettore di idrogeno (Figura 2.8).
 2. Biochimica della fermentazione alcolica e
vie metaboliche dei lieviti enologici
Infine, il fumarato viene idratato in L-malato.
Quest'ultimo viene ridotto in ossalacetato dalla malato
deidrogenasi. In questo caso, il NAD + è ancora una
volta un accettore di elettroni.
Dall'acetato, ogni ciclo completo produce due
molecole di CO2, tre ioni idrogeno trasferiti a tre
molecole NAD + (sei elettroni) e un paio di
atomi di idrogeno (due elettroni) trasferiti a una
molecola FAD. La catena del citocromo trasporta
questi elettroni verso l'ossigeno. L'ATP si forma
durante questo processo. Questa fosforilazione
ossidativa (Figura 2.9) avviene nei mitocondri. Questo
processo fa uso di tre sistemi enzimatici (la NADH-Q
reduttasi, la citocromo riducentasi e la citocromo
ossidasi). Due sistemi di trasporto degli elettroni
(ubichinone, o coenzima Q, e citocromo c) collegano
questi sistemi enzimatici.
La fosforilazione ossidativa produce tre molecole di
ATP per coppia di elettroni trasportati tra il NADH e
l'ossigeno - due molecole di ATP con FADH2. Nel ciclo
di Krebs, la fosforilazione a livello di substrato forma
una molecola di ATP durante la trasformazione del
succinil CoA in succinato.La respirazione di una
molecola di glucosio (Tabella 2.1) produce da 36 a 38
molecole di ATP. Due provengono dalla glicolisi, 28
dalla fosforilazione ossidativa di NADH e FADH2
generata dal ciclo di Krebs e due dalla fosforilazione a
livello di substrato durante la formazione di succinato.
Da quattro a sei molecole di ATP derivano dalla
fosforilazione ossidativa di due molecole di NADH
prodotte nella glicolisi. Il numero preciso dipende dal
sistema di trasporto utilizzato per spostare gli
elettroni del NADH citosolico alla catena respiratoria
nei mitocondri. La respirazione della stessa quantità di
zucchero produce da 18 a 19 volte più energia
biologicamente utilizzabile disponibile per i lieviti
rispetto alla fermentazione. La respirazione è utilizzata
per la produzione di lievito industriale.
2.3 REGOLAZIONE DEI PERCORSI METABOLICI CHE
UTILIZZANO LO ZUCCHERO
2.3.1 Regolazione tra fermentazione e
respirazione: effetto Pasteur ed effetto Crabtree
Pasteur è stato il primo a confrontare la crescita del
lievito nell'aerobiosi e nell'anaerobiosi. Per basse
concentrazioni di glucosio sui terreni di coltura, i lieviti
utilizzano gli zuccheri attraverso la respirazione o la
fermentazione.
L'aerazione induce un aumento della biomassa formata
(totale e per unità di zucchero degradata) e una
diminuzione della produzione di alcol e del consumo di
zucchero. Pasteur ha quindi dedotto che la respirazione
inibisce la fermentazione.
L '"effetto Pasteur" è stato interpretato in diversi modi.
Due enzimi competono per catalizzare la respirazione o la
fermentazione del piruvato. Questa competizione spiega
l'inibizione respiratoria della fermentazione. La piruvato
decarbossilasi è coinvolta nella via fermentativa. Ha una
minore affinità con il piruvato rispetto alla piruvato
deidrogenasi. Inoltre, la fosforilazione ossidativa consuma
molto ADP e fosfato inorganico, che migrano verso i
mitocondri. Ne consegue una mancanza di ADP e fosfato
inorganico nel citoplasma. Questo deficit può limitare la
fosforilazione e quindi rallentare il flusso glicolitico.
L'inibizione degli enzimi di glicolisi da parte dell'ATP spiega
in gran parte l'effetto Pasteur. L'ATP emesso dalla
fosforilazione ossidativa inibisce in particolare la fosfo-
fruttochinasi. Di conseguenza, gli esosi fosforilati si
accumulano. Il trasporto transmembrana degli zuccheri e
quindi la glicolisi viene rallentato.
Per alte concentrazioni di glucosio, ad esempio nel mosto
d'uva, S. cerevisiae metabolizza gli zuccheri solo per via
fermentativa. Anche in presenza di ossigeno, la
respirazione è impossibile. Scoperto da Crabtree (1929)
sulle cellule tumorali, questo fenomeno è noto con diversi
nomi: repressione catabolica da parte del glucosio, effetto
contrario di Pasteur e effetto Crabtree. I lieviti
manifestano i seguenti segni durante questo effetto: una
degenerazione dei mitocondri, una diminuzione della
proporzione di steroli cellulari e acidi grassi e una
repressione sia della sintesi degli enzimi mitocondriali del
ciclo di Krebs che dei costituenti della catena respiratoria.
With S. cerevisiae, there must be at least 9 g of sugar per
liter for the Crabtree effect to occur. The catabolic
repression exerted by glucose on wine yeasts is very
strong. In grape must, at any level of aeration, yeasts are
only capable of fermenting because of the high glucose
and fructose concen- trations. From a technological
viewpoint, yeasts consume sugars by the respiratory
pathway for the industrial production of dry yeast, but not
in wine- making.
Se l'aerazione del mosto aiuta il processo di
fermentazione alcolica (Sezione 3.7.2), gli acidi grassi e gli
steroli sintetizzati dai lieviti, proliferando in presenza di
ossigeno, sono responsabili ma non la respirazione.
 2. Biochimica della fermentazione alcolica e
vie metaboliche dei lieviti enologici
S. cerevisiae può metabolizzare l'etanolo per via
respiratoria in presenza di piccole quantità di glucosio.
Dopo la fermentazione alcolica, i lieviti ossidativi si
sviluppano in modo simile sulla superficie del vino
come parte del processo di produzione di alcuni vini
speciali (Sherry, Yellow Wine of Jura).
2.3.2 Regolazione tra fermentazione alcolica e
Fermentazione gliceropiruvica; Accumulo di
glicerolo
I vini contengono circa 8 g di glicerolo per 100 g di
etanolo. Durante la fermentazione del mosto d'uva,
circa l'8% delle molecole di zucchero subisce la
fermentazione della gliceropiruria e il 92% della
fermentazione alcolica. La fermentazione dei primi
100 g di zucchero costituisce la maggior parte del
glicerolo, dopodiché la produzione di glicerolo rallenta
ma non è mai nulla. La fermentazione gliceropiruvica
è quindi più di una fermentazione induttiva che
rigenera il NAD + quando l'acetaldeide, normalmente
ridotta in etanolo, non è ancora presente. La
fermentazione alcolica e la fermentazione
gliceropiruvica si sovrappongono leggermente
durante la fermentazione.
L'acido piruvico è derivato dalla glicolisi. Quando
questa molecola non viene utilizzata dalla
fermentazione alcolica, partecipa alla formazione di
prodotti secondari. In questo caso, una molecola di
glicerolo è formata dalla riduzione del
diidrossiacetone.
La produzione di glicerolo quindi equilibra il
potenziale di ossidazione-riduzione endocellulare del
lievito, o equilibrio NAD + / NADH. Questa "valvola di
sfogo" elimina il NADH in eccesso che appare alla fine
della sintesi di aminoacidi e proteine.
Alcuni enologi attribuiscono troppa importanza al
ruolo organolettico del glicerolo. Questo composto ha
un sapore zuccherino simile al glucosio. In presenza di
altri costituenti del vino, invece, la dolcezza del
glicerolo è praticamente impercettibile. Per la maggior
parte dei degustatori, anche ben addestrati, l'aggiunta
di 3 - 6 g di glicerolo per litro ad un vino rosso non è
distinguibile e quindi il perseguimento di condizioni di
vinificazione più favorevoli alla fermentazione
gliceropiruvica non ha alcun interesse enologico. Al
contrario, l'enologo dovrebbe favorire una
fermentazione alcolica pura e limitare la
fermentazione gliceropiruvica. La produzione di
glicerolo è accompagnata dalla formazione di altri
prodotti secondari, derivati dall'acido piruvico, la cui
maggiore presenza (come i composti a funzione
carbonilica e l'acido acetico) fa diminuire la qualità del
vino.
2.3.3 Prodotti secondari formati dal piruvato
mediante fermentazione gliceropiruvica
Quando si forma una molecola di glicerolo, una molecola
di piruvato non può essere trasformata in etanolo dopo la
sua decarbossilazione in etanale. In condizioni
anaerobiche, l'ossalacetato è il mezzo di ingresso del
piruvato nel ciclo citosolico dell'acido citrico. Sebbene i
mitocondri non siano più funzionali, gli enzimi del ciclo
degli acidi tricarbossilici sono presenti nel citoplasma. La
piruvato carbossilasi (PC) catalizza la carbossilazione del
piruvato in ossalacetato. Il gruppo protesico di questo
enzima è la biotina; funge da trasportatore di CO2.
La reazione fa uso di una molecola di ATP: biotina – PC +
ATP + CO2 → CO2 –biotina – PC + ADP + [iP]
CO2 –biotina – PC + piruvato → biotina – PC +
ossalacetato
In queste condizioni anaerobiche, il ciclo dell'acido citrico
non può essere completato poiché l'attività della
succinodeidrogenasi richiede la presenza di FAD, un
coenzima strettamente respiratorio. La catena di reazioni
viene quindi interrotta al succinato, che si accumula (0,5–
1,5 g / l). Il NADH generato da questa porzione del ciclo di
Krebs (dall'ossalacetato al succinato) viene riossidato dalla
formazione di glicerolo dal diidrossiacetone.
L'α-chetoglutarato deidrogenasi ha un'attività molto bassa
nell'anaerobiosi; alcuni autori ritengono quindi che le
reazioni ossidative del ciclo di Krebs siano interrotte all'α-
chetoglutarato.
A loro parere, una via riduttiva del ciclo dell'acido citrico
forma l'acido succinico nell'anaerobiosi: ossalacetato →
malato → fumarato → succinato. I batteri hanno un
meccanismo simile. Nel lievito, questa è probabilmente
una via minore poiché solo la via ossidativa del ciclo di
Krebs può mantenere l'equilibrio redox NAD + / NADH
durante la fermentazione (Oura, 1977). Inoltre, ulteriore
succinato si forma durante la fermentazione alcolica su
un terreno arricchito con glutammato. Il glutammato
viene deaminato per formare α-chetoglutarato, che viene
ossidato in succinato.
Tra i prodotti secondari, i composti a funzione chetonica
(acido piruvico, acido α-chetoglutarico) e l'acetaldeide si
combinano prevalentemente con l'anidride solforosa nei
 2. Biochimica della fermentazione alcolica e
vie metaboliche dei lieviti enologici
vini ottenuti da uve sane. La loro escrezione è
significativa durante la fase di proliferazione dei lieviti
e diminuisce verso la fine della fermentazione.
Acetaldeide aggiuntiva viene liberata in presenza di
quantità eccessive di anidride solforosa nel mosto. Un
pH e una temperatura di fermentazione elevati,
condizioni anaerobiche e una carenza di tiamina e
acido pantotenico aumentano la produzione di acidi
chetonici. L'integrazione con tiamina del mosto limita
l'accumulo di composti chetonici nel vino (Figura 2.10).
Altri prodotti secondari della fermentazione sono
derivato anche dall'acido piruvico: acido acetico,
acido lattico, butandiolo, diacetile e acetoina. Loro
i processi di formazione sono descritti di seguito
paragrafi.
2.3.4 Formazione e accumulo di acido acetico da
parte dei lieviti
L'acido acetico è il principale acido volatile del vino.
Viene prodotto in particolare durante il
deterioramento batterico (deterioramento acetico e
malattia lattica) ma è sempre formato dai lieviti
durante la fermentazione. Oltre un certo limite, che
varia a seconda del vino, l'acido acetico ha un effetto
organolettico dannoso sulla qualità del vino. In mosto
d'uva sano con una concentrazione zuccherina
moderata (inferiore a 220 g / l), S. cerevisiae produce
quantità relativamente piccole (100-300 mg / l),
variabili a seconda del ceppo. In determinate
condizioni di vinificazione, anche senza
contaminazione batterica, la produzione di acido
acetico di lievito può essere anormalmente elevata e
diventare un problema per l'enologo.La via biochimica
per la formazione di acido acetico nei lieviti enologici
non è stata ancora chiaramente identificata. L'idrolisi
dell'acetil CoA può produrre acido acetico. La piruvato
deidrogenasi produce preventivamente acetil CoA
mediante la decarbossilazione ossidativa dell'acido
piruvico. Questa reazione avviene nelle matrici dei
mitocondri, ma è limitata nell'anaerobiosi. L'aldeide
deidrogenasi può anche formare acido acetico
mediante l'ossidazione dell'acetaldeide (Figura 2.11).
Questo enzima, il cui cofattore è NADP +, è attivo
durante la fermentazione alcolica. Il NADPH così
formato può essere utilizzato per sintetizzare i lipidi.
Quando la piruvato deidrogenasi viene repressa,
questa via forma acetil CoA attraverso l'uso di acetil
CoA sintetasi. Nell'anaerobiosi su un terreno modello, i
ceppi di lievito che producono la minor quantità di acido
acetico hanno la più alta attività di acetil CoA sintetasi
(Verdhuyn et al., 1990).L'acetaldeide deidrogenasi in S.
cerevisiae ha cinque isoforme, tre localizzate nel citosol
(Sezione 1.4.1) (Ald6p, Ald2p e Ald3p) e le restanti due
(Ald4p e Ald5p) nei mitocondri (Sezione 1.4.3) . Questi
enzimi differiscono per il loro uso specifico del cofattore
NAD + o NADP + (Tabella 2.2).
Remize et al. (2000) e Blondin et al. (2002) hanno studiato
l'impatto della delezione di ciascun gene e hanno
dimostrato che l'isoforma citoplasmatica ALD6
dipendente da NADP ha svolto un ruolo importante nella
formazione di acido acetico durante la fermentazione dei
vini secchi, mentre è stata coinvolta anche l'isoforma
ALD5, ma in misura minore (Figura 2.12).
Le condizioni pratiche di vinificazione che possono
portare ad una produzione anormalmente elevata di
acido acetico da parte di S. cerevisiae sono ben note.
Come nel caso della formazione del glicerolo, la
produzione di acido acetico è strettamente dipendente
dal livello zuccherino iniziale del mosto,
indipendentemente dalla quantità di zuccheri fermentati
(Tabella 2.3). Più alto è il contenuto di zucchero del mosto,
più acido acetico (e glicerolo) produce il lievito durante la
fermentazione. Ciò è dovuto al meccanismo di
adattamento del lievito a un mezzo con un'elevata
concentrazione di zuccheri: S. cerevisiae aumenta il suo
accumulo intracellulare di glicerolo per controbilanciare la
pressione osmotica del mezzo (Blomberg e Alder, 1992).
Questo meccanismo di regolazione è controllato da una
cascata di trasmissioni di segnali che portano ad un
aumento del livello di trascrizione dei geni coinvolti nella
produzione di glicerolo (GPD1), ma anche di acetato
(ALD2 e ALD3) (Attfield et al., 2000) . La formazione di
acetato gioca un importante ruolo fisiologico
nell'equilibrio redox intracellulare rigenerando equivalenti
ridotti di NADH. È quindi chiaro che un aumento della
produzione di acetato è inerente alla fermentazione dei
mosti ad alto contenuto di zucchero. Tuttavia, Bely et al.
(2003) hanno dimostrato che era possibile ridurre la
produzione di acetato fornendo più NADH al processo di
bilanciamento redox.
Ciò può essere fatto indirettamente stimolando la
formazione di biomassa, che genera un eccesso di NADH
durante la sintesi degli amminoacidi. L'azoto disponibile
nel mosto gioca un ruolo chiave in questo processo.
Pertanto, nei mosti ad alto contenuto di zucchero, la
produzione di
 2. Biochimica della fermentazione alcolica e
vie metaboliche dei lieviti enologici
acetato è inversamente correlata alla popolazione
cellulare massima (Figura 2.13), che a sua volta è
correlata al contenuto di azoto disponibile del mosto.
Si raccomanda vivamente di monitorare il contenuto
di azoto disponibile dei mosti botritizzati e di integrarli
con solfato di ammonio, se necessario.
La concentrazione ottimale di azoto disponibile in
questo tipo di mosto per minimizzare la produzione di
acido acetico è di circa 190 mg / l (Figura 2.14). Il
momento migliore per aggiungere integratori di azoto
è all'inizio della fermentazione, poiché le aggiunte
successive sono meno efficaci e possono persino
aumentare la produzione di acetato. In effetti, in
considerazione dell'imprevedibile aumento della
produzione di acido acetico che talvolta si verificava
nei mosti botritizzati integrati con solfato di ammonio,
molti enologi avevano abbandonato completamente
la pratica. È ormai noto che, a condizione che
l'integratore venga aggiunto all'inizio della
fermentazione, l'adeguamento del contenuto di azoto
disponibile al livello ottimale (190 mg / l) riduce
sempre al minimo la produzione di acido acetico nei
vini botritizzati.
Nei vini ottenuti da uve nobili marce, alcune sostanze
nel mosto inibiscono la crescita dei lieviti e aumentano
la produzione di acido acetico e glicerolo durante la
fermentazione. Botrytis cinerea secerne queste
sostanze "botriticine" (Ribe ́ reau-Gayon et al., 1952,
1979). La precipitazione frazionata con etanolo
purifica parzialmente questi composti dal mosto e dai
terreni di coltura della Botrytis cinerea. Queste
glicoproteine termostabili hanno pesi molecolari
compresi tra 10 e 50 000. Comprendono una parte
peptidica (10%) e glucidica contenente principalmente
naso e galattosio e un po 'di ramnosio e glucosio
(Dubourdieu, 1982). Quando aggiunti al mosto d'uva
sano, questi composti provocano un aumento della
fermentazione gliceropiruvica e una significativa
escrezione di acido acetico alla fine della
fermentazione (Figura 2.15). La modalità di azione di
queste glicoproteine sui lieviti non è stata ancora
identificata. Lo stato fisiologico delle popolazioni di
lieviti al momento dell'inoculo sembra giocare un
ruolo importante nello sviluppo fermentativo del
mosto d'uva botritizzato. Le preparazioni di lievito
secco industriale sono molto più sensibili agli inibitori
della fermentazione alcolica rispetto agli starter di
lievito ottenuti dalla precoltura in mosti d'uva sani.
Altri fattori di vinificazione favoriscono la produzione di
acido acetico da parte di S. cerevisiae: anaerobiosi, pH
molto basso (<3.1) o molto alto (> 4), alcune carenze di
aminoacidi o vitamine nel mosto e una temperatura
troppo alta (25 –30 ° C) durante la fase di moltiplicazione
del lievito. Nella vinificazione in rosso la temperatura è
l'elemento più importante, soprattutto quando il mosto
ha un'elevata concentrazione zuccherina. Nei climi caldi,
l'uva deve essere raffreddata durante il riempimento dei
tini. La temperatura non deve superare i 20 ° C all'inizio
della fermentazione. La stessa procedura va seguita nella
termo vinificazione subito dopo il riscaldamento delle uve.
In dry white and rose ́ winemaking, excessive must
clarification can also lead to the exces- sive production of
volatile acidity by yeast. This phenomenon can be
particularly pronounced with certain yeast strains.
Therefore, must turbidity should be adjusted to the
lowest possible level which permits a complete and rapid
fermen- tation (Chapter 13). Solids sedimentation (must
lees) furnishes long-chain unsaturated fatty acids (C18:1,
C18:2).
L'alimentazione lipidica del lievito influenza notevolmente
la produzione di acido acetico durante la vinificazione in
bianco e rosato.
L'esperimento in Figura 2.16 illustra l'importante ruolo dei
lipidi nel metabolismo dell'acido acetico (Delfini e Cervetti,
1992; Alexandre et al., 1994). È stata confrontata l'acidità
volatile di tre vini ottenuti dallo stesso mosto di Sauvignon
Blanc. Dopo la filtrazione, la torbidità del mosto è stata
regolata a 250 Unità di torbidità nefelometrica (NTU)
prima dell'inoculo con tre diversi metodi:
reincorporazione di fecce fresche (controllo); aggiunta di
polvere di cellulosa; e integrare la stessa quantità di fecce
adsorbite sulla polvere di cellulosa con un estratto lipidico
(metanolo-cloroformio). Le acidità volatili del vino di
controllo e del vino che è stato integrato con
un'estrazione lipidica delle fecce prima della
fermentazione sono identiche e perfettamente normali.
Nonostante la fermentazione fosse normale, l'acidità
volatile del vino ottenuto dal mosto integrato con
cellulosa (quindi privo di lipidi) era praticamente doppia
(Lavigne, 1996). L'integrazione del terreno con lipidi
sembra favorire la penetrazione degli amminoacidi nella
cellula, che limita la formazione di acido acetico.
Durante la fermentazione alcolica dei vini rossi o bianchi
leggermente chiarificati, i lieviti non producono
continuamente acido acetico.
 2. Biochimica della fermentazione alcolica e
vie metaboliche dei lieviti enologici
Il lievito metabolizza gran parte dell'acido acetico
secreto nel mosto durante la fermentazione dei primi
50-100 g di zucchero. Può anche assimilare l'acido
acetico aggiunto al mosto all'inizio della fermentazione
alcolica. I meccanismi di assimilazione non sono
ancora chiari. L'acido acetico sembra essere ridotto
ad acetaldeide, che favorisce la fermentazione alcolica
a detrimento della fermentazione gliceropiruvica.
Infatti l'aggiunta di acido acetico a un mosto abbassa
la produzione di glicerolo ma aumenta la formazione
di acetoina e butandiolo-2,3. I lieviti sembrano
utilizzare l'acido acetico formato all'inizio della
fermentazione alcolica (o aggiunto al mosto) tramite
acetil CoA nelle vie di produzione dei lipidi.
Alcune condizioni di vinificazione producono quantità
anormalmente elevate di acido acetico. Poiché questo
acido non viene utilizzato durante la seconda metà
della fermentazione, si accumula fino alla fine della
fermentazione. Riferendosi a un vino contaminato, i
lieviti possono abbassare l'acidità volatile
metabolizzando l'acido acetico. Il vino viene
incorporato nell'uva appena pigiata in una
proporzione non superiore al 20-30%. Il vino deve
essere solfitato o filtrato prima dell'incorporazione per
eliminare i batteri. L'acidità volatile di questa miscela
non deve superare 0,6 g / l in H2SO4. L'acidità volatile
di questo vino di nuova produzione raramente supera
i 0,3 g / l in H2 SO4. La concentrazione di acetato di
etile diminuisce contemporaneamente.
2.3.5 Altri prodotti secondari
della fermentazione degli zuccheri
L'acido lattico è un altro prodotto secondario della
fermentazione. È anche derivato dall'acido piruvico,
ridotto direttamente dalle latticodeidrogenasi L (+) e D
(-) del lievito. Nell'anaerobiosi (il caso della
fermentazione alcolica), il lievito sintetizza
prevalentemente la D (-) latticodeidrogenasi. I lieviti
formano 200-300 mg di acido lattico D (-) per litro e
solo circa una dozzina di milligrammi di acido L (+)
lattico. Quest'ultimo si forma essenzialmente all'inizio
della fermentazione. Determinando la concentrazione
di acido lattico D (-) in un vino, è possibile accertare se
l'origine dell'acido acetico è il lievito o i batteri lattici
(Sezione 14.2.3).
I vini che hanno subito la fermentazione malolattica
possono contenere diversi grammi per litro di acido
lattico esclusivamente L (+).
D'altra parte, la fermentazione lattica degli zuccheri
(malattia lattica) forma acido lattico D (-). I batteri lattici
hanno trasformato substrati diversi dall'acido malico,
quando le concentrazioni di acido lattico D (-) superano
da 200 a 300 mg / l.
I lieviti fanno anche uso di acido piruvico per formare
acetoina, diacetile e 2,3-butandiolo (Figura 2.17). Questo
processo inizia con la condensazione di una molecola di
piruvato e di acetaldeide attiva legata al pirofosfato di
tiamina, che porta alla formazione di acido α-acetolattico.
La decarbossilazione ossidativa dell'acido α-acetolattico
produce diacetile. L'acetoina è prodotta dalla
decarbossilazione non ossidativa dell'acido α-acetolattico
o dalla riduzione del diacetile. La riduzione dell'acetoina
porta alla formazione di 2,3-butandiolo; quest'ultima
reazione è reversibile.
Dall'inizio della fermentazione alcolica, i lieviti producono
diacetile, che viene rapidamente ridotto ad acetoina e 2,3-
butandiolo. Questa riduzione avviene nei giorni che
seguono la fine della fermentazione alcolica, quando i vini
vengono conservati sulla biomassa di lievito (de Revel et
al., 1996). L'acetoina e soprattutto il diacetile sono
composti dall'odore intenso che evocano un aroma
burroso.
Al di sopra di una certa concentrazione, hanno un effetto
negativo sull'aroma del vino. La concentrazione dei vini
che non hanno subito la fermentazione malolattica è
troppo bassa (pochi milligrammi per litro per il diacetile)
per avere un'influenza olfattiva. D'altra parte, i batteri
lattici possono degradare l'acido citrico per produrre
quantità molto più elevate di questi composti carbonilici
rispetto ai lieviti (Sezione 5.3.2).
Infine, i lieviti condensano l'acido acetico (sotto forma di
acetil CoA) e l'acido piruvico per produrre acido
citramalico (0-300 mg / l) e acido dimetilglicerico (0-600
mg / l) (Figura 2.18). Questi composti hanno poca
incidenza organolettica.
2.3.6 Degradazione dell'acido malico da parte del
lievito
Saccharomyces cerevisiae degrada parzialmente l'acido
malico del mosto (10–25%) durante la fermentazione
alcolica. Ceppi diversi degradano quantità variabili di
questo acido e la degradazione è più significativa quando
il pH è basso. La fermentazione alcolica è la principale via
di degradazione dell'acido malico. L'acido piruvico
risultante da questa trasformazione viene decarbossilato
in etanale, che viene poi ridotto ad etanolo. L'enzima
malico è responsabile della trasformazione dell'acido
malico in acido
 2. Biochimica della fermentazione alcolica e
vie metaboliche dei lieviti enologici
piruvico (Figura 2.19). Questa decarbossilazione
ossidativa richiede NAD + (Fuck e Radler, 1972).
Questa fermentazione maloalcolica abbassa l'acidità
del vino molto più della fermentazione malolattica.
Schizosaccharomyces differisce dai lieviti del vino. La
fermentazione alcolica dell'acido malico è completa
nei lieviti di questo genere, che possiedono un
sistema di trasporto attivo del malato. (In S. cerevisiae,
l'acido malico penetra nella cellula per semplice
diffusione.) Tuttavia, attualmente nessun tentativo di
utilizzare Schizosaccharomyces nella vinificazione ha
avuto successo (Peynaud et al., 1964; Carre et al.,
1983). Innanzitutto l'impianto di questi lieviti in
presenza di S. cerevisiae è difficile in un mosto non
sterilizzato. In secondo luogo, la loro temperatura
ottimale di crescita (30 ° C) superiore a quella di S.
cerevisiae, impone condizioni di fermentazione più
calde. A volte, la temperatura più alta influisce
negativamente sulla qualità organolettica del vino.
Infine, alcuni vitigni fermentati da
Schizosaccharomyces non esprimono i loro aromi
varietali. La varietà acida Gros Manseng produce un
vino molto fruttato se correttamente
vinificato con S. cerevisiae, ma non ha aroma varietale
quando fermentato da Schizosaccharomyces. Per
risolvere questi problemi, alcuni ricercatori hanno
utilizzato popolazioni non proliferanti di
Schizosacharomyces racchiuse in palline di alginato.
Queste popolazioni degradano l'acido malico nei vini
che hanno già completato la fermentazione alcolica
(Magyar e Panyid, 1989; Taillandier e Strehaiano,
1990). Sebbene in questi vini non si riscontri alcun
difetto organolettico, le tecniche non sono state
ancora sviluppate per un uso pratico.
Oggi, la biologia molecolare consente un'altra
strategia per utilizzare la capacità dello
Schizosaccaromyces di fermentare l'acido malico.
Consiste nell'integrazione dei geni della permeasi del
malato di Schizosaccharomyces e dell'enzima malico
(mae 1 e mae 2) nel genoma di S. cerevisiae (Van
Vuuren et al., 1996). L'interesse tecnologico di un
lievito enologico geneticamente modificato in questo
modo non è ancora chiaro, così come i rischi della sua
proliferazione nelle cantine e in natura.
2.4 METABOLISMO DEI COMPOSTI AZOTO
Il fabbisogno di azoto dei lieviti enologici e l'apporto di
azoto nei mosti di uve sono discussi nel capitolo 3
(sezione 3.4.2). La sezione seguente copre i meccanismi
generali di assimilazione, biosintesi e degradazione degli
amminoacidi nei lieviti. Vengono anche discusse le
conseguenze di questi metabolismi, che si verificano
durante la fermentazione alcolica e influenzano la
produzione di alcoli superiori e dei loro esteri associati nel
vino.
2.4.1 Vie di sintesi degli amminoacidi
Lo ione ammonio e gli amminoacidi presenti nell'uva
devono fornire azoto al lievito. Il lievito può anche
sintetizzare la maggior parte degli amminoacidi necessari
per la costruzione delle sue proteine. Fissa uno ione
ammonio su uno scheletro di carbonio derivato dal
metabolismo degli zuccheri. Il lievito utilizza le stesse vie
di reazione di tutti gli organismi. Il glutammato e la
glutammina svolgono un ruolo importante in questo
processo (Cooper, 1982; Magasanik, 1992).
La NADP + glutammato deidrogenasi (NADP + - GDH),
prodotto del gene GDH1, produce glutammato (Figura
2.20) da uno ione ammonio e una molecola di α-
chetoglutarato. Quest'ultimo è un prodotto intermedio
del ciclo dell'acido citrico. Il lievito possiede anche una
NAD + glutammato deidrogenasi (NAD + -GDH), prodotto
del gene GDH2.
Questa deidrogenasi è coinvolta nel catabolismo
ossidativo del glutammato. Produce la reazione inversa
del precedente, liberando lo ione ammonio utilizzato nella
sintesi della glutammina. L'attività di NADP + - GDH è
massima quando il lievito è coltivato su un terreno
contenente esclusivamente ammonio come fonte di
azoto. L'attività NAD + - GDH, tuttavia, è al suo massimo
livello quando la principale fonte di azoto è il glutammato.
La glutammina sintetasi (GS) produce glutammina da
glutammato e ammonio. Questa ammina- zione richiede
l'idrolisi di una molecola di ATP (Figura 2.21).
Attraverso le reazioni di transaminazione, il glutammato
funge quindi da donatore di gruppi amminici nella
biosintesi di diversi aminoacidi. Il piridossale fosfato è il
cofattore delle transaminasi (Figura 2.22); è derivato dalla
piridossina (vitamina B6).
Lo scheletro di carbonio degli amminoacidi ha origine da
prodotti intermedi della glicolisi (piruvato, 3-fosfoglicerato,
fosfoenolpiruvato), il ciclo dell'acido citrico (α-
chetoglutarato, ossaloacetato) o il ciclo dei pentoso fosfati
(ribosio 5-fosfato, eritrosio 4-fosfato).
 2. Biochimica della fermentazione alcolica e
vie metaboliche dei lieviti enologici
Alcune di queste reazioni sono molto semplici, come
la formazione di aspartato o alanina mediante
transaminazione del glutammato in ossalacetato o
piruvato: ossalacetato + glutammato →
aspartato + α-
chetoglutarato
→
piruvato + glutammato alanina + α-chetoglutarato
Altre vie biosintetiche sono più complesse, ma si
verificano ancora nei lieviti come nel resto del mondo
vivente. Gli amminoacidi possono essere classificati in
sei famiglie biosintetiche a seconda della loro natura e
del loro precursore di carbonio (Figura 2.23):
1. Oltre al glutammato e alla glutammina, dall'α-
chetoglutarato si formano prolina e arginina.
2. Asparagina, metionina, lisina, treonina e isoleucina
derivano dall'aspartato, che è emesso
dall'ossalacetato. L'ATP può attivare la metionina per
formare la S-adenosilmetionina, che può essere
demetilata per formare la S-adenosilomocisteina, la
cui idrolisi libera l'adenina per produrre l'omocisteina.
3. Il piruvato è il punto di partenza per la sintesi di
alanina, valina e leucina.4. Il 3-fosfoglicerato porta alla
formazione di serina e glicina. La condensazione di
omocisteina e serina produce cistationina, un
precursore della cisteina.
5. Il ciclo imidazolico dell'istidina è formato dal ribosio
5-fosfato e dall'adenina dell'ATP.
6. Gli amminoacidi che possiedono un ciclo aromatico
(tirosina, fenilalanina, triptofano) derivano dall'eritrosio
4-fosfato e dal fosfoenolpiruvato. Questi due composti
sono intermediari rispettivamente del ciclo pentoso e
della glicolisi. La loro condensazione forma shikimate.
La condensazione di questo composto con un'altra
molecola di fosfoenolpiruvato produce il corismato,
un precursore degli amminoacidi aromatici.
2.4.2 Meccanismi di assimilazione di ammonio e
amminoacidi
La penetrazione dell'ammonio e degli amminoacidi
nella cellula di lievito attiva numerosi trasportatori o
permeasi proteici di membrana (Sezione 1.3.2). S.
cerevisiae possiede almeno due trasportatori di ioni
ammonio specifici (Dubois e Grenson, 1979). La loro
attività è inibita da diversi amminoacidi, in maniera
non competitiva.
Due distinte categorie di trasportatori assicurano il
trasporto degli amminoacidi:
1. Una permeasi amminoacidica generale (GAP)
trasporta tutti gli amminoacidi. Lo ione ammonio inibisce
e reprime il GAP. Il GAP appare quindi attivo solo nella
seconda metà della fermentazione, quando il mosto non
contiene più ammonio. Agisce come "scavenger di azoto"
nei confronti degli amminoacidi (Cartwright et al., 1989).
2. S. cerevisiae ha anche molte permeasi amminoacidiche
specifiche (almeno 11). Ognuno garantisce il trasporto di
uno o più amminoacidi. In Contrast to GAP, lo ione
ammonio non limita la loro attività. Dall'inizio della fase di
log dei lieviti durante le prime fasi della fermentazione,
questi trasportatori assicurano la rapida assimilazione
degli amminoacidi del mosto.
Il glutammato e la glutammina, crocevia della sintesi degli
amminoacidi, non sono gli unici amminoacidi
rapidamente assimilati. La maggior parte degli
amminoacidi è praticamente esaurita dal mosto quando i
primi 30 g di zucchero sono stati fermentati. Alanina e
arginina sono i principali amminoacidi presenti nel mosto.
I lieviti fanno uso di questi due composti e l'ammonio
leggermente dopo l'esaurimento di altri amminoacidi.
Inoltre, i lieviti assimilano massicciamente l'arginina solo
dopo la scomparsa dell'ammonio dal terreno. A volte, i
lieviti non consumano completamente acido γ-
amminobutirrico. I lieviti non utilizzano la prolina durante
la fermentazione, sebbene sia uno dei principali
amminoacidi presenti nel mosto.
Durante la fermentazione, i lieviti assimilano tra 1 e 2 g / l
di amminoacidi. Verso la fine della fermentazione, i lieviti
espellono quantità significative ma variabili di diversi
amminoacidi. Infine, al termine della fermentazione
alcolica, rimangono alcune centinaia di milligrammi di
amminoacidi per litro; la prolina rappresenta
generalmente la metà.
Contrariamente ai mosto esosi che penetrano nella
cellula per diffusione facilitata, l'ammonio e gli
amminoacidi richiedono un trasporto attivo. La loro
concentrazione nella cellula è generalmente più alta che
nel mezzo esterno. La permeasi coinvolta accoppia il
trasporto di una molecola di amminoacido (o ione
ammonio) con il trasporto di uno ione idrogeno.
L'idrogeno si muove nella direzione del gradiente di
concentrazione: la concentrazione di protoni nel mosto è
maggiore che nel citoplasma. L'amminoacido e il protone
sono legati alla stessa proteina di trasporto e penetrano
nella cellula contemporaneamente. Questo trasporto
concertato di due sostanze nella stessa direzione è
chiamato symport (Figura 2.24). Ovviamente, il protone
che penetra nella cellula deve poi essere esportato per
evitare l'acidificazione del citoplasma.
 2. Biochimica della fermentazione alcolica e
vie metaboliche dei lieviti enologici
Questo movimento viene effettuato contro il
gradiente di concentrazione e richiede energia. La
membrana ATPasi assicura l'escrezione dello ione
idrogeno attraverso la membrana plasmatica, agendo
come una pompa protonica.
L'etanolo limita fortemente il trasporto degli
amminoacidi. Modifica la composizione e le proprietà
dei fosfolipidi della membrana plasmatica. La
membrana diventa più permeabile. Gli ioni H + del
mezzo penetrano in modo massiccio all'interno della
cellula per semplice diffusione. L'ATPasi di membrana
deve aumentare il suo funzionamento per controllare
il pH intracellulare. Non appena questo compito
monopolizza l'ATPasi, il symport degli amminoacidi
non funziona più. In altre parole, all'inizio della
fermentazione, e fintanto che la concentrazione di
etanolo nel mosto è bassa, i lieviti possono
rapidamente assimilare gli amminoacidi e concentrarli
nei vacuoli per un uso successivo, secondo le loro
esigenze di biosintesi.
2.4.3 Catabolismo degli amminoacidi
Lo ione ammonio è essenziale per la sintesi degli
amminoacidi necessari alla costruzione delle proteine,
ma i lieviti non sempre riescono a trovare quantità
sufficienti nel loro ambiente. Fortunatamente,
possono ottenere ammonio dagli amminoacidi
disponibili attraverso varie reazioni.
La via più comune è il trasferimento di un gruppo α-
ammino, originato da uno dei tanti amminoacidi
differenti, sull'acido α-chetoglutarico per formare
glutammato. Le aminotransferasi o transamminasi
catalizzano questa reazione, il cui gruppo protesico è il
piridossal fosfato (PLP). Il glutammato viene quindi
deaminato dalle vie ossidative per formare NH4 +
(Figura 2.25). Queste due reazioni possono essere
riassunte come segue:
Aminotransferasi
α-amminoacido + NAD + + H2O −− → acido α-
chetonico + NH4 + + NADH + H +
(2.7)
Durante la transaminazione, il piridossal fosfato viene
temporaneamente trasformato in piridossammina
fosfato (PMP). Il gruppo aldeidico PLP è legato a un
gruppo ε-ammino residuo di lisina sul sito attivo
dell'aminotransferasi per formare un prodotto
intermedio (E-PLP) (Figura 2.26).
Il gruppo α-ammino del substrato amminoacidico della
transaminazione sposta il gruppo ε-ammino residuo di
lisina legato al PLP. La scissione di questo prodotto
intermedio libera PMP e acido chetonico, corrispondenti
al substrato amminoacidico. Il PMP può a sua volta
reagire con un altro acido chetonico per fornire un
secondo amminoacido e rigenerare il piridossal fosfato.
Le reazioni parziali possono essere scritte nel modo
seguente:
amminoacido 1 + E-PLP → acido chetonico 1 + E-PMP
acido chetonico 2 + E-PMP →amminoacido 2 + E-PLP
il bilancio per il quale è:
amminoacido 1 + acido chetonico 2 →
acido chetonico 1
+ amminoacido 2
Alcuni amminoacidi, come la serina e la treonina,
possiedono un gruppo idrossile sul loro carbonio β.
Possono essere deaminate direttamente per
disidratazione. Una disidratasi catalizza questa reazione,
producendo l'acido chetonico e l'ammonio corrispondenti
(Figura 2.27).
