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METODOLOGIE DELL’ANALISI NUTRIZIONALE

Prof.ssa Sara Baldelli (BIO/10)


Sommario

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE PROTEICA.............................................................................4

METODI PER CALCOLARE LA CONCENTRAZIONE DELLE PROTEINE..............................................................6

TECNICHE CROMATOGRAFICHE..................................................................................................................8

TIPI DI CROMATOGRAFIA...................................................................................................................................9

Metodo Soxhlet.............................................................................................................................................. 14
METODOLOGIE DELL’ANALISI NUTRIZIONALE

METODOLOGIE DELL’ANALISI NUTRIZIONALE

Prof.ssa Sara Baldelli (BIO/10)

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METODOLOGIE DELL’ANALISI NUTRIZIONALE

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE PROTEICA

Per la determinazione della concentrazione totale di proteina in una miscela sono


disponibili molte tecniche, di cui qui vengono descritte solo le più comuni. Parecchi di questi
metodi non forniscono un concentrazione assoluta ma relativa rispetto ad uno stock di proteina
standard che viene usata per la preparazione di una retta di taratura (spesso, per il basso costo, la
facile reperibilità etc. si utilizza come standard  l’albumina da siero bovino, o BSA).

Metodo del biureto – Il reagente chiave è una soluzione fortemente alcalina di tartrato contenente
solfato di rame(II) diluito. Quando la soluzione è aggiunta alla proteina, il rame si può legare alle
proteine, formando un complesso colorato (si ritiene che tale complesso includa la coordinazione
contemporanea di 4 gruppi peptidici con un unico ione rame). Compare un colore viola-bruno
(max=540 nm) che ovviamente sarà proporzionale alla concentrazione totale dei legami peptidici e
dunque di proteina.

Il metodo è generale (anche se i residui di prolina non reagiscono…) e molto riproducibile.


Purtroppo, la sensibilità è bassa: non consente in genere di misurare concentrazioni proteiche <1
mg/ml.

Metodo di Lowry – Molto usato, soprattutto nel passato. La miscela da saggiare viene dapprima
portata in ambiente alcalino (pH 10-10.5) e fatta reagire con citrato o tartrato di rame(II). Dopo un
certo tempo (necessario probabilmente per consentire la complessazione del rame da parte delle
proteine) si aggiunge la miscela di Folin-Ciocalteau, il cui componente attivo è rappresentato da
una miscela di sodio molibdato, fosfato e tungstato. Con l’andare del tempo si sviluppa un colore
scuro, che tende al blu in presenza di proteina (in assenza, il colore tende al marrone).L’intensità
della colorazione blu (max prossima o superiore a 700 nm), sarà proporzionale alla concentrazione
di proteina. Non è chiaro perché il colore blu si sviluppi, è possibile che gli acidi
fosfomolibdotungstici formino dei complessi misti con rame e proteina.

Poiché la presenza e quantità dei residui aromatici (in particolare, tirosinici) influenzano
fortemente per lo sviluppo del colore, sembra più probabile che il meccanismo coinvolga una
riduzione dello ione Cu2+ a Cu+ da parte di questi residui, seguita da una reazione dello ione
rameoso con gli acidi fosfomolibdotungstici. Svantaggi: richiede tempi d’incubazione precisi;
inoltre alcuni tamponi (come il MES) ed altre sostanze possono interferire; infine, poiché il

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contenuto in tirosine può influenzare la colorazione, le risposte al saggio possono variare


abbastanza a seconda del tipo di proteine presenti.

Metodo dell’acido bicinconico – È un saggio molto simile a quello di Lowry, con la differenza che il
rame(II) anziché in combinazione con il reagente di Folin-Ciocalteau si usa in combinazione con
l’acido bicinconico. Si ritiene che la riduzione dello ione Cu2+ a Cu+ sia qui seguita
dall’associazione dello ione rameoso con l’acido, con formazione di un complesso che assorbe
fortemente a 562 nm (colore viola-blu). Il saggio presenta la stessa variabilità da proteina a
proteina già vista per il Lowry, ma è più riproducibile e un po’ più sensibile.

