ESTRAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DEI PIGMENTI FOTOSINTETICI DALLA

FOGLIA DI SPINACIO

La fotosintesi clorofilliana è un processo chimico grazie al quale le piante verdi ed altri organismi
producono sostanze organiche – principalmente carboidrati – a partire dall'anidride carbonica
atmosferica e dall’acqua, in presenza di luce solare. Durante la fotosintesi la luce solare permette di
convertire sei molecole di CO2 e sei molecole di H2O in una molecola di glucosio (C6H12O6), zucchero
fondamentale per la vita. Come sottoprodotto della reazione si producono sei molecole di
ossigeno, che la pianta libera nell'atmosfera attraverso gli stomi che si trovano nella foglia. La
fotosintesi clorofilliana è il processo di produzione primaria di composti organici a partire da
sostanze inorganiche ed è l'unico processo biologicamente importante in grado di raccogliere
l'energia solare, da cui, fondamentalmente, dipende la vita sulla Terra.
L'energia luminosa può essere utilizzata dai sistemi viventi solo se prima viene assorbita. Una
sostanza in grado di assorbire la radiazione luminosa la cui lunghezza d’onda appartiene ad un ben
preciso intervallo entro lo spettro del visibile è definita pigmento. Alcuni pigmenti assorbono tutte
le lunghezze d'onda della luce e perciò appaiono neri, altri assorbono solo certe lunghezze d'onda,
trasmettendo o riflettendo le lunghezze d'onda che non assorbono.
Per esempio la clorofilla, il pigmento che rende verdi le foglie, assorbe le lunghezze d'onda del
violetto, del blu e anche del rosso, ma, poiché riflette la luce verde, appare verde.
Negli organismi eucarioti fotosintetici (piante e alghe) la clorofilla a è il pigmento direttamente
interessato alla trasformazione dell'energia luminosa in energia chimica (pigmento fondamentale).
Molte cellule fotosintetiche contengono anche un secondo tipo di clorofilla, la clorofilla b, oltre ad
altri pigmenti chiamati carotenoidi, (presenti nei batteri, nelle alghe e nelle piante), detti pigmenti
accessori poiché concorrono all'assorbimento della luce aumentando l'efficacia del sistema. I
carotenoidi comprendono i caroteni, di colore giallo-arancio e le xantofille di colore giallo. In
genere, nelle foglie i colori dei carotenoidi sono mascherati dal verde delle clorofille, che sono i
pigmenti più abbondanti; invece, in alcuni tessuti, come quelli del pomodoro maturo, o nelle
cellule delle foglie quando in autunno cessano di sintetizzare la clorofilla, i colori dei carotenoidi
predominano.

Riassumendo i pigmenti principali presenti nelle piante sono:

• Clorofilla a: colore verde-blu
• Clorofilla b: verde-giallo
• Xantofilla: colore giallo
• Caroteni: giallo-arancio

Nelle foglie sono quindi contenuti diversi pigmenti. Mediante una tecnica nota come
cromatografia, è possibile separarli ed identificarli.
Per estrarre i pigmenti dalle foglie, in genere, si sceglie la pianta di SPINACIO, perché le foglie
larghe e carnose si possono frantumare facilmente.
Inizialmente, si spezzetta la foglia con una forbice; i pezzetti di foglia vanno posti in un mortaio e
pestati (con un pestello) per rompere le pareti cellulari. La presenza di un solvente quale etanolo
consentirà di estrarre i pigmenti fotosintetici dalla foglia ottenendo una miscela di colore verde.
L’operazione suddetta può essere sostituita utilizzando direttamente l’estrattore elettrico di cui
disponiamo.
Attraverso l’utilizzo della cromatografia su strato sottile sarà possibile separare ed identificare i
differenti pigmenti di cui è composta la miscela.

Esperienza di TLC - Classe 5 AC - prof.ssa Capelli Cristina 1

La cromatografia è una tecnica per la separazione di una miscela di soluti, in cui la separazione si
produce per una differente velocità di spostamento dei singoli soluti in seno ad un mezzo poroso,
sotto l’azione di un solvente in moto.
Nel nostro caso il mezzo poroso (fase stazionaria) su cui viene depositata la miscela estratta dallo
spinacio è gel di silice.
La fase stazionaria è generalmente uno strato dallo spessore uniforme di circa 1 mm di materiale
adsorbente, depositato su una lastra di alluminio.
La fase mobile è un solvente opportunamente scelto (o una miscela di solventi), capace di separare
i componenti della miscela da analizzare e poco affine per polarità alla fase stazionaria scelta. Uno
strato di fase mobile alto circa 1 cm viene posto sul fondo di un contenitore, nel quale si immerge
l'estremità inferiore della lastra preparata col materiale adsorbente, sulla quale è stata posta una
goccia del campione da separare. Il contenitore viene poi chiuso in modo da mantenere l'ambiente
saturo di vapori di solvente. Per effetto di capillarità il solvente sale lungo la lastrina, trascinando
con sé in maniera differente i componenti della miscela e separandoli.