2.4.4 Formazione di alcoli ed esteri superiori
I lieviti possono espellere gli acidi chetonici originati dalla
deaminazione degli amminoacidi solo dopo la loro
decarbossilazione in aldeide e riduzione in alcol (Figura
2.28). Questo meccanismo, noto come reazione di Ehrlich,
spiega in parte la formazione di alcoli superiori nel vino.
La tabella 2.4 elenca i principali alcoli superiori e i loro
corrispondenti amminoacidi, possibili precursori di questi
alcoli.
Diversi esperimenti indicano chiaramente, tuttavia, che la
degradazione degli amminoacidi non è l'unica via per la
formazione di alcoli superiori nel vino. In effetti, alcuni,
come il propan-1-olo e il butan-1-olo, non hanno
precursori di amminoacidi. Inoltre, alcuni mutanti carenti
nella sintesi di amminoacidi specifici non producono
l'alcol superiore corrispondente, anche se l'amminoacido
è presente nel mezzo di coltura. Non esiste alcuna
relazione tra la quantità di amminoacidi nel mosto e la
quantità di alcoli superiori corrispondenti nel vino.
La maggiore produzione di alcol da parte dei lieviti
sembra essere collegata non solo al catabolismo degli
amminoacidi ma anche alla loro sintesi tramite i
corrispondenti acidi chetonici. Questi acidi derivano dal
metabolismo degli zuccheri. Ad esempio, il propan-1-olo
non ha amminoacido corrispondente. Deriva dall'α-
chetobutirrato che può essere formato dal piruvato e
dall'acetil coenzima A. L'α-
 2. Biochimica della fermentazione alcolica e
vie metaboliche dei lieviti enologici
chetoisocaproato è un precursore dell'alcool
isoamilico e un prodotto intermedio nella sintesi della
leucina. Anch'esso può essere prodotto dall'α-
acetolattato, che è derivato dal piruvato. La maggior
parte degli alcoli superiori nel vino possono anche
essere formati dal metabolismo del glucosio senza il
coinvolgimento degli amminoacidi.La funzione
fisiologica di una maggiore produzione di alcol da
parte dei lieviti non è chiara. Può essere un semplice
spreco di zuccheri, un processo di disintossicazione
del mezzo intracellulare o un mezzo per regolare il
metabolismo degli amminoacidi.
Ad eccezione del feniletanolo, che ha una fragranza
simile alla rosa, gli alcoli superiori hanno un cattivo
odore. La maggior parte, come l'alcol isoamilico, ha
forti odori simili a solventi. Il metanolo è un alcol
particolare perché contiene un atomo di zolfo. Il suo
odore di cavolo cappuccio ha la soglia di percezione
più bassa (1,2 mg / l). Può essere responsabile degli
inestetismi olfattivi di riduzione più persistenti e
sgradevoli, soprattutto nei vini bianchi. In generale,
l'enologo dovrebbe evitare odori alcolici eccessivi.
Fortunatamente, il loro impatto organolettico è
limitato alle normali concentrazioni nel vino, ma
dipende dall'intensità aromatica complessiva del vino.
Rese eccessive e piogge a fine maturazione possono
diluire il mosto, nel qual caso il vino avrà una bassa
intensità aromatica e si potrà accentuare il carattere
pesante e comune degli alcoli superiori.
I parametri di vinificazione che aumentano la
maggiore produzione di alcol da parte dei lieviti sono
ben noti: pH elevato, temperatura di fermentazione
elevata e aerazione. Nella vinificazione in rosso,
l'estrazione dei costituenti delle vinacce e la
preoccupazione per fermentazioni rapide e complete
impongono aerazione e temperature elevate, e in
questo caso non si può limitare una maggiore
produzione di alcol da parte dei lieviti. Nella
vinificazione in bianco, una temperatura di
fermentazione compresa tra 20 e 22 ° C limita la
formazione di alcoli superiori.
Le carenze di ammonio e aminoacidi nel mosto
determinano una maggiore formazione di alcoli
superiori. In queste condizioni, il lievito sembra
recuperare tutto l'azoto animato disponibile per
transaminazione. Abbandona lo scheletro di carbonio
inutilizzato sotto forma di alcoli superiori. La svinatura
del bianco deve limitare anche la produzione di alcoli
superiori (Capitolo 13).
La natura del lievito (specie, ceppo) responsabile della
fermentazione influisce anche sulla produzione di alcoli
superiori. Alcune specie, come Hansenula anomala, sono
note da tempo per produrre molto, specialmente
nell'aerobiosi
(Guymon et al., 1961). Eppure la produzione dei lieviti
enologici è limitata, anche nella fermentazione spontanea.
Più recentemente, vari ricercatori hanno dimostrato che
la maggior parte dello S. bayanus (ex uvarum) produce
molto più feniletanolo di S. cerevisiae. Infine, la maggiore
produzione di alcol in S. cerevisiae dipende dal ceppo.
Una maggiore produzione di alcol limitata (ad eccezione
del feniletanolo) dovrebbe essere tra i criteri di selezione
dei lieviti enologici.
A causa della loro attività esterasica, i lieviti formano vari
esteri (pochi milligrammi per litro). Gli acetati più
importanti degli alcoli superiori sono l'acetato di isoamile
(aroma di banana) e l'acetato di feniletile (aroma di rosa).
Sebbene non siano legati al metabolismo dell'azoto, sono
coinvolti anche gli esteri etilici degli acidi grassi a catena
media. Sono formati dalla condensazione dell'acetil
coenzima A. Questi esteri hanno aromi più interessanti
degli altri. L'esanoato ha un aroma floreale e fruttato che
ricorda la mela verde. Il decanoato di etile ha un odore
simile al sapone. Nella vinificazione in bianco è possibile
aumentare la produzione di questi esteri abbassando la
temperatura di fermentazione e aumentando la chiarifica
del mosto. Alcuni ceppi di lievito (71B) producono grandi
quantità di questi composti, che contribuiscono all'aroma
di fermentazione dei vini giovani. Vengono rapidamente
idrolizzati durante il loro primo anno in bottiglia e non
hanno influenza a lungo termine sul carattere aromatico
dei vini bianchi.
REFERENCES
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Charpentier C., 1994, Rev. Fr. Œnol., cahiers scien-
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 3. Condizioni di sviluppo del lievito
3.1 INTRODUZIONE
Il mosto d'uva è un mezzo altamente fermentescibile
in cui i lieviti trovano le sostanze necessarie per
assicurare le loro funzioni vitali. I carboidrati (glucosio
e fruttosio) sono usati come fonti di carbonio ed
energia - i lieviti che derivano l'etanolo. L'etanolo
conferisce ai vini il loro carattere principale. Acidi
organici (acido tartarico e malico) e sali minerali
(fosfato, solfato, cloruro, potassio, calcio e magnesio)
assicurano un pH adeguato.
I composti azotati esistono in diverse forme:
ammoniaca, amminoacidi, polipeptidi e proteine. Il
mosto d'uva contiene anche sostanze che servono da
crescita (vitamine) e fattori di sopravvivenza. Altri
costituenti dell'uva (composti fenolici, aromi)
contribuiscono al carattere del vino, ma non giocano
un ruolo essenziale nella cinetica di fermentazione.
In generale, con un adeguato inoculo (106 cellule / ml),
si avvia facilmente la fermentazione nel mosto d'uva. È
completo, se la concentrazione iniziale di carboidrati
non è eccessiva, ma fattori diversi possono
interrompere la crescita del lievito e la cinetica di
fermentazione. Alcuni fattori hanno natura chimica e
corrispondono a carenze nutrizionali o alla presenza
di inibitori formati durante la fermentazione (etanale,
acidi grassi, ecc.).
Altri hanno natura fisico-chimica, ad esempio
ossigenazione, temperatura e chiarificazione del
mosto. Infine, le difficoltà di fermentazione possono
portare allo sviluppo di microrganismi indesiderati.
Possono antagonizzare il ceppo di lievito di
vinificazione desiderato. Il buon esito della
fermentazione dipende da tutti questi fattori. Una
perfetta padronanza della fermentazione è una delle
responsabilità primarie di un enologo, che deve
utilizzare i mezzi necessari per evitare deviazioni
microbiche e portare la fermentazione al suo
completamento: il completo esaurimento degli
zuccheri nei vini secchi. Le fermentazioni bloccate
sono un problema serio. Non solo sono spesso difficili
da riavviare, ma possono anche portare a
deterioramento batterico come la malattia lattica, nei
terreni contenenti zucchero. Questi problemi sono
stati discussi in relazione alle applicazioni pratiche di
vinificazione (Ribe ́ reau- Gayon et al., 1975a, 1976). Le
informazioni teoriche sulla fisiologia del lievito
possono essere trovate in lavori più fondamentali
(Fleet, 1992).
3.2 MONITORAGGIO E CONTROLLO DELLE
FERMENTAZIONI
3.2.1 Conteggio dei lieviti
Metodi diversi (descritti altrove) consentono la
caratterizzazione industriale dei ceppi di lievito coinvolti
nella fermentazione. Può essere utile monitorare la
popolazione di lieviti in base alla cinetica di
fermentazione. Lafon-Lafourcade e Joyeux (1979) hanno
descritto tecniche di enumerazione e identificazione per
diversi microrganismi nel mosto e nel vino (lievito, batteri
acetici e lattici).
Dopo opportuna diluizione del mosto in fermentazione, si
può stimare al microscopio il numero totale di cellule di
lievito, utilizzando una cellula di Malassez. Dopo la
calibrazione, questa determinazione può essere
effettuata anche misurando la densità ottica del mezzo di
fermentazione a 620 nm. Questa misurazione consente
un conteggio delle cellule di lievito interpretando la
torbidezza del mezzo, provocata dai lieviti.
Le cellule totali contate in questo modo includono sia
lievito "morto" che lievito "vivo". I due devono essere
differenziati in enologia. In effetti, è preferibile contare i
"microrganismi vitali".
Quando viene inserito in un file
mezzo nutritivo adatto, solido, cellule vitali sono in grado
di svilupparsi e formare un ammasso microscopico,
visibile ad occhio nudo, chiamato colonia. Il numero di
cellule di lievito vitali può essere determinato contando le
colonie formate su questo terreno dopo 3 - 4 giorni. Il
terreno di coltura viene preparato aggiungendo 1 ml di
soluzione di lievito diluita correttamente a 5 ml di terreno
nutritivo. Questa miscela viene trasferita nella sua forma
liquida a 40 ° C in una capsula di Petri; si solidifica mentre
si raffredda. Il mezzo nutritivo è costituito da volumi
uguali di una soluzione di agar da 20 g / le di mosto d'uva
(180 g di zucchero / le 3,2 pH) diluiti a metà della sua
concentrazione iniziale. Viene calcolata la media di due
conteggi di popolazione aventi tra 100 e 300 colonie.
Le popolazioni vitali di lievito possono anche essere
stimate direttamente contando al microscopio utilizzando
specifiche tecniche di colorazione o epifluorescenza. Le
popolazioni vitali possono anche essere determinate con
misurazioni di ATP utilizzando la bioluminescenza. Bouix
et al. (1997) hanno proposto l'uso
dell'immunofluorescenza per rilevare contaminazioni
batteriche durante la vinificazione.
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
Il controllo microbiologico è utile per il lavoro di
ricerca, ma questi metodi di controllo sono
relativamente lunghi e difficili. Per questo motivo le
fermentazioni sono generalmente seguite in cantina
da metodi più semplici.
3.2.2 Monitoraggio della cinetica di fermentazione
I produttori di vino devono monitorare attentamente
la fermentazione del vino in ogni vasca della cantina.
Questa attenta supervisione consente loro di
osservare le trasformazioni, anticiparne l'evoluzione e,
se necessario, agire rapidamente. Dovrebbero
effettuare giornalmente controlli sia di fermentazione
che di temperatura (Figura 3.1).
La cinetica di fermentazione può essere tracciata
misurando la quantità di zucchero consumato, alcool
formato o anidride carbonica rilasciata, ma la
misurazione della massa per unità di volume (densità)
è un metodo più semplice per tracciarne l'evoluzione.
La massa per unità di volume costituisce una misura
approssimativa della quantità di zucchero contenuta
nel mosto d'uva.
Poiché esiste una relazione tra la quantità di alcol
prodotta durante la fermentazione e la
concentrazione iniziale di zucchero nel mosto, la
densità del mosto può dare direttamente un
potenziale alcolico approssimativo. La densità e il
potenziale alcolico sono generalmente indicati sullo
stelo del densimetro: circa 17 g di zucchero
producono 1% di alcol in volume (Sezione 10.3.2,
Tabella 10.6). Esprimere il potenziale alcolico è senza
dubbio la soluzione migliore.
Durante la fermentazione, l'esaurimento dello
zucchero e la formazione di etanolo riducono la
densità. Per monitorare la densità del mosto viene
utilizzato un idrometro. I campioni vengono prelevati
dal centro della vasca utilizzando il rubinetto di
degustazione. Prima di prelevare un campione, il
rubinetto deve essere svuotato lasciando fluire alcuni
centilitri. La densità viene quindi corretta in base alla
temperatura del mosto. Non sono necessarie altre
conversioni o interpretazioni. Tracciare i punti sotto
forma di grafico consente all'enologo di valutare la
cinetica di fermentazione. Si può valutare anche la
regolarità della fermentazione.
Ancora più importante, le difficoltà di fermentazione,
che portano a fermentazioni bloccate, possono essere
anticipate. A causa dell'eterogeneità della cinetica di
fermentazione in un serbatoio di vinificazione in rosso
(la fermentazione è più attiva sotto il cappello della
vinaccia), si consiglia di omogeneizzare il serbatoio prima
di prelevare i campioni.
3.2.3 Misurazione della temperatura
Il monitoraggio quotidiano della temperatura della vasca
durante la fermentazione è indispensabile, ma questa
misurazione deve essere presa correttamente. Nella
vinificazione in rosso, in particolare, la temperatura della
vasca non è mai omogenea. La temperatura è più alta nel
cappello della vinaccia e più bassa nella parte inferiore
della vasca. Nelle prime ore di fermentazione si verificano
bruschi aumenti di temperatura nelle vinacce, talvolta
molto localizzati. Di conseguenza, la temperatura del
mosto contro il rivestimento della vasca è sempre
inferiore rispetto al centro della vasca. La temperatura
rilevata in queste condizioni, anche dopo aver svuotato
adeguatamente il rubinetto di degustazione, non è
rappresentativa dell'intera vasca. La temperatura deve
essere rilevata dopo un rimontaggio che omogeneizza la
temperatura del serbatoio. In questo modo si può
ottenere la temperatura media, ma la temperatura
massima, anch'essa importante, rimane sconosciuta.
La temperatura del mosto può essere rilevata con un
termometro a quadrante con sonda da 1,5 m. Questo
metodo efficace permette di misurare la temperatura del
mosto direttamente in diverse zone, soprattutto appena
sotto il tappo della vinaccia nella parte più calda della
vasca. Questa zona ha l'attività fermentativa più
significativa. La temperatura può essere rilevata anche da
sonde termoelettriche opportunamente collocate in ogni
vasca. Le sonde sono collegate ad un sistema di misura
nel laboratorio della cantina. Con questo sistema
l'enologo può verificare in ogni momento la temperatura
dei serbatoi. Alcuni sistemi di controllo della temperatura
regolano automaticamente la temperatura del serbatoio
quando la temperatura raggiunge un determinato valore.
3.2.4 Sistemi di controllo della fermentazione
Vari sistemi automatizzati semplificano il monitoraggio
della fermentazione e lo rendono più rigoroso. Questi
sistemi possono anche riscaldare e raffreddare
automaticamente il mosto in base alla temperatura.
Alcuni di questi sistemi possono essere molto sofisticati.
Ad esempio, quando la temperatura supera il limite
impostato, l'apparecchiatura inizialmente omogeneizza il
mosto in vasca mediante pompaggio. Se la temperatura è
ancora troppo alta, il gruppo frigorifero dell'impianto
raffredda il mosto. A causa
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
del carattere stagionale della vinificazione, alcuni
viticoltori devono accontentarsi di sistemi di controllo
manuale. L'automazione, tuttavia, può essere
pienamente giustificata quando consente una
maggiore precisione nella vinificazione. Ad esempio,
un gradiente di temperatura può essere prodotto in
questo modo durante la vinificazione in rosso.
All'inizio una temperatura moderata (18 - 20 ° C)
favorisce la crescita e la vitalità cellulare; alla fine una
temperatura più alta (> 30 ° C) facilita l'estrazione dei
costituenti della sansa.
Nuovi approcci ai sistemi automatizzati potrebbero
essere ulteriormente sviluppati (Flanzy, 1998). Almeno
per il momento influenzano la temperatura,
modulandola secondo la cinetica di fermentazione.
Oltre al controllo della temperatura "in linea",
dovrebbe essere sviluppato un sistema per
monitorare la cinetica di fermentazione. Sono stati
testati vari metodi: misurazione dell'anidride
carbonica emessa, diminuzione del peso e
diminuzione della densità (misurata come differenza
di pressione tra la parte superiore e quella inferiore
del serbatoio). La misurazione del gas rilasciato
sembra essere il metodo più affidabile (pesando in
laboratorio o utilizzando un contatore di gas
domestico per serbatoi di grande capacità; El Halaoui
et al., 1987). Questo processo presuppone che i
serbatoi siano completamente ermetici. Il metodo,
però, non è particolarmente consigliato, soprattutto
nella vinificazione in rosso dove sono indispensabili i
rimontaggi.
Sablayrolles et al. (1990) hanno affermato che i sistemi
automatizzati dovrebbero modulare la temperatura
per controllare meglio la cinetica di fermentazione e
limitare l'uso dei sistemi di raffreddamento.I sistemi di
controllo automatizzati dovrebbero essere legati alla
velocità di fermentazione e quindi all'attività del lievito,
un parametro sicuramente importante quanto la
temperatura. Quando la velocità di produzione di CO2
supera un limite stabilito in precedenza, la
temperatura ottenuta deve essere mantenuta. Non
appena la velocità diminuisce, l'apparecchiatura
dovrebbe far salire la temperatura per rilanciare la
fermentazione. Questa operazione consentirebbe di
completare più rapidamente la fermentazione. La
modulazione della temperatura deve essere correlata
alla fermentabilità del mosto. Lasciando
simultaneamente l'aumento della temperatura si
tradurrebbe in una diminuzione della domanda totale
di energia (Tabella 3.1). Ovviamente l'apparato deve
mantenere la temperatura entro limiti enologici
Un altro approccio consiste nel creare un modello del
processo di fermentazione alcolica. Per prevedere il
comportamento della fermentazione vengono utilizzati
diversi calcoli riguardanti il tempo, la temperatura e le
concentrazioni di alcol e zucchero, in particolare il rischio
di una fermentazione bloccata (Bove ́e et al., 1990). In
questo modo è possibile anticipare la necessità e il
momento di una determinata operazione (soprattutto il
controllo della temperatura).
Infine, queste regole del sistema di controllo devono
essere adattate alle particolari esigenze di ogni vasca in
termini di dati quantificabili ed esperienza dell'enologo.
Un sistema automatizzato altamente avanzato che
ottimizzi le fermentazioni alcoliche nella vinificazione
dovrebbe fare uso dell'intelligenza artificiale per tener
conto dell'esperienza dell'enologo (Grenier et al., 1990).
3.2.5 Evitare la formazione di schiuma
Durante la fermentazione si può formare schiuma
quando viene rilasciata anidride carbonica. Ciò può
provocare il trabocco del serbatoio. Per evitare il
problema, a volte i serbatoi vengono riempiti solo alla
metà della loro capacità.
Questo vincolo 108 non è accettabile. Fattori che
influenzano la formazione di schiuma include la
composizione dell'azoto del mosto (soprattutto
concentrazione proteica), temperatura di fermentazione e
natura del ceppo di lievito. I tentativi di creare condizioni
di fermentazione (ad esempio eliminando proteine
mediante bentonite) capaci di limitare questo fenomeno
non hanno portato a risultati soddisfacenti.
Per questo motivo, alcune cantine americane hanno
adottato l'utilizzo di prodotti che aumentano la tensione
superficiale. Questo processo riduce la formazione di
schiuma e la stabilità. Stanno guadagnando due agenti
antischiuma
popolarità: dimetil polisilossano e una miscela di
mono- e digliceridi dell'acido oleico. Sono usati in
una concentrazione inferiore a 10 mg / le no
lasciare un residuo nel vino, soprattutto dopo la
filtrazione. 105 Grazie alla loro efficienza, i serbatoi di vino
rosso possono essere riempiti fino al 75-80% della
capacità e i serbatoi di vino bianco fino all'85-90%. Questi
prodotti non sono tossici. L'Office International de la
Vigne et du Vin raccomanda l'uso esclusivo della miscela
di acido oleico mono- e digliceride.
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
3.3 CICLO DI CRESCITA DEL LIEVITO E CINETICA
DELLA FERMENTAZIONE
In un mosto non solfato e non inoculato, i lieviti
contaminanti possono iniziare a svilupparsi entro
poche ore dal riempimento della vasca. I lieviti
apiculati (Kloechera, Hanseniaspora) sono i più
frequenti. Si sviluppano anche lieviti aerobici (Candida,
Pichia, Hansenula), che producono acido acetico e
acetato di etile. Il Brettanomyces ed i suoi caratteristici
odori animaleschi sono rari nel mosto. Sebbene tali
lieviti possano essere relativamente resistenti
all'anidride solforosa (Fleet, 1992), la solfitazione
seguita dall'inoculazione con un ceppo selezionato di
Saccharomyces cerevisiae costituisce, in pratica, un
mezzo efficace per evitare la contaminazione (Sezione
3.5.4).
In generale, S. cerevisiae inoculato a 10 6 cellule / ml,
naturalmente o mediante inoculazione di un ceppo
selezionato, induce la fermentazione del mosto
d'uva.Il ciclo di crescita del lievito e la cinetica di
fermentazione del mosto d'uva sono illustrati nella
Figura 3.2 (Lafon-Lafourcade, 1983). Al fine di
accentuare alcuni fenomeni, il dato riguarda un mosto
contenente concentrazioni zuccherine
particolarmente elevate, che non può essere
completamente fermentato. L'analisi di questa figura
suggerisce le seguenti osservazioni.
1. Il ciclo di crescita ha tre fasi principali: una fase di
crescita limitata (2 - 5 giorni) aumenta la popolazione
tra 107 e 108 cellule / ml; segue una fase quasi
stazionaria che dura circa 8 giorni; infine, la fase di
morte riduce progressivamente la popolazione vitale a
105 cellule / ml. La fase finale può durare diverse
settimane.
2. Durante questo ciclo particolarmente lungo, la
crescita è limitata a quattro o cinque generazioni.
3. L'arresto della crescita non è il risultato di una
scomparsa dei nutrienti energetici.
4. La durata di queste diverse fasi non è uguale. La
fase di morte, in particolare, è da tre a quattro volte
più lunga della fase di crescita.
5. La cinetica di fermentazione è direttamente
collegata al ciclo di crescita. La velocità di
fermentazione è al massimo e praticamente costante
per poco più di 10 giorni. Questo periodo di tempo
corrisponde alle prime due fasi del ciclo di crescita. La
velocità di fermentazione quindi rallenta
progressivamente ma la fermentazione dura
comunque diverse settimane. In
questa fase, la popolazione di lievito è nella fase di
sopravvivenza. Infine, l'arresto della fermentazione non è
semplicemente il risultato di una crescita insufficiente del
lievito. Anche l'attività metabolica delle cellule non
proliferanti può essere inibita.
La cessazione dell'attività metabolica è stata interpretata
come l'esaurimento dell'ATP cellulare e l'accumulo di
etanolo nella cellula, molto probabilmente a causa delle
difficoltà di trasporto attraverso le membrane a causa
dell'esaurimento degli steroli cellulari. I sistemi enzimatici
cellulari funzionano ancora durante questa fase di
sopravvivenza ma la concentrazione di zucchero
intracellulare diminuisce gradualmente (Larue et al.,
1982).
Questi fenomeni hanno diverse conseguenze
tecnologiche. Per una concentrazione zuccherina limitata
(inferiore a 200 g / l), la fermentazione avviene durante le
prime due fasi del ciclo. Si svolge rapidamente e molto
spesso senza problemi. Se invece la quantità di zucchero
è elevata, una popolazione in fase di morte effettua
l'ultima parte della fermentazione. In questo caso, la sua
attività metabolica continua a diminuire durante tutto il
processo. La trasformazione totale dello zucchero in alcol
dipende dalla capacità di sopravvivenza di questa
popolazione; è importante quanto nella fase iniziale di
crescita.
Temperature eccessive e concentrazioni di zucchero
possono provocare fermentazioni lente o bloccate.
Possono essere coinvolti anche carenze nutrizionali e
fenomeni di inibizione. Tutti hanno origini chimiche o
fisico-chimiche. La cinetica di fermentazione può essere
migliorata con diversi metodi che influenzano questi
fenomeni. L'azione precoce sembra aumentare la loro
efficacia; i lieviti nella loro fase di crescita e in un terreno
contenente poco etanolo sono più ricettivi agli stimoli
esterni. L'enologo dovrebbe anticipare le difficoltà di
fermentazione: le operazioni possibili sono molto meno
efficaci dopo che si sono verificate.
Inoltre, alcune operazioni, volte ad attivare la
fermentazione, influenzano la crescita del lievito e
migliorano la cinetica di fermentazione all'inizio ma non
sempre influiscono sulla sopravvivenza del lievito o sulle
fasi finali della fermentazione, almeno nei mosti con alte
concentrazioni di zuccheri (i più difficili da fermentare).
L'aumento della temperatura del mosto è un classico
esempio di un'operazione che aumenta la velocità di
fermentazione all'inizio ma porta a fermentazioni bloccate
(vedi Sezione 3.7.1, Figura 3.8). In altri casi, l'attivazione
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
della fermentazione influenza sia la crescita che la
sopravvivenza; la durata della fermentazione è
prolungata. La figura 3.3 fornisce un esempio:
l'attivazione (curva II) ha apparentemente migliorato la
cinetica di fermentazione dei mosti con livelli di
zucchero relativamente bassi rispetto al controllo
(curva I). Tuttavia, in un mosto ad alto contenuto di
zucchero, un attivatore che non ha migliorato la
sopravvivenza non è stato in grado di prevenire
l'arresto della fermentazione. Nel caso della curva III,
dove sono stati aggiunti sia fattori di sopravvivenza
che fattori di crescita, la fermentazione si è conclusa
senza intoppi, anche in un mosto ad alto contenuto di
zucchero.
3.4 REQUISITI NUTRIZIONALI
3.4.1 Approvvigionamento di carbonio
Nel mosto d'uva i lieviti trovano glucosio e fruttosio,
fonti di carbonio ed energia. La concentrazione totale
di zuccheri nel mosto è compresa tra 170 e 220 g / l,
corrispondenti a vini tra il 10 e il 13% vol. Di etanolo
dopo la fermentazione. La quantità di zucchero
disciolto può essere anche maggiore nell'uva per la
produzione di vini dolci, fino a 350 g / l nei mosti di
Sauternes. La concentrazione di zucchero del mosto
può influenzare la selezione dei ceppi di lievito,
garantendo la fermentazione (Fleet, 1992). La
fermentazione è lenta in un mezzo contenente pochi
grammi di zucchero per litro. La sua velocità aumenta
nei mosti che hanno 15-20 g / le rimane stabile fino a
circa 200 g / l. Al di sopra di questa concentrazione, la
fermentazione rallenta. La produzione di alcol, infatti,
può essere inferiore in un mosto contenente 300 g / l
rispetto a un altro contenente solo 200 g / l. Da 600 a
650 g di zucchero per litro, il mosto d'uva concentrato
diventa praticamente non fermentabile. La presenza
di zucchero, oltre che di alcol, contribuisce alla
stabilità del vino liquoroso.
Pertanto, una quantità elevata di zucchero ostacola la
crescita del lievito e riduce la popolazione massima. Di
conseguenza, la fermentazione rallenta anche prima
della produzione di una quantità significativa di
etanolo, che normalmente ha un effetto antisettico
(Sezione 3.6.1).
Allo stesso modo la fermentazione rallenta quando
l'elevata concentrazione zuccherina è dovuta
all'aggiunta di zucchero (zuccheraggio) o mosto
concentrato, oppure all'eliminazione dell'acqua per
osmosi inversa o evaporazione sotto vuoto (Sezione
15.5.1). L'effetto è esacerbato se si aggiunge zucchero
quando la fermentazione è già a buon punto e l'alcol ha
iniziato ad inibire lo sviluppo dei lieviti, anche se
intervenendo in questa fase si ha il vantaggio di evitare il
surriscaldamento del mosto. Quando si aggiunge lo
zucchero si consiglia di attendere il secondo giorno dopo
l'inizio della fermentazione, cioè la fine della fase di
crescita dei lieviti. In queste condizioni, la popolazione
raggiunge un valore più alto, perché cresce in un mezzo
con una concentrazione di zucchero relativamente bassa.
Successivamente, l'aggiunta di zucchero in un mezzo
contenente lievito in piena attività aumenta la capacità
fermentativa delle cellule e quindi la trasformazione dello
zucchero. Ovviamente è necessario un sistema di
refrigerazione per compensare il corrispondente
aumento di temperatura del mosto.
3.4.2 Fornitura di azoto
Henschke e Jiranek (1992) hanno analizzato in dettaglio
molti lavori teorici su questo argomento. La ricerca per
questi diversi lavori è stata condotta in un'ampia gamma
di condizioni e quindi i risultati non erano sempre
applicabili alle condizioni di vinificazione analizzate da
Ribe ́reau-Gayon et al. (1975a).
Il mosto d'uva contiene una concentrazione relativamente
alta di composti azotati (da 0,1 a 1 g di azoto solubile per
litro), sebbene rappresenti solo circa un quarto dell'azoto
totale delle bacche. Questi costituenti includono il catione
ammonio (3–10% dell'azoto totale), amminoacidi (25–
30%), polipeptidi (25–40%) e proteine (5–10%). La
concentrazione di azoto dell'uva dipende dalla varietà,
dalle radici, dall'ambiente e dalle condizioni di crescita, in
particolare dalla concimazione azotata. Diminuisce
quando si sviluppa marciume sull'uva o le viti soffrono di
siccità. Lo stress idrico, tuttavia, è generalmente un
fattore positivo nella produzione di vino rosso di qualità.
Piantare colture di copertura nel vigneto per controllare i
raccolti riduce anche i livelli di azoto dell'uva. Gli effetti
sono variabili, ad es. 118 mg / l di azoto nelle uve della
parcella di controllo e 46 mg / l di azoto per
l'appezzamento con coltura di copertura in un caso e 354
e 210 mg / l di azoto, rispettivamente, in un altro. Il
contenuto di azoto delle uve troppo mature può
aumentare a causa della concentrazione del succo.
Nella vinificazione in bianco secco, i metodi di estrazione
del succo influenzano il composto del gruppo amminico e
la concentrazione proteica nel mosto. La lenta pressatura
e la macerazione pellicolare, che favoriscono l'estrazione
dei costituenti della buccia, ne aumentano la
concentrazione (Dubourdieu et al., 1986).
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
I lieviti trovano nel mosto d'uva l'apporto di azoto
necessario alla loro crescita. Il catione ammonio è
facilmente assimilabile e può soddisfare il fabbisogno
di azoto del lievito, in particolare, per la sintesi degli
amminoacidi. I polipeptidi e le proteine non
partecipano alla crescita di S. cerevisiae, poiché
questo lievito non può idrolizzare queste sostanze. S.
cerevisiae non ha bisogno di aminoacidi come parte
del suo apporto di azoto, poiché è in grado di
sintetizzarli individualmente, ma la loro aggiunta
stimola i lieviti più dell'azoto ammoniacale.
Una miscela di aminoacidi e azoto ammoniacale è uno
stimolante ancora più efficace. I lieviti utilizzano gli
amminoacidi secondo tre meccanismi (Henschke e
Jiranek, 1992):
1. Integrazione diretta senza trasformazione in
proteine.
2. Decomposizione del gruppo amminico, che viene
utilizzato per la biosintesi di diversi costituenti
amminici. La corrispondente molecola di carbonio
viene escreta. Tale reazione è una delle vie di
maggiore formazione di alcol presenti nel vino:
R – CHNH2 – COOH + H2O → R – CH2OH + CO2 +
NH3
I lieviti sono probabilmente in grado di ottenere azoto
ammoniacale dagli amminoacidi attraverso altre vie.
3. La molecola dell'amminoacido può essere utilizzata
come fonte di carbonio nelle reazioni metaboliche. Il
lievito recupera simultaneamente il corrispondente
azoto ammoniacale.
L'assimilazione di diversi amminoacidi de-
pende sul funzionamento dei sistemi di trasporto e
sulla regolazione dei sistemi metabolici. Diversi studi
sono stati pubblicati su questo argomento (Castor
1953; Ribe ́reau-Gayon e Peynaud, 1966). A causa
della diversità della composizione del mosto, i risultati
non sono identici. L'assimilazione degli amminoacidi
da parte dei lieviti non sempre migliora la crescita. Gli
amminoacidi più facilmente assimilabili non sono
necessariamente i più significativi nella composizione
cellulare, ma sono invece i più facilmente trasformabili
dai lieviti. I lieviti hanno difficoltà ad assimilare
l'arginina quando è l'unico amminoacido
nell'ambiente, ma l'arginina è facilmente assimilabile
quando fornita in una miscela. I lieviti non lo usano
quando è presente l'ammonio. Per evitare la difficoltà
di definire con precisione la composizione del mosto
d'uva, Henschke e Jiranek (1992) hanno condotto i
loro esperimenti
utilizzando un ben noto modello medio. I loro risultati
hanno fornito ai ricercatori una nuova comprensione di
questo argomento.Sebbene complesse miscele di sali di
ammonio e amminoacidi siano più efficaci per
promuovere la crescita del lievito e la velocità di
fermentazione, i sali di ammonio sono usati quasi
esclusivamente per aumentare
concentrazioni di azoto nel mosto, per ragioni di
semplicità. Risultati positivi sono stati ottenuti in test di
laboratorio ma la loro efficacia è meno spettacolare in
condizioni pratiche. Inoltre, l'aggiunta di azoto assimilabile
non è sempre sufficiente per risolvere le difficili fasi finali
della fermentazione, sebbene acceleri la fermentazione
nelle fasi iniziali.
Per molto tempo, il fosfato biammonico è stata la forma
esclusiva di sali di ammonio utilizzata. Si riteneva che
anche lo ione fosfato coinvolto nelle reazioni metaboliche
glucidiche favorisse la fermentazione. In realtà il mosto è
sufficientemente ricco di ione fosfato (partecipante per
inciso nella cassa di ferro dei vini bianchi) e per questo è
preferibile utilizzare solfato di diammonio. La normativa
UE autorizza l'aggiunta di 30 g di uno di questi due sali
per ettolitro, corrispondenti a 63 mg / l di azoto. Negli
USA il limite è fissato a 95 g di fosfato di diammonio per
ettolitro. In Australia la sua aggiunta non deve portare a
una concentrazione di fosfato inorganico superiore a 40 g
/ hl. La dose standard è compresa tra 10 e 20 g / hl.
(Notare che 100 g di fosfato o solfato di diammonio
contengono circa 27 mg di ammonio e 73 mg di ioni
fosfato o solfato). L'aggiunta di questa forma di azoto al
mosto ne aumenta l'acidità, grazie al contributo
dell'anione. Per 10 g di sale biammonico per ettolitro
l'acidità del mosto può aumentare di 0,35 g / l (in H2 SO4)
o 0,52 g / l (in acido tartarico).
La concentrazione iniziale di cationi ammonio e
amminoacidi nel mosto è uno degli elementi più
importanti nel determinare la necessità di integratori.
Quando la concentrazione di NH4 + è inferiore a 25 mg /
l, è necessaria l'aggiunta di azoto. È utile che le
concentrazioni siano comprese tra 25 e 50 mg / l. Al di
sopra di questa concentrazione, l'integrazione non ha
effetti negativi. Tuttavia, è improbabile che un'aggiunta
attivi la fermentazione. Se i valori sono espressi in
ammino azoto libero (FAN), rilevabile dalla ninidrina, sono
necessari tra 70 e 140 mg / l per avere una fermentazione
completa dei mosti contenenti tra 160 e 250 g di
zucchero per litro (Henschke e Jiranek, 1992) . Bely et al.
(1990) hanno stabilito che l'aggiunta di azoto era efficace
se il contenuto di azoto disponibile (NH4 + + amminoacidi,
eccetto prolina)
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
nel mosto era inferiore a 130 mg / l, ma non era
necessario e poteva anche essere dannoso a
concentrazioni iniziali di 200-350 mg / l.
L'indice di formolo di Aerny (1996) fornisce una
semplice stima del contenuto di amminoacidi liberi e
cationi di ammonio. Un indice di formolo di 1
corrisponde a 14 mg di azoto amminico per litro.
Secondo Lorenzini (1996), l'aggiunta di azoto nei mosti
varietali svizzeri è indispensabile se l'indice è inferiore
a 10, ed è consigliata se l'indice è compreso tra 10 e
14. Il metodo del formolo fornisce una rapida e
semplice valutazione delle disponibilità carenza di
azoto mediante dosaggio di NH4 + e amminoacidi
liberi, ad eccezione della prolina. Dovrebbe essere più
ampiamente utilizzato per monitorare la maturità e la
fermentazione. Tuttavia, il fabbisogno di azoto di S.
cerevisiae varia da un ceppo all'altro. Julien et al.
(2000) hanno recentemente proposto un test per
confrontare il fabbisogno di azoto del lievito, stimato
durante la fase stazionaria della fermentazione
alcolica. Questo test misura la quantità di azoto
richiesta per mantenere una velocità di fermentazione
costante durante questa fase stazionaria. Il
fabbisogno di azoto variava di un fattore 2 tra i 26
ceppi di lievito enologico testati. Una valutazione del
fabbisogno di azoto è certamente un criterio
importante nella selezione dei ceppi di lievito da
utilizzare in mosti carenti di azoto.Ad esempio, in uno
studio sui mosti dei vigneti di Bordeaux nelle annate
1996-2000 (tabella 3.2), Masneuf et al. (2000) hanno
trovato livelli di azoto di 36-270 mg / l nei mosti
bianchi, con carenze nel 22% dei campioni
(concentrazioni di azoto inferiori a 140 mg / l). Nei
rossi, i livelli variavano da 46 a 354 mg / l, con carenze
nel 49%; in rose, i livelli erano compresi tra 42 e 294
mg / l, con carenze del 60%, mentre l'89% dei mosti
botritizzati era carente di azoto.
Chone ́ (2000) ha analizzato i mosti di Cabernet
Sauvignon nel 1997 e ha riscontrato significative
variazioni nei livelli di azoto, da 95 a 218 mg / l.
Infine, diverse concentrazioni di azoto sono state
trovate anche in singoli appezzamenti all'interno dello
stesso vigneto, ad es. 25 - 45 mg / l nelle viti con
minore crescita vegetativa e 152 - 294 mg / l nelle uve
provenienti da viti più vigorose.
Tutti questi risultati analitici mostrano l'entità e la
frequenza delle carenze di azoto, che sono molto più
comuni di quanto generalmente si pensasse in passato,
forse a causa di cambiamenti nelle tecniche di gestione
del vigneto. In precedenza era generalmente accettato
che le concentrazioni di azoto nei mosti dei vigneti
settentrionali dell'emisfero settentrionale (clima
temperato, oceanico) fossero sufficientemente
elevate.L'aggiunta di azoto a mosti contenenti livelli
insufficienti è estremamente utile per ottenere una buona
cinetica di fermentazione. In alcuni casi di grave carenza
di azoto, può anche essere opportuno aggiungere fino a
40 g / l di solfato di ammonio, che richiederebbe una
modifica alla normativa UE, in quanto il limite attuale è di
30 g / l, corrispondenti a 63 mg / l di azoto. Alcune
osservazioni suggeriscono che un aumento eccessivo del
contenuto di azoto può avere un effetto negativo sulla
cinetica di fermentazione, quindi è consigliabile modulare
le aggiunte di azoto in base al livello naturale nel mosto e
assicurarsi che il totale non superi mai i 200 mg / l.
