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Laboratorio di Biologia Sperimentale PURIFICAZIONE E STUDIO CINETICO DELL'ALDOSO REDUTTASI L'aldoso reduttasi (ALR2 - EC 1.1.1.

21) una aldo-cheto reduttasi NADPH-dipendente che catalizza la riduzione di vari composti contenenti gruppi carbonilici negli alcoli corrispondenti. Esso rappresenta il primo enzima della Via dei polioli (Schema 1 ), nella quale catalizza la riduzione del glucosio in sorbitolo. Quest'ultimo viene successivamente trasformato in fruttosio dal secondo enzima della via, la sorbitolo deidrogenasi, mediante una reazione NAD+ dipendente.
Schema 1 - La Via dei Polioli

L'aldoso reduttasi presenta una bassa affinit per il glucosio, sicch, in condizioni di normoglicemia (3.86.1 mmol/L), solo il 3% di questo viene trasformato in sorbitolo. Quando invece la cellula si trova in condizioni di iperglicemia, ovvero quando la concentrazione intracellulare di glucosio supera i 7mmol/L, come accade nei soggetti diabetici, fino al 30% del glucosio metabolizzabile viene ridotto dagli enzimi di questa via [1]. Questo sbilanciamento osmotico si riflette in un aumento notevole di Specie Reattive dell'Ossigeno (ROS), ormai notoriamente ritenute causa dei disturbi legati al diabete. La suscettibilit di questo enzima all'inibizione , ormai da parecchio tempo, oggetto di numerosi studi, che hanno appunto come scopo ultimo la possibilit di prevenire le suddette complicazioni. La questione non affatto semplice: stato dimostrato che l'enzima riduce efficacemente il 4-idrossi-2,3nonenale (HNE), il prodotto aldeidico della demolizione degli acidi grassi -6 (linoleico e arachidonico), presenti nelle membrane biologiche, causata dai radicali liberi ( perossidazione lipidica). Questa molecola , a basse concentrazioni, un fattore importante nella segnalazione cellulare e nell'espressione genica [2]. Al contrario, ad alte concentrazioni essa diventa altamente tossica: essendo un elettrofilo, reagisce con i nucleofili cellulari, quali acidi nucleici, i gruppi sulfidrilici delle cisteine, l'-amminogruppo delle lisine e con l'anello imidazolico delle istidine (addizione di Michael), con i quali forma degli addotti, che concorrono all'insorgenza di varie patologie, come il morbo di Alzheimer [3] e il cancro. L'ALR2 catalizza la riduzione dell'idrossinonenale (e dei suoi addotti, come ad esempio il glutatione-HNE, GS-HNE) con un'efficacia che supera di diversi ordini di grandezza quella del glucosio [4]; esso quindi pu considerarsi un valido mezzo di detossificazione cellulare e pertanto la sua inibizione non sarebbe sempre vantaggiosa. Ci che i ricercatori si propongono di trovare una strategia di inibizione differenziale, in modo tale che l'attivit riduttiva nei confronti del glucosio venga inibita, senza per alterare la sua capacit riduttiva nei confronti delle aldeidi idrofobiche. Questa relazione il frutto di un'attivit didattica sperimentale. Lo scopo del lavoro era quello di acquisire conoscenze sulle tecniche di laboratorio correntemente utilizzate dai ricercatori dell'unit di Biochimica del Dipartimento di Biologia, nell'ambito dello studio delle caratteristiche strutturali e cinetiche degli enzimi. Il lavoro stato costruito passo dopo passo, seguendo i passaggi della purificazione dell'ALR2 e dello studio cinetico delle reazioni alle quali esso partecipa. Abbreviazioni: ALR2: Aldoso reduttasi NADPH: Nicotinammide adenina dinucleotide fosfato GAL: DL-gliceraldeide HNE: 4-idrossi-2,3-nonenale GSHNE: 3-Glutatione-4-idrossi-nonanale