Metodo di Bradford – Si basa sull’interazione non-covalente di un colorante (il Coomassie Brilliant


Blue R250) con le proteine. Il saggio viene effettuato a pH acido. Il colorante si lega primariamente
ai residui basici ed aromatici, e la formazione di questi complessi determina uno spostamento del
massimo di assorbimento del colorante da 465 a 595 nm, che può essere misurato
spettrofotometricamente. Anche se diverse proteine possono dare risposte alquanto
diverse in questo saggio, la sua semplicità ed elevata sensibilità (<0.1 mg/ml) fa sì che sia
largamente usato. Il Coomassie Blue si usa anche per evidenziare le bande proteiche nella gel
elettroforesi.

Silver staining – Questa tecnica è usata normalmente per colorare proteine nella gel elettroforesi,
nel caso sia richiesta un’elevata sensibilità. Ne riparleremo più avanti.

Assorbimento nel vicino UV – La presenza degli anelli aromatici di tirosina e triptofano fa sì che le
proteine presentino un assorbimento di luce nel vicino ultravioletto, con massimo a circa 280 nm.
Il coefficiente di estinzione molare varia da proteina a proteina (dipende dal numero e dalla
posizione degli amminoacidi aromatici), ma in genere può essere calcolato con buona
approssimazione partendo dalla sequenza amminoacidica.

Tenete presente che molte altre sostanze possono assorbire nel vicino ultravioletto, e quindi
condizionare i risultati della misura; fra queste gli acidi nucleici, che però hanno un massimo di
assorbimento a 260 nm. A volte, nelle prime fasi di purificazione di una proteina, può essere utile
verificare il rapporto tra gli assorbimenti a 280 e 260 nm, per verificare se e quanto una data
frazione di proteina sia contaminata da acidi nucleici.

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Peso secco. Mentre la maggior parte dei metodi visti sopra vanno benissimo per misure relative
(ad es., per seguire l’aumento di attività specifica di un enzima durante la purificazione) quando si
vogliano effettuare esperimenti chimici accurati con una proteina pura è necessario misurare
direttamente il peso secco di un campione desalinizzato della proteina. La proteina viene dializzata
estensivamente contro acqua distillata o contro un tampone volatile (ad es, carbonato
d’ammonio) e poi disseccata sotto vuoto, a 50-100 °C in presenza di un agente disseccante (ad es.,
solfato di calcio) finché il peso non si stabilizza (= tutta l’acqua è stata rimossa).

Analisi di Kjeldahl per l’azoto totale – In questo metodo "storico" (ma tuttora usato in molti campi,
ad es. nelle analisi degli alimenti) il campione viene digerito bollendolo in una soluzione di acido
solforico concentrato e solfato di sodio. La digestione provoca una conversione completa
dell’azoto organico in ammonio. Terminata la digestione, si aggiunge un eccesso di NaOH per
consentire la liberazione di ammoniaca, che viene rimossa per distillazione, raccolta in acido
borico e finalmente titolata con HCl.

Il metodo è preciso e riproducibile ma molto indaginoso (anche se oggi può essere automatizzato).
Soprattutto, il metodo non distingue tra azoto proteico ed azoto proveniente da altre molecole
biologiche (ad es. le basi del DNA). Infine, anche se in genere si assume che gli atomi di azoto
contribuiscano per circa il 16% alla massa totale delle proteine, è chiaro che in proteine diverse
questa proporzione potrà cambiare anche sensibilmente.