L'aggiunta di quantità eccessive di azoto può anche
causare la presenza di azoto residuo non assimilato alla
fine della fermentazione. Sebbene non ci siano dati
specifici su questo problema, l'azoto residuo può avere
un impatto negativo sulla stabilità microbiologica di un
vino.
Un eccesso di azoto ammoniacale può anche portare a
una modificazione dei caratteri aromatici del vino. Poiché
il lievito non ha più bisogno di deaminare gli amminoacidi,
forma prodotti meno secondari (alcoli superiori e loro
esteri). Ciò modifica l'aroma del vino, in particolare i vini
bianchi. Infine, l'apporto di azoto influisce sulla
produzione di carbammato di etile. Questo costituente
indesiderabile ha proprietà cancerogene ed è controllato
dalla legislazione. La concentrazione di zucchero del
mosto influisce anche sull'impatto dell'apporto di azoto
sulla cinetica di fermentazione, in particolare sul
completamento con successo della fermentazione. Per
concentrazioni moderate di zuccheri (inferiori a 200 g / l)
l'aggiunta di azoto aumenta la biomassa di lievito
formatasi e di conseguenza la velocità di fermentazione;
la fermentazione si completa con qualche giorno di
anticipo. Per alte concentrazioni di zucchero, la
fermentazione è accelerata all'inizio rispetto al campione
di controllo ma, man mano che la fermentazione
prosegue, il divario tra il campione di controllo e il
campione integrato diminuisce. Infine, le loro
fermentazioni si arrestano spontaneamente con quantità
simili di zucchero residuo rimanenti. La curva II nella
Figura 3.3 mostra l'effetto dell'azoto supplementare (o
altro effetto attivatore) su un mosto con un'elevata
concentrazione zuccherina, avente una normale
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
concentrazione di azoto. Se invece la lentezza della
fermentazione è dovuta ad una carenza di azoto,
l'aggiunta di sali di ammonio la stimola
manifestamente (Curva III, Figura 3.3). Talvolta si
possono evitare fermentazioni bloccate in questo
modo.
Altri fattori influenzano l'assimilazione dell'azoto
durante la fermentazione. I lieviti hanno capacità
specifiche del ceppo. Henschke e Jiranek (1992) hanno
riferito che diversi ceppi di S. cerevisiae che
fermentano il mosto d'uva hanno assimilato quantità
di azoto variabili da 329 a 451 mg / la 15,5 ° C e da
392 a 473 mg / la 20 ° C. Queste ultime cifre mostrano
anche, tra le altre cose, che la temperatura aumenta
l'assimilazione dell'azoto. Julien et al. (2000) hanno
confrontato il fabbisogno di azoto e ossigeno di diversi
ceppi di lievito utilizzati nella vinificazione.
L'ossigeno, tuttavia, ha il maggior effetto
sull'assimilazione dell'azoto. È noto da tempo che i
lieviti utilizzano molto più azoto in presenza di
ossigeno (Ribe ́reau-Gayon et al.,
1975a). È stato osservato che i lieviti fermentati in
completa assenza di ossigeno assimilano 200 mg di
azoto per litro. Quando si sviluppano in presenza di
ossigeno, la loro assimilazione aumenta fino a 300 mg
/ l. Nell'aerobiosi possono assimilare fino a 735 mg / l
senza un aumento proporzionale della moltiplicazione
cellulare.
L'impatto dell'ossigeno sulla cinetica di fermentazione,
indipendentemente da qualsiasi aggiunta di NH4 +, è
apparentemente complesso e dipende da diversi
fattori (Sablayrolles et al., 1996a e 1996b), nonché dal
tipo di mosto (contenuto di zucchero e possibile nitro
- deficit genetico). È accettato che l'aggiunta di azoto
accelera la fermentazione, con conseguente
completamento più rapido. È però più difficile
individuare le condizioni in cui l'aggiunta di azoto può
prolungare la conversione degli zuccheri da parte dei
lieviti e impedire che la fermentazione si blocchi,
almeno nei mosti ricchi di zucchero.
In un esperimento condotto da Roze`s et al. (1988),
utilizzando un mosto contenente 222 g / l di zucchero
con un normale contenuto di azoto (35 mg / l NH4 +
corrispondenti a circa 200 mg / l di azoto), la
fermentazione si è interrotta prematuramente in
assenza di aria. L'aggiunta di NH4 + (0,15 o 0,50 g / l
(NH4) 2 SO4) ha inizialmente accelerato la
fermentazione ma non ha aumentato la quantità di
zucchero fermentato. Con l'aerazione il 3 ° giorno, la
fermentazione è stata più veloce e tutto lo zucchero è
stato fermentato. L'aggiunta di NH4 + non ha migliorato la
cinetica di fermentazione, ma, al contrario, dopo
un'iniziale accelerazione, l'attività del lievito si è interrotta
quando 9 g / l di zucchero erano ancora non fermentati.
Naturalmente questi risultati sperimentali devono essere
interpretati alla luce delle condizioni specifiche (tenore di
zucchero e azoto del mosto). I risultati non sarebbero
stati necessariamente gli stessi in condizioni diverse,
soprattutto se ci fosse stata una significativa carenza di
azoto nel mosto. In ogni caso, questo esperimento
mostra abbastanza chiaramente che l'aggiunta di azoto
non elimina necessariamente i problemi con la fine della
fermentazione. Sono necessari ulteriori esperimenti
utilizzando mosto carente di azoto per identificare un
possibile miglioramento.
La tempistica dell'aggiunta dei sali di ammonio sembra
essere importante. Ribe ́ reau-Gayon et al. (1975a) ne
aveva suggerito l'aggiunta nel mosto prima dell'inizio della
fermentazione. I lieviti reagiscono meglio agli stimoli
durante la fase di crescita in un terreno contenente poco
etanolo. Hanno assistito a un'assimilazione del
supplemento di azoto ammoniacale (100 mg / l) variabile
tra il 100 e il 50% quando l'aggiunta è stata effettuata
prima dell'inizio della fermentazione o il quarto giorno.
Una migliore assimilazione dell'azoto non ha
necessariamente aumentato il potenziale di
fermentazione dei lieviti. Questo spiega perché l'aggiunta
di azoto non ha un impatto significativo sull'accelerazione
di una fase finale lenta della fermentazione ed è ancora
meno efficace nel riavviare una fermentazione bloccata.
Sablayrolles et al. (1996a e 1996b) hanno riportato
risultati leggermente diversi. Secondo questi autori, gli
integratori di azoto erano più efficaci a metà
fermentazione, insieme all'aerazione. Questa operazione
combinata ha avuto un impatto maggiore sulla cinetica di
fermentazione rispetto alla sola aerazione e ha fornito
una soluzione ottimale per evitare l'arresto prematuro
della fermentazione (Sablayrolles e Blateyron, 2001).
In conclusione, l'integrazione di mosti con livelli di azoto
naturalmente bassi (Ntotal 140 mg / l) con sali di azoto
può migliorare la cinetica di fermentazione, con effetti
variabili sulla crescita dei lieviti e sulla conversione degli
zuccheri. Per la massima efficacia, l'azoto totale dopo
l'integrazione non deve superare i 200 mg / l. Alcuni
risultati sperimentali indicano che la fermentazione può
rallentare in seguito all'aggiunta di quantità eccessive di
azoto. Se il mosto aveva
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
già un contenuto di azoto sufficientemente elevato,
un'ulteriore integrazione avrebbe probabilmente
provocato una prima accelerazione della
fermentazione, ma l'effetto svanì gradualmente. Non
ci si può aspettare che l'aggiunta di azoto rimedi ai
problemi nelle fasi finali della fermentazione (mosti ad
alto contenuto di zucchero o condizioni strettamente
anaerobiche).
È tuttavia vero che le carenze di azoto (vecchie viti o
vigneti con colture di copertura) non sono state
sufficientemente prese in considerazione in passato, e
che il completamento della fermentazione è facilitato
in questi casi dall'aggiunta di sali di ammonio. L'azoto
totale nel mosto deve essere naturalmente analizzato
in vasca prima dell'inizio della fermentazione, insieme
ai livelli di zucchero e acidità.
L'aggiunta di ossigeno all'inizio della fermentazione
(Sezione 3.7.2) quando la popolazione di lieviti è in
fase di crescita è ancora il modo più efficace per
accelerare la fermentazione e prevenire arresti
prematuri. Le opinioni divergono sul momento
corretto per aggiungere i sali di ammonio, variando
dall'inizio della fermentazione a metà del processo. In
ogni caso, gli integratori di azoto sono più efficaci
nell'accelerare la fermentazione che nell'impedire che
si blocchi con lo zucchero residuo indesiderato.
3.4.3 Requisiti minerali
I lieviti coltivati da Pasteur nel seguente terreno hanno
proliferato bene: acqua, 1000 ml; zucchero, 100 g;
tartrato di ammonio, 1 g; ceneri di 10 g di lievito. Le
ceneri di lievito forniscono al lievito tutti i minerali
necessari. Il lievito secco contiene il 5-10% di sostanze
minerali, la cui composizione media (in percentuale in
peso di ceneri) è la seguente:
K2O 23–48
Na2O 0,06 - 2,2
CaO 1,0 - 4,5
MgO 3,7 - 8,5
Fe2O3 0,06 - 7,3
P2O5 45–59
SO3 0,4 - 6,3
SiO2 0 - 1,8
Cl. 0,03 - 1,0
Altri minerali non elencati sopra sono presenti in
tracce: Al, Br, Cr, Cu, Pb, Mn, Ag, Sr, Ti, Sn, Zn, ecc.
Questi sono chiamati oligoelementi. Non tutti sono
indispensabili
ma alcuni sono costituenti enzimatici essenziali.
È nota la funzione precisa di pochi minerali. Il mosto d'uva
contiene, sia qualitativamente che quantitativamente, un
apporto minerale sufficiente a garantire lo sviluppo dei
lieviti.
3.5 ATTIVATORI DELLA FERMENTAZIONE
3.5.1 Fattori di crescita
I fattori di crescita influenzano la moltiplicazione e l'attività
cellulare, anche in piccole concentrazioni. Sono
indispensabili ai microrganismi e una carenza di queste
sostanze disturba il metabolismo. I microrganismi si
comportano in modo diverso in relazione ai fattori di
crescita. Alcuni possono sintetizzarli totalmente o
parzialmente; altri non possono e devono trovarli nel loro
ambiente.
Le sostanze che sono fattori di crescita per i
microrganismi sono anche vitamine necessarie per gli
organismi superiori (Figura 3.4). Sono componenti
essenziali dei coenzimi e sono coinvolti nelle reazioni
metaboliche. Il mosto d'uva ha un ampio apporto di
fattori di crescita (Tabella 3.3) ma la fermentazione
alcolica altera la sua composizione vitaminica. Ad
esempio, la tiamina scompare quasi completamente: i
lieviti sono in grado di consumare quantità maggiori di
tiamina (600-800 μg / l) rispetto al
deve contenere;ma i lieviti formano la riboflavina. La
concentrazione di nicotinamide rimane costante nei vini
rossi e nei mosti, ma solo il 60% nei vini bianchi. Acido
panotenico, piridossina e biotina vengono utilizzati dai
lieviti e poi rilasciati; le loro concentrazioni sono
pressoché identiche nei mosti e nei vini. Il mesoinositolo è
praticamente intatto.
Sebbene i mosti contengano una quantità sufficiente di
fattori di crescita per assicurare lo sviluppo dei lieviti e la
fermentazione alcolica, le concentrazioni naturali non
corrispondono necessariamente a concentrazioni
ottimali. Per questo motivo si consiglia di integrare il
mosto con determinati fattori di crescita.
Una carenza di acido pantotenico provoca l'accumulo di
acido acetico nel lievito ma non è stato dimostrato che
l'aggiunta (non autorizzata) di acido pantotenico a un
mosto in fermentazione abbassi l'acidità volatile del vino
proveniente dal lievito. La produzione da parte dei lieviti
di livelli anormalmente elevati di acidità volatile è
probabilmente dovuta alle carenze del mosto in alcuni
lipidi. Queste carenze sono molto probabilmente legate a
carenze di acido pantotenico, che è coinvolto nella
formazione dell'acetil coenzima A, responsabile della
sintesi degli acidi grassi e dei lipidi.
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
L'integrazione di biotina e soprattutto tiamina ha
migliorato la cinetica di fermentazione del mosto in
numerosi esperimenti. Un'aggiunta di 0,5 mg di
tiamina per litro può aumentare la popolazione vitale
del 30%; anche la fermentazione dello zucchero è più
rapida. Questi risultati, sebbene osservati
regolarmente in esperimenti di laboratorio, non sono
sempre ottenuti in condizioni pratiche. La
concentrazione naturale di tiamina può essere o
meno un fattore limitante della cinetica di
fermentazione, a seconda della natura dell'uva e delle
condizioni di maturazione.
L'aggiunta di tiamina è legale in diversi paesi (UE, alla
dose di 50 mg / hl) ma è usata raramente per
accelerare la fermentazione in vinificazione. Riduce
efficacemente concentrazioni significative di acido
chetonico mediante decarbossilazione (acido piruvico
e α-chetoglutarico). Grandi quantità di questi acidi si
legano all'anidride solforosa nei vini dolci botritizzati
(Sezione 8.4.2).
3.5.2 Fattori di sopravvivenza
L'idea dei fattori di sopravvivenza deriva
dall'interpretazione della modalità di azione degli
steroli e di alcuni acidi grassi a catena lunga
sull'attività del lievito e sulla cinetica di fermentazione.
I primi lavori su questo argomento (Andreasen e Stier,
1953; Bre ́chot et al., 1971) sono stati analizzati da
Ribe ́reau-Gayon et al. (1975a). L'attività del fattore di
crescita dell'ergosterolo nell'anaerobiosi completa è
ottimale ad una concentrazione di 7 mg / l; viene
solubilizzato con Tween 80. Ad esempio, in un mosto
ad alta concentrazione zuccherina (260 g / l) S.
cerevisiae fermenta in completa anaerobiosi 175 g di
zucchero per litro in 10 giorni nel campione di
controllo e 258 g / l in presenza di 5 mg / l di
ergosterolo. Nell'aerobiosi, invece, si osserva una
leggera inibizione della fermentazione quando si
aggiunge l'ergosterolo. Gli autori hanno concluso che
questi steroli sono indispensabili per i lieviti in
completa anaerobiosi, perché non possono essere
sintetizzati in queste condizioni. Gli steroli sono
necessari per garantire la permeabilità della
membrana cellulare. In presenza di ossigeno, i lieviti
sono in grado di produrre steroli. Nell'anaerobiosi,
l'ergosterolo è in qualche modo un sostituto
dell'ossigeno per i lieviti.
Altri steroli e acidi grassi a catena lunga condividono la
maggior parte delle proprietà dell'ergosterolo. Alcuni
sono costituenti della fioritura dell'uva e della cera
cuticolare, come l'acido oleanolico, specialmente se
associati all'acido oleico (Figura 3.5). Questi componenti
spiegano i risultati di esperimenti passati, indicando
un'accelerazione della velocità di fermentazione del
mosto d'uva in completa anaerobiosi quando le bucce e i
semi dell'uva venivano aggiunti in sospensione.
Lavori successivi (Larue et al., 1980; Lafon-Lafourcade,
1983) hanno dimostrato che il meccanismo d'azione degli
steroli è in realtà più complesso. Questi autori hanno
confermato l'azione del fattore di crescita in una
fermentazione strettamente anaerobica: la popolazione
massima aumenta. Hanno anche assistito all'effetto
inibitorio degli steroli su una fermentazione con aera-
zione permanente. Nessuna di queste due condizioni
corrisponde esattamente alle condizioni di vinificazione.
In cantina le fermentazioni di grandi volumi sono
certamente anaerobiche, ma il mosto viene areato
durante l'estrazione e inoculato con un lievito madre
precoltivato in aerobiosi; i lieviti sono quindi ben attrezzati
negli steroli. Sia i lieviti secchi attivi commerciali che i lieviti
indigeni, che si sviluppano sulla superficie del materiale a
contatto con il raccolto, si sviluppano inizialmente in
aerobiosi. In queste condizioni, l'aggiunta di ergosterolo o
acido oleanolico non aumenta la popolazione massima.
Anche la velocità di fermentazione non viene influenzata
durante i primi 10 giorni. Tuttavia le cellule di lievito ben
attrezzate negli steroli mantengono la loro attività di
fermentazione per un tempo più lungo. Alla fine della
fermentazione, avranno degradato una maggiore quantità
di zucchero rispetto alle cellule non integrate (Tabella 3.4).
Per questa azione è stato proposto il termine "fattore di
sopravvivenza" che non corrisponde a un aumento della
crescita.
L'evoluzione delle popolazioni di lieviti durante la
fermentazione in presenza di gli steroli sono
rappresentati nella Figura 3.6; viene indicata anche
l'incidenza della temperatura.
La nozione di fattori di sopravvivenza completa la nozione
di fattori di crescita. Sono particolarmente interessanti in
caso di fermentazioni difficili, ad esempio mosti con
elevate concentrazioni zuccherine. Naturalmente,
l'aggiunta diretta di steroli ai serbatoi in fermentazione
non dovrebbe essere considerata. La vinificazione può,
tuttavia, essere orientata verso metodi che promuovono
la sintesi degli steroli. Va inoltre tenuta in considerazione
la loro esistenza nelle parti solide dell'uva: le uve rosse
pigiate fermentano meglio dei mosti di uve bianche a
causa del contatto con i solidi durante la fermentazione.
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
Inoltre, l'eliminazione degli steroli durante l'eccessiva
chiarifica del mosto di uve bianche può comportare
fermentazioni estremamente difficili (Sezione 3.7.3).
Questo concetto può anche spiegare esperimenti
passati che mostrano velocità di fermentazione
aumentate con l'aggiunta di bucce e semi d'uva
macinati.
3.5.3 Altri attivatori di fermentazione
Ribe ́reau-Gayon et al. (1975a) hanno esaminato altri
attivatori di fermentazione. Questi attivatori
generalmente aiutano il lievito a utilizzare meglio
l'azoto del mosto. Per inciso, lo stesso fenomeno si
osserva ogni volta che la fermentazione è accelerata
dalla presenza di aria o dall'aggiunta di nutrimenti
estratti di lievito o fattori di sopravvivenza (Tabella 3.5).
Gli estratti di lievito idrolizzati sono ricchi di azoto
assimilabile, fattori di sopravvivenza e sali minerali.
Sono stati spesso utilizzati (ad alte concentrazioni, fino
a 4 g / l) per accelerare la fermentazione nell'industria
alimentare. Alcuni possono trasmettere odori e sapori
estranei.
Tra le formule attivanti proposte (Ribe ́reau-Gayon et
al., 1975a), 200 mg / l della seguente miscela possono
facilitare la fermentazione in mosti con carenze di
vitamina e azoto: 100 g di diammonio solfato, 250 mg
di tiamina, 250 mg di pantotenato di calcio e 2 mg di
biotina.
Altri prodotti, estratti da funghi, sono anche attivatori
della fermentazione alcolica. Alcuni sono stati
commercializzati in passato. Uno dei più efficaci è
preparato da un terreno di coltura di Aspergillus niger.
Modifica la concentrazione dei prodotti secondari
favorendo la fermentazione gliceropirugica dello
zucchero. Dal micelio di Botrytis cinerea si ottiene
anche un attivatore di lievito. Questi attivatori non
sono autorizzati dalla legislazione viticola, almeno
nell'UE.
Nella vinificazione in bianco, i solidi sospesi attivano la
fermentazione (Sezione 3.7.3). Alcuni costituenti,
probabilmente steroli e acidi grassi, sono coinvolti in
questo fenomeno (Ribe ́reau-Gayon et al., 1975b).
Sebbene queste sostanze non siano molto solubili, i
lieviti sono in grado di utilizzarle per migliorare la
cinetica di fermentazione. Probabilmente agiscono in
combinazione con altri fattori, come l'ossigenazione e
possibilmente l'aggiunta di azoto. Le bucce di lievito
hanno un effetto simile indipendentemente dalla loro
capacità di eliminare l'inibizione (Sezione 3.6.2).
Come per l'integrazione dell'azoto o del fattore di crescita,
la fermentazione non viene attivata nella stessa misura in
cantina come in laboratorio. L'ossigenazione, la
preparazione del lievito e il mezzo di fermentazione
giocano un ruolo essenziale, oltre alle possibili carenze
nutrizionali del mosto.
3.5.4 Aggiunta di lievito madre
I produttori di vino sono sempre stati interessati a
migliorare la cinetica di fermentazione e la qualità del vino
inoculando con lievito madre attivato. Questa pratica è
certamente diventata più diffusa da quando è diventato
disponibile sul mercato il Lievito Attivato Secco (GIORNO)
relativamente economico e facile da usare. I GIORNI
vengono semplicemente riattivati in acqua o in una
miscela di uguali volumi di acqua e mosto ad una
temperatura di 35–40 ° C. Esistono circa un centinaio di
preparati commerciali di lievito sul mercato e ciascuno
dovrebbe essere preparato per l'uso secondo le istruzioni
del produttore. DAY permette inoltre di eliminare i lieviti
apiculati e selezionare ceppi con un alto tasso di
conversione zucchero-alcol. Insieme ad altre pratiche
vitivinicole, l'uso di DAY ha contribuito all'aumento
generale del contenuto medio di alcol nei vini e alla
corrispondente diminuzione della necessità di
zuccheraggio (aggiunta di zucchero) in alcune regioni.
Al contrario, in alcune situazioni, c'è interesse a utilizzare
ceppi di lievito con un tasso di conversione inferiore. Ciò
riguarda principalmente le zone calde dove può esserci
un alto livello di zucchero nella polpa dell'uva anche se gli
altri indicatori di maturazione (buccia) non hanno
raggiunto livelli ottimali. In questo caso è necessario
ritardare la vendemmia, con il rischio di ottenere mosti
molto zuccherini e difficili da fermentare per produrre vini
ad alta gradazione.
Un inoculo iniziale di 106 cellule / ml è generalmente
considerato necessario per ottenere una buona cinetica
di fermentazione. In considerazione degli attuali vincoli
alla vinificazione in bianco, questo livello iniziale viene
raggiunto raramente; quindi l'uso del lievito madre è
diventato praticamente obbligatorio. Nella vinificazione in
rosso può non esserci sufficiente inoculo nei primi tini
riempiti, ma le operazioni di movimentazione dell'uva e
del mosto in cantina provocano rapidamente la
proliferazione dei lieviti. L'utilizzo del GIORNO è
principalmente giustificato nelle prime tini. I tini successivi
non richiedono alcun starter, oppure DAY può essere
sostituito con il 2-5% di mosto da un tino dove la
fermentazione sta andando bene.
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
Tuttavia, da tempo c'è interesse per la possibilità di
migliorare la qualità di un vino selezionando il ceppo
appropriato per la fermentazione. È certamente vero
che la composizione delle uve e altri fattori naturali
(es. Terroir) sono gli elementi principali delle specificità
riconosciute come base della qualità, soprattutto nel
concetto di denominazione d'origine controˆle ́e. È
anche vero che si sono ottenuti risultati positivi,
soprattutto con i vini bianchi (Paragrafo 13.7). Sono
stati isolati diversi ceppi in grado di fermentare mosti
con bassa torbidità senza produrre un'eccessiva
acidità volatile. Sono stati inoltre identificati ceppi che
non producono vinilfenoli, con il loro odore chimico
sgradevole e altre caratteristiche indesiderabili, a
causa degli alti livelli di esteri di fermentazione. Questi
neutralizzano gli aromi varietali e possono essere
consigliati solo per i vini ottenuti da varietà non
aromatiche. È chiaro che utilizzare il lievito madre è un
buon modo per evitare questi tipi di difetti e, di
conseguenza, valorizzare al massimo la qualità
intrinseca dell'uva. Un altro esempio è lo sviluppo di
lieviti anaerobici suscettibili di produrre acetato di
etile non appena i tini vengono riempiti con uva o
mosto non solfitato. I rapporti in letteratura indicano
che è possibile evitare questi difetti utilizzando ceppi
di lieviti appropriati dopo che l'uva / mosto è stata
solfitata.
Oggi cresce l'interesse a selezionare ceppi di lievito in
grado di esaltare gli aromi varietali di vari vitigni
rilasciando quantità variabili di molecole odorifere dai
loro precursori inodori. La ricerca si è concentrata
sulle varietà di moscato e, soprattutto, sul Sauvignon
Blanc (paragrafo 13.7.2). Sebbene diversi ceppi di
lievito abbiano impatti variabili sugli aromi del vino, è
impossibile affermare che l'uso di lievito madre porta
allo sviluppo di un carattere uniforme che dipende
principalmente dalla composizione dell'uva in termini
di precursori aromatici.
Nel caso dei vini rossi, è stato segnalato che l'uso di
lieviti starter specifici ha un impatto sull'intensità del
colore e sul carattere aromatico del
95
alcuni vitigni. Questi effetti possono manifestarsi
durante la fermentazione stessa o derivare
dall'autolisi delle cellule di lievito morte, che giustifica
la pratica dell'invecchiamento del vino sulle fecce.
Queste osservazioni, tuttavia, richiedono un'indagine
teorica più dettagliata.
In genere si consiglia una dose di 106 cellule / ml di lievito
madre, che corrisponde a 10-20 g / hl di GIORNO. Poiché
la popolazione di lieviti in mosto fortemente fermentato è
dell'ordine di 108 cellule / ml, un inoculo dell'1% è
teoricamente sufficiente, ma il 2% è più comunemente
usato, o addirittura il 5%, per compensare eventuali
difficoltà. Esperimenti condotti con dosi più elevate di
lievito madre (20–25 g / hl di GIORNO) hanno indicato che
c'era un minor rischio che la fermentazione diventasse
lenta verso la fine, ma si potevano produrre aromi
sgradevoli. In ogni caso, i criteri di selezione più
importanti per gli antipasti di lievito enologico sono la
resistenza alla temperatura e la capacità di completare la
fermentazione in mosti ad alto contenuto di zucchero.
Queste proprietà sono caratteristiche dei lieviti
precedentemente noti come Saccharomyces bayanus
(Sezione 1.8.4).
Quando si aggiunge il lievito madre è importante evitare
l'antagonismo con altri ceppi naturalmente presenti nel
mosto. Le reazioni antagonistiche possono ridurre la
velocità di fermentazione e contribuire a causare l'arresto
della fermentazione (Sezione 3.8.1). Affinché l'inoculo con
DAY abbia successo, il lievito madre deve essere più
abbondante e più attivo dei lieviti indigeni, che devono
essere inibiti da una corretta igiene, temperature
sufficientemente basse e un uso appropriato di solfiti.
3.6 INIBIZIONE DELLA FERMENTAZIONE
Questa sezione riguarda il fenomeno dell'inibizione nella
fermentazione del mosto d'uva. Esiste un gran numero di
sostanze che possono ostacolare la moltiplicazione del
lievito: antisettici chimici, antibiotici e fungicidi (Ribe ́reau-
Gayon et al., 1975a). Gli inibitori utilizzati per la
conservazione dei vini (in particolare l'anidride solforosa)
sono descritti nei capitoli 8 e 9.
3.6.1 Inibizione da parte di etanolo
L'etanolo prodotto dalla fermentazione rallenta
l'assimilazione dell'azoto e paralizza il lievito.L'etanolo
agisce modificando i sistemi di trasporto attivo delle
cellule attraverso la membrana (Henschke e Jiranek,
1992). La quantità di alcol necessaria per bloccare la
fermentazione dipende da molti fattori, tra cui il ceppo di
lievito, la temperatura e l'aerazione.
La presenza di etanolo al momento dell'inoculazione
prolunga la fase latente e riduce la moltiplicazione
cellulare. Una temperatura elevata aumenta questa
azione inibitoria. Questo effetto dell'etanolo sulla crescita
del lievito e sulla
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
velocità di fermentazione si verifica anche a basse
concentrazioni dall'inizio della fermentazione. La
difficoltà di riavviare una fermentazione bloccata è
quindi comprensibile.
L'esperimento in Tabella 3.6 mostra l'effetto
dell'aggiunta di alcol al mosto d'uva. Rallenta l'inizio
della fermentazione e limita l'assimilazione dell'azoto e
la formazione di alcol. Eppure i lieviti possono
continuare la loro attività fino a una maggiore
gradazione alcolica, purché l'azione inibitoria
dell'etanolo non sia eccessiva. In questo esperimento,
la variazione della concentrazione di glicerolo
rappresenta una modifica metabolica significativa.
Come visto nella sezione 3.4.1, l'etanolo intensifica
l'effetto inibitorio di un'elevata concentrazione di
zucchero nel mosto.
3.6.2 Inibizione da parte dei sottoprodotti della
fermentazione: l'uso
di scorze di lievito
Osservazioni passate hanno indicato la possibilità
della formazione di sostanze diverse dall'etanolo,
durante la fermentazione, aventi un'azione inibitoria
sui lieviti. Geneix et al. (1983) hanno confermato
questa ipotesi (Figura 3.7). I terreni di fermentazione
sintetici contenenti concentrazioni variabili di etanolo
sono stati inoculati con S. cerevisiae. Una prima serie
era costituita da mezzi non fermentati e interamente
sintetici. Una seconda serie consisteva in terreni
prefermentati. L'etanolo della seconda serie proveniva
da una fermentazione interrotta da doppia
centrifugazione nelle fasi di crescita, stazionaria e
morte del ciclo di crescita della popolazione.
La composizione del mezzo non fermentato e
preferito era la seguente:
A: gradazione alcolica = 1,7% vol .; zucchero = 160 g / l
B: gradazione alcolica = 7,0% vol .; zucchero = 65 g / l
C: gradazione alcolica = 9,5% vol .; zucchero = 23 g / l
La figura 3.7 mostra che i lieviti crescono in tutti i
terreni non prefermentati. Nel mezzo pre-fermentato,
invece, la crescita è possibile solo nel mezzo A, che ha
una bassa concentrazione di alcol. Il declino della
popolazione è significativo nel mezzo C pre-
fermentato, che ha un contenuto alcolico elevato.
Secondo questo esperimento, la fermentazione crea
altre sostanze oltre all'etanolo che inibiscono la
crescita del lievito e la fermentazione alcolica. Un
esperimento
complementare ha indicato che queste sostanze vengono
eliminate dal carbone, confermando le osservazioni del
passato. Per una fermentazione bloccata, il carbone aiuta
a riavviare l'attività del lievito rimuovendo i prodotti del
metabolismo del lievito dal vino.
La ricerca sull'impatto di vari sottoprodotti della
fermentazione sul lievito ha dimostrato l'effetto inibitore
degli acidi grassi a catena corta C6, C8 e C10 presenti nel
vino a concentrazioni di pochi milligrammi per litro.
Influenzano la permeabilità della membrana cellulare e
ostacola gli scambi tra l'interno della cellula e il mezzo di
fermentazione. Quando la fermentazione si ferma, i
sistemi enzimatici del lievito funzionano ancora, ma gli
zuccheri non possono più penetrare nella cellula per
essere metabolizzati (Larue et al., 1982). Salmon et al.
(1993) hanno confermato che la perdita di attività di S.
cerevisiae in condizioni enologiche era collegata
all'inibizione del trasporto dello zucchero. La
fermentazione è inibita da questi acidi grassi saturi C6, C8
e C10 - acidi esanoico (caproico), ottanoico (caprilico) e
decanoico (caprico). Altri acidi grassi insaturi a catena
lunga (C18), invece, sono attivatori in determinate
condizioni: acido oleico, un doppio legame; e acido
linoleico, due doppi legami (Sezione 3.5.2). Il termine
"acido grasso" utilizzato in entrambi i casi può creare
confusione.
I fatti precedenti portano all'uso di scorze di lievito nella
vinificazione. Sono attualmente gli attivatori di
fermentazione più efficaci noti per la vinificazione (Lafon-
Lafourcade et al., 1984). Le bucce di lievito eliminano
l'inibizione della fermentazione fissando gli acidi grassi
tossici (Lafon-Lafourcade et al., 1984). In questo modo
viene ristabilita la permeabilità delle membrane cellulari.
Munoz e Ingledew (1989) hanno confermato l'effetto
tossico degli acidi grassi C6, C8 e C10 e l'attivazione della
fermentazione da parte di diverse varietà di scorze di
lievito. Secondo questi autori, oltre alle loro proprietà di
adsorbimento degli acidi grassi, le bucce di lievito
apportano al terreno steroli e acidi grassi insaturi a
catena lunga. Questi componenti sono considerati
"sostituti dell'ossigeno" o fattori di sopravvivenza (Sezione
3.5.2). Qualunque sia la loro modalità d'azione, le bucce di
lievito sono universalmente riconosciute come attivatori
della fermentazione. La tabella 3.7 fornisce un esempio
dell'attivazione della fermentazione di un mosto d'uva
contenente elevate concentrazioni di zucchero. I numeri
mostrano la superiorità delle scorze di lievito rispetto ai
sali di ammonio per l'attivazione della fermentazione.
Durante la fase finale della fermentazione, la popolazione
cellulare
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
vtotale non è aumentata di molto, ma la popolazione
di lievito vitale è chiaramente più significativa in
presenza di scorze di lievito. Questo effetto
caratteristico del fattore di sopravvivenza non esiste
quando vengono aggiunti solo sali di ammonio.
L'aggiunta di scorze di lievito il quinto giorno
successivo all'inizio della fermentazione, dopo la fase
di crescita, ha un effetto più pronunciato sulla
sopravvivenza della popolazione rispetto a
un'aggiunta prima della fermentazione.
Le bucce di lievito si sono dimostrate efficaci nei mosti
difficili da fermentare; ad esempio quelli contenenti
alte concentrazioni di zucchero o contenenti residui di
pesticidi. I lieviti sono anche più resistenti alla
temperatura in loro presenza (Tabella 3.8). Possono
essere utilizzati, anche se meno efficacemente, in caso
di arresto della fermentazione (sezione 3.8.3).
Le bucce di lievito devono essere perfettamente
purificate per evitare un impatto organolettico sui vini.
La preparazione industriale dell'estratto di lievito
produce odori o sapori pronunciati nel prodotto e
questi devono essere rimossi dalle buste prima
dell'uso nel vino. Inoltre, se le carene non sono
sufficientemente purificate, può verificarsi un
inacidimento (dovuto alla presenza di lipidi residui)
durante la conservazione in determinate condizioni.
Questa acidità porta ad uno sviluppo sfavorevole dei
caratteri organolettici del vino. Tali circostanze hanno
suscitato critiche eccessive riguardo all'uso di scorze
di lievito.
Il coinvolgimento delle bucce di lievito nei processi
fermentativi è accompagnato anche dalla variazione
della concentrazione dei prodotti secondari (alcoli
superiori, acidi grassi e loro esteri). Di conseguenza, gli
aromi e i gusti del vino possono essere modificati.
Tutte le operazioni che influenzano la cinetica di
fermentazione influenzano il vino - temperatura,
ossigenazione, aggiunta di sali di ammonio, ecc. - e le
scorze di lievito non hanno un impatto sulla
fermentazione più di questi altri fattori, e certamente
inferiore alla temperatura,
per esempio. In ogni caso, le scorze di lievito devono
essere utilizzate con prudenza per la fermentazione di
vini di struttura semplice, come alcuni vini bianchi
secchi. In questo caso, il loro effetto può essere più
significativo.
3.6.3 Inibizione di origini diverse
È noto che alcuni residui di spray per il trattamento
della vite (ad esempio Folpel) inibiscono la fermentazione.
I composti a base di zolfo e cloruro sono i più nocivi per i
lieviti. L'inoculo con lievito fresco una volta che il residuo
inibitore si è decomposto è generalmente sufficiente per
riattivare la fermentazione nel mosto (si veda
Hatzidimitriou et al., 1997). Tuttavia, alcune difficili fasi
finali della fermentazione possono essere attribuite alla
presenza di questi residui. Il tempo minimo tra l'ultima
applicazione di un prodotto e la data di raccolta indicata
dal produttore non è sempre sufficiente.
Elevate concentrazioni di tannini e sostanze colorate
presenti in alcune varietà di vini rossi possono ostacolare
l'attività dei lieviti. Si legano alla parete cellulare mediante
una sorta di processo di concia. L'effetto di queste
sostanze non è chiaro: alcune attivano la fermentazione,
mentre altre la inibiscono.
È noto che l'anidride carbonica prodotta dalla
fermentazione ha un effetto inibitorio. Ciò si verifica
durante le fermentazioni sotto pressione (vini spumanti).
Una leggera pressione interna nel serbatoio è sufficiente
per rallentare la fermentazione, e sopra i 7 bar la
fermentazione diventa impossibile. Nelle normali
condizioni di vinificazione l'anidride carbonica viene
liberata liberamente e non esercita inibizioni sulla
fermentazione.
La differenza di fermentabilità delle varie uve e mosti è
legata a molti fattori scarsamente controllati. Allo stesso
modo in cui devono esistere attivatori specifici, è stata
considerata la presenza di inibitori naturali nell'uva. La
loro interazione influenzerebbe la fermentabilità del
mosto.
Nello specifico, lo sviluppo preliminare di lieviti, batteri
lattici o Botrytis cinerea può ostacolare il processo di
fermentazione alcolica. In caso di difficoltà di
fermentazione alcolica, la crescita batterica e la
fermentazione malolattica aggravano queste difficoltà. Ne
risultano spesso fermentazioni bloccate (Sezioni 3.8.1;
6.4.1).
Tra queste cause di difficoltà fermentative, il
coinvolgimento della Botrytis cinerea è stato il più
studiato. Il mosto derivato da uve parassite (muffa nobile
o grigia) è più difficile da fermentare del mosto
proveniente da uve sane. Lavori passati, riassunti da Ribe
́reau-Gayon et al. (1975a), ha identificato una sostanza
con proprietà antibiotiche; gli autori l'hanno chiamata
botryticin. La solfatazione e il riscaldamento prolungato a
120 ° C distruggono questa sostanza. L'etanolo all'80%
può precipitarlo. Il lavoro successivo ha dimostrato che
questa sostanza fungistatica è un polisaccaride neutro
parzialmente o completamente a base di mannosio
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
(Ribe ́ reau- Gayon et al., 1979). Le proprietà
fitotossiche di tali sostanze sono note e questo
polisaccaride influenza la cinetica di fermentazione. È
anche la causa di alcune deviazioni metaboliche
indotte dalla Botrytis cinerea, in particolare un
aumento della produzione di glicerolo e acido acetico
(Sezione 2.3.4; Volume 2, Sezione 3.7.2).
3.7 FATTORI FISICO-CHIMICI CHE INFLUENZANO
LA CRESCITA DEL LIEVITO E LA CINETICA DELLA
FERMENTAZIONE
3.7.1 Effetto della temperatura
Fermentazione alcolica, rappresentata dalla seguente
equazione chimica:
C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2,
libera 40 kcal di energia libera per molecola. I lieviti
utilizzano parte di questa energia per garantire le loro
funzioni vitali, in particolare la loro crescita e
moltiplicazione, e per formare due molecole di ATP
da una molecola di zucchero. Queste molecole di ATP
hanno un alto potenziale energetico:
2ADP + 2H3PO4 −− → 2ATP + 2H2O
Occorrono 7,3 kcal di energia per formare una
molecola di ATP. La differenza (40 - 14,6 = 25,4 kcal) è
l'energia non utilizzata che viene dissipata sotto forma
di calore, provocando il riscaldamento dei serbatoi di
fermentazione.
