C1.

ESTRAZIONE RNA: (QIAGEN)

1. Risospendere il pellet cellulare in 100l lisozima, vortex 10 e 5 a Temperatura ambiente
nel termomix a 750 RPM
2. 350l buffer RLT+-mercaptoetanolo, vortex 10
3. 250l etanolo assoluto, mix pipettando
4. trasferire tutti i 700l nella colonnina, centrifugare 30 a 12000 RPM; scartare il liquido
5. 350l buffer RW1, centrifugare 30 a 12000 RPM; scartare il liquido
6. 80l DNasi (10l DNasi +70l buffer RDD) direttamente sulla membrana e 15 a T amb
7. 350l buffer RW1, centrifugare 30 a 12000 RPM; scartare il liquido
8. trasferire la colonnina in un nuovo tubo da 2 ml e 500l buffer RPE(+etanolo), centrifugare
30a 12000 RPM, scartare il liquido
9. 500l RPE(+etanolo), centrifugare 2 a 12000 RPM
10. trasferire la colonnina in uneppendorf da 1,5 ml, 50l H2O RNase-free, centrifugare 1 a
12000 RPM
11. 50 l H2O RNase-free, centrifugare 1 a 12000 RPM

Lisozima (1mg/ml):
2l lisozima (50mg/ml)
100l TE 1X

Buffers:
RLT+-mercaptoetanolo:

10l -mercaptoetanolo
1ml buffer RLT

C2 Valutazione qualitativa e quantitativa dellRNA C1 mediante EGAg

Gli RNA totali estratti in C1 saranno frazionati mediante EFGAg 1% in TAE pH 8.3 e colorazione
con Bromuro di etidio 0.5 g/ml.
Campioni per elettroforesi:
5 l RNA
1 l Loading Dye

Marcatori di peso molecolare*:

1- Low 100 bp ladder 5 l

C3 Valutazione qualitativa e quantitativa dellRNA C1 mediante mediante

spettrofotometria: lettura OD260/280
Effettuare una diluizione x10 della preparazione di RNA ponendo 10 l di RNA in 90 l di H2O.
Mescolare accuratamente.
Trasferire la diluzione in cuvetta da spettrofotometro
Leggere OD260 e OD280
Calcolare la concentrazione dellRNA tenendo conto che una soluzione di RNA con una
concentrazione di 40 g/ml presenta una OD260 di 1.
Valutare in grado di purezza dellRNA tenendo conto che una preparazione pura ha un rapporto
OD260/280 di 1.9-2.1 a pH 7.5.

gruppo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

OD260

OD280

OD260/280 g/ml
/ml
diluizione finale

Trattamento con DNasiI:

x l RNA (ca. 2g)
2l 10X buffer
1l DNasi I
H2O a 20 l
20 l totale

Incubare 15 a 37C
Aggiungere 2l EDTA 25mM
Inattivare lenzima per 10 a 65C