Isolamento, caratterizzazione e sintesi

totale del Cinanthrenol A

 Cinanthrenol A

Estradiolo Fenantrene

Il Cinanthrenol A è uno dei primi esempi di steroide a struttura fenantrenica di origine naturale
• Estrazione e isolamento da una matrice complessa di origine
naturale

• Caratterizzazione e identificazione

• Analisi preliminare dell’attività biologica

• Sintesi
• Estrazione e isolamento da una matrice complessa di origine
naturale

• Caratterizzazione e identificazione

• Analisi preliminare dell’attività biologica

• Sintesi
 Cynachirella sp.

Il Cinanthrenol A è un metabolita che viene estratto da una spugna del genere Cynachirella
sp., distribuita in moltissime aree geografiche e che vive a elevata profondità
 Le spugne sono una fonte molto variegata e
ancora inesplorata di nuovi prodotti naturali
in quanto:

• Possono crescere a elevate profondità

• Sono in grado di produrre metaboliti

secondari per difendersi dall’attacco di
predatori e parassiti

• Ospitano sulla superficie numerosi

batteri simbionti, a loro volta in grado di
produrre metaboliti

Matrici estremamente complesse

Difficoltà di campionamento
Il dragaggio e la pesca con il tramaglio possono essere tecniche molto efficaci di raccogliere campioni di
organismi sessili. Producono infatti una grande quantità di detriti che normalmente vengono scartati senza
essere esaminati e che sono un’interessante fonte di studio.
 Raccolta dei campioni
I detriti (6,5 kg, peso non essiccato) sono stati raccolti per dragaggio del fondale del
vulcano marino di Oshimashinsone, a una profondità compresa tra i 140 e i 160 m.
 Estrazione

1. I detriti (6,5 kg, peso non essiccato) sono stati sottoposti a un’estrazione
solido/liquido con metanolo

2. Evaporazione del solvente ad ottenere una sospensione acquosa

3. Estrazione liquido/liquido acqua/cloroformio (CHCl3)

 Procedura di Kupchan

Metodo di frazionamento sistematico basato sull’attività biologica che viene molto

utilizzato nei procedimenti estrattivi su piccola scala. Prevede uno schema di
estrazioni liquido/liquido successive che vengono effettuate utilizzando solventi di
diversa polarità. Ciascuna fase viene quindi sottoposta a una rapida analisi
dell’attività biologica.
 Estratto grezzo in
metanolo

1. Evaporazione del solvente

2. Sospensione in acqua
3. Estrazione liquido/liquido acqua/cloroformio (CHCl3)

Fase acquosa Fase organica

1. Evaporazione del solvente
Ripartizione in butanolo 2. Sospensione in una miscela
metanolo:acqua (9:1)
3. Estrazione liquido/liquido con esano

1. Aggiunta di acqua fino a ottenere

una miscela metanolo:acqua 1:1
2. Estrazione con cloroformio

Acqua Butanolo Acqua:metanolo Cloroformio Esano

1:1
 Screening preliminare dell’attività biologica

Le fasi ottenute vengono sottoposte a un rapido screening preliminare volto a

determinare la citotossicità su due diverse linee cellulari: la linea cellulare umana
HeLa (cancro alla cervice) e la linea cellulare murina P388 (modello murino di
leucemia).

Soltanto la fase ottenuta dall’estrazione in cloroformio ha mostrato citotossicità

per le linee cellulari testate.

 Viene ulteriormente purificata la fase organica contentente cloroformio, mentre

vengono scartate tutte le altre
 Purificazione
La fase organica in cloroformio viene purificata mediante cromatografia flash in
fase inversa e vengono raccolte sei frazioni di cui viene valutata l’attività biologica.

