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MODELLO CINETICO PER LA

PRODUZIONE DELLO XANTANO


Xanthan gum is a complex
exopolysaccharide produced by
the plant pathogenic bacterium
Xanthomonas campestris pv.
campestris. It consists of D-
glucosyl, D-mannosyl, and D-
glucuronyl acid residues in a
molar ratio of 2:2:1 and variable
proportions of O-acetyl and
pyruvyl residues. Because of its
physical properties, it is widely
used as a thickener or viscosifier
in both food and non-food
industries. Xanthan gum is also
used as a stabilizer for a wide
variety of suspensions,
emulsions, and foams. We are
interested in the biosynthesis
and degradation of xanthan. The
iosynthetic pathway of xanthan
resembles that of succinoglycan.
INTRODUZIONE

Lo xantano è una gomma


industriale ottenuta mediante
fermentazione ed è probabilmente
la più utilizzata a livello
commerciale.

Le soluzioni acquose della gomma


di xantano hanno una grande
utilità per le loro proprietà
reologiche:
Proprietà reologiche

 Comportamento da finta plastica;


 Viscosità stabile in un vasto range
di temperature;
 pH e concentrazione salina;
 Effetto sinergico con soluzioni di
galattomannani.
Tali proprietà reologiche permettono
alle soluzione acquose di Xantano di
essere usate in un gran numero di
industrie differenti (alimentare,
cosmetica e farmaceutica) come:

 Emulsionante;
 Agente sospendente;
 Agente addensante.
Produzione dello Xantano

Xanthomonas campestris è il batterio


maggiormente utilizzato per la
produzione dello xantano, è un
microorganismo aerobio obbligato.

X. campestris utilizza maggiormente la


via di Entner-Doudoroff come processo
catabolico del glucosio.
Via di Entner-Doudoroff

Glucochinasi Glucosio-6-fosfato
deidrogenasi Aldolasi

Etanolo + CO2

Alcuni batteri demoliscono il glucosio attraverso la via


del 2-cheto-3-deossi-6-fosfogluconato (o di Entner-
Doudoroff) e grazie alla piruvato decarbossilasi il
piruvato è convertito in acetaldeide e CO2.
L’acetaldeide viene poi ridotta ad etanolo grazie
all’azione di un alcool deidrogenasi.
Il processo di produzione della gomma
dello xantano può essere effettuato in
diverse tappe:

1. Produzione di una coltura contenente X.


campestris;
2. Preparazione dell’inoculo;
3. Produzione;
4. Raccolta della massa;
5. Isolamento.
Variabili che influenzano la produzione:

 Composizione del mezzo di coltura;


 Temperatura;
 pH;
 Coefficiente di diffusione della
massa di O2;
 Fonte di azoto.
Concentrazione di O2 e N
 La concentrazione dell’ossigeno è molto
importante per lo sviluppo cellulare dei
microrganismi aerobici; infatti l’X. campestris
necessita di ossigeno per compiere sia il
processo di crescita che quello di produzione.

 Anche la quantità di N necessario varia a


seconda delle diverse fasi del processo
produttivo; infatti è possibile registrare, nella
fermentazione dell’ X. campestris, una
richiesta massima sia durante la crescita che
durante la fase di produzione.
La produzione dello xantano può essere
descritta mediante modelli cinetici più o
meno complessi.

Il più complesso è capace di descrivere


la biomassa, la fonte di azoto, la fonte di
carbonio, la produzione della gomma
dello xantano e l’evoluzione di ossigeno
dissolto.

Tuttavia questi modelli non sono capaci


di prendere in considerazione i
cambiamenti futuri di tutte le condizioni
operative.
MODELLO CINETICO
Il modello cinetico proposto può essere
diviso in due diverse parti in relazione
tra di loro:
1. descrizione della crescita (intesa
prevalentemente come metabolismo
dell’azoto);
2. descrizione della produzione di xantano,
dell’energia di mantenimento e della
fosforilazione ossidativa (produzione e
catabolismo intesi prevalentemente
come metabolismo del carbonio).
La descrizione della crescita si
basa sul presupposto di
considerare le reazioni ottenute
come un somma dei parametri
formanti la via considerata;
come mostra la figura:
 Sintesi degli
amminoacidi non
formanti basi (r1);

 sintesi degli
amminoacidi
formanti basi (r2);

 sintesi delle basi


dell’RNA (r3);

 sintesi delle basi


del DNA (r4).
La descrizione del metabolismo
della fonte di carbonio è
determinata assumendo che il
glucosio è coinvolto nelle quattro
reazioni preliminari, ed è anche
usato per:
 produzione dello
xantano (r5);

 catabolismo totale del


glucosio (r6).