MATERIALI E METODI Materiali Cristallini di bovino, forniti da un macello locale; Sodio fosfato monobasico monoidrato (NaH2PO4H2O) acquistato da J.T. Baker; Acido etilendiaminotetraacetico (EDTA ) acquistato dalla SERVA Feinbiochemica; Solfato d'ammonio ((NH4)2SO4) acquistato dalla Merk Chemicals; Ditiotreitolo (DTT o Reagente di Cleland) acquistato dalla INALCO; DE52 DEAE cellulosa acquistata dalla Whatman; Matrex Gel Orange A acquistato dalla Millipore-Amicon; Sephadex G75 acquistato dalla Pharmacia; NADP H e GAL, acquistati alla SigmaAldrich; HNE e GS-HNE, acquistati dalla Cayman Chemical; Determinazione della concentrazione proteica Il dosaggio delle proteine stato effettuato secondo il metodo Bradford [5], utilizzando come standard lalbumina di siero bovino (BSA) a 0,1 mg/ml. Sono state preparate 4 cuvette da 1ml, contententi concentrazioni crescenti di BSA (da 0 a 4 g/ml) e una quantit fissa di colorante. Sono stati misurati i valori di assorbanza a = 595 nm e, dopo aver sottratto a questi lassorbanza della cuvetta senza BSA ( bianco), sono stati riportati in grafico, in funzione della quantit di BSA presente nella soluzione (espressa in g) (vedi Figura 1). La curva ottenuta ci permetter, una volta misurata lassorbanza a 595 nm nei vari estratti proteici ottenuti durante la purificazione, di risalire alla quantit di proteine presente in questi.

0,3 Assorbanza 0,2 0,1 0 0

f(x) = 0,07x + 0,01

0,5

1,5

2,5

3,5

4,5

BSA (g)

Figura 1: Retta di taratura per la determinazione della concentrazione proteica Misura dell'attivit enzimatica L'attivit enzimatica pu essere quantificata tramite la misurazione del decremento di assorbanza (A), che direttamente correlato al decremento della concentrazione di substrato. Nota la legge di Lambert-Beer, possibile ottenere la velocit di reazione misurando il A 340/min della reazione di ossidazione di NADPH a NADP+ e dividendo questo valore per il coefficiente di estinzione molare () (340 = 6,22 x 103 M-1cm-1 ; d = 1 cm). Da qui possibile calcolare le unit enzimatiche presenti nella soluzione. Per unit enzimatica (U) si intende la quantit di un enzima che catalizza la conversione di 1 mol di substrato in un minuto. Quindi se si moltiplica il valore della velocit di reazione per il fattore di diluizione, si ottengono le U/mL di enzima contenute nel campione.

V U =v 0 tot ml V enz

dove

v 0=

A 340min

Dosaggio enzimatico - Miscela di saggio standard (V = 700 l) (T= 37C) Tampone sodio-fosfato monobasico 250mM a pH=6.8 EDTA 0,47mM

