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Protocollo

 del  1°  giorno  

Scopo:  

• Separazione   delle   proteine   dell’estratto   mediante   SDS-­‐PAGE   (PoliAcrillamide   Gel  


Elettroforesi  in  presenza  di  Sodio  Dodecil  Solfato)  
• Colorazione  di  un  gel  mediante  Blu  di  Coomassie  
• Trasferimento  delle  proteine  su  un  filtro  di  PVDF  (PoliVinilDenFluoruro)  mediante  Western  
Blotting  

Prima   parte:   Separazione   delle   proteine   dell’estratto   mediante   SDS-­‐PAGE   (PoliAcrillamide   Gel  
Elettroforesi  in  presenza  di  Sodio  Dodecil  Solfato)  

Materiale  fornito:  

• 2   estratti   proteici   di   lievito   in  


TCA  (Acido  Tricloroacetico)    
• Marker  di  proteine    
• Gel  di  poliacrilammide  precast  
• Tampone   di   corsa   1X   (Tris,  
glicina)  con  SDS  
 
Metodo:  

Il   tutor   fornirà   a   ciascun   ragazzo   una   eppendorf   contenente   un’aliquota   di   estratto   proteico  
proveniente  o  da  un  ceppo  di  lievito  non  trattato  o  da  un  ceppo  di  lievito  irraggiato  con  raggi  UV.  

 Incubare   i   campioni   nel   termostato   a   100°C   per   5’   per   favorire   la   denaturazione   delle  
proteine  
 Centrifugare   i   campioni   per   30’’   a   13200   rpm   per   raccogliere   sul   fondo   il   liquido   contenuto  
nella  provetta  
 Aprire   i   gel   precast   e   sciacquarli   dolcemente   con   acqua   distillata;   togliere   i   pettini   e   le  
guarnizioni  adesive  alla  base  del  gel;  montarli  sull’apposito  sostegno  
 Riempire  lo  spazio  tra  i  due  gel  con  il  tampone  di  corsa  
 Nel   primo   pozzetto   caricare   5   µl   del   marker   di   proteine,   una   miscela   di   proteine   di   peso  
molecolare  noto  già  colorate  
 In  seguito,  ciascun  ragazzo  dovrà  caricare  10  µl  del  proprio  estratto  proteico  
 Posizionare   l’apparato   con   i   gel   nella   cella   elettroforetica   e   riempirla   con   il   tampone   di  
corsa  
 Applicare  al  sistema  una  differenza  di  potenziale  di  200V  per  40’  circa  (finchè  il  “fronte  blu”  
esce  dal  gel)  

 
Seconda  parte  
Colorazione  del  gel  con  Blu  di  Coomassie  
Materiale  fornito:  

• Blu  di  Coomassie  safety  


• Acqua  distillata    
• Vaschette  di  vetro            

Metodo:  
Al  termine  della  corsa,  uno  dei  due  gel  viene  sottoposto  alla  colorazione  con  Blu  di  Coomassie.  
Porre  il  gel  in  una  vaschetta  e  fare  3  lavaggio  di  5’,  tenendo  il  gel  in  blanda  agitazione.  
Dopo  l’ultimo  lavaggio,  aggiungere  50  ml  e  lasciare  in  blanda  agitazione  over  night  (O/N).  
In   seguito   il   gel   viene   trasferito   in   acqua   per   rimuovere   l’eccesso   di   colorante,   rendendo   visibili  
come   bande   blu   le   proteine   (che   trattengono   il   colorante,   il   quale   si   lega   a   esse   mediante  
interazioni  deboli).  
 

Terza  parte  
Trasferimento  delle  proteine  su  membrana  in  PVDF  
Materiale  fornito:  

• Griglia  per  elettroblotting  


• Carta  da  filtro  3M  
• Membrana  in  PVDF  (PoliVinilDenFluoruro)  
• Tampone  di  trasferimento  
• Etanolo    
 