Rappresentazione di una separazione per cromatografia su strato sottile.

L'immagine a sinistra rappresenta la situazione iniziale, quella a destra rappresenta la fine della separazione

Al termine della corsa cromatografica sarà possibile vedere l’effettiva composizione dei differenti
pigmenti fotosintetici. Le bande corrispondenti alle due clorofille a e b saranno grattate dalla
lastrina, estratte dal gel di silice con etanolo e verranno caratterizzate mediante l’utilizzo dello
spettrofotometro, una strumentazione che ci consente di studiare le caratteristiche proprietà di
assorbimento della luce dei pigmenti fotosintetici in soluzione.

PROTOCOLLO ESTRAZIONE DEI PIGMENTI DALLA FOGLIA DI SPINACIO

Metodo manuale:
• Prendere 4-5 foglie di spinacio e spezzettarle con una forbice, ponendole su un mortaio.
• Aggiungere circa 7-8 ml di alcool etilico al 95% e frantumare molto bene con il pestello fino ad
osservare l’alcool di colore verde molto intenso.
Oppure utilizzare l’estrattore elettrico.
• Trasferire l’estratto in una provetta avvolta con stagnola per non esporre il campione alla luce.
Miscelare vigorosamente ed aggiungere etanolo.
• Porre a bagnomaria a 60°C per 20 minuti
• Raffreddare e, se necessario, filtrare con carta da filtro.

Esperienza di TLC - Classe 5 AC - prof.ssa Capelli Cristina 2

CARICAMENTO E CORSA DELLA CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE
• Preparare delle lastrine di gel di silice su supporto in alluminio dalle dimensioni 4-5 cm di
larghezza e 8-9 cm di altezza.
• Con una matita tracciare in maniera leggera una linea orizzontale a 1.5 cm dalla base.
Delimitare inoltre con delle stanghette verticali uno spazio centrale di 1.5 cm corrispondenti
alla zona di caricamento del campione.

1,5 cm 1,5 cm 1,5 cm

1,5 cm

• Depositare con un puntale circa 50 µl di campione di estratto di spinacio distribuendolo su tutta

la linea di caricamento. Con l’aiuto di un phon il campione asciugherà velocemente.
• Inserire la lastra in una camera cromatografica per la corsa preventivamente riempita con
uno strato leggermente inferiore a 1,5 mL di una miscela di solventi: etere di petrolio e acetone
rapporto 7:3.
• Attendere che la miscela di solventi salga per capillarità lungo la lastra trascinando e separando
i campioni caricati. Quando il liquido sarà arrivato a circa 2-3 cm dal bordo superiore estrarre la
lastra, asciugarla bene e fotografarla.

CARATTERIZZAZIONE MEDIANTE SPETTROSCOPIA DELLA CLOROFILLA a e CLOROFILLA b

• Identificare i differenti pigmenti che si sono separati durante la corsa.
• Circondare con una matita le due bande corrispondenti alla clorofilla a e b.
• Posizionare la lastra sopra un foglio di carta e grattare con delicatezza, utilizzando un bisturi,
la silice corrispondente alla clorofilla a.
• Raccogliere la polvere di silice nel foglio di carta e inserire la polvere in una provetta
preventivamente siglata (clorofilla a + N. gruppo).
• Ripetere l’operazione con la banda della clorofilla b.
• Aggiungere nelle due provette da centrifuga 1 ml di etanolo al 95%. Chiudere le provette e
agitare vigorosamente per 10 secondi.
• Centrifugare i campioni per 2 minuti a 3000 rpm.
• Trasferire il surnatante in una provetta preventivamente siglata.
• Avvicinarsi con i due campioni alla postazione dello spettrofotometro per la loro
caratterizzazione. Verrà eseguito uno spettro di assorbimento della luce da 350 nm a 700 nm
(visibile) e sarà confrontato con lo spettro caratteristico delle clorofille.

Esperienza di TLC - Classe 5 AC - prof.ssa Capelli Cristina 3

In particolare la clorofilla a ha due picchi di assorbimento a 430 nm e 663 nm, mentre la clorofilla
b presenta due picchi a 480 nm e 642 nm.

Esperienza di TLC - Classe 5 AC - prof.ssa Capelli Cristina 4