Fase mobile polare

Catena C18
 Purificazione

Fase mobile polare La frazione eluita MeOH/H2O 70:30 è l’unica citotossica sulle
linee cellulari HeLa e P388

Fase stazionaria apolare

Viene ulteriormente purificata, mentre vengono scartate tutte le

altre

MeOH/H2O
MeOH/H2O CH3CN/H2O CH3CN/H2O MeOH CHCl3/MeOH/H2O
(70:30)
(50:50) (70:30) (80:20) (100%) (80:20:10)
(1,7 g)

Polarità
 Purificazione

Fase mobile apolare

Vengono raccolte 14 frazioni, eluite con miscele di solventi a
polarità crescente e ne viene determinata la citotossicità.

Fase stazionaria polare La frazione più citotossica (281,4 mg) viene ulteriormente
purificata, mentre vengono scartate tutte le altre.

CHCl3/ CHCl3/ CHCl3/ CHCl3/

CHCl3/ CHCl3/ CHCl3/
MeOH/ MeOH/ MeOH/ MeOH/ MeOH
MeOH MeOH MeOH
H2O H2O H2O H2O (100%)
(100:0) (19:1) (9:1)
(80:20:1) (70:30:5) (60:40:10) (50:50:20)

Polarità
 Purificazione

Fase mobile polare Vengono raccolte 10 frazioni, eluite con miscele di solventi a
polarità decrescente e ne viene determinata la citotossicità.

Fase stazionaria apolare

La frazione più citotossica viene ulteriormente purificata, mentre
vengono scartate tutte le altre.

MeOH/H2O MeOH/H2O MeOH CHCl3/MeOH/H2O

(70:30) (80:20) (100%) (60:40:10)

Polarità
 Purificazione e isolamento

La frazione citotossica (281,4 mg) viene sottoposta a due step di purificazione

ulteriori mediante HPLC. Vengono quindi isolati 3,5 mg di Cinanthrenol A puro

6,5 kg di detriti (peso non essiccato)  3,5 mg di prodotto puro!

Resa: 5,4 x 10-5 %!

• Estrazione e isolamento da una matrice complessa di origine
naturale

• Caratterizzazione e identificazione

• Analisi preliminare dell’attività biologica

• Sintesi
Caratterizzazione e identificazione: fluorescenza

• Identificazione di una proprietà caratteristica della sostanza in

esame, che la permetta di distinguerla rispetto alle altre

• Il Cinanthrenol A possiede uno spettro caratteristico di fluorescenza

(ex 270, em 380 nm)

• Come riconoscere da quale specie proviene la sostanza che si sta

identificando?

• Confronto con 39 campioni standard di specie diverse

Identificazione: confronto con campioni standard

• Vengono preparati gli estratti dei 39 campioni standard di riferimento

• Vengono sottoposti a un rapido screening di fluorescenza: soltanto

l’estratto di Cinachyrella sp. (70 g, peso non essiccato) mostra un
picco caratteristico e riconducibile a quello della sostanza isolata dai
detriti.

• L’estratto viene nuovamente purificato mediante HPLC e viene

isolato soltanto il picco che ha le stesse caratteristiche di
fluorescenza del Cinanthrenol A (0,4 mg)

• 70 g di Cynachirella sp. (peso non essiccato)  0,4 mg di

Cynanthrenol A  Resa: 5,7 x 10-4%
 Identificazione

• Qual è il peso molecolare della sostanza in esame?

• Qual è la formula bruta?
• Sono presenti dei centri stereogenici? Si tratta di una molecola chirale?
• Quali gruppi funzionali sono presenti sulla molecola?
• Come sono disposti i sostituenti?

Identificazione della struttura chimica della molecola ottenuta dal processo di

estrazione e isolamento
 Analisi UV
L’analisi UV conferma la presenza di un’unità
fenantrenica

Cinanthrenol A

Assorbanza

Fenantrene

Lunghezza d’onda
 Potere rotatorio specifico
Permette di stabilire la presenza di centri stereogenici in base alla capacità della
sostanza di ruotare la luce polarizzata.

Il Cinanthrenol A possiede un potere rotatorio specifico, suggerendo la presenza di

centri stereogenici nella molecola.
 Identificazione

• Qual è il peso molecolare della sostanza in esame?