Infine altre reazioni


sono prese in esame:

 fosforilazione
ossidativa (r7 e r8);

 energia di
mantenimento (r9).
Il processo di produzione della gomma
dello xantano è formato da nove reazioni
stechiometriche linearmente indipendenti
che riguardano:

1. aminoacidi non formanti basi;


2. DNA;
3. RNA;
4. ammonio (NH4+);
5. xantano (P);
6. saccarosio (S);
7. FAD+;
8. ossigeno disciolto (O2);
9. ATP.
La biomassa è stata considerata
come formata da quattro
componenti:

1. proteine intracellulari (IPR);


2. basi formanti RNA;
3. basi formanti DNA;
4. idrocarburi intracellulari (lipidi,
xantano, ecc.).
Equazioni Cinetiche
Le equazioni cinetiche supposte per
ogni reazione dello schema precedente
sono:
dove:
3.58 e 4 sono i coefficienti
stechiometrici;
CA = [ammoniaca]
CX = [biomassa]
CO2 = [ossigeno disciolto]
YATP = resa ATP
k’5 = costante modello (L/molO2)
Il modello cinetico è costituito da otto
equazioni differenziali, che descrivono
la produzione della biomassa e i
processi di produzione dei composti
restanti (ammoniaca, IPR, RNA, DNA,
fonte di carbonio, xantano e ossigeno
disciolto).
Al fine di conoscere la quantità delle
proteine extracellulari formate
(EPR) è stato condotto un bilancio
sulla massa di azoto ad ogni fase
dell’esperimento.

La formula molecolare (generica)


per le EPR è stata assunta essere
simile a quella delle IPR.
Il modello proposto è formato dal seguente
insieme di equazioni differenziali:
dove 18, 136.9, 103.4, 475.25,
463.9, 180.0 e 923.2 sono
rispettivamente i pesi molecolari
dell’NH4 e quelli assunti per
amminoacidi non formanti basi
(aaNFB), amminoacidi formanti basi
(aaFB), RNA, DNA, glucosio e
xantano. I coefficienti 1.4, 2.74,
5.49, 0.933, 0.5, 1.08, 0.041 e 0.3
sono i coefficienti stechiometrici dei
diversi composti coinvolti nello
schema della reazione.
Per la valutazione del coefficiente
volumetrico di trasferimento della massa
di ossigeno (kLaV), in un reattore
omogeneo e continuamente agitato, è
stata impiegata l’equazione:

Dove:
µ = viscosità apparente
N = velocità dell’agitatore
VS = flusso d’aria (m/s)
Condizioni sperimentali e procedura
Gli esperimenti sono stati svolti in un bireattore
commerciale con un volume di lavoro di 1.5 L.
Procedura sperimentale:

 inoculo costruito usando un mezzo di coltura


complesso (YM: D-glucosio (10 g/L));
 peptone batteriologico (5 g/L);
 estratto di lievito (3 g/L);
 estratto di malto (3 g/L)

che devono essere aggiunti, sia per la piastra di


coltura sia per il primo stage della coltivazione
nell’agitatore.
Il secondo stage dopo che l’inoculo si è formato
viene compiuto usando:

 YM-T (D-Glucosio (12 g/L));


 peptone batteriologico (2.5 g/L);
 estratto di lievito (1.5 g/L);
 estratto di malto (1.5 g/L);
 PO4H(NH4)2 (1.5 g/L);
 PO4HK2 (2.5 g/L);
 MgSO4 (0.05 g/L).