Questa stima dell'energia non utilizzata è oggetto di
discussione. In situazioni in cui parte dell'ATP formato
non è necessaria al lievito, viene idrolizzato dagli
enzimi corrispondenti. Tuttavia, 25 kcal corrispondono
abbastanza bene alle misure termodinamiche del
passato del calore dissipato dalla fermentazione di
una molecola di zucchero.
La fermentazione di mosto contenente 180 g (una
molecola) di zucchero per litro libera quindi 25 kcal
sotto forma di calore. Questa liberazione di calore
potrebbe teoricamente aumentare la temperatura da
20 a 45 ° C. Un tale aumento di temperatura
ucciderebbe il lievito. Fortunatamente, questo
aumento è il caso ipotetico di una fermentazione
esplosiva istantanea o di una fermentazione in un
serbatoio completamente isolato. In realtà, la
fermentazione avviene in più giorni. Durante questo
tempo le calorie prodotte vengono dissipate da diversi
fenomeni: essendo trascinate con la grande quantità
di anidride carbonica rilasciata durante la
fermentazione; mediante raffreddamento derivante
dall'evaporazione di acqua e
alcool; e da scambi attraverso la parete del serbatoio.
L'aumento della temperatura nei fermentatori dipende da
diversi fattori.
1. La concentrazione di zucchero del mosto, che
determina la quantità di calorie liberate.
2. La temperatura iniziale del mosto.
3. La velocità di fermentazione, che dipende dalla
composizione del mosto (sostanze a base di azoto) e dalle
condizioni di inoculo del lievito. Operazioni come
l'aerazione, lo zuccheraggio e l'inoculazione
aumenteranno la velocità di fermentazione, limiteranno la
dispersione delle calorie e aumenteranno la temperatura
massima. Reciprocamente, non schiacciare la vendemmia
rossa in macerazione carbonica (Sezione 12.9.1)
rallenterà la cinetica di fermentazione e abbasserà la
temperatura massima.
4. Dimensioni del serbatoio. All'aumentare del volume, la
superficie delle pareti e la loro capacità di scambio
termico diminuiscono a parità di proporzioni.
5. Materiale del serbatoio. Il coefficiente di scambio
termico globale (K, espresso in cal / h / m2 per ogni grado
di differenza di temperatura) è compreso tra 0,7 e 0,78
per un muro di cemento di 10 cm di spessore, da 1,46 a
1,49 per un muro di legno di 5 cm e da 5,34 a 32,0 per
una parete in acciaio inossidabile da 3 mm. Il coefficiente
varia maggiormente nel caso dell'acciaio inossidabile. Un
serbatoio in acciaio inossidabile è sensibile alle condizioni
esterne (temperatura, aerazione) in cui è posto.
6. Aerazione e temperatura della cantina. La ventilazione
della cantina limita le temperature dei serbatoi di
fermentazione dissipando il calore.
La temperatura massima della vasca è relativa a tutti
di questi fattori da leggi complesse ed è difficile da
prevedere. A seconda delle circostanze, la temperatura
massima può essere compatibile con la vinificazione in
rosso. In questo caso, una temperatura massima
compresa tra 25 e 30 ° C garantisce un'estrazione
sufficiente dei composti fenolici dalle parti solide durante
la macerazione. In altri casi, la refrigerazione è necessaria
per evitare di superare il limite di temperatura massima.
La refrigerazione è sempre necessaria per i vini bianchi: la
loro fermentazione deve essere effettuata intorno ai 20 °
C per conservare i loro aromi.
Gli attuali metodi di refrigerazione includono la
circolazione di acqua fredda o altro fluido freddo
attraverso il doppio rivestimento di serbatoi metallici o
attraverso uno scambiatore di temperatura immerso nel
serbatoio. In
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
alcuni casi può essere sufficiente spruzzare l'esterno
di un serbatoio metallico. Il mosto può essere inviato
anche attraverso scambiatori tubolari raffreddati da
acqua circolante, essa stessa refrigerata da uno
scambiatore ad aria.
La temperatura ha un impatto sullo sviluppo del lievito
e sulla cinetica di fermentazione. Secondo Fleet e
Heard (1992), la temperatura può influenzare
l'ecologia dei lieviti indigeni. Gli autori suggeriscono
che ceppi diversi sono più o meno adatti a
temperature diverse, comprese tra 10 e 30 ° C. Più
precisamente, il tasso di crescita varia per ogni ceppo
in base alla temperatura, ad esempio
con Kloechera apiculata e S. cerevisiae. Le possibili
conseguenze enologiche di questo fenomeno
meritano ulteriori ricerche.
Numerosi fattori di sovrapposizione rendono difficile
anticipare l'impatto della temperatura sulla cinetica di
fermentazione. Ough (1964, 1966) ha sviluppato
equazioni per la stima dell'impatto della temperatura
sulla cinetica di fermentazione in funzione di
numerosi parametri. Gli enologi di Bordeaux hanno
dedicato molte ricerche a questo argomento,
riassunte da Ribe ́reau-Gayon et al. (1975a). La
temperatura influisce profondamente sull'intensità
respiratoria e di fermentazione del lievito (Tabella 3.9):
l'intensità di fermentazione raddoppia per ogni
aumento di temperatura di 10 ° C. È al massimo a 35 °
C e inizia a diminuire a 40 ° C. Questi numeri
mostrano l'importanza della temperatura di
fermentazione. La fermentazione dello zucchero è
due volte più veloce a 30 ° C rispetto a 20 ° C, e per
ogni aumento di temperatura di 1 ° C il lievito
trasforma il 10% in più di zucchero nello stesso tempo
trascorso. La temperatura ottimale di fermentazione
varia a seconda della specie di lievito.
La temperatura influenza la cinetica di fermentazione.
La resa alcolica è generalmente inferiore a
temperature elevate, nel qual caso parte dell'alcol può
essere trascinata con il rilascio intenso di anidride
carbonica. Inoltre, la maggior parte dei prodotti
secondari della fermentazione gliceropiruvica si
trovano in concentrazioni maggiori. Gli acidi grassi, gli
alcoli superiori ed i loro esteri sono i più colpiti: la loro
formazione è al massimo a circa 20 ° C per poi
diminuire progressivamente.
Le basse temperature di fermentazione sono giustificate
quando questi prodotti sono desiderati nella vinificazione
in bianco.
Oltre alla sua influenza sull'attività del lievito, la
temperatura influisce sulla velocità e sui limiti di
fermentazione. Tra 15 e 35 ° C, la durata della fase latente
e il ritardo prima dell'inizio della fermentazione si
accorciano all'aumentare della temperatura.
Contemporaneamente, aumenta il consumo di lievito di
azoto (sezione 3.4.2).
Ad esempio, un mosto d'uva con una concentrazione
zuccherina limitata (inferiore a 200 g / l) impiega diverse
settimane per fermentare a 10 ° C, 15 giorni a 20 ° C e da
3 a 4 giorni a 30 ° C. Per mosti con concentrazioni
zuccherine più elevate la fermentazione si limita
all'aumentare della temperatura; infatti, la fermentazione
può interrompersi, lasciando lo zucchero non fermentato.
La tabella 3.10 riguarda un mosto di Sauternes
contenente più di 300 g di zucchero per litro. Lo stesso
fenomeno si è verificato nell'esperimento di Mu? Ller-
Thurgau nel 1884 (citato in Ribe ́ reau-Gayon et al.,
1975a). Ha fermentato lo stesso mosto con
concentrazioni crescenti di zucchero (Tabella 3.11). La
concentrazione zuccherina iniziale del mosto e le
temperature eccessive limitano la produzione di etanolo.
Altri fattori, come la quantità di ossigeno presente,
possono limitare o arrestare la fermentazione a
concentrazioni alcoliche relativamente basse (11-12% vol.)
E temperature (inferiori a 30 ° C). Una temperatura
eccessivamente alta (25 - 30 ° C), durante la fase di
moltiplicazione dei lieviti, influisce sulla loro vitalità e
favorisce l'arresto delle fermentazioni. Anche l'impatto
della temperatura sulla cinetica di fermentazione varia da
un ceppo di lievito all'altro.
Questi fatti sono importanti per le pratiche di cantina e
mostrano la difficoltà di determinare un limite massimo di
temperatura accettabile.
L'impatto della temperatura sulla fermentazione è
illustrato nella Figura 3.8. Il tempo di latenza diminuisce e
la velocità di fermentazione iniziale aumenta con
l'aumentare della temperatura. Anche i rischi e la gravità
di una fermentazione bloccata aumentano con la
temperatura. Naturalmente, se la concentrazione iniziale
di zucchero fosse stata inferiore in questo esempio, la
fermentazione sarebbe stata completa a 35 ° C. D'altra
parte, una maggiore concentrazione di zuccheri avrebbe
comportato un arresto della fermentazione anche a 25 °
C. Ciò dimostra che la velocità di fermentazione aumenta
con l
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
'aumentare della temperatura, ma anche la
fermentazione è sempre più limitata.
Un brusco cambiamento di temperatura durante la
fermentazione può portare a shock termici. Questo
fenomeno è diverso dalla nozione di shock o stress
utilizzata in microbiologia (Sezione 6.2.5). In alcune
cantine, i serbatoi di fermentazione del vino bianco
sono situati all'aperto a causa dei limiti di spazio.
Questi vini, fermentando a temperature moderate (20
° C), hanno difficoltà a sopportare le brusche
variazioni di temperatura tra il giorno e la notte
quando arriva il freddo autunnale. La fermentazione
rallenta progressivamente e infine si ferma. Una
seconda inoculazione non è efficace. Se questi vini
vengono trasferiti in una vasca a temperatura
costante prima che la fermentazione sia
completamente interrotta e dopo un conseguente
inoculo, la fermentazione sarà completata. Test di
laboratorio confermano che un brusco cambiamento
di temperatura, in una direzione o nell'altra, influisce
sull'attività del lievito. Questo fenomeno merita uno
studio più approfondito.
I dati nella Tabella 3.12 sono presi da un esperimento
di laboratorio. A 12 ° C la fermentazione è lenta ma
completa. A 19 ° C la fermentazione è più rapida e
anche la trasformazione dello zucchero è completa.
Se la fermentazione inizia a 19 ° C e viene abbassata
bruscamente a 12 ° C, si arresta, lasciando lo
zucchero non degradato. Lo stesso vale per una
fermentazione la cui temperatura aumenta
bruscamente da 12 a 19 ° C.
Se durante la fase finale della fermentazione si verifica
uno shock termico (dopo la fermentazione di 120 g di
zucchero per litro, ad esempio), il suo effetto è meno
significativo.
Ricapitolando, un aumento della temperatura accelera
la fermentazione ma influisce negativamente anche
sul suo limite. Può verificarsi anche un blocco della
fermentazione se altri fattori limitanti aggiungono i
loro effetti (ricchezza di zuccheri, anaerobiosi). Per
questo motivo non esiste un limite di temperatura
fisso oltre il quale non è più possibile la
fermentazione. Nella vinificazione in rosso, la
temperatura di fermentazione non deve mai superare
i 30 ° C: al di sopra di questa temperatura i rischi sono
certi. Naturalmente, ciò non significa che una
fermentazione non possa essere completa a
temperature pari o superiori a 35 ° C.
Il lievito è particolarmente sensibile alla temperatura
all'inizio del suo sviluppo; è più resistente durante la fase
finale della fermentazione. Per questo motivo, nella
vinificazione in rosso, la fermentazione dovrebbe iniziare
a 18 - 20 ° C e aumentare progressivamente fino a 32 ° C
o anche un po 'più in alto. La temperatura finale più alta
favorisce i fenomeni di macerazione. Una temperatura
eccessivamente alta all'inizio della fermentazione (circa 30
° C) può comportare una difficile fase finale della
fermentazione.
3.7.2 Influenza dell'ossigeno - Effetto dell'aerazione
del mosto
I lieviti utilizzano l'energia derivata dalla degradazione
degli zuccheri. Questa degradazione viene effettuata sia
dalla via respiratoria che da quella fermentativa. Nel
mosto d'uva, a causa della repressione catabolica della
respirazione esercitata dal glucosio del mosto in S.
cerevisiae, la degradazione degli zuccheri avviene
esclusivamente per fermentazione alcolica.
La capacità respiratoria dei lieviti è messa a frutto in
enologia per la produzione di vini flor. In questo caso, i
lieviti ossidano l'etanolo in aldeide nei vini secchi. Durante
la vinificazione possono svilupparsi anche lieviti ossidativi:
ossidano l'etanolo in anidride carbonica e sono
considerati lieviti deterioranti.
Pasteur ha parlato della fermentazione del mosto come di
un tipo di "vita senza aria". È noto da tempo che lo
sviluppo e la fermentazione del lievito sono impossibili in
completa assenza di ossigeno (Ribe ́ reau-Gayon et al.,
1951). La completa assenza di ossigeno suppone la
fermentazione di un mosto privo di ossigeno in completa
anaerobiosi.
Il mosto dovrebbe inoltre essere inoculato da un lievito
madre coltivato in assenza di ossigeno. Le condizioni
sperimentali nell'anaerobiosi completa sono difficili da
mantenere. Per questo motivo, alcuni autori potrebbero
aver pensato che l'ossigeno non fosse assolutamente
necessario per la cinetica di fermentazione.
Al contrario, l'ossigeno ha un impatto considerevole sulla
cinetica di fermentazione del vino. L'aggiunta di ossigeno
è probabilmente il metodo più efficace a disposizione
dell'enologo per controllare la fermentazione del mosto.
Per questo motivo, i termini "anaerobiosi completa",
"semi-anaerobiosi" o "aerobiosi limitata" vengono talvolta
utilizzati per spiegare la quantità di ossigeno aggiunta
durante la fermentazione. Negli esperimenti di
laboratorio, i campioni vengono sigillati con un batuffolo
sterile che consente
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
l'introduzione controllata di ossigeno e garantisce uno
scambio in entrambe le direzioni tra l'ambiente
interno ed esterno. L'anaerobiosi completa si ottiene
otturando l'apertura dei campioni con un blocco di
fermentazione.
In cantina, serbatoi aperti che lasciano il vino a
contatto con l'aria consentono un'aerazione
permanente. Non sono raccomandati, a causa del
rischio di sviluppo batterico - sono preferibili serbatoi
chiusi ma una quantità controllata di ossigeno
dovrebbe essere aggiunta al vino in fermentazione in
questi serbatoi durante i rimontaggi, per esempio.
Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata nella
vinificazione in rosso da molti anni. Il mosto in
fermentazione è facilmente saturo di ossigeno (6 - 8
mg / l). Il rimontaggio, invece, è meno utilizzato nella
vinificazione in bianco per timori di ossidare il mosto e
modificare gli aromi. In realtà, questo timore non è
stato confermato nella pratica, poiché il lievito può
assorbire una grande quantità di ossigeno durante la
fermentazione. Gli aromi del mosto prima della
fermentazione e del vino bianco separato dalle fecce
dopo la fermentazione sono suscettibili
all'ossidazione, ma gli aromi del mosto durante la
fermentazione sono probabilmente meno influenzati
dall'aerazione.
L'aerazione accelera la fermentazione e di
conseguenza aumenta la richiesta di nutrienti
contenenti azoto. L'ossigeno favorisce la sintesi di
steroli e acidi grassi insaturi, migliorando la
permeabilità della membrana cellulare e di
conseguenza la penetrazione del glucide. L'aggiunta di
ossigeno ha un effetto simile all'aggiunta di steroli, che
sono considerati sostituti dell'ossigeno.
I dati nella Tabella 3.13, presi da un esperimento
condotto molti anni fa nel laboratorio di Ribe ́ reau-
Gayon (Ribe ́ reau-Gayon et al., 1951), mostrano gli
effetti dell'aerazione controllata sulla fermentazione
cinetica di un mosto di zucchero relativamente alto. In
completa anaerobiosi, la fermentazione si ferma il 14 °
giorno, lasciando 75 g di zucchero per litro. Il 21 °
giorno, la popolazione di lievito era 5 × 107 cellule /
ml. Nell'aerobiosi limitata, la fermentazione è
completa con una popolazione di lieviti doppia.
Inoltre, l'inizio della fermentazione e la sua velocità
iniziale sono maggiori in presenza di ossigeno.
Ovviamente, se la concentrazione iniziale di zucchero
fosse stata inferiore nell'esperimento nella Tabella
3.13, la fermentazione sarebbe stata completa in
entrambi i casi, sebbene più
lenta nell'anaerobiosi. Una concentrazione zuccherina più
elevata avrebbe portato ad un arresto della
fermentazione in entrambi i casi prima del completo
esaurimento dello zucchero.Nella vinificazione, l'aerazione
permanente è raramente possibile, ma le aerazioni
momentanee sono un sostituto adeguato. I dati nella
Tabella 3.14 sono anche presi da un esperimento
passato. Confermano la differenza di fermentabilità tra i
mosti in presenza e in assenza di ossigeno. L'effetto
dell'ossigeno sulla cinetica di fermentazione aumenta con
la quantità di ossigeno introdotto. La tempistica
dell'aggiunta di ossigeno sembra essere particolarmente
importante. L'accelerazione della fermentazione è più
significativa quando l'ossigeno viene aggiunto il secondo
giorno successivo all'inizio della fermentazione, durante la
fase di crescita della popolazione di lieviti. In questo caso,
la fermentazione è quasi altrettanto (se non altrettanto)
rapida di una fermentazione con limitata aerazione
permanente; la stessa quantità di zucchero viene anche
trasformata. Infatti, non è il mosto che deve essere
aerato, ma piuttosto i lieviti che fermentano il mosto,
soprattutto la popolazione in fase di crescita. Altri
esperimenti confermano l'uso di ossigeno da parte del
lievito principalmente durante le prime fasi della
fermentazione. Non beneficiano di un'aerazione quando
la fermentazione è in fase avanzata e la concentrazione di
alcol è eccessiva.
Queste osservazioni sono significative ai fini pratici e
dovrebbero essere prese in considerazione durante la
vinificazione, in particolare quella in rosso (Sezione
12.4.2). I rischi della vinificazione in serbatoi aperti, o
aerobiosi permanente, sono noti (Sezione 12.5.1).
L'anerobiosi in vasca è consigliata se si aggiunge ossigeno
al momento giusto. Occorre comunque prevenire
l'accelerazione della fermentazione indotta da una
momentanea aerazione. Questa accelerazione si traduce
in un riscaldamento più significativo del vino.
Gli esperimenti citati in questa sezione risalgono a Ribe
́reau-Gayon et al. (1951). Anche se non più citati in lavori
recenti, i risultati sono ancora validi (Fleet, 1992). In
particolare, Sablayrolles e Barre (1986) hanno mantenuto
gli stessi valori per il fabbisogno di ossigeno del lievito,
cioè circa 10 mg / l; hanno inoltre confermato la notevole
influenza dell'ossigeno e il momento della sua aggiunta
sulla cinetica di fermentazione. Altre ricerche hanno
dimostrato che l'aerazione, combinata con l'aggiunta di
azoto a metà fermentazione, è più efficace della sola
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
aerazione (Sablayrolles et al., 1996a e 1996b) (Sezione
3.4.2). Questo effetto è apparentemente più marcato
in alcuni terreni in determinate condizioni di
fermentazione.
3.7.3 Effetto della chiarificazione del mosto sulle
uve bianche
È noto da tempo che la chiarifica del mosto prima
dell'inizio della fermentazione influisce sulla qualità del
vino bianco (Sezione 13.5.1). I lieviti che fermentano
limpidi devono formare più alcoli superiori, acidi grassi
e corrispondenti esteri. Inoltre i solidi sospesi del
mosto possono conferire odori vegetali pesanti e
sgradevoli. Fondamentale quindi la svinatura del
mosto.
La chiarifica del mosto influisce anche sui fenomeni
fermentativi. Elimina parte dei lieviti selvatici, insieme
al naturale sedimento vegetale, ma l'inoculo
compensa questa perdita, ed è spesso consigliato
anche per compensare la piccola popolazione
presente al momento del riempimento della vasca. In
questo modo la fermentazione viene condotta da
ceppi selezionati che esprimono al meglio la qualità
del mosto, senza che si sviluppino difetti olfattivi.
Durante la decantazione del succo, alcune condizioni
utili alla sedimentazione (come bassa temperatura e
solfatazione) possono favorire lo sviluppo di alcuni
ceppi resistenti a queste condizioni. Naturalmente,
questa crescita non deve diventare una
fermentazione; altrimenti rimetterebbe i sedimenti in
sospensione. Tuttavia, questi ceppi possono
svilupparsi preferenzialmente durante la
fermentazione anche dopo un inoculo di lievito attivo
(Fleet, 1992).
La chiarificazione modifica essenzialmente la
fermentabilità del mosto. È noto che il mosto limpido
fermenta con più difficoltà del mosto torbido
(sebbene l'eliminazione dei lieviti non sia l'unica
ragione di questa difficoltà di fermentazione, come si
pensava una volta). Eppure la chiarifica favorisce
contemporaneamente la finezza aromatica del vino. Si
ritiene che la qualità del vino bianco sia migliorata da
una fermentazione piuttosto difficile e lenta. In
generale, tutte le operazioni che accelerano la
fermentazione abbasseranno la qualità del vino e
viceversa. Occorre ricercare un compromesso che
consenta una fermentazione completa e una qualità
del vino soddisfacente. Diversi ricercatori hanno
studiato l'effetto delle fecce del mosto d'uva e di altri
materiali solidi sulla cinetica di fermentazione (Ough e
1993). Ribe ́reau-Gayon et al. (1975b) hanno valutato
l'effetto di diversi fattori correlati sulla fermentabilità del
mosto: l'eliminazione del lievito, l'eliminazione degli
elementi nutritivi rilasciati dai sedimenti del mosto d'uva e
un possibile effetto di supporto che consentirebbe una
maggiore attività del lievito, eventualmente mediante la
fissazione di composti tossici ( acidi grassi a catena corta).
Diverse fermentazioni sono state effettuate in laboratorio
in diverse condizioni. Per questo esperimento, il terreno è
stato riscaldato a 100 ° C per 5 minuti per distruggere i
lieviti e garantire la solubilizzazione degli elementi nutritivi
che potrebbero essere coinvolti nella fermentazione. In
considerazione della distruzione dei lieviti in determinate
condizioni, il terreno è stato sistematicamente inoculato,
utilizzando un ceppo di S. cerevisiae con un buon
potenziale di fermentazione ad una concentrazione
relativamente bassa (105 / ml) per valutare ogni possibile
effetto di eliminazione naturale del lievito . In questo
modo si apprezza il successivo effetto della naturale
eliminazione dei lieviti. Confrontando i diversi campioni, è
stato possibile valutare il contributo di ciascuno dei tre
parametri alla perdita di fermentabilità. I risultati di due
test con diverse concentrazioni di zucchero sono riportati
nella Tabella 3.15.
La perdita di fermentabilità dovuta alla chiarifica del succo
è apparsa significativa. Le misurazioni sono state
effettuate il secondo e il quinto giorno di fermentazione e
si deve tenere conto che il rallentamento della
fermentazione dovuto alla decantazione e
all'illimpidimento del mosto è più evidente in questo
momento. Le differenze tendono a diventare meno
evidenti nel tempo. Nella prova A la fermentazione è
completa anche dopo la decantazione del succo. Nella
prova B, la decantazione del succo provoca un arresto
della fermentazione. Nonostante le necessarie
approssimazioni fatte nell'esecuzione di questo
esperimento, mostra la moltitudine di effetti della
sedimentazione del succo. Inoltre, la somma delle singole
perdite di fermentabilità corrisponde abbastanza bene
alla perdita totale.La natura del sedimento e il suo effetto
sulla fermentabilità del mosto sono legati all'origine
dell'uva, alle condizioni igienico-sanitarie dell'uva e alle
condizioni di estrazione del mosto. Lafon-Lafourcade et
al. (1980) hanno dimostrato il ruolo essenziale delle
condizioni di pigiatura e pressatura delle uve bianche. In
identiche condizioni di chiarifica, i mosti estratti dopo
l'energica pigiatura delle uve fermentano meno bene dei
mosti provenienti dalla pressatura senza pigiatura.
Questa differenza di fermentazione può provocare un
arresto della
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
fermentazione se associata ad altre condizioni
sfavorevoli (concentrazioni elevate di zucchero,
anaerobiosi completa, ecc.).
La pressatura senza pigiatura mantiene il mosto a
contatto con le bucce per un certo periodo, e questo
contatto sembra consentire la diffusione degli steroidi
della buccia dell'uva. Allo stesso modo, il contatto
prefermentativo con le bucce produce generalmente
un mosto con una buona fermentabilità, anche dopo
un'attenta decantazione del mosto. Delfini et al. (1992)
hanno notato che la chiarificazione del mosto elimina
gli acidi grassi a catena lunga. La loro eliminazione è
stata collegata all'aumentata produzione di acido
acetico frequentemente riscontrata nei mosti bianchi
con problemi di fermentazione, in particolare quelli
che sono stati fortemente chiarificati. Le particelle di
fecce di mosto e anche le macromolecole glucidiche,
che costituiscono parte della torbidità colloidale dei
mosti come le bucce di lievito, possono adsorbire gli
acidi grassi a catena corta (C8 e C10) (Sezione 3.6.2)
(Ollivier et al., 1987) . Di conseguenza, il livello di
chiarifica del mosto deve essere controllato per ogni
tipo di vinificazione in bianco misurando la torbidità o
la torbidità del mosto, espressa in NTU
(Sezioni 13.5.2; 13.5.3). Per i vigneti nella regione di
Bordeaux, una torbidità inferiore a 60 NTU può
portare a gravi difficoltà di fermentazione. Oltre i 200
NTU è certo il rischio di deviazioni olfattive dovute alla
presenza di fecce di mosto.
3.8 FERMENTAZIONI BLOCCATE 3.8.1 Cause di
fermentazioni bloccate
Le fermentazioni bloccate sono sempre state un
grosso problema nella vinificazione. La letteratura
enologica francese li ha citati dall'inizio del XX secolo.
La produzione di vini fortificati è stata sicuramente
una risposta alle difficili fasi finali della fermentazione
e ai conseguenti incidenti microbici, soprattutto nei
paesi a clima caldo. Questi vini sono stati rapidamente
stabilizzati mediante l'aggiunta di alcool puro. In tutto
il mondo, molti di questi vini sono scomparsi poiché il
progresso della microbiologia ha consentito
l'elaborazione di vini secchi.
L'arresto della fermentazione continua ad essere un
argomento molto discusso. In alcuni casi, una
modifica delle varietà di vite ha prodotto uve con
elevate concentrazioni di zucchero. Queste uve sono
più difficili
da fermentare rispetto alle varietà passate. In altri casi, i
produttori di vino si sono recentemente resi conto che le
fermentazioni lente diffuse su diversi mesi non sono ideali
per la produzione del vino.
Poiché le tecniche di vinificazione in rosso utilizzate a
Bordeaux (uve con un contenuto di zucchero
relativamente alto e una lunga vasca che richiedono tini
chiusi) sono particolarmente favorevoli a questo
problema, è stata studiata qui per molti anni. Negli anni
'50 una ricerca approfondita a Bordeaux ha portato a
importanti scoperte in materia di regolazione della
temperatura e aerazione. L'ubiquità delle fermentazioni
bloccate in altre regioni viticole ha portato a nuove
ricerche che confermano il lavoro passato.
Il rallentamento della fermentazione può essere
monitorato monitorando la massa per unità di volume. Se
una densità inferiore a 1,005 diminuisce solo di 0,001 o
0,002 al giorno, è possibile prevedere un arresto della
fermentazione prima del completo esaurimento dello
zucchero. Dall'esperienza passata, le conseguenze di un
arresto di fermentazione non sono troppo gravi se
avviene con almeno 15 g di zucchero per litro e una
moderata gradazione alcolica (<12% vol.). In questo caso
la ripresa della fermentazione non pone grossi problemi.
D'altra parte, con una concentrazione zuccherina
inferiore a 10 g / l, è spesso molto difficile riavviare
fermentazioni bloccate, in particolare quando viene
avviata la fermentazione malolattica.
Una fermentazione bloccata può derivare da una causa
particolare. Ad esempio, un'eccessiva concentrazione di
zucchero del mosto rende impossibile una fermentazione
completa; in questo caso si può fare solo un vino dolce. In
caso di temperature eccessive si possono prevedere
fermentazioni bloccate e questo tipo di fermentazione
bloccata è generalmente il risultato di diverse cause. Gli
effetti sono cumulativi, anche se a volte individualmente
senza conseguenze. I viticoltori non sempre
comprendono i possibili rischi cumulativi e le precauzioni
da prendere.
Per riassumere, i seguenti fattori possono essere coinvolti
in fermentazioni bloccate:
1. La concentrazione di zucchero del mosto ha un effetto
inibitorio che aggrava la tossicità dell'alcol formato.
L'aggiunta di zucchero al mosto (zuccheraggio), quando è
troppo tardi, richiede ai lieviti di perseguire la loro attività
metabolica anche se già ostacolata dall'alcol formato.
2. Una temperatura eccessiva risulta dalla temperatura
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
iniziale, dalla quantità di zucchero fermentato e dal
tipo di serbatoio utilizzato (dimensioni e materiale).
Tutte le operazioni che accelerano la velocità di
trasformazione dello zucchero aumentano la
temperatura massima. La temperatura diventa un
fattore limitante a circa 30 ° C. L'effetto è più
pronunciato quando la temperatura è elevata nelle
prime fasi della fermentazione. Normalmente, la
fermentazione dovrebbe iniziare a una temperatura
moderata (20 ° C).
Al contrario, una temperatura iniziale troppo bassa
può limitare la crescita del lievito e portare a una
popolazione di lieviti insufficiente. A temperature
moderate, i lieviti hanno difficoltà a sopportare sbalzi
termici estremi (shock termici). L'anaerobiosi completa
non consente un'attività soddisfacente del lievito
(crescita e sopravvivenza). L'aerazione aumenta la
velocità di fermentazione. Deve essere posto nelle
prime fasi della fermentazione, durante la fase di
crescita della popolazione. Anche i sostituti
dell'ossigeno come gli steroidi e gli acidi grassi a
catena lunga possono migliorare la cinetica di
fermentazione. L'attività dei lieviti può essere
influenzata da carenze nutrizionali: composti azotati,
fattori di crescita e possibilmente minerali. Le aggiunte
combinate di ossigeno e azoto ammoniacale
sembrano essere particolarmente efficaci. Queste
carenze di azoto si verificano probabilmente in
situazioni specifiche che ora siamo in grado di
prevedere. L'efficacia dell'aggiunta di elementi
nutritivi, osservata nel lavoro di laboratorio, va
interpretata rispetto ad altre condizioni di
fermentazione (concentrazione zuccherina e aera-
zione). Alcune condizioni di coltivazione dell'uva, come
lo stress idrico, le viti vecchie e le colture di copertura
per diminuire il vigore della vite, possono portare a
mosti meno fermentabili. In queste condizioni,
l'arresto della fermentazione è probabilmente dovuto
a carenze di nutrienti (azoto), che probabilmente
richiedono ulteriori indagini. I sottoprodotti metabolici
(acidi grassi saturi C6, C8 e C10) inibiscono la crescita
del lievito, intensificando la tossicità dell'alcol. Nel
mosto possono essere presenti sostanze fungine -
residui di antiparassitari usati per proteggere la vite o
composti prodotti dalla Botrytis cinerea nelle uve
marce. Nella vinificazione in bianco, le condizioni di
estrazione del mosto hanno un'influenza significativa:
pigiatura dell'uva, condizioni di drenaggio del succo,
pressatura del pigiato, e soprattutto il grado di
chiarifica del mosto (decantazione del succo).
Queste operazioni possono provocare un'eccessiva
eliminazione degli steroidi, che agiscono come fattori di
sopravvivenza per il lievito.
Nella gamma di acidità del mosto, un'acidità elevata
non sembra favorire la fermentazione, ma un pH elevato
può rendere molto più gravi le conseguenze di un arresto
di fermentazione. Un pH basso si combina con l'effetto
della solfitazione per inibire la crescita batterica. In questo
caso diminuiscono i fenomeni antagonisti tra batteri e
lieviti e la fermentazione è più costante. Un'altra
sfortunata conseguenza del pH basso è che favorisce la
formazione di acidità volatile da parte del lievito.
Oltre alle cause chimiche e fisico-chimiche delle
fermentazioni bloccate, sono coinvolti anche i fenomeni
microbici. Innanzitutto la quantità di inoculo di lievito
iniziale può essere insufficiente (Sezione 3.5.4) se, ad
esempio, la temperatura del mosto è esageratamente
bassa. Possono verificarsi anche fenomeni antagonistici
tra diversi ceppi di lievito e il fattore killer (Sezione 1.7)
spiega questo antagonismo abbastanza diffuso. La
fermentazione può essere rapida in alcune vasche
mentre è più lenta in altre, e le tecniche di identificazione
del ceppo hanno dimostrato che la fermentazione è
svolta quasi esclusivamente da un ceppo nel primo caso,
mentre più ceppi fermentano il mosto nel secondo caso
(Sezione 1.10.2) . Questi fenomeni antagonisti possono
influenzare un'inoculazione. In determinate condizioni (ad
esempio, un inoculo naturale significativo in piena attività),
l'inoculo con lievito commerciale secco porta ad una
fermentazione più lenta rispetto al non inoculo. I ceppi di
lievito devono quindi essere selezionati in base al tipo di
vino da produrre, assicurandosi che siano più attivi e
numerosi dei lieviti indigeni. Le condizioni necessarie per
controllare la fermentazione includono: pulizia; inibire
sufficientemente precocemente i lieviti naturali
mantenendo basse le temperature; solforare
adeguatamente; e inoculare con un lievito madre attivo
non appena il serbatoio è pieno per assicurarne il rapido
impianto.
Anche fenomeni di antagonismo tra lieviti e batteri lattici
possono causare difficoltà di fermentazione (Sezione
6.4.1), soprattutto nella vinificazione in rosso (Sezione
12.4.3). L'iniziale solfatazione delle uve deve inibire
temporaneamente la carica batterica consentendo allo
stesso tempo lo sviluppo dei lieviti e la fermentazione
degli zuccheri. I batteri non si sviluppano fintanto che
l'attività del lievito è sufficiente, ma se la fermentazione
alcolica
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
rallenta per qualche motivo, i batteri possono iniziare
a crescere, soprattutto se la solfatazione iniziale era
insufficiente. Questo sviluppo batterico aggrava le
difficoltà del lievito e aumenta i rischi di una
fermentazione alcolica prematura e bloccata. Il rischio
batterico è un'ulteriore giustificazione per la
solfitazione dell'uva rossa (5 g / hl) prima della
fermentazione (Sezione 8.7.4). L'aggiunta di lisozima
(200 - 300 mg / l), estratto dagli albumi, è stato
suggerito per rafforzare l'effetto inibitorio della
solforazione sui batteri nelle fermentazioni difficili
(Sezione 9.5.2). Inoltre, si sconsiglia l'inoculo di batteri
dell'acido lattico (Oenococcus oeni) prima della
fermentazione alcolica per attivare una successiva
fermentazione malolattica; in caso di fermentazioni
alcoliche difficili, questa operazione aumenta il rischio
di alterazione batterica (Sezione 3.8.2). Eppure questa
è una pratica standard in alcuni vigneti. Dovrebbe
essere considerata la relazione tra questa pratica e un
aumento dell'acidità volatile.
Per molto tempo, le difficili fasi finali della
fermentazione e le fermentazioni bloccate sono state
un vero problema durante la vinificazione in rosso. I
sistemi di controllo della temperatura e la pratica
generale del rimontaggio con aerazione hanno
limitato questi incidenti. I mosti bianchi, invece, sono
diventati sempre più difficili da fermentare a causa
dell'eccessiva chiarifica e delle condizioni di estrazione
del mosto meccanizzato. Questa chiarifica eccessiva
rimuove i costituenti del mosto indispensabili per una
completa fermentazione. Nella vinificazione in bianco,
il mosto spesso non viene aerato per evitare
l'ossidazione, ma anche la mancanza di aerazione
durante la fermentazione contribuisce alle difficoltà di
fermentazione. Oggi, durante la fermentazione si
consiglia l'aerazione controllata dei mosti bianchi in
quanto la CO2 rilasciata li protegge dall'ossidazione.
L'errore umano è un altro fattore che ha certamente
un impatto sulle fermentazioni bloccate, anche se è
difficile da dimostrare. Non è raro trovare cantine
dove le fermentazioni bloccate avvengono con una
certa regolarità, come se ci fosse una causa tecnica
specifica che poteva essere individuata e corretta, per
poi scomparire completamente a seguito di un
cambio di enologo.
3.8.2 Conseguenze di fermentazioni bloccate
Lo zucchero residuo non è accettabile nei vini bianchi
secchi e nella maggior parte dei vini rossi. Una
fermentazione bloccata richiede quindi la ripresa
dell'attività del lievito in un mezzo ostile. Evidentemente,
se la gradazione alcolica è già elevata (13% vol.), Le
possibilità di riavviare la fermentazione sono scarse.
Il rischio di alterazione batterica è il principale pericolo di
una fermentazione bloccata. La figura 3.9 schematizza il
coinvolgimento di diversi fenomeni microbici, (la
vinificazione in rosso è rappresentata specificatamente
poiché si tiene conto della fermentazione malolattica)
(Ribe ́reau-Gayon, 1999). Sono comprese le varie fasi della
fermentazione. I lieviti fermentano gli zuccheri e l'attività
del lievito dovrebbe interrompersi solo quando tutte le
molecole di zucchero sono state consumate. I batteri
lattici si affermano quindi decomponendo esclusivamente
molecole di acido malico in un processo chiamato
fermentazione malolattica. Se l'attività del lievito si
interrompe prima del completo esaurimento dello
zucchero del mosto, possono svilupparsi batteri. Lo
sviluppo batterico dipende da diversi fattori, tra cui
l'iniziale solfatazione delle uve e l'eventuale aggiunta di
lisozima (Sezione 9.5.2). Anche l'inoculo di batteri della
fermentazione malolattica nel mosto favorisce il loro
sviluppo. L'acido acetico si forma quando i batteri lattici,
principalmente Oenococcus etero-fermentativi, sono
presenti in un terreno contenente zucchero. In queste
situazioni, l'acidità volatile può aumentare rapidamente a
livelli inaccettabili anche se c'è una concentrazione
zuccherina residua relativamente piccola. Infatti, i batteri
formano acido acetico dallo zucchero dopo la loro fase di
crescita, durante la quale l'acido malico viene assimilato.
Di conseguenza, in caso di arresto della fermentazione
alcolica, l'enologo può far proseguire la fermentazione
malolattica fino al suo completamento prima di inibire i
batteri.
La comprensione dei processi rappresentati nella Figura
3.9 ha costituito un progresso indiscutibile nella
microbiologia del vino. Di conseguenza, sono state avviate
alcune operazioni per controllare la fermentazione
alcolica ed evitare fermentazioni bloccate. L'acidità volatile
dei vini rossi di prim'ordine è notevolmente diminuita, con
un corrispondente miglioramento della qualità. Negli anni
'30 nella regione di Bordeaux, l'acidità volatile di questi
vini era spesso 1,0 g / l (espressa in H2 SO4) o 1,2 g / l
(espressa in acido acetico). Il contenuto è stato ridotto
della metà di questo valore e le cifre più alte di oggi sono
dovute a vari problemi durante la fermentazione e lo
stoccaggio, che possono e devono essere evitati.