• Qual è la formula bruta?
• Sono presenti dei centri stereogenici? Si tratta di una molecola chirale?
• Quali gruppi funzionali sono presenti sulla molecola?
• Come sono disposti i sostituenti?
 Spettrometria di massa ad alta risoluzione

Questa tecnica permette di avere informazioni riguardo:

- Peso molecolare della sostanza in esame
- Formula bruta
- Grado di insaturazione

m/z 298,1235

Formula molecolare: C20H18O2

Grado di insaturazione: 12
 Identificazione

• Qual è il peso molecolare della sostanza in esame?

• Qual è la formula bruta?
• Sono presenti dei centri stereogenici? Si tratta di una molecola chirale?
• Quali gruppi funzionali sono presenti sulla molecola?
• Come sono disposti i sostituenti?
 Spettroscopia IR

Questa tecnica permette di ottenere informazioni riguardo la natura di alcuni

gruppi funzionali caratteristici presenti nella molecola

3392 cm-1
 Identificazione

• Qual è il peso molecolare della sostanza in esame?

• Qual è la formula bruta?
• Sono presenti dei centri stereogenici? Si tratta di una molecola chirale?
• Quali gruppi funzionali sono presenti sulla molecola?
• Come sono disposti i sostituenti?
 Spettrometria NMR

Questa tecnica è di fondamentale importanza per l’interpretazione della struttura di

molecole organiche e per identificare la disposizione degli atomi di Idrogeno e di
Carbonio.
Spettrometria NMR protonica
Spettrometria NMR del Carbonio 13
 Identificazione

• Qual è il peso molecolare della sostanza in esame?

• Qual è la formula bruta?
• Sono presenti dei centri stereogenici? Si tratta di una molecola chirale?
• Quali gruppi funzionali sono presenti sulla molecola?
• Come sono disposti i sostituenti?

Identificazione della struttura chimica del

Cinanthrenol A
• Estrazione e isolamento da una matrice complessa di origine
naturale

• Caratterizzazione e identificazione

• Analisi preliminare dell’attività biologica

• Sintesi
 Attività biologica del Cinanthrenol A

• Citotossicità: Il Cinanthrenol A ha un’attività citotossica verso le

linee cellulari HeLa e P-388 pari a 0.4 µg/mL e 4.5 µg/mL.

• Capacità di legare il recettore per gli estrogeni (ER)

 Attività biologica del Cinanthrenol A

Estradiolo

Estradiolo Cinanthrenol A

07/12/2018 IC50= 10 nM

Cinanthrenol A

Analogamente all’estradiolo, il Cinathrenol A ha mostrato di alterare i livelli di espressione dei geni responsivi
al recettore per gli estrogeni, confermando la sua attività estrogenica
• Estrazione e isolamento da una matrice complessa di origine
naturale

• Caratterizzazione e identificazione

• Analisi preliminare dell’attività biologica

• Sintesi
Sintesi totale del Cinanthrenol A

Resa: 10,9 %
 Sintesi vs Isolamento

Estrazione e isolamento dai detriti: 6,5 kg3,5 mg di Cinanthrenol A.

Resa: 5,4 x 10-5 %. Per ottenere 1g di Cinanthrenol A servirebbero 1,9 tonnellate di
detriti!

Estrazione e isolamento da Cinachyrella sp.: 6,5 kg0,4 mg di Cinanthrenol A.

Resa: 5,7 x 10-4 %. Per ottenere 1g di Cinanthrenol A servirebbero 175 kg di
spugne!

Sintesi totale:
Resa: 10,9%. Per ottenere 1g di Cinanthrenol A sono necessari 7,3 g di materiale
di partenza (disponibile commercialmente)
• Estrazione, isolamento, caratterizzazione e identificazione: Machida, K. et
al. Cinanthrenol A, an Estrogenic Steroid Containing Phenanthrene Nucleus,
from a Marine Sponge Cinachyrella sp. Org Lett 2014, 16, 1539-1541

• Sintesi totale: Zhu, L. et al. Total synthesis of ent-(+)-cinanthrenol A J

Antibiot 2016, 69, 280-286