NaH2PO4H2O 0,38 mM NADPH 0,11 mM Enzima 100 l GAL 4,7 mM

Risultati: Purificazione dell'enzima L'ALR2 stato purificato a partire da 118 cristallini di bovino, che erano stati puliti e congelati a -20C, fino al momento dell'utilizzo. E' stato preparato un tampone standard a pH 7, utilizzato nel corso di tutta la purificazione, contenente: NaH2PO4H2O 10 mM, EDTA 0,5 mM e DTT 2 mM. Estratto grezzo I cristallini di bovino, precedentemente scongelati e ai quali stata praticata un'incisione ad X, sono stati posti in agitazione, per 45 minuti alla temperatura di 4C, in 800 ml di tampone standard. Quindi la sospensione stata centrifugata per 40 minuti a 9820 x g. Il sovranatante, l' estratto grezzo, stato raccolto e subito ne stata misurata l'attivit enzimatica, con il metodo suddetto. Resina a scambio anionico Nel primo passaggio della purificazione, l'estratto grezzo stato lasciato adsorbire su una resina a base di DEAE-cellulosa (DE52), che ci permette di trattenere le proteine cariche negativamente ed eliminare le restanti. L'adsorbimento stato fatto in batch in modo da facilitare l'interazione ionica tra le proteine e la resina. Dopo 40 minuti, stato effettuato un filtraggio tramite un filtro Bchner montato su una beuta codata collegata ad una pompa da vuoto: la resina stata lavata con 4 l di tampone standard; successivamente stato effettuato un secondo lavaggio con 2 l di tampone standard contenente NaCl 30mM. La resina stata risospesa ed stata trasferita in una colonna cromatografica (30 x 3,5 cm), sulla quale si proceduto con l'eluizione con il tampone con il sale (velocit del flusso: 55ml/h). Delle frazioni raccolte stata misurata l'assorbanza a = 280 nm. Quando quest'ultima risultava essere circa uguale a 0.5, stato applicato alla colonna un gradiente salino 2,5 0,03 [gradiente: 30-200mM], che ha permesso di 0,03 2 staccare l'enzima dalla resina. Si 0,02 1,5 0,02 continuata la lettura dell'assorbanza a 280nm. 1 0,01 A partire dalle prime frazioni sono stati 0,5 0,01 effettuati anche i dosaggi enzimatici (vedi 0 0 0 50 100 150 200 250 Figura 2). Assorbanza n frazione Attivit enzimatica Sono state quindi riunite le frazioni che Figura 2: Profilo di eluizione - DE52 presentavano attivit enzimatica (Vtot= 340 ml) e sono state concentrate tramite una membrana con taglio molecolare da 30kDa (V finale= 42ml).
Assorbanza

Colonna cromatografica per affinit Le frazioni enzimaticamente attive ricavate dal passaggio precedente sono state eluite su una colonna cromatografica impaccata con il Matrex Gel Orange A, il quale, avendo una struttura molecolare simile al coenzima, trattiene le proteine NADPH-dipendenti. Anche in questo caso, stata misurata l'assorbanza a 280 nm di tutte le frazioni e sono stati effettuati i dosaggi enzimatici su una frazione 2,5 0,07 0,06 2 ogni 10 raccolte. Quando l'assorbanza si 0,05 0,04 1,5 stabilizzata intorno a 0,1, il tampone stato 0,03 1 0,02 sostituito con un analogo contenente 0,01 0,5 [NADPH]=0,1mM, al fine di favorire il distacco 0 0 -0,01 delle proteine dalla resina. Attraverso ulteriori 0 50 100 150 200 250 dosaggi stato possibile individuare quelle Assorbanza n frazione attivit enzimatica frazioni in cui era presente l'enzima (vedi Figura 3: Profilo di eluizione Matrex Gel Orange Figura 3). Queste sono state raggruppate (Vtot= 90 ml), quindi saggiate e concentrate (V finale= 7 ml). Questo volume stato saggiato nuovamente, per calcolare le unit enzimatiche di ALR2 effettivamente presenti.
Assorbanza dA/min

dA/min

Colonna cromatografica ad esclusione molecolare Le frazioni attive ricavate dal Matrex Gel Orange sono state immesse in una terza colonna cromatografica, impaccata con il Sephadex G-75, un destrano con legami crociati in grado di filtrare proteine con peso molecolare compreso tra 3 e 80 kDa.
0,5

La Figura 4 mostra il risultato dell'assorbanza a 280 nm e dei dosaggi enzimatici effettuati sulle frazioni ricavate dall'eluizione di questa colonna.

0,4 Assorbanza 0,3 0,2 0,1 0 0 30 60 90

0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0

Le frazioni che presentavano attivit enzimatica Assorbanza n frazione Attivit enzimatica pi alta sono state raggruppate (V tot =58 ml); Figura 4: Profilo di eluizione Sephadex G75 questo insieme di frazioni stato poi concentrato (Vfinale= 5 ml) e diviso in aliquote da 250 l, per essere conservate a -80C.