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
3.8.3 Azione in caso di arresto della
fermentazione
Molte fermentazioni bloccate derivano da errori di
vinificazione. Inoltre, anno dopo anno, in alcune
cantine sono state osservate fermentazioni
sistematiche. Scompaiono senza alcuna ragione
apparente nello stesso momento in cui cambia
l'enologo. Il più delle volte, le operazioni necessarie
sono note ma non eseguite correttamente. Nella
vinificazione in rosso, gli arresti delle fermentazioni
spesso derivano da temperature eccessive all'inizio
della fermentazione e da uno scarso controllo della
temperatura della vasca durante la fermentazione.
Può anche contribuire una dissoluzione insufficiente
dell'ossigeno durante il rimontaggio. Nella
vinificazione in bianco, l'eccessiva chiarifica del mosto,
le variazioni di temperatura e l'assenza di aria
contribuiscono a problemi di fermentazione.
Ovviamente una maggiore concentrazione di zuccheri
nel mosto aumenta i rischi, ma in certe situazioni non
c'è una spiegazione soddisfacente per l'arresto delle
fermentazioni.
Una densità che rimane stabile per 24 o 48 ore
conferma l'arresto della fermentazione. In questo
caso esistono diverse procedure per riavviare la
fermentazione evitando il deterioramento batterico.
Riavviare una fermentazione è spesso un'operazione
difficile. Innanzitutto, questo terreno è ricco di alcoli e
povero di zuccheri - non favorisce lo sviluppo di una
seconda fermentazione. Inoltre i lieviti si esauriscono
dalla prima fermentazione e reagiscono male ai diversi
stimoli impiegati. Beneficiano maggiormente di
diverse operazioni come l'integrazione di azoto e
l'ossigenazione all'inizio del loro sviluppo, quando il
terreno contiene elevate concentrazioni di zucchero e
non contiene etanolo. Pertanto, un'operazione dopo
l'arresto della fermentazione non può compensare un
errore di vinificazione. Tutte le operazioni favorevoli
alla fermentazione dovrebbero essere eseguite
dall'inizio del processo di vinificazione per evitare
fermentazioni bloccate. La prevenzione dell'arresto
delle fermentazioni è essenziale per la vinificazione e
dovrebbe tener conto di tutte le raccomandazioni
precedentemente enunciate.
Nonostante tutte le precauzioni, può comunque
verificarsi un arresto della fermentazione. In questo
caso i vini bianchi devono essere trattati diversamente
dai rossi che subiscono la fermentazione malolattica.
Al momento dell'arresto della fermentazione, il
serbatoio del vino rosso contiene mosto e vinacce
ricche di
batteri. Il vino va drenato rapidamente, anche se la
macerazione delle bucce e dei semi non è completa. Il
drenaggio elimina parte della contaminazione batterica e
introduce l'ossigeno, che favorisce la ripresa della
fermentazione e abbassa la temperatura. Il vino può
essere contemporaneamente solfitato, per inibire lo
sviluppo batterico. In alcuni casi la fermentazione
riprende spontaneamente.
Anche se l'arresto della fermentazione risulta dalla
combinazione di diverse cause elementari, ognuna lo ha
il proprio effetto sulla facilità di riavvio della
fermentazione. Temperature eccessive distruggono i
lieviti ma non rendono il terreno non fermentabile, così
come la fermentazione in completa anaerobiosi.
Se la fermentazione non riprende da sola, è necessario
un inoculo con lievito attivo. Attualmente, i lieviti secchi
commerciali sono inattivi in terreni contenenti più dell'8-
9% vol. di alcol, a causa delle condizioni di produzione. In
futuro, sarebbe auspicabile un lievito preparato
industrialmente in grado di svilupparsi in un mezzo
contenente alcol. I batteri con questa proprietà sono stati
ora sviluppati per la fermentazione malolattica.
Un lievito madre attivo deve essere preparato utilizzando
il mezzo di fermentazione in blocco regolato al 9% vol.
Alcol e 15 g di zucchero per litro; Si aggiungono anche 3 g
di SO2 per ettolitro. I lieviti secchi attivi vengono aggiunti
alla concentrazione di 20 g / hl. La loro crescita a 20 ° C
richiede diversi giorni e viene monitorata misurando la
densità o misurando gli zuccheri. Quando tutto lo
zucchero è stato consumato, i lieviti sono al culmine della
loro fase di crescita. Questo lievito di avviamento, ricco di
lieviti attivati e non contenente più zucchero, viene
inoculato nel mezzo di fermentazione bloccato ad una
concentrazione del 5 - 10%. Sono necessari diversi giorni
per il completo esaurimento degli ultimi pochi grammi di
zucchero rimasti. È un'operazione lunga e faticosa. Il
volume dello starter di lievito può anche essere
progressivamente aumentato aggiungendo quantità
sempre maggiori di vino di fermentazione bloccato.
Nella scelta di un ceppo di lievito, i lieviti dovrebbero
certamente essere resistenti all'etanolo. I lieviti
commercializzati con il nome di S. bayanus potrebbero
essere consigliati ma sembrano avere una propensione a
formare acidità volatile in queste condizioni. A tale scopo
si raccomandano lieviti S. cerevisiae (ex S. bayanus)
disponibili in commercio, noti per la loro resistenza
all'etanolo e la bassa probabilità di produrre acidità
volatile.
In effetti l'acidità volatile del vino tende ad aumentare
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
durante la ripresa di una fermentazione bloccata. Ciò
si verifica generalmente quando i lieviti incontrano
condizioni sfavorevoli.
Alcuni ceppi di lievito sono più predisposti a formarlo
rispetto ad altri. L'aggiunta di 50 mg di acido
pantotenico per ettolitro (non autorizzata dalla
normativa UE) non solo può limitarne la formazione
ma può anche contribuire alla scomparsa di un
eccesso di acido acetico.
Va considerata la temperatura per la ripresa della
fermentazione. Una temperatura leggermente elevata
favorisce la moltiplicazione cellulare ma le proprietà
antisettiche dell'etanolo aumentano con la
temperatura. Anche il rischio di un aumento
dell'acidità volatile sembra essere in funzione della
temperatura. Per questi motivi, la ripresa della
fermentazione dovrebbe essere effettuata ad una
temperatura compresa tra 20 e 25 ° C.
I lieviti attivi esistenti in cantina possono essere
utilizzati anche per riavviare una fermentazione
bloccata. Se c'è un grande volume di raccolto fresco
disponibile al momento giusto, il serbatoio con la
fermentazione bloccata può essere annegato con
esso. Questa operazione, tuttavia, è in conflitto con il
legittimo desiderio di selezionare le cuvée. La pratica
di aggiungere il 5 - 20% di un mezzo in piena
fermentazione a un serbatoio fermo deve essere
eseguita con prudenza. Sicuramente si aggiungono
lieviti attivi ma anche lo zucchero. In questa
situazione, a volte si è osservato che la fermentazione
riprendeva e poi si interrompeva di nuovo, lasciando
circa la stessa quantità di zucchero che esisteva prima
dell'operazione. Le fecce di un serbatoio che ha
normalmente completato la sua fermentazione
possono essere utilizzate anche come lievito madre
per riavviare una fermentazione bloccata. Gli zuccheri
supplementari non vengono introdotti nel terreno, ma
i lieviti nella loro fase di morte non sono più molto
attivi. Il corretto riavvio di una fermentazione richiede
l'introduzione di lieviti attivi in questo mezzo alcolico
senza introdurre zuccheri supplementari. La
preparazione di un lievito madre utilizzando lievito
secco dà i risultati più soddisfacenti.Nella vinificazione
in bianco, almeno quando non si ricerca la
fermentazione malolattica, il vino a fermentazione
interrotta deve essere leggermente solfitato per
proteggere dallo sviluppo batterico. La fermentazione
può quindi essere riavviata utilizzando un lievito madre
preparato secondo le istruzioni precedenti.
Sono stati proposti molti possibili coadiuvanti che aiutano
a riavviare una fermentazione bloccata. L'aggiunta di sali
di ammonio non solleva controindicazioni, ma non si è
osservato alcun miglioramento apprezzabile della presa
di spuma. L'aggiunta di solfato di ammonio dovrebbe
essere limitata a 5 g / hl a causa dell'uso limitato di azoto
da parte dei lieviti.
La pastorizzazione flash (riscaldamento tra 72 e 76 ° C
per 20 secondi) sembra essere efficace. Migliora la
fermentabilità dei vini a fermentazione bloccata
(Dubernet, 1994). Questa operazione è valida per i vini
rossi, rosati e bianchi secchi e deve essere eseguita prima
dell'inoculo. Il suo effetto riscaldante può essere
paragonato all'effetto osservato durante la termo
vinificazione (Sezione 12.8.3). Nonostante la distruzione
dei lieviti, i mosti riscaldati fermentano particolarmente
bene. Gli effetti di questo processo meritano ulteriori
studi, ma possono essere proposte diverse spiegazioni:
fermentazione da parte di un unico ceppo evitando
antagonismi microbici; aggiunta di elementi nutritivi
dovuti alla lisi del lievito; eliminazione di sostanze
tossiche; e modifica della struttura colloidale.
Il carbone attivo viene utilizzato da molto tempo anche
per riattivare le fermentazioni (10-20 g / hl). Una tale
aggiunta è difficilmente concepibile nei vini rossi, ma la
sua efficacia per le fermentazioni bloccate nei vini bianchi
è riconosciuta. Agisce eliminando gli inibitori del lievito
(acidi grassi) (Sezione 3.6.2).
L'aggiunta di scorze di lievito è sicuramente il modo più
efficace per riavviare una fermentazione bloccata, anche
se meno che per evitare che la fermentazione si fermi in
primo luogo. (Sezione 3.6.2). Possono essere aggiunti alla
preparazione del lievito madre o direttamente al terreno
con l'arresto della fermentazione.
In base ai risultati di un esperimento riportato nella
tabella 3.16, la prima fermentazione di un mosto
contenente inizialmente 250 g di zucchero per litro si
ferma a 67 g di zucchero non fermentato per litro. La
seconda fermentazione viene condotta dopo un inoculo a
106 cellule di S. cerevisiae per millilitro, senza l'aggiunta di
scorze di lievito nel campione di controllo e con
un'aggiunta di 0,5 g / l nel campione in esame 24 ore
dopo.
Questa aggiunta consente una fermentazione completa in
36 giorni, cosa non possibile nel campione di controllo.
 3. Condizioni di sviluppo del lievito
Una massiccia aggiunta di scorze di lievito combinata
con un inoculo di lievito attivo può provocare
modifiche olfattive di vini leggeri come i bianchi e le
rose. Si consigliano quindi dosi comprese tra 20 e 30 g
/ hl (massimo).
Sia nella vinificazione in bianco che in quella in rosso,
la ripresa di una fermentazione interrotta deve essere
monitorata attentamente, soprattutto misurando
l'acidità volatile per garantire che la fermentazione
alcolica sia pura. Il minimo aumento di acidità volatile
rappresenta una contaminazione batterica, che
dovrebbe essere assolutamente evitata. Un solfito
giudizioso dovrebbe prevenire la contaminazione;
senza dubbio rallenta la fermentazione. Tuttavia se le
dosi vengono adeguate alla situazione (3 - 5 g / hl), la
fermentazione non sarà definitivamente
compromessa; si riavvierà dopo l'inoculazione. Deve
inoltre prevenire ogni sviluppo batterico prima del
completo esaurimento degli zuccheri, anche se la sua
aggiunta può rendere più difficile la fermentazione
malolattica.
I serbatoi con fermentazioni bloccate devono essere
riavviati il prima possibile. In pieno inverno questa
operazione può diventare impossibile e in queste
situazioni è preferibile attendere la primavera
successiva, quando la fermentazione può riprendere
spontaneamente.
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 4. Batteri dell'acido lattico
I fermenti lattici sono presenti in tutti i mosti e vini
d'uva. A seconda della fase del processo di
vinificazione, le condizioni ambientali determinano la
loro capacità di moltiplicarsi. Quando si sviluppano,
metabolizzano numerosi substrati. I batteri lattici
svolgono quindi un ruolo importante nella
trasformazione del mosto d'uva in vino. Il loro impatto
sulla qualità del vino dipende non solo da fattori
ambientali che agiscono a livello cellulare, ma anche
dalla selezione delle specie e dei ceppi batterici più
adatti.
Tutti i ceppi hanno un'organizzazione cellulare simile,
ma le loro differenze fisiologiche tengono conto delle
loro caratteristiche specifiche e dell'impatto variabile
sulla qualità del vino. Sono classificati in base ai loro
tratti morfologici, genetici e biochimici.
4.1 I DIVERSI COMPONENTI DELLA CELLULA
BATTERICA
I batteri sono cellule procariotiche con
un'organizzazione estremamente semplice. Si
distinguono dagli eucarioti (a cui appartiene il lievito)
per le loro piccole dimensioni e la mancanza di una
membrana nucleare che delimita un nucleo.
È impossibile distinguere tra batteri così diversi come
Escherichia coli e Oenococus oeni (O. oeni,
precedentemente noto come Leuconostoc oenos o L.
oenos) mediante semplice esame microscopico. In
effetti, la struttura di tutti i batteri è molto simile. Può
essere suddiviso in tre elementi principali (Figura 4.1):
• Involucri cellulari, compresa la parete cellulare e la
membrana. La cellula è delimitata dalla membrana
citoplasmatica raddoppiata verso l'esterno dalla
parete cellulare. Tra la parete cellulare e la membrana,
lo spazio periplasmatico è un gel più o meno fluido in
cui si muovono le proteine.
• Il citoplasma.
• Il nucleo.
4.1.1 La parete cellulare
La parete cellulare dei batteri Gram-positivi, come i
batteri dell'acido lattico, è essenzialmente composta
da un peptidoglicano che si trova solo nei procarioti
(Figura 4.2). Questo polimero avvolge la cellula
batterica con una sorta di reticolo costituito da catene
polisaccaridiche legate da peptidi. Gli osi sono derivati
del glucosio: acido N-acetilmuramico e N-
acetilglucosamina (Figura 4.2). Si alternano lungo l'intera
lunghezza della catena, legati da legami glicosidici di tipo
β (1–4) che possono essere idrolizzati dal lisozima o dalla
mutanolisina.
Una catena di quattro amminoacidi è legata all'acido
muramico; L-alanina, D-alanina e acido D-glutammico
sono in maggioranza. Un legame peptidico collega il
tetrapeptide di un'altra catena polisaccaridica al terzo
amminoacido (Figura 4.3). Le catene peptidiche variano a
seconda delle specie dei batteri. La sequenza dei loro
amminoacidi può essere utilizzata nella tassonomia.
Le pareti cellulari dei batteri lattici, come quelle di quasi
tutti i batteri Gram-positivi, contengono anche polimeri di
ribitolo fosfato o glicerolo fosfato chiamati acidi teicoici. I
legami del fosfodiestere possono fissare gli amminoacidi
e gli osi a queste catene. Gli acidi teicoici a base di
glicerolo contengono un glicolipide mediante il quale si
attaccano allo strato esterno della membrana plasmatica.
Passano attraverso il peptidoglicano e si trovano sulla
superficie della parete cellulare, agendo come siti
antigenici dei batteri. La proporzione di peptidoglicani e
acidi teicoici varia a seconda della specie e anche della
fase del ciclo di sviluppo cellulare. Gli acidi teicoici
possono rappresentare fino al 50% del peso della parete
cellulare.
La parete cellulare è rigida e dà alla cellula la sua forma:
rotonda per i cocchi, allungata per i bacilli. Permette alla
cella di resistere a pressioni osmotiche interne molto
elevate (fino a 20 bar). La coltura di cellule in presenza di
penicillina, inibendo la sintesi della parete cellulare, porta
alla formazione di protoplasti: sono vitali solo in mezzi
isotonici. Allo stesso modo, il lisozima idrolizza i legami
glicosidici del peptidoglicano, provocando lo scoppio della
cellula in un mezzo ipotonico.
Acqua, ioni minerali, substrati e prodotti metabolici si
diffondono liberamente attraverso la parete cellulare. A
questo livello, le proteasi rilasciano anche amminoacidi da
proteine e peptidi che vengono utilizzati per il
metabolismo cellulare.
Le osservazioni al microscopio elettronico hanno anche
dimostrato l'esistenza di uno strato proteico sulla
superficie della parete cellulare (strato S) in diverse specie
di batteri lattici. Lo studio di questo strato S nei batteri del
vino non è stato ancora tentato.
Infine, l'accumulo di polisaccaridi accumulati su queste
proteine può formare una capsula più o meno distinta. Il
 4. Batteri dell'acido lattico
suo spessore varia a seconda delle condizioni
ambientali. In enologia, Pediococcus damnosus
fornisce il miglior esempio di questo fenomeno. In
determinate condizioni, i ceppi di questa specie
sintetizzano quantità significative di polisaccaridi che
rendono il vino viscoso (corda). Queste cellule sono
facilmente riconoscibili al microscopio ottico dall'alone
rifrangente che le circonda.
4.1.2 La membrana plasmatica
La membrana è situata contro la parete cellulare,
delimitando uno spazio periplasmatico. A volte sono
visibili pieghe all'interno della cellula: questi sono
mesosomi.
La membrana dei batteri lattici ha la struttura classica
di tutte le membrane biologiche: un doppio strato
lipidico che crea una zona idrofobica centrale
(Capitolo 1, Figura 1.6). Le proteine sono più o meno
strettamente legate ad esso. Tra queste, le proteine
idrosolubili sono fissate alla superficie solo da legami
ionici o idrogeno (proteine periferiche, 30% delle
proteine). Gli altri sono alloggiati nella membrana da
legami idrofobici (proteine integrali). Le proteine
periferiche hanno una certa mobilità nello spazio
periplasmatico tra il peptidoglicano e la membrana,
mentre le proteine integrali sono pressoché immobili.
Alcuni sporgono dalla membrana mentre altri
appaiono solo in superficie. I legami idrofobici tra le
catene lipidiche alifatiche e le catene proteiche creano
la struttura della membrana. L'elevato numero di
questi legami garantisce la solidità di questa struttura,
ma non ci sono legami covalenti e quindi la struttura
creata rimane fluida. Da questa fluidità dipendono le
funzioni biochimiche assicurate dalla membrana,
ovvero le interazioni lipide-proteine. La struttura può
essere distrutta da solventi organici e detergenti.
Inoltre è disturbato dai componenti del vino. Infine,
sulla superficie, le parti idrofile dei lipidi ed i gruppi
ionizzati delle proteine stabiliscono legami ionici tra
loro.
I lipidi membranosi rappresentano quasi tutti (95–
99%) i lipidi delle cellule batteriche. Includono
essenzialmente fosfolipidi e glicolipidi. I fosfolipidi
sono i più abbondanti; sono costituiti da una molecola
di glicerolo che ha una funzione alcolica primaria e
una funzione alcolica secondaria esterificata dagli
acidi grassi. L'altra funzione primaria è esterificata
dall'acido fosforico, che viene esterificato dal glicerolo,
formando
fosfatidil glicerolo. I batteri lattici contengono anche
difosfatidil glicerolo (cardiolipide), amino esteri del
fosfatidil glicerolo con alano (Oenococcus oeni) e lisina
(Lactobacilus plantarum) (Figura 4.4). Le concentrazioni di
fosfolipidi dei batteri variano a seconda dello stadio di
crescita e delle condizioni colturali.
Glicolipidi - generalmente glicosidi di diglyc- erides - sono
formati da legami glicosidici tra un
mono o disaccaride (glucosio, fruttosio, galattosio,
ramnosio) e la funzione alcolica primaria di un digliceride
(Figura 4.5).
Gli acidi grassi possiedono una lunga catena di
idrocarburi e una funzione di acido carbossilico terminale.
Queste molecole sono caratterizzate dalla lunghezza della
loro catena, dal loro livello di insaturazione, dalla
conformazione cis o trans dei doppi legami e (per Gram-
positivi) dalla ramificazione iso o anti-iso:
iso ramification H3C-CH-CH2-
- CH3
anti-iso ramification H3C- CH2-CH-
CH3
Nei batteri, la maggior parte degli acidi grassi ha da 14 a
20 atomi di carbonio e sono saturi o monoinsaturi. I
batteri lattici contengono anche un caratteristico acido
ciclopropanico: l'acido lattobacillico (cis -11,12- metilene-
octodecanoico). La tabella 4.1 elenca i principali acidi
grassi dei batteri lattici presenti nel vino, in particolare
Oenococcus oeni (Lonvaud-Funel e Desens, 1990). Il
malonil CoA e l'acetato si condensano per formare acidi
grassi con un numero pari di atomi di carbonio. Per un
numero dispari di atomi di carbonio, gli acidi grassi sono
sintetizzati dalla condensazione di malonil CoA e
propionato. I batteri anaerobici sintetizzano gli acidi
insaturi mediante l'azione di una disidratasi
sull'idrossidecanoato che è formato dall'aggiunta di
un'unità malonilica su una molecola di acido ottanoico.
Le seguenti reazioni sono fornite in modo molto
schematico:
CH3CH3 CH3(CH2)5 CH2 COOH octanoic acid -->
CH3-(CH2)5-CH2-CH=CH-COOH decenoic acid
Il progressivo allungamento di questo acido porta alla
formazione di acido cis-vaccenico (C18), un precursore
dell'acido lattobacillico (C19). In quest'ultima fase, il
doppio legame dell'acido insaturo (il precursore) viene
metilato per formare il corrispondente acido
ciclopropanico.
 4. Batteri dell'acido lattico
La composizione in acidi grassi dei lipidi dei batteri
varia durante il ciclo fisiologico ed è anche fortemente
influenzata da diversi fattori ambientali.
Infine, oltre ai lipidi polari, le membrane batteriche
contengono lipidi neutri, analoghi agli steroli negli
eucarioti. Queste molecole triterpeniche e
pentacicliche sono chiamate apanoidi. Sono formati
dalla ciclizzazione dello squalene in un processo
anaerobico. Non sono stati chiaramente identificati
nei batteri dell'acido lattico.
La membrana è ancora più vitale per i batteri della
parete cellulare. Numerose proteine nella membrana
assicurano funzioni enzimatiche essenziali come il
trasferimento del substrato e del prodotto metabolico
e il sistema ATPasi. I batteri lattici non hanno un
sistema respiratorio. La permeabilità selettiva
assicurata dalla membrana crea un gradiente
protonico elettrochimico transmembrana tra l'interno
e l'esterno della cellula. Questa differenza genera
energia elettrochimica utilizzata nella sintesi dell'ATP.
Inoltre, la membrana mantiene un pH cellulare
ottimale per il funzionamento di numerose reazioni
del metabolismo cellulare. Costituisce una barriera il
cui funzionamento ottimale è garantito dalla fluidità.
La fluidità determina l'attività specifica delle proteine
in base all'ambiente lipidico, ma questa fluidità deve
essere controllata affinché la membrana rimanga
un'efficace barriera tra il citoplasma e l'ambiente.
Durante il ciclo di crescita cellulare e in risposta a
molteplici parametri esterni come temperatura, pH e
presenza di sostanze tossiche (etanolo), la cellula
riesce a modificare la composizione della membrana
per adattarsi e resistere agli effetti ambientali. Le
proprietà fisiche della membrana vengono mantenute
almeno fintanto che il fattore di stress rimane entro
certi limiti. I meccanismi messi in gioco agiscono
insieme sulle stesse proprietà. Influenzano la
lunghezza media e il livello di insaturazione,
ramificazione e ciclizzazione delle catene di acidi
grassi, la proporzione di lipidi neutri e polari e la
quantità di proteine. In questo modo, dalla fase di
crescita fino alla fase stazionaria, l'acido cis-vaccenico
diminuisce notevolmente al punto da rappresentare
meno del 10% degli acidi grassi totali, mentre l'acido
lattobacillico raggiunge una proporzione del 55% in
Oenococcus oeni, Lactobacillus plantarum e
Pediococcus damnosus (Lonvaud-Funel e Desens,
1990).
L'effetto della temperatura sulla composizione della
membrana è uno degli effetti più noti. A basse
temperature il tasso di insaturazione degli acidi grassi
aumenta così come la proporzione di acidi a catene
ramificate. Allo stesso tempo, la lunghezza delle catene
diminuisce. In questo modo, l'acido palmitico (C16)
aumenta e l'acido cis-vaccenico e lattobacillico
diminuiscono in Oenococcus oeni e Lactobacilus
plantarum quando la temperatura della coltura aumenta
da 25 a 30 ° C. L'introduzione di un gruppo metile, la
formazione di un propanico
ciclo, ha lo stesso effetto sulle proprietà fisiche dei batteri
come un doppio legame. I fenomeni inversi si verificano
quando la temperatura di coltura è più alta. Gli acidi
grassi insaturi sono meno abbondanti. I lipidi neutri
partecipano anche all'adattamento cellulare al mezzo
aumentando la viscosità della membrana.
La presenza di etanolo nel mezzo provoca significative
modifiche nella struttura della membrana. Esercita un
effetto detergente intercalandosi nella zona idrofobica
della membrana, la cui polarità aumenta di conseguenza.
La fluidità è aumentata e le proteine sono denaturate. In
generale, si osserva un aumento del rapporto acidi grassi
insaturi / saturi. In Oenococcus oeni, questo rapporto
aumenta da 0,4 a 2,1, quando i batteri vengono coltivati in
presenza di etanolo al 9%. I risultati sono gli stessi per la
specie Lactobacillus hilgardii i cui ceppi, come
Oenococcus oeni, sono in grado di crescere meglio di
altre specie in un mezzo alcolico (Desens, 1989).
Le proteine di membrana partecipano anche alla risposta
cellulare a un cambiamento ambientale. Le proteine dello
stress nei microrganismi stanno diventando più
conosciute. La loro sintesi è aumentata, ad esempio, dalla
temperatura, dall'acidità o dalla concentrazione in
etanolo. Alcune proteine cambiano anche quando la
cellula entra nella fase stazionaria. Sono state costituite
diverse famiglie di queste proteine e sono state
identificate le funzioni specifiche di alcune di esse. La loro
sovraespressione nella cellula è correlata ad una migliore
resistenza ai fattori di stress. La loro induzione mediante
shock termico protegge la cellula non solo dall'effetto
tossico del calore ma anche dall'effetto di altri fattori,
come l'etanolo e l'acidità. In alcuni batteri lattici del vino,
in particolare Oenococcus oeni, le proteine esistono ma il
loro ruolo non è noto. La loro sintesi aumenta quando il
vino viene aggiunto al terreno di coltura o quando le
cellule vengono inoculate direttamente nel vino. È stato
riscontrato che le concentrazioni riscontrate in
Oenococcus oeni sono fino a cinque volte superiori a
 4. Batteri dell'acido lattico
quelle di altre specie. (Garbay, 1994). Tra queste, due
proteine sono state identificate e codificate dai geni
Omr A e Fts H (Bourdineaud et al., 2003a, 2003b).
4.1.3 Il citoplasma
Il citoplasma contiene gli elementi principali per il
funzionamento delle cellule: enzimi, materiale
nucleare e talvolta sostanze di riserva. L'intero
metabolismo - sia reazioni di degradazione
(catabolismo) che reazioni di sintesi (anabolismo) -
viene svolto in modo programmato secondo gli
scambi con l'ambiente esterno, per produrre l'energia
necessaria alla crescita cellulare. Codificato dal
genoma, il citoplasma le proteine sono sempre le
stesse per ogni dato ceppo batterico, ma per alcuni di
essi il loro livello di espressione varia a seconda delle
condizioni culturali. Sono state anche identificate
proteine dello stress, prodotte da drastici
cambiamenti nelle condizioni. Uno di quelli prodotti in
O. oeni, Lo18, è stato particolarmente studiato
(Delmas et al., 2001). Il profilo elettroforetico delle
proteine solubili della cellula può quindi essere
utilizzato come metodo di identificazione per
confronto con ceppi stabiliti.
Le granulazioni citoplasmatiche possono essere
rivelate mediante specifiche tecniche di colorazione.
Sono sostanze di riserva insolubili di natura organica:
polimeri del glucosio o del poliestere dell'acido β-
idrossibutirrico. Queste sostanze di riserva si
accumulano in caso di carenza di azoto, quando è
ancora presente una fonte di carbonio. Le inclusioni di
volutina (un polimero di fosfato inorganico insolubile)
sono caratteristiche nei batteri dell'acido lattico,
specialmente in alcune specie del genere del
Lactobacillus strettamente omofermentante. Volutin
comprende una riserva di fosfati disponibile per la
sintesi di molecole fosforilate come gli acidi nucleici.
Al microscopio elettronico a trasmissione, l'interno
della cellula batterica appare granulare. Ciò è dovuto
ai ribosomi, che sono attori essenziali nella sintesi
proteica. Assicurano, insieme al t-RNA, la traduzione
del codice genetico. I ribosomi sono costituiti da due
parti caratterizzate dalla loro velocità di
sedimentazione, espressa in valori di Svedberg (S).
Queste due sottounità sono di dimensioni diverse: 30
S e 50 S nei procarioti. Il ribosoma assemblato ha una
costante di sedimentazione di 70 S. La sottounità 30 S
contiene una molecola di RNA ribosomiale 16 S (1542
nucleotidi)
e 21 molecole proteiche differenti; la sua massa
molecolare è di 900 KDa. La sottounità 50 S più grande
contiene due molecole di RNA ribosomiale, una molecola
23 S e una 5 S (rispettivamente 2904 e 120 nucleotidi).
Inoltre contiene 35 proteine e ha una massa molecolare
di 1600 KDa. Durante la sintesi proteica nella fase di
traduzione, le sottounità (dapprima separate) possono
essere riassemblate. I geni che codificano le proteine e
l'RNA ribosomiale sono noti per i batteri Escherichia coli.
Sono organizzati in operoni, assicurando il controllo della
sintesi dei componenti ribosomiali. Gli operoni dei geni
che codificano per l'rRNA hanno la seguente struttura:
Le sequenze nucleotidiche di questi geni, in particolare
quelle di rRNA16S, sono note per molte specie e
identificate nelle banche genetiche. Il confronto di
sequenze costituisce la base dei metodi di identificazione
molecolare.
4.1.4 Il nucleo e il materiale genetico
Il nucleo del batterio è costituito da un singolo
cromosoma circolare di DNA a doppia elica sospeso nel
citoplasma senza alcuna separazione. Le sue dimensioni
variano a seconda della specie. Nel Lactobacillus
plantarum, la sua lunghezza è di circa 2400 kb. È molto
più piccolo in Oenococcus oeni (circa 1400 kb) e
Pediococcus pentosaceus (1200 kb) (Daniel, 1993). Il
cromosoma trasporta le informazioni genetiche essenziali
di una cellula.
Altre funzioni più o meno vitali sono determinate dai
plasmidi. Queste piccole molecole di DNA circolari sono
completamente indipendenti dal cromosoma. Variano in
dimensioni e numero a seconda della specie e del ceppo
di batteri. In Oenococcus oeni vengono spesso identificati
plasmidi da 2 a 40 kb e uno di essi è stato sequenziato
(Fremaux et al., 1994). Finora non è stata loro attribuita
alcuna funzione di interesse enologico o fisiologico. In
generale, i plasmidi determinano funzioni come la
fermentazione di alcuni zuccheri, l'idrolisi delle proteine,
la resistenza ai fagi, agli antibiotici, ai metalli pesanti, ecc.
Nei batteri lattici del vino della specie Pediococus
damnosus è stato identificato un plasmide come
determinante della sintesi polisaccaridica. I ceppi che lo
contengono sono responsabili della cordialità dei vini
(Lonvaud-Funel et al., 1993). Questo plasmide è stato
interamente sequenziato. Ha tre regioni codificanti, una
delle quali è probabilmente responsabile della sintesi
 4. Batteri dell'acido lattico
dell'esolisaccaride (Sezione 5.4.4) poiché
probabilmente codifica per una glucosil transferasi
(Walling, 2003). Tipicamente, i plasmidi sono
relativamente instabili da una generazione all'altra, ma
alcuni, in Enococco oeni, manifestano un'immensa
stabilità. Altri si perdono facilmente in assenza di
pressioni ambientali. I plasmidi coniugativi possono
trasferirsi naturalmente da un ceppo all'altro, sebbene
questa proprietà non sia mai stata dimostrata per i
batteri lattici del vino. Il profilo plasmidico di un ceppo
può quindi variare.
4.1.5 Moltiplicazione dei batteri
Tutti i batteri si moltiplicano per divisione binaria
(Figura 4.1). Una cellula dà due cellule figlie
completamente identiche. La moltiplicazione
presuppone, da un lato, la divisione del materiale
nucleare e, dall'altro, la sintesi per la costruzione di
nuovi involucri cellulari ed elementi citoplasmatici, in
particolare ribosomi ed enzimi.
Il materiale genetico viene trasmesso dopo la
duplicazione del DNA cromosomico e dei plasmidi
potenzialmente esistenti. La replicazione del DNA,
secondo il meccanismo semi-conservativo, porta alla
formazione di due molecole identiche al cromosoma o
al plasmide parentale. La replicazione avviene quasi
durante l'intero ciclo cellulare a livello dei mesosomi.
Quando è finito, inizia la scissione del citoplasma.
Un setto si forma al centro della cellula come risultato
della sintesi di porzioni della membrana e della parete
cellulare. Separa la cellula madre a poco a poco in due
cellule figlie. Il materiale genetico e gli altri componenti
cellulari sono distribuiti simultaneamente tra di loro.
Infine, quando il setto è completamente formato, le
due cellule figlie si separano. La divisione cellulare e
nucleo non sono sincrone; la replica è più veloce.
Inoltre, un ciclo di replicazione può iniziare prima che
avvenga la divisione cellulare
completato. Per questo motivo, le cellule batteriche
nella loro fase di crescita attiva contengono più di un
cromosoma per cellula. Durante la divisione, i plasmidi
(molto più piccoli del cromosoma) non sono sempre
distribuiti correttamente tra le cellule dopo la loro
replicazione, da qui la loro instabilità nel corso delle
generazioni.
4.2 TASSONOMIA
L'obiettivo della tassonomia è identificare, descrivere
e
classificare i microrganismi. La classificazione viene
effettuata secondo diversi livelli gerarchici. Per i batteri, il
livello più alto corrisponde alla loro classificazione tra i
procarioti. Il livello più basso è la specie. In una specie di
batterio, i ceppi raggruppati condividono un numero di
caratteri identici. Questi caratteri li differenziano
radicalmente da altri ceppi.
I batteri lattici appartengono al gruppo dei Gram-positivi,
sulla base dei test del colore (Sezione 4.3.2). Il prodotto
principale del loro metabolismo del glucosio è l'acido
lattico.
4.2.1 Tassonomia fenotipica, tassonomia molecolare
e filogenesi
I fenotipi comprendono i caratteri morfologici, fisiologici,
biochimici e immunologici nel loro insieme e la
composizione di alcuni componenti cellulari. Alcuni
caratteri fenotipici sembrano variare in un dato ceppo, ad
esempio l'assimilazione di determinati zuccheri. Alcuni
ceppi aventi fenotipi diversi ma appartenenti alla stessa
specie sono ceppi atipici.
I progressi nella biologia molecolare forniscono nuovi
criteri di classificazione basati sull'analisi del genoma. La
tassonomia molecolare consiste nel classificare i batteri in
base alle somiglianze nel loro genoma. Esistono diversi
metodi che consentono diversi livelli di classificazione.
Un primo livello tiene conto della percentuale di basi di
guanina e citosina nel DNA - la (G + C)% rispetto al
numero totale. Due ceppi non sono necessariamente
correlati perché hanno lo stesso (G + C)%. In effetti, la
composizione di base non fornisce alcuna indicazione
della sequenza del DNA. Tra i Gram-positivi, i batteri lattici
appartengono al phylum Clostridium.Il (G + C)% di questo
phylum è inferiore al 50%. Gli attinomiceti il cui (G + C)% è
maggiore del 50% includono altri batteri importanti anche
per le industrie alimentari e delle bevande (Tabella 4.2). Il
ramo del Clostridium è costituito da tre gruppi: il primo
comprende i generi Lactobacillus, Pediococcus,
Leuconostoc, Oenococcus e Weissella; il secondo,
Streptococcus e Lactococcus; e il terzo, Carnobacterium,
Vagococcus ed Enterococcus (Gasser et al., 1994).
Dicks et al. (1995) hanno proposto una nuova specie,
Oenococcus oeni, di batteri precedentemente noti come
Leuconostoc oenos, attualmente l'unica specie del genere
Oenococcus. Questa proposizione era basata sulla
distanza filogenetica di O. oeni rispetto ad altri batteri
lattici.
 4. Batteri dell'acido lattico
L'omologia del DNA genomico consente la definizione
di specie batteriche in base alla loro sequenza
nucleotidica. L'omologia è misurata dalla percentuale
di riassociazione tra i filamenti di DNA del ceppo da
classificare e un ceppo tipo della specie. I filamenti
vengono isolati mediante denaturazione del DNA. Due
ceppi batterici appartengono alla stessa specie se la
percentuale di ibridazione è maggiore del 70%. Per un
valore inferiore, i ceppi fanno parte dello stesso
genere, a condizione che l'ibridazione rimanga
misurabile.
Il confronto della sequenza nucleotidica può essere
effettuato su porzioni del genoma piuttosto che
sull'intero genoma. Le porzioni scelte corrispondono a
funzioni essenziali, comuni ai ceppi da confrontare. I
geni che codificano la sintesi dei ribosomi, in
particolare per l'RNA ribosomiale (una molecola
conservata), sono un esempio degno di nota. Sono
possibili diversi tipi di analisi. In uno di essi, l'RNA 16 S
è influenzato dall'azione di un'endonucleasi di
restrizione. I minuscoli frammenti oligonucleotidici
inferiori a 20 bp vengono separati mediante
elettroforesi e quindi sequenziati, consentendo la
creazione di una banca dati. In questo modo è
possibile identificare sequenze specifiche per gruppi
di batteri. Può anche essere definito il coefficiente di
similarità tra i ceppi.
Un altro tipo di analisi consiste nel sequenziare l'RNA
16S, 23S e 5S. La sequenza di RNA 16S può fornire le
indicazioni più interessanti. Contiene zone conservate
e zone variabili: il confronto delle zone conservate è
valido per batteri lontani; Il confronto a zone variabili
può essere utilizzato su batteri strettamente correlati.
Il sequenziamento del 16 S rRNA divide i batteri
dell'acido lattico in tre gruppi filogenetici:
1. Il gruppo Lactobacillus delbrueckii contiene questa
specie e altri lattobacilli strettamente omofermentanti.
2. Il gruppo Leuconostoc è suddiviso in due
sottogruppi: uno contenente L. paramesenteroides e
lattobacilli eterofermentanti; l'altro contenente
Leuconostoc sensu stricto, a cui appartiene (sebbene
individualizzato) Oenococcus oeni.
3. Il gruppo Lactobacillus casei — Pediococcus è un
gruppo più eterogeneo poiché comprende specie
strettamente e facoltativamente eterofermative e
specie strettamente omofermentanti.
Il raggruppamento per mezzo di sequenze di 16 S
rRNA
si basa su relazioni filogenetiche tra batteri. Non
supporta il raggruppamento realizzato utilizzando
fenotipi, come morfologia e fisiologia. Allo stato attuale,
quindi, è difficile classificare i batteri lattici se riferiti sia al
fenotipo che al genoma. Restano utili i criteri fisiologici e
biochimici, ma il contributo della tassonomia molecolare è
considerevole e sembra più assoluto in quanto
direttamente correlato al patrimonio genetico di un
ceppo.
4.2.2 Classificazione dei batteri dell'acido lattico del
vino. Descrizione di Genera
I fermenti lattici del mosto d'uva e del vino appartengono
ai generi Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus e
Pediococcus. Oltre alla loro morfologia in forme coccali o
simili a bastoncelli, il carattere omofermentativo o
eterofermentativo è un fattore decisivo nella loro
classificazione. I batteri omofermentativi producono più
dell'85% di acido lattico dal glucosio. I batteri
eterofermentanti producono anidride carbonica, etanolo
e acido acetico oltre all'acido lattico.