Inoltre il pH deve essere portato a 7.0 con


l’aggiunta di HCl.
Il mezzo di coltura è stato ottimizzato altrove,
utilizzando:

 saccarosio (40 g/L);


 acido citrico (2.1 g/L);
 NH4NO3 (1.144 g/L);
 KH2PO4 (2.866 g/L);
 MgCl2 (0.507 g/L);
 Na2SO4 (0.089 g/L);
 H3BO3 (0.006 g/L);
 ZnO (0.006 g/L);
 FeCl3. 6H2O (0.020 g/L);
 CaCO3 (0.020 g/L);
 HCl (0.13 ml).
Condizioni operative
 Il pH è stato portato, con aggiunta di NaOH, al
valore di 7.
 Il mezzo di coltura privo della fonte di carbonio
è stato sterilizzato in sito.
 La fonte di carbonio è stata separatamente
sterilizzata e introdotta in un secondo momento
nel bioreattore.
 L’inoculo è stato introdotto nel bioreattore
attraverso un setto di membrana.
 La temperatura è stata controllata attraverso la
strumentazione del bioreattore.

In diversi momenti durante i processi, campioni


di 10 ml di coltura sono stati prelevati per
essere analizzati.
Metodi analitici

 La citometria a flusso è stata la modalità d’analisi


utilizzata per i composti intracellulari (proteine,
DNA e RNA).
 La concentrazione delle proteine extracellulari è
stata calcolata mediante il bilancio dell’azoto.
 La concentrazione dello Xantano è stata ottenuta
come variazione della viscosità del brodo di
coltura misurata a 25°C e 30 rpm in un
viscosimetro.
 La concentrazione del saccarosio è stata misurata
mediante strumenti di HPLC.
 La concentrazione dell’ossigeno disciolto è stata
monitorata mediante un elettrodo polarografo.
Metodo del calcolo del parametro
I valori del parametro sono stati ottenuti
attraverso una tecnica di regressione non
lineare, usando un algoritmo a risposta
multipla.

L’integrazione dell’insieme delle eq.


differenziali è stata ottenuta con l’ausilio
di un algoritmo di Runge-Kutta del quarto
ordine.

Per il significato statistico dei dati sono


stati utilizzati i test di F Fisher e Student
(t-test).
Risultati sperimentali e discussione
Sono stati effettuati sei esperimenti
cambiando due variabili: la [N] iniziale
(130,257 e 457 ppm di ammonio) e la
temperatura (25, 28, 31 e 34°C).

I valori cinetici del parametro ottenuti non


hanno mostrato dipendenza rispetto alla
[N] iniziale, ma hanno, invece, mostrato
dipendenza rispetto alla temperatura.

Alcuni di questi con un massimo (k2, k5 e


YOX), altri con tendenze lineari (k1, kHC e
k’5), e infine altri non variano (k3 e k4).
I risultati sperimentali ottenuti posso
essere osservati nelle seguenti figure:

T=25°C; T=28°C;
[ammonio]=257 ppm [ammonio]=257 ppm
(a)biomassa, proteine intracellulari, RNA, DNA, [ammonio]
(b)saccarosio, xantano e ossigeno disciolto
T=31°C; T=34°C;
[ammonio]=257 ppm [ammonio]=257 ppm

(a)biomassa, proteine intracellulari, RNA, DNA, [ammonio]


(b)saccarosio, xantano e ossigeno disciolto
T=28°C; T=28°C;
[ammonio]=130 ppm [ammonio]=457 ppm

(a)biomassa, proteine intracellulari, RNA, DNA, [ammonio]


(b)saccarosio, xantano e ossigeno disciolto
I dati sperimentali sono stati uniti al modello
cinetico, tenendo conto dei diversi parametri in
funzione della temperatura, ne consegue:
Conclusioni
Il modello proposto è capace di prevedere il
comportamento del sistema quando solo alcune
condizioni variano.

Ad es.

Quando la [N] iniziale


cambia, la produzione
massima di xantano si
ha a ~200 ppm di
ammonio.
Quando è la temperatura
a cambiare, la
produzione massima si
ha al di sopra di 28°C

Inoltre maggiore è la
percentuale di O2
disciolto e maggiore è la
produzione di Xantano