La Tabella 1 mostra, in maniera riassuntiva, il risultato della purificazione. I valori sono stati cos calcolati:

Attivit specifica: AS=

UE tot Proteine tot AS campione AS EstrattoGrezzo

Fattore di purificazione F . P .=

Resa R=

UE campione UE EstrattoGrezzo %

VOLUME TOTALE (ml)

PROTEINE (mg/ml)

PROTEINE TOTALI (mg)

ENZIMA (UE/ml)

ENZIMA (UE totali)

ATTIVIT SPECIFICA

RESA %

FATTORE DI PURIFICAZIONE

ESTRATTO GREZZO POOL DE52 POOL MATREX ORANGE POOL SEPHADEX G75

860 42 7,2 5

43,64 13,01 1,74 0,57

903,64 546,42 8,94 2,85

0,0182 0,239 0,486 0,88

15,65 10,06 4,13 4,4

0,000417 0,0183 0,279 1,54

100 64,28 26,38 28,11

1 43,88 699,06 3693,04

Tabella 1 - Tabella di Purificazione

dA/min

Risultati: Studio cinetico Determinazione del valore di Km I valori di Km per i tre substrati dell'ALR2 (GAL, HNE e GS-HNE) sono stati determinati tramite dosaggi enzimatici, nei quali la miscela di saggio (V tot = 700 l) quella standard, ma a pi alta concentrazione di NADPH (0,2 mM) e concentrazione crescente di substrato (da 0,04mM a 0,15 mM). I valori della velocit di reazione cos ricavati sono stati quindi riportati in grafico, in funzione della concentrazione del substrato (Figure 5, 7 e 9) e successivamente analizzati per via computazionale, al fine di ricavare le costanti cinetiche delle reazioni prese in esame. A tale scopo sono stati anche costruiti i diagrammi di Lineweaver-Burk o grafici dei doppi reciproci, riportati nelle Figure 6, 8 e 10.

Figure 5 e 6: Andamento della reazione di riduzione (a sinistra) e il grafico dei doppi reciproci per la stessa reazione (a destra) [GAL - pH 6,8]

Figure 7 e 8: Andamento della reazione di riduzione (a sinistra) e il grafico dei doppi reciproci per la stessa reazione (a destra) [HNE - pH 6,8]

Figure 9 e 10: Andamento della reazione di riduzione (a sinistra) e il grafico dei doppi reciproci per la stessa reazione (a destra) [GSHNE - pH 6,8]

La Tabella 2 mostra i valori di K m e Vmax che sono stati ricavati, per via computazionale (tramite GraphPad Prism), dai grafici.
Km (mM)
regressione non lineare

Km (mM) L-B plot 0,0465 0,0335 0,0737

Vmax (mM/min)
regressione non lineare

Vmax (mM/min) L-B plot 0,0136 0,0119 0,00916

GAL HNE GSHNE

0,042 0,016 0,0334 0,012 0,076 0,019

0,013 0,002 0,012 0,001 0,009 0,001

Tabella 2: Parametri cinetici (pH 6,8)

L'attivit catalitica dell'ALR2 raggiunge il suo massimo a pH 6.5. Per evidenziare questa dipendenza della Vmax di reazione dalla concentrazione idrogenionica, sono state ripetute le misurazioni appena descritte (riduzione di HNE e GSHNE) in condizioni pi acide (pH 6). I grafici ricavati mostrano come la Vmax venga influenzata negativamente in entrambi i casi. Inoltre, come meglio evidenziato dai grafici di Lineweaver-Burk, nelle nuove condizioni la K m della reazione con l'HNE risulta pressoch invariata, mentre quella per il GSHNE lievemente aumentata (Tabella 3).