Tra i cocchi, i batteri del genere Pediococcus sono
omofermentanti e quelli dei generi Leuconostoc e
Oenococcus sono eterofermentanti. I lattobacilli possono
presentare i due comportamenti. Sono divisi in tre gruppi:
• Gruppo I: rigorosi omofermentatori (questo gruppo non
è mai stato identificato nel vino).
• Gruppo II: eterofermentatori facoltativi. • Gruppo III:
eterofermentatori rigorosi.
I lattobacilli rigorosamente omofermentanti non
fermentano il pentosio e formano due molecole di acido
lattico da una molecola di glucosio tramite la via Embden-
Meyerhoff.
Negli eterofermentatori facoltativi (gruppo II), una
molecola di glucosio, come nel caso del gruppo I, porta a
due molecole di acido lattico, ma i pentosi
vengono fermentati in acido lattico e acetico mediante la
via eterofermentativa dei pentoso fosfati. I batteri
strettamente eterofermentanti del gruppo III non
possiedono la fruttosio 1,6-difosfato aldolasi che è
caratteristica della via di Embden-Meyerhoff. Fermentano
il glucosio in CO2, acido lattico e acetico ed etanolo per
via del pentoso fosfato e il pentosio in acido lattico e
acetico allo stesso modo dei batteri del gruppo II.
La tabella 4.3 elenca i batteri lattici più spesso riscontrati
nel mosto d'uva e nel vino. Oenococcus oeni è noto per
assicurare la fermentazione malolattica nella grande
 4. Batteri dell'acido lattico
maggioranza dei casi. Finora i lattobacilli
rigorosamente omofermentanti del Gruppo I non
sono stati isolati nel mosto o nel vino. Le specie sono
quindi suddivise in eterofermentanti facoltativi e
rigorosi per i lattobacilli e in omofermentatori
(Pediococcus) ed eterofermentatori (Leuconostoc) per
i cocchi. È probabile che questa classificazione venga
modificata, da un lato a causa dei progressi anticipati
nell'identificazione di nuove specie nel vino e,
dall'altro, a causa di eventuali riclassificazioni dei
lattobacilli nei gruppi sopra descritti.
Nessun batterio lattico possiede citocromo. Si
presume generalmente che l'attività della catalasi non
esista, ma diverse specie di batteri (Lactobacillus,
Pediococcus e Leuconostoc) possono sintetizzare una
pseudocatalasi non ematica dipendente dal
manganese. In molti ceppi è stata identificata
un'attività di catalasi emica.
Quella che segue è una descrizione generale di tre
generi di batteri lattici nel vino.
Genere Leuconostoc Oenococcus
• Celle non mobili, non sporulanti, sferiche o
leggermente allungate, assemblate a coppie o piccole
catene; diametro 0,5–0,7 μm, una lunghezza 0,7–1,2
μm.
• Anaerobiosi facoltativa.
• Chemio-organotropo: richiede un terreno ricco e
zuccheri fermentescibili.
◦
• Temperatura di crescita ottimale 20 - 30 C.
• Prodotti metabolici del glucosio: CO2, acido lattico
ed etanolo.
• L'arginina è metabolizzata da alcuni ceppi di
Oenococcus oeni, mentre altre specie di Leuconostoc
rispondono negativamente a questo test.
• (G + C)% dal 38 al 44%
• Nessun acido teicoico.
Genere Pediococcus
• Cellule non mobili, non sporulanti, a volte isolate,
sferiche (mai allungate); diametro 1 - 2 μm; divisione in
due piani ad angolo retto che porta alla formazione di
tetradi - senza catene.
• Anaerobiosi facoltativa.
• Chemio-organotropo: richiede un terreno ricco e
zuccheri fermentescibili.
• Prodotti metabolici del glucosio: acido lattico DL o L,
no CO2.
• (G + C)% dal 34 al 42%.
• Nessun acido teicoico.
Genere Lactobacillus
• Cellule allungate regolari, non mobili, non sporulanti.
0,5–1,2 μm per 1,0–10 μm, spesso a forma di bastoncino
lungo. Alcuni sono molto piccoli (quasi le stesse
dimensioni di Leuconostoc). Assemblati in coppia o in
catene di dimensioni variabili.
• Anaerobiosi facoltativa.
• Chemio-organotropo: richiede un terreno ricco e
zuccheri fermentescibili.
• Metabolismo fermentativo: almeno la metà dei prodotti
del metabolismo del glucosio è l'acido lattico. Il
metabolismo omofermentativo porta a questa unica
molecola. Il metabolismo eterofermentativo produce
anche acido acetico, etanolo e CO2.
• (G + C)% dal 36 al 47%.
• Molte specie contengono acido teicoico nella cellula
parete.
4.3 IDENTIFICAZIONE DEI BATTERI DELL'ACIDO
LATTICO
4.3.1 Principi generali
Dall'inizio della microbiologia, l'identificazione dei batteri
si è basata sui loro caratteri fenotipici (Sezione 4.3.2).
Oltre che per la sua morfologia, che fornisce poche
informazioni, un ceppo è identificato essenzialmente dai
substrati e dai prodotti del suo metabolismo. Quando
sono comparsi metodi analitici più discriminanti, anche la
composizione chimica dei microrganismi (acidi grassi e
proteine, sezione 4.3.8) ha partecipato alla loro
identificazione.
Più recentemente, e in maniera spettacolare, gli strumenti
della biologia molecolare hanno reso l'identificazione
ancora più precisa a livello di genere e specie e anche
all'interno della stessa specie. Per molto tempo, i batteri
lattici del vino sono stati identificati dai loro fenotipi. Ora,
con l'analisi del DNA, si ottengono risultati più affidabili
(Sezioni 4.3.3 - 4.3.6).
L'identificazione mediante analisi fenotipica di cloni isolati
nel vino pone spesso due tipi di problemi. Innanzitutto,
questi cloni sono difficili da moltiplicare in condizioni di
laboratorio. Sono necessarie numerose sottocolture per
ottenere una biomassa sufficiente per eseguire tutti i test.
Per gli stessi motivi, la risposta ai test biochimici nei test
API (sezione 4.3.2) può essere ambigua. Il cambiamento di
colore dell'indicatore non è evidente se il ceppo non si
moltiplica sufficientemente nel microtubo.
 4. Batteri dell'acido lattico
In secondo luogo, il carattere fenotipico, come
l'assimilazione di un substrato o la formazione di un
particolare prodotto, rappresenta il risultato di una
catena metabolica che dipende dalla totalità
dell'attività enzimatica cellulare. Perché un fenotipo
sia positivo, devono essere espressi tutti i geni che
codificano gli enzimi della catena particolare; anche gli
enzimi devono essere funzionali. L'induzione o la
repressione della sintesi enzimatica nonché le
inibizioni dovute a determinate condizioni del mezzo
possono quindi modificare un fenotipo.
La composizione del DNA dei ceppi è strettamente
specifica. Non è influenzato dalle condizioni della
cultura. Può, tuttavia, subire mutazioni puntuali nel
corso delle generazioni. Alla scala della coltura di
laboratorio, queste mutazioni non influenzano in
modo significativo le caratteristiche del DNA
genomico. L'identificazione del ceppo mediante analisi
genomica sembra quindi essere l'approccio più
affidabile. Esistono diversi tipi di analisi che
consentono diversi livelli di identificazione: ceppo,
specie, genere.
Il principio generale consiste nel cercare somiglianze
tra il DNA del ceppo non identificato e il DNA del
ceppo di riferimento. Esistono diversi metodi basati su
vari strumenti e proprietà della molecola di DNA. Lo
studio del polimorfismo di restrizione si basa
sull'azione specifica degli enzimi di restrizione.
L'ibridazione si basa sulla capacità delle catene di DNA
a filamento singolo di riassemblarsi in catene a doppio
filamento. La combinazione di questi due metodi e dei
vari usi di ciascun metodo amplia notevolmente le
possibilità di analisi.
Infine, la reazione a catena di polimerizzazione (PCR)
consente l'amplificazione di porzioni del genoma
delimitate da marcatori. Questi marcatori sono primer
(oligonucleotidi) che devono ibridarsi con la matrice
del DNA affinché inizi l'amplificazione. A seconda dei
primer scelti, il profilo elettroforetico dell'amplicone
ottenuto può consentire differenti livelli di
classificazione all'interno del genere o della specie.
4.3.2 Analisi fenotipica
L'analisi fenotipica comprende la morfologia,
l'assimilazione di diversi substrati e la natura dei
prodotti metabolici.
Le osservazioni morfologiche possono essere fatte con
cellule fresche ma sono più precise con preparazioni
fisse. L'osservazione microscopica può essere accoppiata
con il test di colorazione Gram, utilizzato per verificare
che i batteri siano Gram-positivi. Dopo che i batteri sono
stati posti sul vetrino ed essiccati alla fiamma di un becco
Bunsen, il preparato viene immerso prima in un colorante
viola, poi in una soluzione di alcol-acetone e infine in un
colorante rosa. La parete cellulare dei batteri Gram-
positivi non viene alterata dal solvente organico: questi
batteri mantengono la colorazione viola. Al contrario, i
batteri Gram-negativi sono di colore rosa. La forma
cellulare, coccale o simile a bastoncelli, è facile da
identificare, così come la disposizione delle cellule
(coppie, tetradi, piccole catene). In secondo luogo, viene
determinato il carattere omofermentativo o
eterofermentativo. Il ceppo non identificato viene
coltivato in un terreno con glucosio come fonte di
energia. Dopo la crescita cellulare, i prodotti metabolici
vengono caratterizzati e misurati. Un rilascio di CO2
manifesta il carattere eterofermentativo del ceppo.
Questo risultato viene regolarmente confermato
misurando le concentrazioni di acido acetico ed etanolo.
La loro presenza è anche la prova di un metabolismo
eterofermentante. Al contrario, la formazione esclusiva di
acido lattico attesta un carattere omofermentativo. In
condizioni colturali, i bacilli eterofermentanti facoltativi (ad
esempio Lactobacillus plantarum) hanno un metabolismo
omofermentativo rispetto al glucosio. Durante lo stesso
test è interessante determinare la natura ottica dell'acido
lattico formato dal glucosio. Questa analisi si avvale di un
processo enzimatico. I due stereoisomeri dell'acido
lattico: (L e D) vengono analizzati separatamente. Questa
forma di analisi è particolarmente adatta
all'identificazione di cocchi eterofermentanti (Oenococcus
oeni, Leu- conostoc mesenteroides), che formano solo
l'isomero D, e di Lactobacillus casei, che forma solo acido
L-lattico. identificazione a livello di genere: Lactobacillus
per morfologia, Pediococcus e Leuconostoc per
morfologia e determinazione del loro carattere
omofermentativo o eterofermentativo. La classificazione a
livello di specie si avvale dell'analisi dei profili fermentativi
di un gran numero di zuccheri.
Per questo tipo di analisi viene comunemente utilizzato il
sistema di identificazione API 50 CHL (Bio-Me ́ rieux). In
questo sistema vengono miniaturizzati i classici test che
un
 4. Batteri dell'acido lattico
tempo venivano eseguiti in provetta. Il ceppo non
identificato viene inoculato in un mezzo nutritivo che
contiene tutti i nutrienti, le vitamine e i sali a base di
azoto necessari per la sua crescita. Diverse fonti di
energia di carboidrati sono rappresentate in ogni
microtubo del sistema. In questo modo vengono
testate 49 sostanze, inclusi esosi, pentosi, disaccaridi,
ecc. Un indicatore nel mezzo di coltura, che cambia
colore, facilita la lettura dei risultati. La fermentazione
in microtubo acidifica il terreno, provocando il cambio
di colore dell'indicatore.
Per eseguire il test API si depositano 0,1 ml di
sospensio- ne batterica in ciascuna delle 50 microtubi.
Le provette sono sigillate con una goccia di paraffina
per garantire l'anaerobiosi. Generalmente, il sistema
viene incubato a 25 ° C per 24 ore. I tubi in cui il
colore cambia da blu a giallo indicano caratteri
positivi. In questo modo è possibile stabilire il profilo
di fermentazione del ceppo esaminato (Figura 4.6).
Questo metodo è ben adattato per l'identificazione di
numerosi batteri lattici, ma deve essere eseguito con
molta attenzione con batteri isolati nel vino.
L'esperienza ha dimostrato che il ceppo dovrebbe
prima essere sottoposto a diverse subcolture
successive nel terreno di laboratorio standard.
specie. La maggior parte dei ceppi per ciascuna specie
possiede Questa preparazione è essenziale per
ottenere la stabilità del profilo, indispensabile prima di
fare riferimento alla chiave di identificazione. In ogni
caso, un ceppo non può essere identificato solo su
questi risultati. I poteri discriminanti del metodo non
sono sufficienti e la somiglianza nei profili di
Lactobacillus plantarum e Leuconostoc
mesenteroides dimostra questo punto. Tutti gli altri
fenotipi in precedenza
allo stesso tempo devono essere presi in
considerazione anche quelli descritti. Questi caratteri
nel loro insieme rendono possibile la determinazione
di una specie senza troppe ambiguità, facendo
riferimento al manuale di Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology (1986).
Le tabelle 4.4 e 4.5 riassumono i caratteri fenici usati
per determinare il genere e i profili fermentativi che
corrispondono a quelli elencati nella tabella 4.5.
Tuttavia, oltre alle differenze che possono essere
introdotte dalla precoltura del ceppo prima del test, si
deve tener conto della variabilità intraspecifica più
pronunciata di alcuni caratteri. Ad esempio, Leuconostoc
(in particolare Oenococcus oeni) è stato a lungo ritenuto
non possedere il carattere di idrolisi dell'arginina, ma
studi recenti hanno dimostrato che numerosi ceppi di
Oenococcus oeni possiedono tutte le apparecchiature
enzimatiche necessarie per idrolizzare l'arginina,
portando alla produzione di citrullina, ornitina e carbamil
fosfato (Liu et al., 1994; Makaga, 1994). L'attività di idrolisi
dipende dalle condizioni ambientali che determinano non
solo l'attività enzimatica ma anche la sua sintesi. Inoltre,
l'operone “arco”, contenente i geni codificanti per i vari
enzimi nella via metabolica, è stato identificato e
sequenziato in ceppi di O. oeni (Tonon et al., 2001).
L'uso dei profili fermentativi come metodo di
identificazione dovrebbe quindi essere standardizzato. I
caratteri batterici possono quindi essere espressi nel
modo più riproducibile possibile. Infine, questi test
mettono i batteri in condizioni metaboliche e di crescita
ottimali, non danno alcuna indicazione del loro vero
metabolismo nel vino. La fermentazione di un carboidrato
presente nel sistema API 50 CHL può essere del tutto
impossibile nel vino: le sue condizioni nutrizionali sono
lontane da quelle del mezzo sintetico. Al contrario, un
substrato che non può essere metabolizzato in condizioni
ottimali può essere metabolizzato nel vino a causa delle
regolazioni metaboliche totalmente diverse in gioco.
4.3.3 Estrazione e visualizzazione del DNA per lo
studio genomico
Prima dell'analisi, l'intero DNA genomico dei batteri deve
essere separato dai lipidi, glucidi e proteine che
costituiscono la cellula. I protocolli di estrazione per i
batteri dell'acido lattico includono tutte le fasi di lisi
cellulare, deproteinizzazione e precipitazione del DNA. Ci
sono lievi differenze tra i protocolli (Lonvaud-Funel et al.,
1989). La lisi delle cellule Gram-positive è ottenuta
dall'azione del lisozima. I peptidoglicani vengono
idrolizzati
per formare protoplasti, che sono sottoposti all'azione di
SDS - un potente detergente che distrugge le membrane
e libera il contenuto cellulare. L'aggiunta di fenolo, il più
delle volte miscelato con cloroformio e alcol isoamilico, fa
precipitare le proteine. Le fasi organica e acquosa
vengono
 4. Batteri dell'acido lattico
separate per centrifugazione. Le proteine denaturate
si assemblano insieme all'interfase. La fase fenolica
inferiore contiene i lipidi e le proteine; la fase
superiore contiene il DNA disciolto.
Il fenolo viene eliminato da questa fase mediante
estrazioni successive con una miscela di cloroformio,
alcool e alcool isoamilico. Il DNA è precipitato
dall'etanolo in presenza di sali. Può essere conservato
a −20 ° C dopo essere stato sciolto in un tampone.
L'elettroforesi è la tecnica più popolare, semplice e
affidabile per analizzare l'estratto di DNA. A un pH
alcalino, i gruppi di fosfato del DNA vengono ionizzati.
Le molecole poste in un campo elettrico migrano
quindi verso l'anodo. In un gel viscoso (il più delle
volte agarosio), la mobilità elettroforetica dipende
dalle dimensioni e dalla conformazione delle
molecole. Più piccole sono le molecole lineari, più
velocemente migrano. Le molecole circolari di uguale
dimensione sono meno mobili delle molecole lineari. I
plasmi, ad esempio, esistono in forma circolare e
circolare a spirale. La dimensione del DNA lineare è
facilmente calcolabile dalla distanza di migrazione dei
marcatori di peso del DNA. Esiste una relazione
inversa tra la mobilità e il logaritmo della dimensione
della molecola. Le molecole separate dall'elettroforesi
sono rivelate da una colorazione a base di bromuro di
etidio. Questo composto è un analogo di una base
aromatica; si intercala nel DNA e diventa arancione
fluorescente alla luce ultravioletta.
Gli enzimi, infatti, agiscono su siti specifici,
riconoscendo sequenze palindromiche generalmente
da quattro a sette nucleotidi sui due filamenti di DNA.
L'enzima Eco RI, ad esempio, idrolizza il DNA secondo
il seguente schema:
5′−G AATT C−3′
3′−C TTAA G−5′
A seconda della sequenza riconosciuta, il numero di
siti tagliati sul polinucleotide varia, ma è sempre
identico per un dato enzima e nucleotide. Da un lato,
è possibile ottenere diversi frammenti di dimensioni e
numero diversi dallo stesso DNA utilizzando una
varietà di enzimi di restrizione disponibili. D'altra
parte, la restrizione di DNA diverso da parte dello
stesso enzima porta a frammenti di dimensioni
diverse.
I prodotti di restrizione vengono analizzati mediante
elettroforesi. I profili caratteristici sono ottenuti dopo
rivelazione per colorazione. Considerando il numero e la
sequenza dei nucleotidi, gli enzimi che tagliano
statisticamente il DNA troppo spesso produrranno profili
complessi che sono difficili da studiare. Se il numero di siti
di taglio è molto basso, i profili sono più semplici ma la
lunghezza dei frammenti prodotti richiede l'uso
dell'elettroforesi a campo pulsato per separarli. Questa
tecnica è molto affidabile e ben adattata per
l'identificazione dei lieviti ma rimane molto difficile da
usare per i batteri (Daniel, 1993).
Il polimorfismo di restrizione non è rilevante per
l'identificazione delle specie batteriche. Non esiste alcun
tipo di profilo per Oenococcus oeni, ad esempio, né per
ciascuna delle altre specie di interesse per la vinificazione.
Questo metodo sembra più adatto alla differenziazione di
ceppi della stessa specie. È quindi facile identificare i
ceppi di O. oeni, in seguito all'idrolisi del loro DNA da
parte dell'enzima NotI con siti di restrizione rari. Questo
metodo viene utilizzato per monitorare lo sviluppo di
ceppi selezionati inoculati, utilizzati durante la
vinificazione per favorire la fermentazione malolattica. Il
profilo di restrizione della biomassa raccolta nel vino
durante la fermentazione malolattica viene confrontato
con quello del ceppo selezionato aggiunto (Gindreau et
al., 1997; 2003).
4.3.5 Identificazione mediante ibridazione DNA /
DNA della sonda specifica
L'ibridazione è una tecnica spesso utilizzata nella genetica
molecolare ed è molto ben adattata per l'identificazione
di specie e persino ceppi. La tecnica si basa sulla capacità
del DNA a doppia elica di separarsi, reversibilmente, in
due singoli filamenti, in determinate condizioni che
distruggono i loro legami idrogeno. Insieme alla forza
ionica del mezzo, la temperatura è il parametro
determinante della denaturazione del DNA. Un aumento
della temperatura provoca la separazione dei due fili, che
si riassociano al diminuire della temperatura.
In condizioni ambientali favorevoli, le catene possono
riassociarsi se le sequenze nucleotidiche presenti sono
complementari. Ad esempio, gli oligonucleotidi delle
seguenti sequenze si ricombinano: 5′- ATGCAATTGGCC-e
3′-TACGTTAACCGG-.
Un'ibridazione è costituita da due singoli filamenti,
ciascuno proveniente da cellule diverse, che si riassociano
a causa delle loro sequenze complementari.
 4. Batteri dell'acido lattico
Questa proprietà viene utilizzata per l'identificazione e
i ceppi sono considerati appartenenti alla stessa
specie se hanno un'omologia del 70% della loro
sequenza di DNA genomico.
Il DNA di un ceppo di riferimento è necessario per
identificare un ceppo mediante ibridazione del DNA.
Uno dei due frammenti (il più delle volte il DNA di
riferimento) costituisce la sonda isotopica o la sonda
marcata con un analogo di base di derivazione
chimica. Una sonda è un frammento di DNA a
filamento singolo che si combina con la sequenza
complementare del DNA bersaglio.
Queste operazioni sono schematizzate nella Figura
4.7. Il DNA bersaglio (il DNA del ceppo non
identificato) viene fissato e denaturato su una
membrana di nylon. La membrana viene quindi posta
in un tampone di ibridazione senza sonde. Durante
questa fase di pre-ibridazione, tutti i siti non specifici
sul nylon vengono saturati da una miscela di
macromolecole. Queste molecole non hanno affinità
per la sonda. L'ibridazione avviene nelle stesse
condizioni fisico-chimiche dopo l'aggiunta della sonda
DNA marcata. Alla fine di questa fase, i singoli filamenti
della sonda di DNA si saranno fortemente combinati
con il DNA bersaglio complementare, ma anche più
debolmente con DNA avente sequenze meno simili.
La rivelazione viene utilizzata per localizzare il DNA
bersaglio che corrisponde veramente agli ibridi di
ceppi della stessa specie.
Pertanto, questo passaggio viene eseguito dopo
l'eliminazione della sonda e dei filamenti di DNA che
presentano poca omologia. I lavaggi successivi con
tamponi ionici di forza decrescente sono molto
importanti e
partecipare alla specificità e alla sensibilità di questo
metodo. Il processo di rivelazione si avvale
dell'autoradiografia per le sonde isotopiche e delle
reazioni immunoenzimatiche per le sonde non
isotopiche più spesso utilizzate.
A seconda del problema da risolvere, la sonda viene
preparata dall'intero DNA o da uno specifico
frammento di DNA. Nel primo caso è possibile
identificare le specie di un ceppo sconosciuto. Nel
secondo caso possono essere identificati ceppi che
possiedono un gene specifico e di conseguenza una
proprietà funzionale caratteristica.
La maggior parte dei batteri lattici del vino possono
essere identificati a livello di specie in questo modo. La
prima sonda funzionante è stata sviluppata per la specie
Oenococcus oeni. È stato creato utilizzando il DNA totale
di diversi ceppi presi come riferimento (Lonvaud-Funel et
al., 1989). Le sonde del DNA di O. oeni non si ibridano con
il DNA genomico di altre specie; è vero anche il contrario.
La presenza del batterio della specie O. oeni può essere
identificata anche in una miscela contenente altri batteri.
Successivamente, questo metodo si è dimostrato ben
adattato anche ad altre specie presenti nel mosto d'uva e
nel vino (Tabella 4.6) (Lonvaud-Funel et al., 1991b).
Tuttavia, la somiglianza delle specie L. hilgardii e L. brevis
ha reso necessario lo sviluppo di una sonda più specifica
mirata a L. hilgardii (Sohier et al., 1999).
Ibridando la sonda direttamente con il DNA delle colonie
di batteri, questo metodo diventa notevolmente più
interessante della precedente tecnica di ibridazione della
sonda con il DNA estratto dal ceppo e poi posto su una
membrana. Nella nuova tecnica, la membrana di nylon
viene posizionata sulla superficie di una capsula di Petri
dopo lo sviluppo delle colonie. Viene quindi trattato
successivamente in diversi tamponi e reagenti che
provocano la lisi dei batteri e l'immobilizzazione del DNA
sulla membrana. Seguono le fasi di preibridazione;
Vengono quindi effettuati l'ibridazione e i lavaggi. In
queste condizioni si può facilmente studiare una
popolazione mista di batteri lattici. Infatti, dopo una prima
ibridazione della membrana con una data sonda, la
deibridazione e quindi la reibridazione con una seconda
sonda permettono la localizzazione di cloni appartenenti
ad un'altra specie. Almeno cinque specie diverse possono
essere rilevate successivamente in una miscela con
questo sistema (Figura 4.8) (Lonvaud-Funel et al., 1991a).
Grazie a questo metodo, preparando sonde che
rappresentano le otto specie più spesso
incontrate in enologia, le dinamiche di ciascuna specie
sono state studiate per la prima volta durante la
vinificazione.
L'ibridazione DNA / DNA è anche un ottimo strumento
per identificare ceppi che differiscono nel fenotipo ma
appartengono alla stessa specie. La differenza sta in una
funzione metabolica che dipende dalla presenza di uno o
più enzimi e quindi dalla presenza dei geni
corrispondenti. In questo caso, la sonda viene preparata
da un frammento di DNA che rappresenta tutto o parte
del gene.
 4. Batteri dell'acido lattico
Allo stato attuale in enologia, due casi particolari
vengono analizzati in questo modo: ceppi di
Pediococcus damnosus, responsabili della malattia
della corda, e ceppi che producono istamina, in
particolare O. oeni. Studi preliminari hanno
dimostrato che i ceppi di P. damnosus in grado di
sintetizzare il polisaccaride del "vino filante"
possiedono un plasmide supplementare,
contrariamente ai ceppi normali. Il carattere ropy è
legato alla presenza di questo plasmide. Un
frammento è stato clonato in E. coli e ora costituisce il
materiale di base per la preparazione della sonda. In
questo modo, l'ibridazione delle colonie consente
l'identificazione di cloni "ropy" anche se mescolati con
altri cloni di Pediococcus o altre specie di batteri.
Questo metodo viene utilizzato abitualmente per
identificare questa popolazione indesiderata nella
microflora dei vini alla fine della vinificazione e durante
l'invecchiamento (Lonvaud-Funel et al., 1993).
L'altra sonda specifica clonata viene preparata da un
frammento di gene di istidina decarbossilasi. Questo
enzima catalizza la decarbossilazione dell'istidina in
istamina. L'ibridazione di un batterio con questa
sonda, a più della metà della lunghezza del gene,
significa che il ceppo possiede il gene (Le Jeune et al.,
1995). La presenza di questi ceppi nel vino molto
probabilmente aumenta la concentrazione di
istamina. Durante la vinificazione, e anche
l'invecchiamento, questi ceppi in particolare possono
essere contati per ibridazione di colonie.
4.3.6 Identificazione mediante reazione a catena
di polimerizzazione (PCR)
La PCR consiste nell'utilizzare la polimerizzazione per
amplificare uno o più frammenti di DNA, localizzati da
sequenze specifiche. Il prodotto ottenuto esiste in
quantità sufficienti per essere facilmente rivelato
mediante elettroforesi. Questo metodo include una
reazione enzimatica per la sintesi del DNA che
richiede primer e uno stampo. La polimerasi copia il
DNA bersaglio partendo dal primer a 3 ′ verso 5 ′. La
tecnica PCR utilizza due primer oligonucleotidici, scelti
per le loro sequenze complementari: ognuno è
complementare a un singolo filamento del DNA
bersaglio. La sintesi viene effettuata tra i due primer
mediante una polimerasi. Il prodotto estensionale di
uno dei primer funge da modello per l'altro dopo la
denaturazione. La ripetizione di cicli comprendenti la
ricottura del primer, le reazioni di estensione e la
denaturazione porta ad un accumulo di molecole
neosintetizzate identiche, affiancate dagli oligonucleotidi
scelti (Capitolo 1, Figura 1.21).
Affinché le tre fasi dell'amplificazione abbiano successo e
per evitare manipolazioni complicate del campione
durante la moltiplicazione, è necessario un enzima
resistente alla temperatura. L'uso della Taq polimerasi ha
risolto questo problema; è termoresistente e funziona a
temperature elevate fino a 72 ° C. I cicli vengono quindi
ripetuti, generalmente da 30 a 40 volte. In questo modo
viene prodotta una grande quantità di frammenti di DNA
specifici determinati dai primer. Teoricamente, 2n
frammenti bersaglio si ottengono dopo n cicli.
L'apparecchiatura automatica attualmente in uso
permette di programmare i diversi parametri delle tre fasi
di ogni ciclo. Da una singola copia di un frammento di
DNA, è possibile ottenere un numero sufficiente di copie
per poterle visualizzare facilmente dopo la colorazione
con bromuro di etidio. I prodotti della PCR vengono
analizzati mediante elettroforesi. Se viene rivelata una
banda fluorescente con la dimensione prevista, significa
che la matrice del DNA conteneva la sequenza identificata
dai primer. Pertanto, all'interno di un genoma con circa
due milioni di nucleotidi, come quello di Enococcus oeni,
è possibile determinare se è presente o meno un gene o
un frammento di gene lungo diverse centinaia di
nucleotidi.La specificità della PCR si basa sul livello di
ibridazione tra gli oligonucleotidi e lo stampo. Dipende
quindi dalla sequenza e dalla lunghezza del primer, dalla
forza ionica del mezzo, dalla temperatura e dalla
concentrazione di ioni Mg2 +. La scelta dei primer può
essere molto precisa quando si conosce la sequenza delle
regioni confinanti con la zona da amplificare. L'uso di
primer casuali fornisce anche risultati preziosi, quando il
genoma dei batteri è totalmente sconosciuto.
Il valore principale della PCR è la sua sensibilità. La
presenza di un gene in un piccolo numero di cellule può
generare una quantità di DNA facilmente analizzabile
mediante elettroforesi su gel. In enologia, la PCR viene
utilizzata anche per identificare i due problemi descritti in
precedenza, attraverso l'uso di sonde specifiche per
ceppo "ropy" e per ceppi produttori di istamina. La
reazione di amplificazione è molto specifica; la
dimensione del frammento amplificato viene verificata
dopo l'elettroforesi. Questi ceppi di batteri indesiderati
vengono quindi rilevati in una miscela di altri batteri,
anche se sono pochi in numero L'amplificazione PCR
utilizzando una regione del gene dell'istidina
decarbossilasi consente di identificare i batteri che
possono produrre istamina, indipendentemente dalla
specie (Coton et al., 1998). Il sequenziamento del
plasmide dei batteri che hanno
 4. Batteri dell'acido lattico
prodotto il glucano ha portato all'identificazione del
gene dps responsabile di questo effetto. I primer sono
stati selezionati per la rilevazione mediante PCR di
questi batteri direttamente nel vino (Gindreau et al.,
2001). Ora è anche possibile rilevare i batteri lattici
che scompongono il glicerolo per produrre acroleina
(Claisse e Lonvaud-Funel, 2001) così come quelli che
decarbossilano la tirosina per formare la tiramina.
La PCR avrà presto un'altra applicazione nel nostro
dominio per la differenziazione di ceppi della stessa
specie. Per il momento vengono utilizzati primer
casuali. In questo caso, le reazioni amplificano diverse
zone del genoma del batterio. Dopo l'elettroforesi, i
prodotti di amplificazione forniscono un profilo che
può essere caratteristico del ceppo. La difficoltà sta
nel trovare i primer. Quelli più adatti per riconoscere i
ceppi devono fornire un profilo per ogni ceppo in
modo riproducibile. Tra i batteri lattici nel vino, questo
processo è stato applicato solo ai ceppi di O. oeni.
L'applicazione principale è nel monitoraggio di batteri
selezionati per la fermentazione malolattica.
La PCR è uno strumento utile, soprattutto per la sua
grande sensibilità e velocità. Questo metodo integra il
metodo di ibridazione delle colonie mediante sonde
specifiche, ei due metodi consentono la diagnosi
precoce (PCR) e la quantificazione (sonde specifiche)
di ceppi batterici che alterano il vino. Tuttavia, nel
prossimo futuro, è probabile che la PCR quantitativa
sviluppata più di recente in tempo reale fornisca dati
quantitativi con tutta l'accuratezza e la velocità della
PCR. In futuro, altri metodi di analisi del genoma
permetteranno probabilmente di identificare con
maggiore certezza le specie meno comuni al vino.
Queste specie sono interessanti per il loro
metabolismo o per la loro resistenza al vino
processi di stabilizzazione. La ribotipizzazione, ad
esempio, consiste nell'ibridare il DNA genomico con
una sonda preparata dal DNA che codifica i geni
ribosimali. Prima di questo processo, il DNA genomico
deve essere prima sottoposto all'azione degli enzimi
di restrizione e sottoposto a separazione mediante
elettroforesi. Questo metodo, che consente l'analisi di
modelli di ibridazione semplificati, è stato utilizzato
per studiare alcuni ceppi di L. hilgardii e L. brevis. I tipi
di profilo consentono di classificare i ceppi in due
specie che corrispondono veramente ai fenomeni
abituali descritti (Le Jeune e Lonvaud-Funel, 1994).
4.3.7 Identificazione per composizione di acidi grassi
e proteine
Oltre alle loro caratteristiche fenotipiche, la composizione
proteica e degli acidi grassi dei batteri è determinata
anche dalla massa di informazioni nel genoma e può
quindi essere utilizzata a scopo di identificazione. In
entrambi i casi, questi componenti risultano da una
successione di sintesi geneticamente determinate. Le
differenze nella composizione di acidi grassi e proteine
riflettono quindi le differenze tra i ceppi. Possono anche
portare all'identificazione del genere e della specie.
Gli acidi grassi totali vengono dosati sotto forma di esteri
dopo la saponificazione. L'analisi utilizza la cromatografia
in fase gassosa (Roze`s, 1993). Anche se questa analisi è
affidabile, deve essere usata con cautela per
l'identificazione; infatti diversi studi hanno chiaramente
dimostrato che, per un dato batterio lattico, sono sempre
rappresentati gli stessi acidi grassi, ma la loro proporzione
varia sensibilmente a seconda della fase del ciclo cellulare
e ancor più delle condizioni fisico-chimiche di crescita. Le
modifiche riguardano essenzialmente il livello di
saturazione e la lunghezza delle catene di carbonio.
Inoltre, per una data specie, i ceppi sono in grado di
sintetizzare acidi grassi a catena molto lunga (più di 20
atomi di carbonio) per adattarsi alla crescita in un
ambiente alcolico (Desens, 1989; Kalmar, 1995).
I batteri possono quindi essere identificati dalla loro
composizione in acidi grassi totali solo quando la coltura
delle cellule da analizzare è standardizzata. Anche se
questo metodo non sembra facile da usare, merita di
essere menzionato. Nel genere Pediococcus, è stato
utilizzato per caratterizzare tre gruppi in cui sono
classificate sei specie. P. damnosus e P. pentosaceus,
riscontrati in enologia, appartengono a due di questi
gruppi. Gli autori di questo lavoro (Uchida e Mogi, 1972)
hanno osservato che l'età della coltura e le condizioni
ambientali modificano le proporzioni degli acidi grassi
senza influenzare la separazione dei gruppi. Le proteine
cellulari dei batteri costituiscono un altro livello di
espressione genomica. La sequenza amminoacidica delle
proteine è il risultato di una traduzione diretta dei geni. È
quindi normale distinguere i batteri l'uno dall'altro dalle
proteine che contengono. La struttura primaria
determina la mobilità delle molecole in un gel
elettroforetico in condizioni in cui le strutture secondaria,
terziaria e quaternaria sono denaturate. Questo metodo
di identificazione prevede quindi di sottoporre il
contenuto
 4. Batteri dell'acido lattico

cellulare totale dei batteri a elettroforesi. Dopo la
colorazione, i profili proteici vengono confrontati
visivamente o mediante analisi assistita da computer. I
profili elettroforetici sono riproducibili. Sono
standardizzati da marcatori necessari per confrontare
diversi gel.
Secondo Kersters (1985), i profili proteici dei ceppi
sono identici quando il loro DNA presenta
un'omologia maggiore del 90%; sono molto simili fino
al 70%. I ceppi possono quindi essere identificati in
questo modo a livello di specie. Tuttavia, come per il
metodo che utilizza gli acidi grassi, tutte le seguenti
condizioni devono essere rigorosamente
standardizzate: condizioni di coltura batterica; il
momento del campionamento; estrazione; e
protocollo elettroforetico. Recentemente, i batteri
lattici che alterano i vini fortificati sono stati scoperti in
questo modo: O. oeni (Dicks et al., 1995) e diverse
specie di lattobacilli (L. hilgardii, L. fructivorans, L.
collinoides e L. mali - gli ultimi tre sono rari) (Couto e
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 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
5.1 GENERALITÀ: UNA REVISIONE
Il metabolismo rappresenta le reazioni biochimiche di
degradazione e sintesi effettuate dalla cellula batterica
durante la moltiplicazione. Le reazioni cataboliche
forniscono energia, trasformando substrati
dall'ambiente o sostanze di riserva della cellula; le
reazioni anaboliche garantiscono la sintesi cellulare da
substrati ambientali e prodotti di catabolismo
intermedio.
I batteri lattici sono chemiotrofici: trovano l'energia
necessaria per il loro intero metabolismo
dall'ossidazione dei composti chimici. L'ossidazione
dei substrati rappresenta la perdita di elettroni che
deve essere accettata da un'altra molecola, che viene
ridotta. La maggior parte delle ossidazioni si liberano
simultaneamente protoni ed elettroni. Il trasporto di
queste due particelle all'accettore finale può attivare
una catena di successive ossidazioni-riduzioni.
Così l'ossidazione biologica di un substrato è sempre
accoppiata con la riduzione di un'altra molecola. Nella
seguente reazione di ossidoriduzione la sostanza
ossidata è indicata come DH2 e l'ultimo accettore di
elettroni e protoni come A:
DH2 → D + 2H + + 2e− + energia A + 2H + + 2e− → Nell'anaerobiosi, la molecola ridotta può anche essere
AH2
La reazione complessiva è:
DH2 + A → AH2 + D + energia.
La natura dell'accettore finale di elettroni A determina
il tipo di metabolismo: fermentativo o respiratorio. La
presenza di ossigeno distingue anche i microrganismi
aerobici e anaerobici.
Nell'aerobiosi, gli elettroni e i protoni vengono
trasportati all'ossigeno, che viene spesso ridotto
all'acqua. Questo processo è chiamato respirazione
aerobica. Il sistema di trasporto è costituito da un
gruppo di citocromi. Il flusso protonico crea una forza
motrice protonica, che permette la sintesi delle
molecole di ATP. La conservazione dell'energia di
ossidazione è assicurata dalla sintesi del legame
pirofosato dell'ATP. Questo legame genera energia
quando viene idrolizzato. Questo sistema non esiste
nei batteri dell'acido lattico, sebbene alcune specie
possano sintetizzare citocromi da precursori.
Alcuni batteri dell'acido lattico riducono l'ossigeno
dall'ambiente formando perossido di idrogeno
secondo la seguente reazione: O2 + 2e− + 2H+ → dal punto di vista energetico.