METODI PER CALCOLARE LA CONCENTRAZIONE DELLE PROTEINE


Si può attaccare cromofori alle proteine affinché siano visualizzate meglio ad una data lunghezza
d’onda o ad una diversa.
METODO DEL BIURETO: storicamente il biureto è il più usato; esso deriva dalla condensazione
dell’urea. Il reattivo del biureto è costituito da una soluzione di solfato di rame alcalino contenente
potassio tartrato di sodio. In condizioni alcaline gli ioni rameici Cu2+ formano un complesso di
coordinazione con quattro gruppi –NH presenti in altrettanti legami peptidici. Il complesso che si
forma assorbe luce nel visibile, con un picco a 550 nm.
VANTAGGI: Essendo basato sull’interazione degli ioni rameici con i legami peptidici, il metodo
è universale e molto riproducibile

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SVANTAGGI: Scarsa sensibilità: il metodo non si dimostra infatti adatto alla determinazione di
concentrazioni inferiori ad 1 mg/ml. Si ha interferenza da parte dei sali ammonici: inutilizzabile su
campioni proteici ottenuti per precipitazione con ammonio solfato perché questi campioni
contengono alte concentrazioni di ammonio.

METODO DI LOWRY: Consiste nella reazione del biureto, seguita dalla riduzione in condizioni
alcaline del reagente di Folin-Ciocalteu (acidi misti di fosfomolibdotungstato). Gli ioni di rame
facilitano il processo di riduzione. I gruppi cromogeni principali sono i legami peptidici complessati
con rame (biureto) ed i molibdotungstati ridotti blu, che sono ridotti in gran parte da tirosina,
triptofano ed amminoacidi polari. Il prodotto della reazione, eteropolimolibdeno, ha una forte
colorazione blu, con un massimo di assorbimento a circa 750 nm.
VANTAGGI: Poco costoso e di facile esecuzione. Altamente riproducibile è molto sensibile: è
possibile determinare concentrazioni fino a 10 μg/ml. E’ un metodo diretto.
SVANTAGGI: E’ soggetto ad interferenze da parte di una varietà di sostanze, quali Tris, HEPES ed
EDTA. Le curve standard sono lineari (necessario affinchè la curva sia una retta) solo a basse
concentrazioni proteiche. Sono necessari tempi d’incubazione precisi per ottenere dati
riproducibili. La reazione dipende dal pH ed è necessario avere un pH compreso tra 10 e 10,5.
Recentemente sono stati introdotti un certo numero di reagenti alternativi per la determinazione
degli ioni rameici, i quali consentono di effettuare un saggio più conveniente e riproducibile.

METODO BCA: La reazione del BCA (acido bicinconinico) è simile a quella del reattivo di Lowry.
Cu+2è ridotto a Cu+1dalle molecole proteiche in soluzione alcalina. Due molecole di BCA chelano
uno ione rameoso (Cu+1). Per cui è come un metodo indiretto che sfrutta la coniugazione. Tale
evento determina la formazione di un intenso colore violetto con un massimo di assorbimento a
562 nm.
VANTAGGI: Sensibilità simile a quella del metodo di Lowry (10 μg/ml). Ridotta suscettibilità alla
presenza di detergenti. Dopo un’incubazione di 30 minuti a 37°C il colore è sufficientemente
stabile per misurazioni attendibili (spostamento del 2,5% in 10 minuti).
SVANTAGGI: Il colore continua a svilupparsi lentamente nel tempo. Interferenza da parte di
carboidrati. Ecco un elenco di una parte delle sostanze che interferiscono con il metodo BCA:
catecolamine, triptofano, lipidi, rosso fenolo, cisteina, tirosina, saccarosio, glicerolo non puro,
H2O2, acido urico e ferro.