Figure 11 e 12: [riduzione HNE] Dipendenza dal pH; A sinistra l'andamento diretto della reazione; a destra il grafico di Lineweaver-Burk

Figure 13 e 14: [riduzione GS-HNE] Dipendenza dal pH; A sinistra l'andamento diretto della reazione; a destra il grafico di Lineweaver-Burk

Km (mM)
regressione non lineare

Km (mM)
L-B plot

Vmax (mmol/min)
regressione non lineare

Vmax (mmol/min)
L-B plot

HNE GSHNE

0,031 0,012 0,077 0,04

0,0330 0,0791

0,0085 0,0009 0,0075 0,0018

0,0086 0,0004 0,0076 0,0009

Tabella 3: Parametri cinetici (pH 6,0)

Conclusioni Il calcolo dei parametri cinetici un importante passaggio dello studio di un enzima, poich ci permette di definirlo in termini di efficienza catalitica, nei confronti dei suoi substrati. Nelle condizioni saggio in cui sono state effettuate le misure (pH 6.8, T= 37C e in condizioni saturanti di NADPH), le reazioni con GAL e HNE descrivono delle curve simili, come si pu vedere in maniera chiara dai grafici di Lineweaver-Burk (Figure 6 e 8); questi due substrati presentano quindi una simile affinit all'enzima. Allo stesso modo, possibile constatare che la riduzione del GS-HNE caratterizzata da costanti cinetiche che delineano una minor affinit per l'enzima, se paragonate a GAL e HNE (Figura 11) I tre valori di Km cos calcolati risultano, come previsto, non comparabili con quello notevolmente pi alto, che caratterizza la reazione di riduzione del glucosio (K m compresa tra 3 e 300 mM [6]).
Figura 11: Comparazione dei risultati

Nella seconda parte dello studio, si visto come il valore della V max diminuisce quando la miscela di saggio viene acidificata (Tampone a pH 6.0): possibile che l'aumento della concentrazione idrogenionica causi la protonazione di alcuni residui del sito attivo, come ad esempio l'His110 (nella anion binding pocket - [6]), apportando alcune modifiche al sito o alla sua capacit di legare il coenzima; in questo modo si spiegherebbe l'abbassamento della velocit massima di reazione, in relazione ad un valore di Km praticamente invariato (HNE) o solo lievemente aumentato (GSHNE). Questi risultati sperimentali per non sono sufficienti per formulare un'ipotesi che spieghi l'effetto del pH sull'ALR2: le variabili in che entrano in gioco in uno studio di catalisi enzimatica sono molteplici e tutte dovrebbero essere considerate in maniera opportuna. Come detto prima, questo lavoro si poneva come scopo l'acquisizione di conoscenze sulle tecniche di laboratorio, quindi i risultati possono considerarsi soddisfacenti.

Riferimenti bibliografici [1] Wai Ho Tang, Kathleen A. Martin and John Hwa Aldose reductase, oxidative stress, and diabetic mellitus Front. Pharmacol., 09 May 2012 doi: 10.3389/fphar.2012.00087 http://www.frontiersin.org/Experimental_Pharmacology_and_Drug_Discovery/10.3389/fphar.2012.00087/full [2] Esterbauer H; Schaur RJ; Zollner H. Free Radic Biol Med., 11(1):81128, 1991. [3] D. A. Butterfield, M. L. Bader Lange, R. Sultana Involvements of the lipid peroxidation product, HNE, in the pathogenesis and progression of Alzheimer's disease Biochimica et Biophysica Acta 1801 (2010) 924929 [4] Vander Jagt DL; Kolb NS; Vander Jagt TJ; Chino J; Martinez FJ; Hunsaker LA; Royer RE. Biochim Biophys Acta., 1249(2):11726, 1995. [5] Bradford, M. M. (1979). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding Anal. Biochem. 72:248-254. [6] A. Del Corso, M. Cappiello and U. Mura From a dull enzyme to something else: facts and perspectives regarding aldose reductase Current Medicinal Chemistry, 2008, 15, 1452-1461