H2O2
Il perossido di idrogeno deve essere eliminato poiché è
tossico. Le cellule che non sono in grado di eliminarlo non
possono svilupparsi in presenza di ossigeno: sono
anaerobi stretti. A seconda del loro comportamento nei
confronti dell'ossigeno, i batteri lattici sono classificati
come anaerobi stretti, anaerobi facoltativi, microaerofili o
aerotolleranti. La distinzione tra queste diverse categorie
è spesso difficile da stabilire per un dato ceppo.
La maggior parte dei batteri lattici tollerano la presenza di
ossigeno ma non lo usano nei meccanismi di produzione
di energia. A seconda della specie, utilizzano percorsi
diversi per eliminare il perossido tossico, attivando le
perossidasi che utilizzano l'NADH come riduttore: una
superossido dismutasi, una pseudo catalasi e talvolta ioni
Mn2 + (Desmazeaud e Roissart, 1994). Ad oggi, questo
argomento non è stato studiato specificamente per le
specie isolate nel vino.
Se l'ultimo accettore di elettroni e protoni è uno ione
minerale (solfato, nitrato), il microrganismo funziona
nell'anaerobiosi, ma è ancora coinvolto un meccanismo
respiratorio. Questo processo è chiamato respirazione
anaerobica.
una sostanza endogena, uno dei prodotti del
metabolismo. Questo è il caso della fermentazione.
Nei batteri lattici, questa molecola è piruvato. Si riduce in
lattato nella reazione che caratterizza la fermentazione
→
lattica: pyruvate + NADH + H+ −− lactate + NAD+
Contrariamente alla riossidazione del coenzima da parte
della catena respiratoria, questa reazione non è energia
producendo.
Altri tipi di reazioni possono portare all'ATP
sintesi. Si verificano in aerobiosi o anaerobiosi. Durante
queste reazioni, l'ossidazione del substrato accompagna
la creazione di un legame ricco di energia tra il carbonio
ossidato e una molecola di fosfato:
→
XH2 +[Pi] X∼P+2H+ +2e−
L'energia del legame esterfosforico è quindi
immagazzinato in un legame pirofosfato:
X∼P+ADP--- → X+ATP
In questo modo il fosfoenolpiruvato e l'acetilfosfato
possono trasferire il loro gruppo fosfato all'ADP nello
stesso tipo di reazione. Le due molecole intermedie nel
catabolismo dello zucchero sono quindi molto importanti
 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
5.2 METABOLISMO DEGLI ZUCCHERI DA PARTE
DEI BATTERI DELL'ACIDO LATTICO
L'ossidazione degli zuccheri costituisce la principale
via di produzione di energia. Questa energia è
essenziale per la crescita batterica. Nei batteri lattici, la
fermentazione è la via per l'assimilazione degli
zuccheri. Per una data specie, il tipo di zucchero
fermentato e le condizioni ambientali (presenza di
accettori di elettroni, pH, ecc.) Modificano la resa
energetica e la natura dei prodotti finali.
La membrana citoplasmatica è un'efficace barriera
che separa l'ambiente esterno dal citoplasma
cellulare. Sebbene permeabile all'acqua, ai sali e alle
molecole a basso peso molecolare, è impermeabile a
molte sostanze organiche.
Vari lavori descrivono i diversi sistemi di trasporto
attivo dello zucchero nei batteri lattici. Sono per la
maggior parte dipendenti dall'ATP e attivano sistemi
enzimatici, a volte complessi. Questi sistemi sono
specifici per gli zuccheri trasportati. I batteri
eterofermentanti, in particolare le specie che
interessano gli enologi, non sono stati studiati in
profondità, ma è altamente probabile l'esistenza di
sistemi di trasporto attivi che utilizzano permeasi
dipendenti dall'ATP.
I batteri lattici dei generi Lactobacillus, Leuconostoc e
Pediococcus assimilano gli zuccheri mediante una via
omofermentativa o eterofermentativa. Tra i cocchi, i
batteri Pediococcus sono omofermentativi, mentre
Leuconostoc e Oenococcus sono eterofermentativi.
Nei lattobacilli, gli eterofermentanti e gli
omofermentanti sono distinti in base al percorso
utilizzato per la degradazione dell'esoso. I pentosi,
quando degradati, vengono metabolizzati mediante
eterofermentazione.
5.2.1 Metabolismo omofermentativo degli esosi
I batteri omofermentanti trasformano quasi tutti gli
esosi che usano, specialmente il glucosio, in acido
lattico. A seconda della specie, si forma l'isomero
lattico L o D (vedi Capitolo 4). La via omofermentativa
o via Embden-Meyerhof comprende una prima fase
che contiene tutte le reazioni di glicolisi che portano
dall'esosio al piruvato. In questa fase avviene la
reazione di ossidazione che genera il coenzima ridotto
NADH + H +. Questo percorso è utilizzato da
numerose cellule. Per gli organismi aerobici, questo
percorso è seguito dal ciclo dell'acido citrico o di
Krebs.
Nei batteri lattici, la reazione della seconda fase
caratterizza la fermentazione lattica. Il coenzima ridotto
viene ossidato in NAD + durante la riduzione del piruvato
in lattato.
Le reazioni della glicolisi sono elencate nella Figura 5.1.
Nella prima fase, la glucochinasi fosforila il glucosio in
glucosio 6-P (glucosio 6-fosfato). Questa molecola subisce
quindi un'isomerizzazione per diventare fruttosio 6-P.
Un'altra fosforilazione porta alla formazione di fruttosio
1,6-difosfato.
In questa fase, le due reazioni più importanti si sono già
verificate. Attivano le chinasi che richiedono ioni bivalenti
(Mg2 +, Mn2 +) e utilizzano ogni volta una molecola di
ATP. Uno di questi, la fosfofruttochinasi, un enzima
allosterico controllato dall'ATP, determina la velocità della
glicolisi.
Il fruttosio 1,6-difosfato viene quindi suddiviso in due
molecole di triosefosfato. Questa reazione è catalizzata
dall'aldolasi, un enzima chiave della via glicolitica. I batteri
omofermentanti presentano un'elevata attività di fruttosio
1,6-difosfato aldolasi. I prodotti di questa reazione sono
glicerina-aldeide 3-P e diidrossiacetone-P.
Solo la gliceraldeide 3-P persegue la via di trasformazione.
Il diidrossiacetone-P viene rapidamente isomerizzato in
gliceraldeide 3-P. In realtà, l'equilibrio tra queste due
molecole favorisce il diidrossiacetone-P, ma è
continuamente invertito, poiché la gliceraldeide 3- P viene
eliminata dalla reazione che segue. Nella fase successiva
iniziano i processi di produzione di energia. La
gliceraldeide 3-P viene ossidata in 1,3-difosfoglicerato.
Una fosforilazione da fosfato inorganico accompagna
l'ossidazione. Il coenzima NAD + è ridotto a NADH + H +.
Queste reazioni consentono la sintesi di un legame acil-
fosfato - un legame ad alto potenziale energetico.
Durante l'idrolisi di questo legame, la reazione
immediatamente successiva recupera l'energia mediante
la sintesi di una molecola di ATP.L'1,3-difosfoglicerato
viene trasformato in 3-P glicerato. Questa molecola
subisce un riarrangiamento: il suo gruppo fosfato passa
dalla posizione 3 alla posizione 2 esterificando in questo
modo la funzione alcolica secondaria del glicerato. Si
verifica quindi una disidratazione interna della molecola.
L'importante reazione che segue genera un enolfosfato,
una molecola ad alto potenziale energetico, chiamata
fosfoenolpiruvato. Infine, questa energia viene utilizzata
per la sintesi dell'ATP dall'ADP in una reazione che forma
il piruvato.
 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
Dal momento in cui vengono utilizzate le molecole di
triosio, la seconda parte della glicolisi comprende le
fasi di produzione di energia più importanti. Due
reazioni assicurano la sintesi di ATP per ciascuna delle
molecole di gliceraldeide-P provenienti dall'esosio.
L'energia di reazione totale dalla trasformazione di
una molecola di glucosio è quindi la sintesi di due
molecole di ATP e incidentalmente la riduzione di NAD
+.
Per ogni molecola di esosio assimilata, la cellula
richiede una molecola NAD +. La cella deve quindi
avvalersi di un sistema che mantenga un
livello NAD + accettabile. I batteri dell'acido lattico
usano il piruvato formato dalla glicolisi come accettore
di elettroni per ossidare l'NADH. Questo carattere
definisce la fermentazione lattica. In generale, i batteri
quindi trasformano una molecola di esosio in due
molecole di lattato per via omolattica.
5.2.2 Metabolismo eterofermentativo degli esosi
I batteri che utilizzano la via eterofermentativa
trasformano gli esosi principalmente ma non
esclusivamente in lattato. Le altre molecole prodotte
da questo metabolismo sono essenzialmente CO2,
acetato ed etanolo; questa è la via del pentoso
fosfato. Dopo essere stata trasportata nella cellula,
una glucochinasi fosforila il glucosio in glucosio 6-P
(glucosio 6-fosfato). La sua destinazione è
completamente diversa dal glucosio 6-P della via
omofermentativa. Successivamente si verificano due
reazioni di ossidazione: la prima porta al gluconato 6-
P; il secondo, accompagnato da una
decarbossilazione, forma la ribulosio 5-P (Figura 5.2).
In ciascuna di queste reazioni, una molecola del
coenzima NAD + o NADP + viene ridotta. Il ribulosio 5-
P viene quindi epimerizzato in xilulosio 5-P.
La xilulosio 5-P fosfochetolasi è l'enzima chiave di
questo percorso: catalizza la scissione della molecola
di pentulosio 5-P in acetil-P e gliceraldeide 3-P. Questa
reazione richiede fosfato. La gliceraldeide 3-P viene
metabolizzata in acido lattico seguendo lo stesso
percorso della via omofermentativa. L'acetil-P ha due
possibili destinazioni, a seconda delle condizioni
ambientali. Questa molecola può essere
successivamente ridotta in etanale e quindi in etanolo,
nel qual caso le molecole del coenzima NADH + H + o
NADPH + H +, formatesi durante le due reazioni di
ossidazione dell'esosio all'inizio della via
eterofermentativa, vengono riossidate. Questa
riossidazione è fondamentale per rigenerare i coenzimi
necessari all'assimilazione dello zucchero.
In determinate condizioni, quando la cellula fa uso di altri
sistemi di riossidazione del coenzima, l'acetato chinasi
catalizza una reazione che porta alla formazione di
acetato da acetil-P. Questa reazione recupera
simultaneamente l'energia di legame del gruppo P
dell'acetil-P mediante la sintesi di una molecola di ATP. In
questo caso, i sistemi di riossidazione del coenzima
attivano le ossidasi NADH o NADPH, quando le cellule
sono in aerobiosi o reazioni di riduzione come la
trasformazione del fruttosio in mannitolo. Quando l'acetil-
P porta alla formazione di acetato, c'è un netto vantaggio
energetico. Una molecola supplementare di ATP viene
formata per ogni molecola di esosio trasformata.
La quantità finale di prodotti del metabolismo del glucosio
(presenza di etanolo e acetato) da batteri etero-
fermentativi dimostra che questa via è quasi sempre
utilizzata. Tuttavia l'uso di questo percorso varia più o
meno a seconda del grado di aerazione e della presenza
di altri accettori di protoni ed elettroni. In questo modo, i
batteri del genere Leuconostoc producono
preferenzialmente lattato ed etanolo in ambiente
leggermente aerato e, al contrario, lattato e acetato in
ambiente aerato. I cambiamenti delle condizioni quindi
non solo influenzano la natura dei prodotti formati ma
anche la resa energetica e quindi la crescita.
I batteri eterofermentanti producono acido acetico dagli
esosi, ma i meccanismi di regolazione modificano la
produzione. In condizioni anaerobiche, la NADH ossidasi
non può rigenerare il NAD. Il glucosio porta
preferenzialmente alla formazione di acido lattico ed
etanolo. Quando NADH può essere riossidato da un altro
processo, la quantità di etanolo formato diminuisce, con
conseguente aumento dell'acido acetico. Ciò si verifica in
condizioni aerobiche o in presenza di un'altra sostanza
che può essere ridotta. I batteri omolattici fermentano il
glucosio quasi esclusivamente in acido lattico. In un
ambiente anaerobico con una concentrazione di glucosio
limitata, i batteri omofermentanti come il Lactobacillus
casei formano meno acido lattico; i prodotti primari
possono diventare acido acetico, acido formico ed
etanolo.
 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
La variazione è legata alla regolazione della L-LDH da
parte del fruttosio 1,6-difosfato. Il cambiamento è
meno evidente quando le specie omofermentanti
possiedono i due tipi di LDH, L e D. FDP non regola il
D-LDH.
5.2.3 Metabolismo dei pentosi
Alcuni ceppi di Lactobacillus, Pediococcus o
Leuconostoc fermentano pentosi come ribosio,
arabinosio e xilosio, siano essi omofermentanti o
eterofermentanti, secondo lo stesso schema (Figura
5.3). I pentosi sono fosforilati dalle reazioni che
attivano le chinasi e utilizzano l'ATP. Isomerasi
specifiche portano quindi alla formazione della
molecola di xilulosio 5-P. Le seguenti reazioni sono
descritte nella via eterofermentativa per
l'assimilazione del glucosio. Nonostante la
gliceraldeide 3-P abbia lo stesso destino in questo
caso, l'acetil-P porta esclusivamente alla formazione
della molecola di acetato, generando in questo modo
una molecola di ATP. Infatti, non è disponibile una
molecola di coenzima ridotta per ridurre l'acetil-P in
etanolo. Il percorso fornisce due molecole di ATP per
ciascuna molecola di pentoso fermentata. Questo
percorso quindi ha una resa maggiore rispetto alla
fermentazione di un esoso per via del pentoso
fosfato.
Lo studio delle vie metaboliche omofermentative ed
etero-fermentative degli zuccheri consente quindi di
prevedere la natura dei prodotti formati. I pentosi
sono sempre all'origine dell'acido acetico e
ovviamente della produzione di acido lattico.
5.3 METABOLISMO DEI PRINCIPALI ACIDI
ORGANICI DEL VINO
I batteri essenzialmente degradano due acidi organici
del vino: acido malico e acido citrico. Altri acidi
possono naturalmente essere degradati ma sono di
minore interesse per l'enologia, ad eccezione
dell'acido tartarico, che è stato studiato raramente.
Sin dalle prime ricerche sui batteri lattici e sul loro
ruolo nella vinificazione, l'acido malico è stato al
centro di un gran numero di studi. Tuttavia anche la
degradazione dell'acido citrico gioca un ruolo
importante nella vinificazione. La maggior parte delle
specie batteriche preponderanti nel vino dopo la
fermentazione alcolica degradano questi due acidi.
Questa degradazione è evidentemente la fonte di
molti cambiamenti
organolettici rilevati dopo il loro sviluppo. L'enologo può
considerare la trasformazione dell'acido malico come il
fenomeno più importante della fase di fermentazione
malolattica, ma vanno prese in considerazione anche altre
trasformazioni, in particolare dell'acido citrico.
5.3.1 Trasformazione dell'acido malico
Nel caso di cellule non proliferanti in un terreno di
laboratorio e durante la vinificazione, i batteri dell'acido
lattico del vino trasformano l'acido L-malico
esclusivamente in acido L-lattico. Seifert (1901) stabilì la
reazione della trasformazione malolattica secondo la
seguente equazione:
acido malico → acido lattico + CO2.
Questa equazione è stata confermata quando gli
stereoisomeri potevano essere determinati
separatamente per ciascuno dei due acidi.
Questa reazione comporta quindi una decarbossilazione
senza un prodotto intermedio in grado di seguire un'altra
via metabolica. Diversi autori hanno riferito che alcuni
ceppi batterici formano altre molecole dall'acido malico,
suggerendo in questo modo l'esistenza di altre reazioni.
Anche se non si può escludere la loro esistenza, la
trasformazione malolattica è l'unica reazione che esiste
nei batteri lattici coinvolti nella vinificazione.
Alizade e Simon (1973) hanno studiato la stereochimica di
questa trasformazione. Metodi enzimatici sono stati
utilizzati per determinare le quantità specifiche degli
stereoisomeri. Inoltre, la fermentazione del glucosio
marcato radioattivamente e dell'acido malico ha
permesso lo studio dei loro prodotti. Si è riscontrato che i
cocchi eterofermentanti (Oenococcus), abbondanti o
esclusivi durante la vinificazione, presentavano diverse
proprietà. Formano esclusivamente acido D-lattico dal
glucosio (Capitolo 4) ed esclusivamente acido L-lattico
dall'acido L-malico (Figura 5.4).
Questa osservazione suggerisce che la trasformazione
dell'acido malico non passa per l'intermediazione
dell'acido piruvico. Peynaud (1968) ha concluso che il
substrato è stato decarbossilato direttamente.
Sono state condotte molte ricerche per chiarire questo
meccanismo. Porta naturalmente all'esame dell'aspetto
enzimatico di questa trasformazione. A quel tempo solo la
malato deidrogenasi (MDH) e gli enzimi malici erano noti
per essere in grado di fissare e catalizzare una reazione il
cui substrato è l'acido L-malico. Questi due enzimi sono
stati descritti in numerose cellule vegetali e animali e in
 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
diversi microrganismi.
Catalizzano le seguenti reazioni: MDH: L-malate ←→
oxaloacetate + NADH + H+ + NAD+
malic enzyme: L-malate + NAD ←→pyruvate + CO2 +
NADH + H+
Poiché l'ossalacetato è facilmente decarbossilato in
piruvato e CO2, queste due reazioni portano alla
formazione di piruvato da L-malato. Poiché il prodotto
finale della trasformazione malolattica nel vino è
l'acido L-lattico, l'MDH o l'enzima malico sarebbe
associato a un LDH che catalizza la riduzione del
piruvato in L-lattato in questa via metabolica. Almeno
per i batteri del vino, questo concetto non è
accettabile poiché questi batteri possiedono solo un
D-LDH. L'acido malico porterebbe solo alla formazione
di acido D-lattico.
Pertanto, è stata avanzata l'ipotesi dell'esistenza di un
enzima che catalizza la decarbossilazione diretta
dell'acido L-malico in acido L-lattico. L'enzima,
chiamato enzima malolattico, è stato isolato per la
prima volta in Lactobacillus plantarum (Lonvaud,
1975; Schu ̈tz e Radler, 1974). Da estratti batterici
acellulari e grazie a successivi stadi di purificazione, gli
autori hanno ottenuto frazioni purificate rispondenti
ai criteri funzionali dell'enzima malolattico. L'acido L-
malico viene trasformato stechiometricamente in
acido L-lattico. Queste frazioni non hanno un'attività
LDH.
Almeno in L. mesenteroides e L. oenos (O. oeni),
l'enzima malolattico è inducibile. Coltivate senza acido
malico durante numerose generazioni, le cellule
conservano una piccolissima attività residua.
Riacquistano la loro massima attività non appena
viene aggiunto acido malico (1 g / lo più). La presenza
di zuccheri fermentescibili (esoso o pentoso) ne
favorisce anche l'attività.
Qualche tempo dopo, lo stesso enzima è stato
purificato in altri ceppi e specie di batteri dell'acido
lattico, in particolare nei ceppi di L. plantarum, L.
murinus, L. mesenteroides, O. oeni e L. lactis. Le
caratteristiche fisiche e la cinetica di tutti gli enzimi
malolattici descritti sono le stesse. L'enzima è una
proteina dimerica o tetramerica formata
dall'associazione di un polipeptide da 60 kDa. Il pHi
dell'enzima è 4,35. Funziona solo in presenza del
cofattore NAD + e di ioni bivalenti, Mn2 + è il più efficace e
utilizza un meccanismo sequenziale. Il Mn2 + e il NAD + si
fissano sulla proteina prima dell'L-malato. Al pH ottimale,
le costanti di Michaelis sono 2 × 10−3 M per il malato e 4
× 10−5 M per NAD. Il pH ottimale della reazione
enzimatica è 5,9. A questo pH, la cinetica è michaeliana. A
un pH lontano dal pH ottimale, è sigmoidale, a
dimostrazione di un meccanismo cooperativo positivo
che indica una crescente affinità per il malato. Gli enzimi
omopolimerici condividono questa caratteristica: il
legame della prima molecola substrato sul primo
promotore trasmette una defor- mazione, aumentando
l'affinità delle altre. Questa cooperatività permette un
aumento dell'efficacia del sistema in condizioni
sfavorevoli. Evidentemente, nella vinificazione, i batteri si
trovano in condizioni tutt'altro che ottimali (Lonvaud-
Funel e Strasser de Saad, 1982).
Gli acidi carbossilici del vino - acido succinico, citrico e L-
tartarico - sono inibitori competitivi con le seguenti
rispettive costanti di inibizione: 8 × 10−2M, 1 × 10−2M e
0,1M.L-L-acido lattico, un prodotto della reazione, è un
inibitore inefficiente e non competitivo la cui costante di
inibizione di 0,3 M indica una debole affinità.
Sebbene questo enzima stia diventando più conosciuto,
una domanda rimane ancora senza risposta: qual è il vero
ruolo del NAD + nello scambio ossidazione - riduzione? Il
coenzima indispensabile della reazione non è coinvolto,
almeno in modo convenzionale.
L'enzima malolattico purificato dal Lactococus lactis, un
batterio lattico di origine lattea, ha esattamente le stesse
caratteristiche dell'enzima del ceppo enologico. È stato
utilizzato per studiare la struttura del gene. L'estremità N-
terminale del protomero è stata sequenziata su 20
amminoacidi (Laboratorio IBMC, Università di Bordeaux
II). Le sequenze nucleotidiche corrispondenti sono state
dedotte dai cinque primi e cinque ultimi amminoacidi di
questa porzione della proteina (Denayrolles et al., 1994).
Queste sequenze oligonucleotidiche sono state utilizzate
come primer in una reazione di amplificazione PCR con
DNA batterico come modelli. In questo modo, un
frammento di 60 nucleotidi è stato isolato e utilizzato per
produrre una sonda, permettendo l'identificazione del
gene malolattico nel cromosoma batterico. Questo
frammento, e progressivamente l'intero gene, è stato
sequenziato. Ansanay et al. (1993) hanno ottenuto lo
 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
stesso risultato con un altro metodo, a partire dalla
stessa preparazione enzimatica purificata.
La sequenza nucleotidica che codifica per l'enzima
malolattico è quindi nota e mostra una forte
somiglianza con l'enzima malico. Sono stati individuati
anche i siti di legame del coenzima sulla proteina
(Figura 5.5). Infine, dopo essere stato inserito in un
vettore, questo gene è stato trasferito in E. coli e
anche in ceppi di laboratorio di lievito di S. cerevisiae;
il gene è stato espresso in queste condizioni (Ansanay
et al., 1993; Denay-rolles et al., 1995).
Alla fine degli anni '80, il programma finalizzato allo
sviluppo di un “lievito malolattico” in grado di
effettuare la trasformazione malolattica durante la
fermentazione alcolica è stato sostenuto da enologi in
Francia e all'estero. La prima fase consisteva nella
clonazione del gene dell'enzima malolattico e nella
sua espressione in un lievito. Sfortunatamente, è
diventato molto rapidamente ovvio che il sistema era
limitato dal fatto che l'acido malico entrava nel lievito.
Per superare questo problema, il team di Stellenbosch
(Sud Africa) ha deciso di clonare il gene della permeasi
malato da Schizosaccharomyces pombe, un altro
lievito presente nel vino (Grobler et al., 1995).
Avendo dimostrato che un lievito poteva essere
trasformato da un vettore recante il gene che codifica
per permeasi e un altro recante l'enzima malolattico,
lo stesso team ha inserito questi due geni in un
cromosoma di lievito per stabilizzare i dati genetici
desiderati. Ora esiste un ceppo di lievito con attività
malolattica, può essere prodotto su scala industriale e
ha mostrato un certo livello di prestazioni (Van Vuuren
e Husnik, 2003). Non si tratta di svolgere la
fermentazione malolattica completa in quanto questo
lievito non esibisce tutte le altre attività batteriche
coinvolte nell'esaltare le qualità gustative del vino. Può
essere utile come agente organico per la
disacidificazione dei vini quando l'enologo desidera
preservare i caratteristici aromi rivelati dai lieviti.
Tuttavia, questo lievito è un microrganismo
geneticamente modificato e, come tale, è lontano
dall'ottenere l'accettazione universale.
La produzione dell'enzima per l'uso diretto nei vini è
inutile, poiché questa proteina è rapidamente inibita
da diverse sostanze nel vino: acidi, alcol e polifenoli. La
reazione malolattica avviene all'interno del batterio in un
mezzo protetto dagli inibitori dalla membrana batterica. Il
tasso di degradazione dell'acido malico è limitato dalla
sua velocità di trasporto all'interno della cellula. Sebbene
il pH ottimale per l'attività enzimatica sia intorno a 6,0, è
compreso tra 3,0 e 3,5 per le cellule intere di O. oeni. A
questo pH, l'acido malico penetra più facilmente nel
batterio rispetto a pH più alti.
L'azione inibitoria dell'acido tartarico e succinico è ancora
più forte sulle cellule intere che sulle proteine. L'acido
citrico alla concentrazione di 0,5 g / l, normalmente non
raggiunta nel vino, rallenta l'attività cellulare solo di circa il
5% (Lonvaud-Funel e Stras- ser de Saad, 1982).
Infine, tra le questioni sollevate già nel periodo delle
prime ricerche sulla fermentazione malolattica, resta da
interpretare il ruolo fisiologico dell'acido malico.
L'aggiunta di acido malico in un terreno di coltura di
batteri lattici aumenta simultaneamente la resa e la
velocità di crescita. Una spiegazione parziale di questa
osservazione è stata scoperta solo di recente. La stessa
reazione malolattica non è molto esergonica, ma
indirettamente costituisce una vera fonte di energia per la
cellula. Poolman (1993) ha dimostrato che, a seguito della
reazione di decarbossilazione, l'aumento del pH interno
(che impone un afflusso di protoni), l'assorbimento di
acido malico e l'efflusso di acido lattico si combinano per
creare una forza motoria protonica, permettendo la
conservazione di energia attraverso la membrana ATPasi.
5.3.2 Metabolismo dell'acido citrico
Alcuni batteri lattici (cocchi eterofermentanti e bacilli
omofermentanti) degradano l'acido citrico. Tra le specie
presenti nel vino, L. plantarum, L. casei, O. oeni e L.
mesenter- oides utilizzano rapidamente l'acido citrico. I
ceppi del genere Pediococcus e delle specie L. hilgardii e
L. brevis non possono.
In alcuni batteri dell'industria lattiero-casearia, la
mancanza di utilizzo dell'acido citrico è collegata alla
perdita del plasmide che codifica per la permeasi citrato,
essenziale per l'assorbimento dell'acido. Nei batteri isolati
nel vino, la permeasi citrata può esistere, ma il suo ruolo è
irrilevante, poiché al pH del vino, il substrato non
dissociato si diffonde attraverso la membrana senza
bisogno della permeasi. Le specie ed i ceppi che non
degradano l'acido citrico sono quindi almeno carenti nel
primo enzima della via metabolica: la citrato liasi. Questo
 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
enzima è stato studiato nei batteri lattici del vino e più
particolarmente in un ceppo di L. mesenteroides
(Weinzorn, 1985).
All'interno dei batteri, l'acido citrico viene diviso in una
molecola di ossalacetato e una molecola di acetato
dalla liasi (Figura 5.6). Le maggiori quantità di questo
enzima vengono sintetizzate in mezzi a bassa
concentrazione di zucchero contenenti acido citrico. Il
glucosio agisce come un repressore. La proteina è
attiva in una forma acetilata. La forma inattiva
deacetilata può essere riattivata in vivo dalla citrato
liasi ligasi con acetil CoA o acetato e ATP. Questa
prima fase di degradazione porta alla formazione di
una molecola di acetato per ciascuna molecola del
substrato.
L'ossalacetato viene quindi decarbossilato in piruvato
in Oenococcus, il batterio più importante in enologia.
In alcuni lattobacilli, può anche portare a una
formazione parziale di succinato e formiato. Il piruvato
è la fonte dei composti dell'acetoina: diacetile,
acetoina e 2,3-butandiolo. Il primo è particolarmente
importante dal punto di vista organolettico. È la
molecola molto aromatica che dà al burro il suo
odore. L'intensità olfattiva dell'acetoina e del
butandiolo, che derivano dal diacetile per riduzione
delle funzioni chetoniche, è molto più bassa (Figura
5.6).
Sono state proposte due vie di sintesi del diacetile. In
uno, il diacetile deriva dalla reazione dell'acetil CoA
con l'etanale-TPP (acetaldeide attiva), catalizzata da
una diacetil sintetasi, che non è mai stata isolata.
L'altro percorso suppone che da due molecole di
piruvato, l'α-acetolattato sintetasi produca α-
acetolattato che viene poi decarbossilato in acetoina.
Il diacetile è derivato da esso per ossidazione. Questa
è una via aerobica.
Oltre alle sostanze acetoiniche, le molecole di piruvato
provenienti dal citrato hanno altre destinazioni.
Innanzitutto, se il coenzima NADH, prodotto da altre
vie, è disponibile, porta alla formazione di lattato.
Segue la decarbossilazione del piruvato e quindi una
riduzione produce etanolo. Infine, il piruvato derivato
dal citrato partecipa alla sintesi di acidi grassi e lipidi
tramite acetil CoA. La radioattività del citrato marcato
fornito ai batteri è incorporata nel materiale cellulare.
In questo percorso, parte dell'acetil CoA può anche
generare molecole di acetato (Figura 5.6).
I prodotti del metabolismo dell'acido citrico sono
quindi molto diversi. Qualunque siano le condizioni,
più che
una molecola di acido acetico è sicuramente formata da
una molecola di substrato. La produzione degli altri è in
gran parte determinata da fattori influenzati dalle
condizioni di crescita. In condizioni di concentrazione di
glucosio limitata, pH basso e presenza di inibitori della
crescita, l'acido citrico porta preferenzialmente alla
formazione di sostanze acetoiniche. Infatti, a causa delle
condizioni, il piruvato non è né orientato
verso la sintesi di materiale cellulare, poiché la crescita è
difficile, né verso lattato ed etanolo, a causa della
mancanza di coenzimi ridotti. La via di sintesi della
sostanza acetoinica è considerata un processo di
disintossicazione della cellula. Per mantenere il suo pH
intracellulare, deve eliminare il piruvato. Al contrario,
quando la crescita è facile, il piruvato è utilizzato dalle vie
di sintesi degli acidi grassi; l'acido acetico viene prodotto
in quantità maggiori. In un mezzo di laboratorio,
Oenococcus forma più di due molecole di acido acetico
da una molecola di acido citrico con un pH di 4,8 e solo
1,2 molecole con un pH di 4,1. Al contrario, la produzione
di molecole acetoiniche è quattro volte maggiore
(Lonvaud-Funel et al., 1984).
Non sorprende quindi che alcuni vini contengano più di
10 mg di diacetile per litro. Eppure è stato stabilito che
diversi milligrammi di diacetile per litro (2-3 mg / l per i
vini bianchi e circa 5 mg / l per i vini rossi) contribuiscono
favorevolmente al bouquet. Al di sopra di queste
concentrazioni, l'aroma burroso, percepito distintamente,
diminuisce la qualità del vino. Le condizioni della
fermentazione malolattica e la quantità di acido citrico
degradato (da 0,2 a 0,3 g / l) e anche senza dubbio la
specie di O. oeni coinvolta determina la quantità di
diacetile prodotta. Diverse altre reazioni contribuiscono
alla sua concentrazione finale. Innanzitutto i lieviti
sintetizzano il diacetile anche durante la fermentazione
alcolica attraverso una via completamente diversa legata
al metabolismo degli amminoacidi. Il diacetile viene quindi
ridotto in acetoina dalla diacetil riduttasi, un enzima
presente nei lieviti e nei batteri lattici. La concentrazione
di diacetile raggiunge in questo modo due massimi: uno
durante la fermentazione alcolica, l'altro durante la
degradazione dell'acido citrico da parte dei batteri.
Diminuisce tra le due fermentazioni e nella fase finale
dell'attività batterica. Il mantenimento del vino sulle fecce
di lievito e batteri alla fine della fermentazione garantisce
questa riduzione e determina anche il livello finale di
diacetile (De Revel et al., 1989). Infine, l'anidride solforosa
 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
diminuisce ulteriormente la sua concentrazione
combinandosi con le funzioni chetoniche.
L'acido citrico viene sempre metabolizzato durante la
fermentazione perché in quasi tutti i casi è coinvolta la
specie O. oeni. La sua degradazione inizia
contemporaneamente a quella dell'acido malico, ma è
molto più lenta, tanto che alla fine della fermentazione
malolattica spesso rimane l'acido citrico, fino a 0,15 g /
lo talvolta anche di più. Rappresenta un'ulteriore fonte
di energia. Infatti, l'ATP è formato da acetil-P, derivato
dal piruvato, che è diretto verso la produzione di
componenti cellulari. In presenza di zuccheri residui
(glucosio o fruttosio) degradati dalla via
eterofermentativa, parte del piruvato derivato
dall'acido citrico agisce come accettore di elettroni e
protoni. Una parte dell'acetil-P proveniente dagli
zuccheri porta alla formazione di acetato nella
produzione di ATP. In questo modo la presenza di
acido citrico in un vino favorisce la crescita e la
sopravvivenza batterica, soprattutto in presenza di
zuccheri residui. Questo metabolismo partecipa
quindi, insieme al metabolismo dell'acido malico, alla
stabilizzazione microbiologica del vino eliminando le
fonti energetiche (Lonvaud-Funel, 1986).
5.3.3 Metabolismo dell'acido tartarico
I batteri lattici del vino possono degradare l'acido
tartarico, ma questo metabolismo differisce dal
metabolismo dell'acido malico e citrico. È un vero e
proprio deterioramento batterico. Pasteur lo
descrisse nel secolo scorso e lo chiamò malattia del
tourne. È pericoloso in quanto la scomparsa dell'acido
tartarico, un acido essenziale nel vino, abbassa
l'acidità fissa ed è accompagnata da un aumento
dell'acidità volatile. La degradazione può essere totale
o parziale, a seconda del livello di sviluppo batterico,
ma abbassa sempre la qualità del vino.
Questo deterioramento è raro poiché i ceppi in grado
di degradare l'acido tartarico sembrano essere
relativamente pochi. Studi condotti su questo
argomento negli anni '60 e '70 hanno dimostrato che
questa proprietà non è legata a una particolare specie
batterica. Ceppi appartenenti a specie diverse sono
stati isolati da vari autori, ma molto spesso sono
lattobacilli. Tra questi, Radler e Yannissis (1972) hanno
trovato quattro ceppi di L. plantarum e un ceppo di L.
brevis aventi questa caratteristica sui 78 ceppi esaminati.
Peynaud (1967) ha scoperto circa 30 ceppi in grado di
utilizzare parzialmente o totalmente l'acido tartarico in
uno studio condotto su più di 700 ceppi. La scarsità di
questa proprietà costituisce in definitiva la prima
protezione contro questa malattia.
Poiché un pH elevato è sempre propizio alla
moltiplicazione di un maggior numero di batteri, i vini ad
acidità più elevata ne risentono meno. Inoltre, questi
batteri sono sensibili alla SO2. Pertanto, il rispetto delle
attuali norme igieniche in cantina e nel vino dovrebbe
essere sufficiente per evitare questo problema.
Esistono pochi studi che esaminano le vie metaboliche
della trasformazione dell'acido tartarico. Gli unici risultati
esistenti descrivono percorsi differenti per L. plantarum e
L. brevis (Radler e Yannissis, 1972). Da una molecola di
acido tartarico, L. plantarum produce 0,5 molecole di
acido acetico, 0,3 di acido succinico e 1,3 di CO2. L. brevis
forma 0,7 molecole di acido acetico, 0,3 di acido succinico
e 1,3 di CO2 (Figura 5.7).
5.4 ALTRE TRASFORMAZIONI CHE POSSONO
AVVENIRE NELLA VINIFICAZIONE
5.4.1 Degradazione del glicerolo
Il glicerolo è uno dei componenti principali del vino, sia
nella sua concentrazione (5 - 8 g / l) che nel suo
contributo al gusto. I lieviti formano il glicerolo mediante
fermentazione gliceropiruvica all'inizio della
fermentazione. La degradazione del glicerolo danneggia
la qualità del vino, in parte a causa della diminuzione della
sua concentrazione e in parte a causa dei prodotti
risultanti del metabolismo.
Alcuni ceppi batterici producono amarezza nel vino, un
fatto noto sin dai tempi di Pasteur. I batteri dell'acido
lattico fanno uso di una glicerina deidratasi per
trasformare il glicerolo in β-idrossi-propionaldeide (Figura
5.8). Questa molecola è il precursore dell'acroleina, che si
forma nel vino riscaldando o lentamente durante
l'invecchiamento. La combinazione di tannini del vino e
acroleina, o il suo precursore, conferisce un sapore
amaro.
Come la tourne, questo deterioramento non è diffuso, a
causa della rarità di ceppi in grado di degradare il
glicerolo attraverso questo percorso. Nessuna singola
specie di batteri è responsabile della degradazione del
glicerolo nel vino. Poche ricerche sono state dedicate a
questo
 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
problema, ma ceppi di due specie di batteri,
Lactobacillus hilgardii e Lactobacillus diolivorans, sono
stati isolati dal vino a seguito della degradazione del
glicerolo (Claisse, 2002). Un enzima chiave, la glicerina
deidrogenasi, è stato studiato in diversi ceppi. In ceppi
di L. brevis e L. buchneri, Schutz e Radler (1984)
hanno dimostrato la degradazione del glicerolo da
parte della glicerina deidratasi a 1,3-propandiolo
tramite β-idrossipropionaldeide quando il terreno
conteneva anche glucosio o fruttosio. Il NADH (o
NADPH), prodotto dalla fermentazione dello zucchero,
riduce l'aldeide a 1,3-propandiolo. Come descritto in
precedenza, questo co-metabolismo porta a una
deviazione dell'acetil-P derivato dallo zucchero verso
la produzione di ATP e acetato aggiuntivi. Facilita
quindi la crescita batterica.
Alcuni ceppi degradano il glicerolo nel vino tramite la
via della glicerolo deidratasi, mentre altri usano anche
la via della 3-P-glicerolo deidrogenasi. Sono stati
studiati i geni che codificano gli enzimi per il primo
percorso. Sono organizzati in un set comprendente
un totale di 13 geni, probabilmente tutti necessari per
il funzionamento del glicerolo deidratasi, che consiste
di tre subunità proteiche e propano-1,3-diolo-
deidrogenasi, che portano, infine, a propano-1,3-diolo.
L. hilgardii e L. diolivorans sono organizzati nello
stesso modo, così come i ceppi di L.collinoides isolati
dal sidro affetti da deterioramento dell'acroleina
(Gorga et al., 2002). I primer oligonucleotidici per la
rilevazione di questi batteri sono stati selezionati dalla
sequenza genica che codifica per una delle subunità
glicerolo deidratasi (Claisse e Lonvaud-Funel, 2001). La
degradazione del glicerolo porta non solo alla
produzione di idrossi-3-propionaldeide, precursore
dell'acroleina, ma anche, per accoppiamento
metabolico, ad un aumento dell'acidità volatile
prodotta dall'acido L-lattico nel vino. L'altra via è
costituita dalla fosforilazione della glicerochinasi che
ingloba il glicerolo e dalla 3-P-glicerolo deidrogenasi
che produce 3-P-deidrossiacetone. Questa molecola
entra nelle reazioni di glicolisi mediante ossidazione in
diidrossiacetone-P che provocano la formazione di
piruvato. I prodotti finali di questo percorso sono
quelli precedentemente descritti dalla degradazione
del piruvato, in particolare l'acido acetico e le sostanze
acetoiniche. La quantità dei prodotti varia a seconda
delle condizioni ambientali, in particolare della
quantità di zucchero fermentabile e
dell'aerazione.