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METODO DI BRADFORD: Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine
determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595
nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976). Tale colorante forma forti complessi non covalenti con
le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi amminici e carbossilici e tramite
interazioni di van der Waals. Il colorante è preparato come soluzione stock in acido fosforico. Il
metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio in cui il colorante è aggiunto
ai campioni e si determina l’assorbanza a 595 nm. La quantità di colorante che si lega è
proporzionale alla quantità di proteina presente in soluzione. Pertanto l’intensità del colore blu
(dunque l’assorbimento) è proporzionale alla concentrazione proteica. In genere quantità uguali di
proteine differenti legano la stessa quantità di colorante → il saggio è indipendente dal tipo di
proteina. Poiché l’intensità della colorazione non è lineare in una vasta gamma di concentrazioni di
proteine, si raccomanda fortemente di preparare una curva standard per ogni saggio. La curva di
taratura è molto importante perché permette di verificare che la legge di LB sia lineare e
conoscendo assorbanza ci permette di estrapolare concentrazione x del campione, in quanto
abbiamo calcolato a concentrazioni standard l’assorbanza del campione. Solo un caso in cui non è
necessaria, ed è quello in cui abbia una proteina pura e il coefficiente di estensione molare noto in
quanto posso ricavare direttamente C.
VANTAGGI: Semplicità di preparazione del reattivo. Sviluppo del colore immediato. Stabilità del
complesso. Elevata sensibilità (fino a 22 μg/ml). Il saggio è compatibile con la maggior parte dei
tamponi comuni, degli agenti denaturanti come guanidina, HCl 6M e urea 8 M e dei preservanti
come sodioazide.
SVANTAGGI: Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere. La quantità di
colorante che si lega alla proteina dipende dal contenuto in aminoacidi basici→ ciò rende difficile
la scelta di uno standard. Molte proteine non sono solubili nella miscela di reazione acida.

TECNICHE CROMATOGRAFICHE
La cromatografia è una tecnica di separazione basata sulla diversa velocità di migrazione
con cui più sostanze depositate su su un supporto adatto (carta da filtro, gel di silice o di alluminio,
ecc.), vengono trasportate da un fluido detto eluente e si stratificano in posizioni differenti sul
supporto.
La cromatografia permette quindi la separazione e la purificazione di miscele anche molto
complesse di sostanze inorganiche ed organiche.

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Il temine cromatografia deriva dal greco "Khrômatos" (colore) e deve il suo nome al fatto che fu
utilizzata, per la prima volta, dal chimico russo M. Tswett per separare i pigmenti colorati
contenuti nelle foglie dei vegetali.

Il chimico russo Mikhail Tswett

La cromatografia, nata quindi come tecnica di separazione e solo successivamente utilizzata anche
come tecnica analitica, si basa sul fatto che i diversi componenti di una miscela tendono ad avere
affinità diverse tra due fasi (la fase fissa è quella del supporto e la fase mobile è quella del
solvente).
Oggigiorno gli sviluppi della cromatografia fanno di questa tecnica uno dei procedimenti di
maggior interesse in molti campi della ricerca scientifica e tecnologica, soprattutto per quanto
riguarda la chimica organica, la biochimica e la chimica analitica.

Tipi di cromatografia
In base al tipo di supporto utilizzato possiamo avere:
 la cromatografia su carta

 la cromatografia su colonna

 la cromatografia su strato sottile

La cromatografia su carta è un tipo di tecnica di separazione cromatografica nella quale la fase


fissa è costituita da una striscia di carta da filtro.

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Questa tecnica viene utilizzata per separare piccole quantità di una miscela liquida depositata
all'estremità di una striscia di carta. La striscia di carta viene immersa all'interno di un becher nel
quale è stato inserito un solvente il cui livello deve essere inferiore rispetto al punto in cui è stata
depositata la miscela.
Dopo un intervallo di tempo variabile, il solvente, per capillarità, risale lungo il foglio di carta
trascinando con sè, a velocità diversa, le sostanze solubili presenti nella miscela.

Separazione di una miscela liquida tramite cromatografia su carta

Nella striscia di carta, le sostanze vengono trasportate in vari punti più o meno lontani dall'origine
a secondo della solubilità maggiore o minore delle sostanze nel solvente e identificate in base al
loro diverso e caratteristico colore.

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Le sostanze incolori invece possono essere identificate per mezzo di reattivi capaci di trasformarle
in composti colorati oppure tramite l'osservazione del loro comportamento ai raggi ultravioletti
(UV), coi quali possono mostrare fluorescenze di diverso colore.