Metodo:  
Al  termine  della  corsa,  il  secondo  dei  due  gel  verrà  utilizzato  per  la  procedura  di  Western  Blotting,  
ovvero  di  trasferimento  delle  bande  proteiche  dal  gel  di  poliacrilammide  a  una  membrana  in  PVDF.  
 Preparare   la   griglia   di   trasferimento,   aprendola   in   una   vaschetta   con   la   parte   nera  
appoggiata  al  fondo.  
 Posizionare  in  sequenza:  una  spugnetta  bagnata  di  tampone  di  trasferimento,  un  foglio  di  
carta  3M  anch’essa  già  imbevuta  di  tampone.  
 Delicatamente  appoggiare  sulla  carta  3M  il  gel.  
 Attivare  la  membrana  in  PVDF,  precedente  tagliata  sull’angola  a  destra  e  in  alto,  tenendola  
almeno   10’’   in   una   vaschetta   di   plastica   contenente   etanolo:   la   membrana   va   sempre  
maneggiata  con  i  guanti.  
 Sovrapporre  la  membrana  in  PVDF  sul  gel    
 Posizionare   un   secondo   foglio   di   carta   3M   e   infine   la   seconda   spugnetta   (sempre   imbevute  
di  tampone  di  trasferimento).  
 Chiudere  la  griglia  così  ottenuta  (sandwich).  
 Inserire  il  sandwich  nella  camera  di  un  apparato  per  elettroblotting,  riempita  di  tampone  di  
trasferimento.  
 
La  struttura  dell’apparato  è  tale  per  cui  il  campo  elettrico  viene  applicato  perpendicolarmente  al  
piano  del  sandwich.  Il  trasferimento  viene  realizzato  applicando  un’intensità  di  corrente  di  400  mA  
per  un’ora.  
 Una  volta  completato  il  trasferimento,  seccare  la  membrana  in  PVDF  immergendola  in  
etanolo.  Questo  passaggio  serve  per  fissare  le  proteine  alla  membrana.  

 Una  volta  bagnata  la  membrana  diventa  trasparente.  Lasciarla  asciugare  su  un  foglio  di  
carta  3M.  

Protocollo  del  2°  giorno  

Prima  parte:  immunodecorazione  della  membrana  in  PVDF    


Materiale  fornito:  
• Membrana  precedentemente  sottoposta  a  western  blotting    
• Soluzione   di   lavaggio   (PBST,   una   soluzione   fisiologica   con   NaCl   e   NaH2PO4   +   Tween,   un  
detergente)  
• Soluzione   di   incubazione   con   anticorpi   primari   (PBST   e   Latte   al   5%   con   anticorpi   primari  
Anti-­‐Rad53,  diluiti  1:100)  
• Soluzione   di   incubazione   con   anticorpi   secondari   (PBST   e   Latte   al   5%   con   anticorpi  
secondari  coniugati  con  la  perossidati  di  rafano  diluiti  1:50.000)  
Metodo:  
 Dopo   il   western   blotting,   incubare   con   la   soluzione   contenente   anticorpi   primari   diretti  
contro  la  proteina  Rad53  per  un’ora,  in  blanda  agitazione.  
 Effettuare  3  lavaggi  della  membrana  come  segue:  
o Rimuovere  la  soluzione  di  incubazione.  
o Incubare  la  membrana  con  PBST  per  5  minuti.  
 Incubare   la   membrana   con   la   soluzione   di   incubazione   contenente   gli   anticorpi   secondari  
per  45  minuti.  
 Effettuare  3  lavaggi  della  membrana  come  segue:  
o Rimuovere  la  soluzione  di  incubazione.  
o Incubare  la  membrana  con  PBST  per  5  minuti.  
 
Seconda  parte:  immunorilevazione  di  Rad53  (in  camera  oscura)  
Materiale  fornito:  
• Reagenti  di  sviluppo:  Acido  Paracumarico  e  Luminolo  
• Soluzione  di  acqua  ossigenata  
• Vaschetta  per  lo  sviluppo  
• Fogli  di  acetato  
• Lastre  
• Liquidi  di  sviluppo  e  fissaggio  per  le  lastre  
• Pinzetta    
   
Metodo:  
 Spostare  il  filtro  nella  vaschetta  con  i  reagenti  di  sviluppo  e   incubare  il  filtro  per  3  minuti:  il  
luminolo   viene   così   ossidato   dall’ossigeno   liberato   dalla   reazione   dell’acqua   ossigenata   e  
perossidasi  coniugata  agli  anticorpi  secondari,  con  concomitante  produzione  di  luce.  
 Posizionare  il  filtro  tra  due  fogli  di  acetato.  
 Segnare  con  un  pennarello  i  quattro  angoli  della  membrana  e  la  posizione  delle  bande  del  
marker.  
 Sovrapporre  una  lastra  fotografica  e  tenere  coperto  e  fermo.  
 Esporre  la  lastra  per  circa  3  minuti.  
 Rimuovere  la  lastra  e  bagnarla  con  il  liquido  di  sviluppo  fino  a  comparsa  delle  bande.  
 Immergere  la  lastra  in  una  vaschetta  piena  d’acqua  per  sciacquarla  e  bagnarla  con  il  liquido  
di  fissaggio  fino  a  che  non  diventa  trasparente.