In particolare, si formano grandi quantità di acido lattico,
aumentando l'acidità totale e fissa del vino e
provocandone l'abbassamento del pH. L'acidificazione
arrivava fino a 0,8 g / l (espresso in acido tartarico) nei vini
in cui il pH scendeva da 0,25 a 0,30.
Le molecole acetoiniche possono anche essere formate
dal piruvato. Il destino delle molecole di piruvato è
probabilmente, come al solito, determinato dalla
disponibilità dei coenzimi NADH / NAD, cioè la condizione
redox intracellulare. Se è disponibile NADH, viene
prodotto lattato. In caso contrario, il piruvato viene
eliminato sotto forma di composti acetoinici. Le
interazioni tra le vie metaboliche e l'ambiente dei batteri
sono il fattore decisivo. In ogni caso, la presenza di batteri
in grado di degradare il glicerolo è un rischio nella misura
in cui, anche se non completamente metabolizzato, i suoi
sottoprodotti metabolici possono rovinare il vino in
misura variabile.
5.4.2 Decarbossilazione dell'istidina
L'istidina, un amminoacido contenuto nel vino, viene
decarbossilata in istamina, la cui tossicità, sebbene bassa,
si aggiunge a quella di altre ammine biogene (tiramina,
fenil etilammina, putrescina e cadaverina) (Figura 5.9). La
tirosina viene decarbossilata per formare tiramina
mediante una reazione simile.
In generale, le ammine biogene - in particolare l'istamina -
sono più abbondanti nei vini dopo la fermentazione
malolattica. Questo spiega i risultati presentati in vari
lavori: i vini rossi sembravano essere più ricchi di ammine
rispetto ai vini bianchi. Alcuni ricercatori (Aerny, 1985)
hanno anche dimostrato che l'istamina si forma
principalmente alla fine della fermentazione malolattica, e
anche successivamente.
Per molto tempo sono stati fatti molti tentativi per isolare
i batteri in grado di decarbossilare l'istidina, e hanno
portato alla conclusione che solo i ceppi di
contaminazione appartenenti al genere Pediococcus
avevano questa proprietà. Secondo alcuni autori, la
presenza di istamina indicava una mancanza di abilità
enologica e di igiene in cantina.
Eppure questo fenomeno si verifica anche durante le
fermentazioni malolattiche di vini la cui microflora è quasi
esclusivamente O.oeni. Questo fatto contraddice i risultati
di cui sopra. Uno studio approfondito della microflora dei
vini ricchi di istamina ha infine portato all'isolamento dei
ceppi di O. oeni che producono istamina dall'istidina
 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
(Lonvaud-Funel e Joyeux, 1994). Nei terreni di
laboratorio, la formazione di istamina da parte di
questi ceppi aumenta quando le condizioni di crescita
diventano meno favorevoli: l'assenza di altri substrati
(in particolare lo zucchero) a pH basso e in presenza
di etanolo. Anche la concentrazione di istamina,
ovviamente, dipende dalla concentrazione di istidina.
L'aggiunta di fecce di lievito, che liberano
progressivamente aminoacidi e peptidi, aumenta la
concentrazione nel terreno. I batteri che possiedono
anche peptidasi trovano lì una significativa fonte di
istidina. Non sorprende quindi che la concentrazione
di istamina aumenti verso la fine e anche dopo la
fermentazione, fintanto che sono presenti batteri
lattici. Uno studio preciso dell'attività dell'istidina
carbossilasi di un ceppo di O. oeni mostra che anche
le cellule non vitali conservano la loro attività per un
tempo molto lungo nel vino.
Questo enzima è stato completamente purificato. Le
sue caratteristiche e proprietà sono simili a quelle
dell'enzima purificato da un Lactobacillus di origine
non enologica. La proteina comprende due diverse
subunità raggruppate in un esamero di tipo [αβ] 6.
L'attività è ottimale ad un pH di 4,5; è lo stesso per le
cellule intere. L'enzima è sintetizzato sotto forma di un
precursore inattivo . Viene quindi attivato dalla
scissione di in α e β. Come la reazione malolattica, la
decarbossilazione di histi- dine non genera
direttamente energia cellulare, ma i ceppi di O. oeni
che sono in grado di utilizzarlo traggono profitto dalla
sua presenza nel mezzo e crescono più rapidamente
rispetto ai ceppi che non hanno questo capa - bilità. Il
vantaggio energetico è spiegato (come in L. buchneri)
secondo il processo descritto per la fermentazione
malolattica da Poolman (1993). Lo scambio tra istidina
e istamina a livello della membrana crea un gradiente
protonico e una forza motrice protonica, generando
ATP.
I ceppi di O. oeni che utilizzano l'istidina, quindi, hanno
un ulteriore vantaggio che può essere un fattore
decisivo dopo la vinificazione quando il terreno è
povero di nutrienti. La loro sopravvivenza può essere
facilitata in questo modo.
Non tutti i ceppi di O. oeni possiedono l'istidina
decarbossilasi; in effetti, ce ne sono solo pochi. La
rilevazione di questi particolari ceppi è stata resa
possibile dall'uso di strumenti molecolari.
L'amplificazione del DNA mediante PCR, utilizzando gli
appropriati primer oligonucleotidici, consente
l'identificazione di questi particolari ceppi in una miscela.
L'etichettatura di un frammento di gene, o di un intero
gene, che codifica per l'enzima fornisce la sonda specifica.
Pertanto, la rilevazione e il conteggio dei ceppi in grado di
formare istamina non rappresentano più un problema.
Ad esempio, l'analisi di 250 campioni di vini Bordeaux ha
mostrato che quasi il 50% conteneva tali ceppi. Questo
metodo può essere esteso ad altri batteri, poiché è
specifico solo per la presenza del gene e non della specie
batterica (Le Jeune et al., 1995; Coton, 1996).
Fino ad ora, gli unici ceppi isolati dal vino in grado di
produrre tiramina erano identificati come L. brevis e L.
hilgardii (Moreno-Arribas et al., 2000). L'enzima tirosina
decarbossilasi è stato studiato in un ceppo
particolarmente attivo di L. brevis, quindi estratto da esso
(Moreno-Arribas e Lonvaud-Funel, 2001). Poiché lo scopo
era quello di produrre strumenti di rilevamento specifici
per questi ceppi, la proteina è stata sequenziata per
trovare la sequenza codificante del gene e, infine, i primer
oligonucleotidici necessari per l'amplificazione PCR (Lucas
e Lonvaud-Funel, 2002; Landete et al. ., 2003).
In futuro, strumenti per l'identificazione rapida e accurata
dei ceppi che producono ammine biogene consentiranno
ai produttori di vino di valutare i rischi e anche di
effettuare studi sull'ecologia di questi ceppi, in particolare
sulla loro distribuzione e sulle condizioni che ne
incoraggiano la presenza in alcune cantine.
5.4.3 Metabolismo dell'arginina
Tra gli amminoacidi del mosto d'uva, l'arginina è il più
rapidamente e completamente consumato all'inizio della
fermentazione alcolica. Viene quindi secreto dal lievito e
liberato durante l'autolisi. L'uso di questo amminoacido
da parte dei batteri durante la fermentazione non è stato
studiato da vicino fino a tempi recenti, in particolare
nell'ambito della ricerca sulle origini dell'etil carbammato
(Makaga, 1994; Liu et al., 1994).
I microrganismi impiegano diverse vie metaboliche per
utilizzare l'arginina. Nei batteri dell'acido lattico, il più
utilizzato è il percorso dell'arginina deiminasi. L'enzima di
questa prima fase catalizza la deaminazione dell'arginina
in citrullina (Figura 5.10). Successivamente, l'ornitina
transcarbamilasi e la carbammato chinasi portano alla
formazione di ornitina, CO2, ammonio e alla sintesi di
ATP. I lattobacilli rigorosamente eterofermentanti sono
stati a lungo considerati gli unici capaci di queste
trasformazioni. I
 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
lattobacilli eterofermentanti sono stati a lungo
considerati gli unici in grado di effettuare queste
trasformazioni. È il caso di L. hilgardii, che ha un
metabolismo dell'arginina molto attivo che fornisce
una fonte di energia di alto livello (Tonon e Lonvaud-
Funel, 2002).
Tuttavia, alcuni studi hanno anche identificato questo
percorso in lattobacilli opzionalmente
eterofermentanti, come il Lactobacillus plantarum
(Arena et al., 1999). È interessante notare che
Oenococcus oeni (O. oeni) è stato classificato nel
manuale di riferimento di Bergey per l'identificazione
dei batteri come tra quelli che non idrolizzano
l'arginina. Tuttavia, lavori recenti di autori citati in
precedenza hanno confermato in modo definitivo che
alcuni ceppi della specie O. oeni sono in grado di
degradare l'arginina per via dell'arginina deiminasi. La
frequenza di questo carattere non è attualmente
nota.
La sintesi di tre enzimi - arginina deiminasi, ornitina
transcarbamilasi e carbammato chinasi - è indotta
dalla presenza di arginina nel terreno. Un ceppo di O.
oeni studiato da Liu et al. (1994) trasforma l'arginina
stechiometricamente in una mole di ornitina e due
moli di ammonio. In O. oeni, i geni che codificano per
gli enzimi di questa via metabolica sono organizzati in
un operone sul cromosoma che include l'arco A, B e C
che codifica per arginina deiminasi, ornitina
transcarbamilasi e carbammato chinasi, preceduto da
un gene di regolazione, arco R, e seguito da due geni
che codificano per proteine di trasporto, arco D1 e
arco D2 (Tonon et al., 2001; Divol et al., 2003).
In una raccolta di O. oeni, i ceppi non hanno
sistematicamente questa regione completa del
cromosoma. Naturalmente, solo quelli che hanno la
regione completa sono in grado di assimilare l'arginina
attraverso questo percorso.
Una piccola quantità di citrullina è ancora liberata nel
mezzo (fino al 16%); non è assorbito nel catabolismo
di O. oeni al contrario dei lattobacilli. Questa molecola
è la fonte del carbammato di etile, la cui presenza
corrisponde alla degradazione dell'arginina da parte
dei batteri del vino.
Tuttavia, le quantità formate sono notevolmente
inferiori a quelle originate dall'urea rilasciata dai lieviti
durante la fermentazione alcolica. Non è necessario
preoccuparsi dello sviluppo di ceppi di O. oeni che
degradano l'arginina durante la fermentazione
malolattica. Tuttavia, è consigliabile evitare che questi
ceppi, così come i lattobacilli eterofermentanti, proliferino
dopo la fermentazione malolattica. Si consiglia di non
rischiare la formazione di questi precursori dell'etil
carbammato.
Come nel caso delle reazioni di decarbossilazione che
coinvolgono acido malico, istidina e tirosina, la
degradazione dell'arginina fornisce ai lieviti ulteriori
risorse energetiche. Il guadagno netto di energia
attraverso la via dell'arginina è costituito da una molecola
di ATP prodotta da carbamil-P.
Tuttavia, come con i ceppi che decarbossilano l'istidina, i
ceppi che degradano l'arginina hanno un vantaggio
rispetto ad altri ceppi. Il guadagno netto di energia è una
molecola di ATP prodotta da carbamil-P. Nei lattobacilli, è
stato dimostrato che l'assorbimento di arginina è
accoppiato con l'escrezione di ornitina da parte di un
sistema antiport; quindi non richiede energia. Almeno nei
lattobacilli, l'arginina stimola la crescita. Lo stesso effetto è
stato dimostrato in O. oeni (Tonon e Lonvaud-Funel,
2000).
5.4.4 Sintesi di polisaccaridi esocellulari
La sintesi di polisaccaridi esocellulari da parte dei batteri
lattici è un carattere molto diffuso. L. mesenteroides e
Streptococcus mutans producono omopolimeri del
glucosio come destrano e glucano; vengono sintetizzati
anche omopolimeri di fruttosio (levans) ed eteropolimeri.
Il destrano di L. mesenteroides è il più conosciuto, tanto
per le sue diverse strutture e la sua biosintesi quanto per
le sue varie applicazioni.
La produzione di polisaccaridi esocellulari aumenta la
viscosità e può essere misurata o valutata visivamente dal
carattere filante del terreno.
I polisaccaridi esocellulari sono di interesse per l'industria
del latte e per applicazioni industriali e mediche, ma
molto meno in enologia. Danno origine alla corda e al
morbo di graisse, studiato da Pasteur. Molto meno raro di
tourne e amertume, questo deterioramento ha stimolato
nuove ricerche.
In letteratura, l'aumento della viscosità nei sidri e nelle
birre è attribuito a diverse specie di batteri lattici, in
particolare P. damnosus e L. brevis - che si trovano anche
nel vino (Williamson, 1959; Beech and Carr, 1977). Luthi
(1957) ha stabilito che la simbiosi tra batteri lattici che
producono polisaccaridi e batteri acetici accelera
l'aumento della viscosità del mezzo.
 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
All'inizio degli anni '80, questo deterioramento è
ricomparso con sempre maggiore frequenza. Gli
isolamenti effettuati da allora hanno dimostrato il
coinvolgimento della specie P. damnosus. Questo
fatto non esclude la possibile partecipazione di altre
specie, ma generalmente sono in proporzioni molto
minori. La produzione di polisaccaridi è stata studiata
sia misurando la viscosità media che determinando le
concentrazioni di polisaccaridi. Per un dato vino,
l'aumento della viscosità corrisponde direttamente
alla produzione del polisaccaride.
Non si tratta semplicemente di misurare la viscosità: è
l'aspetto visivo del vino il criterio determinante per
caratterizzare questo problema. Ad esempio, un vino
con una viscosità di 1,637 centistoke (cst) e una
concentrazione di polisaccaridi di 95 mg / l non è ropy,
a differenza di un vino con una viscosità di 1,615 e
una concentrazione di polisaccaridi di 300 mg / l. Molti
altri fattori medi contribuiscono alla viscosità del vino,
in particolare il contenuto alcolico.Rispetto ai ceppi
non ropy di P. damnosus, i ceppi ropy si distinguono
per l'esistenza di una sorta di capsula refringente
attorno alla cellula, chiaramente visibile al
microscopio. Le colonie formate su un terreno solido
sono anche facilmente identificabili dalla formazione
di una fibra spessa quando raccolte con una fibra di
platino. A livello fisiologico, i ceppi rampicanti
dimostrano la capacità occasionale di adattarsi alla
crescita nel vino. Si sviluppano con la stessa facilità
qualunque sia la gradazione alcolica, anche superiore
al 12%. Il loro tasso di crescita è difficilmente ridotto a
un pH di 3,5 rispetto a un pH di 4,5 e non è molto
influenzato dall'anidride solforosa.
La crescita rimane normale a pH 3,7 con una
concentrazione di SO2 libera di 30 mg / l (Lonvaud-
Funel e Joyeux, 1988).
Ropy P. I ceppi damnosus aumentano la viscosità del
vino quando si moltiplicano in un mezzo contenente
glucosio. La malattia è chiaramente visibile quando la
popolazione supera le 107 unità formanti colonia
(UFC) / ml. Gli zuccheri del vino come il fruttosio o i
pentosi non consentono la sintesi del polisaccaride. È
un glucano, un omopolimero di glucosio con una
struttura comprendente una catena β 1-3 su cui è
attaccata un'unità di glucosio in β 1-2 ogni due unità
(Llaube`res et al., 1990): −[glc − glc]−n
glc
La particolare struttura di questo glucano non consente
un trattamento enzimatico dei vini colpiti con enzimi
attualmente noti.
Nel vino il polisaccaride è quindi formato dal glucosio
residuo. Diverse dozzine di milligrammi per litro sono
sufficienti per aumentare la viscosità. Il deterioramento
può avvenire in vasca alla fine della fermentazione, ma la
maggior parte dei problemi sono posti dal
deterioramento in bottiglia, principalmente pochi mesi
dopo l'imbottigliamento. Studi approfonditi hanno
dimostrato che questi ceppi adottano forme fisiologiche
che ne assicurano non solo la sopravvivenza ma anche la
crescita. Inoltre, la produzione di glucano è maggiore in
un mezzo povero di nutrienti, come il vino. Per la stessa
quantità di biomassa batterica, si forma da due a tre volte
più glucano in un terreno contenente 0,1 g di glucosio per
litro rispetto a un mezzo con 2 g / l. Allo stesso modo, a
parità di concentrazione di glucosio, la produzione è
maggiore in un mezzo carente di azoto.
Indipendentemente dalla sopravvivenza e dal tasso di
crescita, la fisiologia del ceppo in mezzi estremi dirige il
loro metabolismo verso la sintesi del glucano.
Studi di laboratorio su diversi ceppi hanno dimostrato la
grande instabilità del fenotipo ropy. I ceppi trasferiti in un
terreno senza etanolo perdono rapidamente questa
proprietà. Questo risultato ha portato al confronto dei
ceppi ropy e dei loro mutanti. La presenza di un plasmide
distingue i ceppi. Su questo c'è un piccolo plasmide con
5,5 kbp; tre geni codificanti sono stati identificati per
omologia, uno probabilmente per la replicasi, il secondo
per una proteina di mobilizzazione,
157
e il terzo per una glucosil transferasi. Questo terzo gene è
probabilmente la chiave della sua proprietà di sintetizzare
l'esopolisaccaride (Walling et al., 2001). La conoscenza di
questo plasmide ha permesso di sviluppare strumenti per
la rilevazione di questi ceppi, sia mediante ibridazione con
una sonda che mediante PCR (Lonvaud-Funel et al., 1993;
Gindreau et al., 2001). Consentono di identificare e
contare i ceppi "ropy" in una popolazione eterogenea di
batteri del vino, tra cui P "non ropy". damnosus o altre
specie.
In caso di deterioramento in cantina o in un magazzino, la
prima precauzione è evidentemente la disinfezione di
tutte le vasche e del materiale della cantina per evitare
contaminazioni future. In generale un vino filante non
presenta altri difetti organolettici e può quindi essere
 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico
commercializzato dopo gli opportuni trattamenti. La
viscosità può essere generalmente abbassata
dall'azione meccanica dell'agitazione del vino. La
solfitazione di un minimo di 30 mg di SO2 libera per
litro e le filtrazioni progressive fino ad una filtrazione
sterile assicurano la preparazione del vino per un
reimbottigliamento senza rischi. Il trattamento termico
del vino, appena prima dell'imbottigliamento, è
un'altra soluzione affidabile per questi fragili vini.
5.5 EFFETTO DEL METABOLISMO DEI BATTERI
DELL'ACIDO LATTICO SULLA COMPOSIZIONE E
SULLA QUALITÀ DEL VINO
A meno che non vengano applicati gli opportuni
trattamenti inibitori, i batteri lattici fanno parte della
normale microflora di tutti i vini bianchi e rossi.
Dall'inizio alla fine della fermentazione, e anche
durante l'invecchiamento e la conservazione,
alternano periodi di crescita e regressione successivi a
seconda delle specie e dei ceppi. Ogni moltiplicazione
o sopravvivenza comporta un metabolismo forse
molto attivo o, al contrario, appena percettibile e
perfino impossibile da rilevare con i metodi analitici
attuali. I substrati vengono trasformati e di
conseguenza i caratteri organolettici vengono
modificati. Alcune attività metaboliche sono favorevoli
e altre senza conseguenze, mentre alcune sono
totalmente dannose per la qualità del vino (Volume 2,
Sezione 8.3).
I principali substrati per i batteri del vino fino ad oggi
conosciuti sono molecole semplici: zuccheri e acidi
organici. Sebbene la loro trasformazione non sia
attualmente verificata, altri componenti del vino più
complessi, come i composti fenolici, i composti
aromatici oi precursori di aromi, presenti in piccole
quantità, sono senza dubbio parzialmente
metabolizzati. La ripercussione di queste piccole
trasformazioni sui caratteri organolettici può essere (a
seconda delle molecole interessate) almeno
altrettanto importante delle reazioni principali.
L'unico substrato sempre metabolizzato per la stessa
via da tutte le specie di batteri del vino è l'acido L-
malico. L'attività cellulare è modulata dalla presenza di
altri composti che agiscono a livello di trasporto o
sull'attività enzimatica. La crescita dei batteri lattici nel
vino è ricercata proprio per questa attività; anzi, è
l'unica attività veramente desiderata. Consente
l'ammorbidimento del vino provocato dalla
deacidificazione e dalla sostituzione dell'acido malico con
l'acido lattico, composto dal sapore meno aggressivo.
I batteri degradano gli zuccheri del mosto e del vino con
affinità diversa a seconda della specie e forse anche del
ceppo. Gli esosi vengono fermentati in acido L o D lattico
o in una miscela delle due forme, a seconda della specie.
In generale, lo sviluppo batterico si verifica dopo lo
sviluppo del lievito. Pertanto, l'acido lattico formato dagli
zuccheri è in quantità trascurabili rispetto alla quantità
proveniente dall'acido malico. Diverse specie batteriche
producono acido D-lattico ma è la forma esclusiva per i
cocchi eterofermentanti, e quindi O. oeni, il batterio più
importante per l'enologia. Tra i prodotti della
fermentazione dello zucchero di O. oeni, l'acido acetico è
significativo per il suo contributo all'acidità volatile dei vini.
Come l'acido D-lattico, viene prodotto in piccole quantità
fintanto che i batteri non fermentano troppo lo zucchero
residuo. Un aumento dell'acidità volatile può quindi
essere attribuito ai batteri lattici, se si forma
contemporaneamente una quantità anormale (> 0,3 g / l)
di acido D-lattico. In questo caso O. oeni ha fermentato
una notevole quantità di zuccheri (pochi grammi per litro).
Questa situazione è chiamata malattia lattica.
L'acido acetico è anche uno dei prodotti metabolici
inevitabili dell'acido citrico, prodotto da
lattobacilli omofermentanti e soprattutto da cocchi
eterofermentanti. La fermentazione di poche centinaia di
milligrammi di zuccheri per litro aumenta l'acidità volatile
durante la fermentazione malolattica. Sebbene effettuata
su una piccola quantità di substrato, la degradazione
dell'acido citrico è certamente importante per la
produzione di diacetile.
Il diacetile, come gli altri composti α-dicarbonilati nel vino,
il gliossale, il metilgliossale e il pen- tanedione, prodotti in
parte dal metabolismo dei batteri lattici, sono altamente
reattivi. Le reazioni, in particolare quelle con la cisteina nel
vino, producono eterocicli come il tiazolo, descritto come
odore di popcorn, pane tostato e nocciole, e tiofene e
furano, con aromi di caffè e gomma bruciata (Marchand
et al., 2000) .
La metionina e la cisteina vengono metabolizzate in
composti solforati volatili. La specie O. oeni è
particolarmente attiva nella conversione della cisteina in
idrogeno solforato e 2-sulfanil etanolo e la metionina in
 5. Metabolismo dei batteri dell'acido lattico

dimetil disolfuro, 3- (metha- sulfanil) propanolo, 3-
(metasulfanil) propan-1-olo e 3- (metasulfanil ) acido
propionico. Il più interessante di questi composti dal
punto di vista sensoriale è l'acido 3- (metasulfanil)
propionico, con le sue sfumature terrose di frutti a
bacca rossa (Pripis-Nicolau, 2002).
Per quanto riguarda gli altri metabolismi noti dei
batteri lattici nel vino, tutti partecipano in un modo o
nell'altro al deterioramento del vino. La degradazione
dei componenti essenziali del vino come l'acido
tartarico e il glicerolo rispettivamente in acidità volatile
e sostanze dal sapore amaro distrugge
completamente la qualità organolettica del vino. Il
metabolismo degli amminoacidi (arginina, istidina,
ecc.) Non influisce sul gusto, ma a livello tossicologico
crea un problema aumentando le concentrazioni di
precursori di ammine biogene ed etil carbomato nel
vino. Tutto sommato, la corda sembra essere la
malattia più diffusa e spettacolare, ma anche se causa
un danno economico, i danni possono essere limitati
poiché il vino avariato può essere curato e
commercializzato.
A differenza del metabolismo dell'acido malico, degli
zuccheri e dell'acido citrico, queste ultime
trasformazioni sono effettuate da alcuni ceppi
appartenenti a specie normalmente inoffensive. Il
deterioramento batterico non può più essere
attribuito a una specifica specie batterica, come in
passato. Alcuni ceppi di O. oeni formano ammine
biogene e altri ceppi formano la citrullina, precursore
dell'etil carbomato.
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 6. Sviluppo dei batteri dell'acido lattico nel vino
6.1 NUTRIZIONE DEI BATTERI ACIDO LATTICO NEL
VINO
Come tutti i microrganismi, le cellule dei batteri lattici
si moltiplicano quando le condizioni sono favorevoli:
presenza di fattori nutritivi, assenza di fattori tossici e
temperatura adeguata. Tutte le principali reazioni del
suo metabolismo sono dirette alla biosintesi dei
componenti cellulari: acidi nucleici per la trasmissione
del patrimonio genetico, carboidrati, lipidi, proteine di
struttura e naturalmente proteine biologicamente
attive. Per garantire queste sintesi, la cellula deve
prima trovare gli elementi chimici necessari nel
mezzo: carbonio, azoto e minerali - in forme
utilizzabili. Poiché tutte queste reazioni di sintesi sono
endergoniche, il mezzo deve forniscono anche
molecole in grado di
energia necessaria. La maggior parte dell'energia
viene fornita dall'assimilazione di vari substrati. Inoltre,
la cellula riceve energia da sofisticati sistemi che
attivano fenomeni di trasporto di elettroni e protoni.
Sebbene questi sistemi non possano garantire la
totalità della crescita cellulare, vi contribuiscono, in
alcuni casi molto attivamente, in particolare quando le
cellule sono in condizioni nutrizionalmente limitate.
6.1.1 Fonti di energia
La maggior parte dell'energia proviene
dall'assimilazione di numerosi substrati organici,
zuccheri, amminoacidi e acidi organici. I batteri lattici
sono organismi chemioorganotrofi. L'ossidazione di
questi substrati è principalmente rappresentata dalla
fermentazione degli zuccheri. I batteri lattici
eterofermentanti e omofermentanti degradano esosi
e pentosi. In diversi stadi del loro metabolismo, le
reazioni esergoniche consentono lo stoccaggio di
energia nelle molecole di ATP (Sezione 5.2).
L'ossidazione degli zuccheri è sempre accoppiata alla
riduzione dei coenzimi. Nell'anaerobiosi, il processo di
fermentazione lattica è responsabile della loro
riossidazione. Nel metabolismo di altri substrati, la
liberazione di energia dalle reazioni può essere
accompagnata dalla sintesi di ATP: è il caso della
degradazione dell'acido citrico e dell'arginina.
L'importanza energetica della forza motrice del
protone creata a livello della membrana è stata
dimostrata in diverse specie di batteri lattici. La
membrana batterica ha infatti un duplice ruolo: da un
lato è una barriera che si oppone alla libera diffusione
dei componenti del mezzo e del citoplasma; d'altra
parte, è il sito dello
scambio di protoni ed elettroni. La forza motrice del
protone ha due componenti: una differenza di potenziale
elettrico (negativo all'interno) e un gradiente protonico (di
pH). Il mantenimento di una forza motrice protonica
richiede una H + -ATPasi della membrana, che funziona in
modo reversibile. Un afflusso di protoni porta alla sintesi
di ATP; al contrario, l'efflusso di protoni consuma energia.
Nei batteri lattici, l'efflusso di lattato dal metabolismo è
associato all'efflusso di due protoni (symport). In questo
modo, l'efflusso di protoni non richiede energia.
Durante la fermentazione malolattica, l'uso del malato
produce una forza motrice protonica sufficiente per la
sintesi dell'ATP. L'afflusso di malato caricato
negativamente nella cellula è accoppiato con l'efflusso di
lattato neutro; si crea una differenza di potenziale. Inoltre,
la decarbossilazione provoca l'alcalinizzazione del
citoplasma e quindi aumenta il gradiente di pH. Tutto ciò
porta alla creazione della forza motrice del protone. Si
conserva quindi l'energia fornita indirettamente dalla
trasformazione malolattica. Questo stesso processo
spiega il guadagno di energia dalla decarbossilazione di
istidina e tirosina. Lo scambio istidina / istamina,
accompagnato dal trasferimento di una carica negativa, e
la reazione di decarbossilazione provocano
l'alcalinizzazione dell'ambiente interno, garantendo la
conservazione dell'energia come nel caso precedente
(Poolman, 1993).
6.1.2 Nutrienti, vitamine e oligoelementi
Oltre all'acqua (il componente più importante), le cellule
traggono dal loro ambiente carbonio, azoto ed elementi
minerali come fosforo e zolfo. Queste sostanze entrano
nella composizione dei componenti cellulari.
Il carbonio proviene essenzialmente da zuccheri e talvolta
da acidi organici. Glucosio e fruttosio sono gli zuccheri più
rappresentati nel vino dopo la fermentazione alcolica
(poche centinaia di milligrammi per litro). Sono presenti
anche mannosio, galattosio, pentosi (arabinosio, xilosio,
ribosio), ramnosio e alcuni disaccaridi in piccole
concentrazioni (una dozzina di milligrammi ciascuno per
litro). La capacità di degradazione dello zucchero dipende
dalla specie batterica e (ad esempio per il glucosio) da
fattori ambientali.
Oenococcus oeni degrada il fruttosio più facilmente del
glucosio. La sua presenza in miscela con glucosio è
benefica per la crescita. La sua riduzione in mannitolo
rigenera le molecole di coenzima necessarie per
l'ossidazione del glucosio. Per mancanza di coenzimi
ridotti,
 6. Sviluppo dei batteri dell'acido lattico nel vino
'acetilfosfato non porta alla formazione di etanolo, ma
piuttosto ad acido acetico e ATP.
L'energia ottenuta dalla fermentazione degli zuccheri
residui è ampiamente sufficiente per garantire la
crescita necessaria per avviare e completare con
successo la fermentazione malolattica. Secondo
Radler (1967), meno di 1 g di glucosio per litro copre il
fabbisogno dei batteri per formare la biomassa
necessaria alla fermentazione malolattica. Infatti, è
sufficiente molto meno di 1 g di glucosio, poiché
vengono utilizzati anche altri zuccheri nel mezzo. Gli
zuccheri disponibili non provengono solo
direttamente dal mosto d'uva ma probabilmente
anche dall'idrolisi di alcuni dei suoi componenti, in
particolare i polisaccaridi.
Gli amminoacidi e talvolta i peptidi forniscono ai
batteri lattici il loro azoto assimilabile. Il fabbisogno di
aminoacidi varia in relazione alla specie e persino al
ceppo. Questi acidi possono essere strettamente
indispensabili o semplicemente attivatori della
crescita.
Secondo Ribe ́reau-Gayon et al. (1975), i seguenti
amminoacidi sono necessari in tutto o in parte, a
seconda del ceppo: Ala, Arg, Cys, Glu, His, Leu, Phe,
Ser, Trp, Tyr e Val. I cocchi hanno richieste più severe
dei bacilli. I risultati degli studi auxotrofici sono,
tuttavia, difficili da ottenere e interpretare. In uno
studio più recente su O. oeni, Fre ́ maux (1990) ha
dimostrato la loro auxotrofia per Ile, Leu e Val. Le vie
di sintesi di questi acidi hanno enzimi in comune per
la produzione di acidi aromatici (Phe, Trp, Tyr), derivati
dallo stesso precursore, acido corismico, e per Arg,
His, Ser e Met. Nuove osservazioni suggeriscono che il
suo è uno stimolante e non essenziale.
Sebbene questi dati rimangano molto imprecisi, una
carenza di aminoacidi non sembra essere
responsabile delle difficoltà di crescita dei batteri
lattici nel vino. Si possono notare carenze temporanee
all'inizio della fermentazione alcolica durante la fase di
rapida moltiplicazione dei lieviti, ma alla fine non è più
così. Il metabolismo e quindi l'autolisi dei lieviti
rilasciano nell'ambiente una grande varietà e quantità
di amminoacidi. La coltura di Oenococcus e
Lactobacilus in un terreno di laboratorio sintetico
mostra che tutti gli amminoacidi del terreno possono
essere consumati durante la crescita. Nel vino alcuni
amminoacidi
diminuiscono mentre altri aumentano di concentrazione,
probabilmente a causa della contemporanea idrolisi di
peptidi o proteine. Inoltre, la concentrazione di ammonio
aumenta in seguito alla reazione di deaminazione (Ribe
́reau-Gayon et al., 1975). Gli amminoacidi sono
essenzialmente utilizzati per la sintesi proteica. A seconda
del ceppo, alcuni possono essere catabolizzati e servire
come fonti di energia (arginina, istidina e tirosina).
Tra i composti azotati, le basi puriche e piramidiche
svolgono un ruolo importante nell'attivazione della
crescita. In questo caso, anche il fabbisogno di adenina,
guaina, uracile, timina e timidina dipende dal ceppo. Non
sono sempre essenziali.
Sono necessari minerali come Mg2 +, Mn2 +, K + e Na +. I
primi due sono spesso usati come cofattori enzimatici
chiave del metabolismo (chinasi, enzima malolattico). I
seguenti oligoelementi sono coinvolti nella nutrizione dei
lattococchi: Cu2 +, Fe3 +, Mo4 + e Se4 +. Eppure il ruolo di
questi metalli
163
ioni non è stato ancora stabilito per i batteri lattici del
vino.
Le vitamine sono coenzimi o precursori del coenzima. I
batteri lattici non sono in grado di sintetizzare le vitamine
del gruppo B, in particolare l'acido nicotinico, la tiamina, la
biotina e l'acido pantotenico. Nel succo d'uva è stato
identificato un derivato glicosilato dell'acido pantotenico;
inizialmente era stato purificato dal succo di pomodoro
(Tomato Juice Factor: Amachi, 1975).
Infine, tra gli elementi chimici importanti, il fosforo gioca
un ruolo primordiale nei batteri lattici, come in tutte le
cellule, nella composizione degli acidi nucleici, dei
fosfolipidi e nello stoccaggio di energia sotto forma di
ATP.
Tutti i minerali e le vitamine citati, così come i substrati di
carbonio e i nutrienti azotati, si trovano in quantità
sufficienti nel vino. Solo in casi eccezionali, le difficoltà di
sviluppo dei batteri dopo la fermentazione alcolica
possono essere dovute a carenze nutrizionali. Un
semplice esperimento è sufficiente per provare questa
affermazione: una modificazione favorevole di uno dei
fattori fisico-chimici che verranno studiati in seguito
(temperatura, pH) di solito permette la moltiplicazione
della popolazione. Indipendentemente da questi fattori
fisico-chimici, l'assenza di crescita deve essere
considerata come causata da inibitori.
 6. Sviluppo dei batteri dell'acido lattico nel vino
6.2 FATTORI FISICO-CHIMICI DELLA CRESCITA
BATTERICA
Quattro parametri determinano molto distintamente il
tasso di crescita dei batteri lattici nel vino: pH,
temperatura, contenuto di alcol e concentrazione di
SO2. Anche altri fattori sono in gioco, ma in misura
minore e possono essere determinanti solo in alcune
condizioni.
Questi quattro fattori essenziali sono noti da molto
tempo. Hanno permesso la definizione di “regole
enologiche”. I progressi nelle attrezzature della
cantina hanno reso queste regole progressivamente
più facili da seguire (Sezione 12.7.4). Nessuno di
questi fattori può essere considerato
indipendentemente dagli altri: i quattro agiscono
insieme come un'unità. Un livello favorevole di uno
compensa un valore sfavorevole di uno o più altri. È
anche piuttosto difficile dare un limite esatto per
ciascuno di essi. In questo modo, i batteri tollerano
contenuti alcolici e concentrazioni di SO2 più elevati
nei vini con pH favorevoli rispetto ai vini con pH bassi.
6.2.1 Influenza del pH
La variazione del tasso di crescita correlata al pH
presenta un valore ottimale e limiti estremi. La
maggior parte dei batteri si sviluppa meglio a un pH
vicino alla neutralità. Non è il caso dei batteri
acidogeni come i fermenti lattici: la loro acidofilia ne
permette lo sviluppo attivo nel vino a pH bassi, intorno
a 3,5. A pH bassi come 2,9-3,0, la crescita rimane
possibile ma lenta. Ai limiti di pH superiori del vino
(3,7–3,8), è molto più veloce. La crescita interrotta a
causa dell'acidità ambientale si verifica quando il pH
intracellulare raggiunge un certo limite (pHi). Non
dipende solo dal pH ambientale ma anche dalla
natura degli acidi (McDonald et al., 1990). Infatti, la
frazione di acidi che penetra liberamente in forma
non dissociata si dissocia all'interno della cellula,
determinando una diminuzione del pH. Di
conseguenza, l'attività enzimatica intracellulare è più o
meno inibita rispetto al pH ottimale della loro attività.
Anche la forza motrice del protone e i trasporti
dipendenti sono rallentati, interferendo con il
metabolismo globale della cellula e quindi con la
moltiplicazione. Il limite inferiore tollerato per il pHi
varia a seconda della specie. Secondo McDonald et al.
È rispettivamente di circa 4,7 e 5,5 per L. plan- tarum
e L. mesenteroides. (1990). A pH 3.5, O.
oeni mantiene un pHi più alto di L. plantarum (Henick-
Kling, 1986). I ceppi di questa specie si adattano meglio
all'acidità rispetto ad altre specie. Inoltre, se coltivate in un
ambiente acido, hanno un pHi più elevato e quindi una
forza motrice protonica maggiore, legata al gradiente
protonico più elevato.
I meccanismi di adattamento dell'acidità non sono noti
ma partecipano attivamente alla selezione naturale di
questa specie nel vino. È ormai da tempo accertato che i
vini con pH relativamente alti presentano non solo una
microflora lattica più abbondante ma anche una molto
più varia rispetto ai vini acidi. Questi vini sono
microbiologicamente più fragili come alcuni batteri
sono fattori di deterioramento e poiché una gamma più
ampia di substrati viene metabolizzata. Il pH elevato
facilita la crescita dei batteri nel vino, oltre a favorirne la
sopravvivenza, non solo direttamente ma anche
riducendo l'efficacia dell'anidride solforosa libera. Il
deterioramento può svilupparsi diversi mesi, o anche
anni, dopo la fermentazione. Il pH ha anche un impatto
sull'attività malolattica dell'intera cellula.
Oltre alla crescita, il pH influisce sull'attività malolattica
dell'intera cellula. Sebbene il pH ottimale dell'enzima
purificato sia 5,9, non è lo stesso per le cellule. L'attività
malolattica dei ceppi O. oeni è ottimale a un pH compreso
tra 3,0 e 3,2 e circa il 60% della sua attività massima a pH
3,8. Il normale intervallo di pH dei vini, quindi, ben
corrisponde alla massima attività malolattica della cellula
batterica. Tuttavia la velocità della fermentazione
malolattica dipende non solo dall'attività ma anche dalla
quantità di cellule. Infine, ai valori usuali del vino, il pH
influenza entrambi allo stesso modo. Di conseguenza, a
parità di condizioni, la fermentazione malolattica è più
rapida a pH più elevati. Ad esempio, la fermentazione
malolattica dura 164 giorni per un vino regolato a pH 3,15
e 14 giorni per un vino regolato a 3,83 (Bousbouras e
Kunkee, 1971).
Secondo Ribe ́reau-Gayon et al. (1975), il pH condiziona
anche la natura dei substrati trasformati. Gli autori hanno
definito la soglia di pH per l'assimilazione dell'acido malico
e dello zucchero. Corrisponde al pH più basso al quale si
trasforma il substrato e varia a seconda del ceppo. Il pH
soglia per l'acido malico è inferiore al pH soglia per gli
zuccheri. Nella zona compresa tra questi due pH, i batteri
degradano l'acido malico senza fermentare una grande
quantità di zuccheri e quindi senza produrre acidità