La cromatografia su colonna è una particolare tecnica cromatografica che si basa sulla proprietà
che hanno alcune sostanze, una volta sciolte in opportuni solventi, di fissarsi su materiali inerti
(fase stazionaria) come ad esempio l'allumina, il talco o il carbonato di calcio.
Principi su cui si basa la cromatografa su colonna
La cromatografia su colonna è riconducubile alla tecnica utilizzata nel 1906 dal chimico russo
Tswett. Egli aveva osservato che introducendo un solvente adatto (fase mobile) all'interno di una
colonna in vetro riempita con carbonato di calcio (fase stazionaria) alla cui sommità era stata
depositata una soluzione dei pigmenti ottenuti da un estratto di foglie verdi, i componenti della
miscela venivano trascinati dalla fase mobile verso l'estremità inferiore della colonna con velocità
diverse. I componenti della miscela iniziavano a separarsi ed era possibile osservare, lungo la
colonna, diverse zone colorate corrispondenti ciascuna a un pigmento presente nella miscela
originale (una zona di color verde-giallastro dovuta alla clorofilla b, una verde-bluastra dovuta alla
clorofilla a, una terza di color giallo dovuta alla xantofilla e infine una zona arancione dovuta al ß-
carotene).

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1 - Il miscuglio da separare è sciolto in un opportuno solvente (fase mobile) e stratificato sopra la


fase stazionaria

2 - La fase mobile è aggiunta dall'alto all'interno della colonna

3 - I componenti della miscela vengono trascinati dalla fase mobile con velocità diverse e quindi
iniziano a separarsi

4 - Ogni componente del miscuglio è raccolto separatamente. Prima verranno raccolti i


componenti adsobiti dalla fase fissa più debolmente e poi via via gli altri.

La cromatografia su colonna viene utilizzata ai giorni nostri sia per la separazione di sostanze
colorate che per la separazione di sostanza incolori.
In quest'ultimo caso l'eluente viene fatto passare all'interno della colonna sino a quando le
sostanze non escono una dopo l'altra, per poi venire raccolte separatamente ed essere identificate
con mezzi opportuni.

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La cromatografia su strato sottile (Thin Layer Chromatography, TLC), è una particolare tecnica
cromatografica nella quale la fase stazionaria, costituita da un materiale granulare omogeneo (gel
di silice, allumina attiva, etc.) viene fatta aderire a un supporto piano cosituito da una lastrina di
vetro o di metallo. L'insieme della lastrina di vetro e della fase stazionaria è detto lastrina.
Secondo la tecnica più diffusa (cromatografia ascendente), una piccola macchia della miscela da
separare viene depositata alla base dello strato di materiale omogeneo.

La miscela viene depositata alla base dello strato

L'estremità inferiore della lastrina viene immersa nell'opportuno eluente: quest'ultimo risalendo
per capillarità lungo lo strato sottile di materiale omogeneo trascina con sè, in modo differenziato,
i vari componenti della miscela che, pertanto, vengono separati. Terminata la separazione,
distribuite lungo lo strato si potranno notare macchie di varie dimensioni e di vario colore separate
tra loro, corrispondenti ad ognuna delle sostanze componenti la miscela.

Separazione tramite cromatografia su strato sottile


Il processo secondo cui la miscela viene suddivisa nei vari componenti è detto sviluppo.

Applicazioni della cromatografia su strato sottile


Le applicazioni della cromatografia su strato sottile sono le stesse che riguardano tutte le altre
tecniche cromatografiche e interessano quindi sia il settore industriale che quello della ricerca.

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Generalmente però la TLC trova più applicazioni nei laboratori di ricerca biochimica piuttosto che
in quelli di chimica.

Metodo Soxhlet
L'alimentazione è un aspetto molto importante per quanto riguarda la salute delle persone.
Ad oggi è ben noto, nel mondo scientifico, come una corretta dieta possa influire positivamente
sulle condizioni corporee. Un altro aspetto fondamentale riguarda l'ambito estetico, cibi sani e
assunti in modo intelligente possono portare le persone ad avere un corpo più snello, sopratutto
se in parallelo si svolge un'adeguata attività fisica. Per poter raggiungere tali scopi è necessario
avere una conoscenza di base degli alimenti. In questa guida si vuole spiegare, in particolar modo,
come determinare i lipidi frezzi di un alimento in modo da avere un'idea di ciò che abbiamo
davanti. Un metodo molto utilizzato per raggiungere tale scopo è il metodo Soxhlet.

Assicurati di avere a portata di mano:


dispositivo Soxhlet
Solvente
Soluto

La procedura è basata su un particolare strumento: l'estrattore Soxhlet. Esso è caratterizzato da


vari componenti fondamentali. La parte più bassa presenta una caldaia all'interno della quale
viene inserito il solvente. A metà è presente un particolare filtro detto estrattore. Questo è diviso
in due sezioni, una comunica con la parte inferiore (la caldaia) e l'altra comunica con la parte
superiore (il condensatore, il quale verrà descritto più avanti). La parte superiore è detta
condensatore il quale serve per il raffreddamento del vapore generato a causa della caldaia. Dopo
aver descritto a grandi linee la struttura di un estrattore, è possibile spiegare il suo funzionamento.
Bisogna collocare il solvente nel pallone, il quale sarà a contatto con una piattaforma riscaldata. La
sostanza da analizzare, in gergo detta campione, deve essere inserita all'interno dell'estrattore. Il
riscaldamento generato dalla piattaforma provoca l'ebollizione del solvente. Questo, allo stato
gassoso, passa nella sezione dell'estrattore. Prosegue il suo percorso verso l'elemento
raffreddante, il condensatore. Il contatto con il freddo provoca la caduta del vapore nell'estrattore
e qui entra in contatto con il soluto precedentemente inserito nell'estrattore. A questo punto,
grazie a particolari filtri, il solvente e il soluto passano in una camera dove saranno distinti. Il

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METODOLOGIE DELL’ANALISI NUTRIZIONALE

vantaggio in questa procedura è che si usa una quantità minore di solvente, anche grazie al suo
ricircolo continuo. A questo punto il solvente deve essere allontanato dal soluto, una delle
tecniche più utilizzate è quella del rotavapor.
Concludiamo dicendo che, per eseguire un corretto esperimento, è necessario valutare bene la
temperatura di ebollizione del solvente e pulire, prima del processo, i vari componenti
dell'estrattore. Ricordare sempre di indossare dovute precauzioni e di operare insieme a personale
esperto e qualificato Si ricorda inoltre che anche in questo settore la tecnologia ha fatto progressi
introducendo dispositivi automatici in grado di svolgere questa tipologia di prove.

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L'Università Telematica San Raffaele Roma, istituita con decreto del Ministero
dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca dell'8 maggio 2006, è un Ateneo non
statale, legalmente riconosciuto, che rilascia titoli di studio equipollenti e con il
medesimo valore legale di quelli rilasciati dalle Università tradizionali.
L'offerta didattica è erogata in modalità E-Learning, attraverso l'utilizzo di internet e
delle nuove tecnologie digitali. Gli studenti possono pertanto accedere alla
piattaforma didattica in qualsiasi momento ed in qualunque luogo, abbattendo ogni
vincolo spazio-temporale e offrendo in tal modo la fruizione del materiale didattico
anche a coloro che, per ragioni fisiche, geografiche o lavorative, ne sarebbero esclusi.
La lezione ex cathedra viene in sostanza sostituita da lezioni registrate e disponibili
online 24 ore su 24 e integrata con specifico materiale didattico: slides, materiale
illustrativo, problemi e discussioni in linea. Per garantire inoltre un alto livello
qualitativo, le lezioni online sono integrate da attività seminariale e di laboratorio.
Le prove finali, relative ad ogni insegnamento, sono da sostenersi in modalità
frontale, o "faccia a faccia", costituendo l'unico momento per cui è necessaria la
presenza presso l'Ateneo, le sessioni d’esame verranno svolte, su indicazione dello
studente all’atto dell’iscrizione alle prove, presso la sede di Roma o quella di Milano

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